CICLO DE LOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO

Piruvato Deshidrogenasa

La conexión entre la llamada fase anaeróbica de la glucólisis, en donde se metaboliza la glucosa para convertirla en 2 moléculas de ácido pirúvico, con la fase aeróbica de la glucólisis, que llevará la degradación de la glucosa hasta CO2 y H2O en el Ciclo de Krebs, consiste en la descarboxilación oxidativa del piruvato a Acetil-CoA.

Esta transformación es catalizada por un complejo multienzimático llamado Piruvato Deshidrogenasa.

Piruvato Deshidrogenasa

La conversión del piruvato a Acetil-CoA por la acción de la Piruvato Deshidrogenasa es un punto crítico del metabolismo, particularmente en el hígado, puesto que disminuye la posibilidad de que el piruvato se reconvierta en glucosa o en ácido láctico.

La conversión a Acetil-CoA compromete al piruvato a entrar al Ciclo de Krebs, donde puede ser utilizado como sustrato para la fosforilación oxidativa, o puede ser convertido a citrato para ser exportado al citosol y servir como sustrato para la biosíntesis de ácidos grasos e isoprenoides.

Piruvato Deshidrogenasa

La descarboxilación oxidativa del piruvato en los organismos anaeróbicos requiere la utilización de un receptor de electrones diferente al NAD+, el cual es frecuentemente una proteína ferro sulfurada.

La conversión es catalizada por una enzima dependiente de tiamina (vitamina B1) que tambien produce la acilación de la Coenzima-A.

Los equivalentes reductores son eliminados por la producción de H2 por la actividad de una hidrogenasa.

Piruvato

Acetil-CoA

Oxaloacetato

Citrato

Piruvato deshidrogenasa

Citrato Sintetasa

H2O

FORMACIÓN DE ACETIL-COENZIMA A PIRUVATO DESHIDROGENASA

PIRUVATO Acetil-CoA

PIRUVATO DESHIDROGENASA

•Es un complejo formado por tres enzimas que transforma el piruvato resultante de la glucólisis, en Acetil-CoA por medio de una reacción de descarboxilación oxidativa.

•De esta manera enlaza la Vía de Embden-Meyerhof con el Ciclo de Krebs.

UNA REACCIÓN MUY FÁCIL DE PONER EN EL PAPEL. PERO MUY DIFÍCIL DE LLEVAR A CABO POR LA COMPLEJIDAD DEL SISTEMA ENZIMÁTICO NECESARIO PARA QUE SE REALICE

Piruvato Deshidrogenasa La Piruvato deshidrogenasa es un sistema complejo formado

por 60 unidades en los procariotas, 102 en los eucariotas, organizadas en 3 unidades enzimáticas funcionales

Este complejo multienzimático está estructural y funcionalmente relacionado con otros dos procesos de gran importancia para el metabolismo celular la cetoglutárico deshidrogenasa y la alfa-cetoácido deshidrogenasa responsable de la degradación de algunos amino ácidos.

El complejo está formado por las siguientes enzimas. Cada una de las cuales requiere un conjunto de cofactores específicos:

1. Piruvato deshidrogenasa {Tiamina Pirofosfato} 2. Dihidrolipoil Transacetilasa {Lipoil-CoA} 3. Dihidrolipoil Deshidrogenasa {FAD y NAD+}

Es el paso limitante de toda la reacción de conversión del pirúvico en Acetil-CoA.

Requiere Tiamina (Vitamina B1) pirofosfato como cofactor. Por esta razón la tiamina fue llamada en un tiempo cocarboxilasa.

La enzima está formada por 24 subunidades en los procariotas y por 30 subunidades en los eucariotas.

El mecanismo central de la actividad enzimática es un ataque nucleofílico sobre el carbono 2 (ceto) del pirúvico, con la producción de un hemi-tioacetal que libera el CO2

Al final de la reacción se libera el CO2 resultante de la descarboxilación del piruvato y el derivado acilado de la tiamina pirofosfato.

Una reacción de transacilación transfiere el grupo acetil del derivado acetil de la Tiamina pirofosfato y lo transfiere a la Coenzima A.

Esto produce Acetil-CoA, que es liberada al interior de la mitocondria para entrar en el ciclo de Krebs y convierte la Lipoil-CoA en la forma reducida del ácido Lipoico.

La Dihidrolipoil Transacetilasa es la enzima mas compleja del grupo y esta formada por 24 subunidades en los procariotas y por 60 subunidades en los eucariotas.

E3 Dihidrolipoil Deshidrogenasa

Para que la reacción continúe se requiere reformar la Lipoil-CoA, para lo cual el ácido Lipoico debe ser oxidado nuevamente.

La forma reducida del ácido Lipoico es oxidada mediante un reacción que requiere FAD como cofactor, el cual será convertido a FADH2.

Enseguida la forma reducida del FAD, FADH2, es reoxidada por una reacción ligada a NAD+, produciéndose NADH.

La dihidrolipoil deshidrogenasa es la parte más sencilla del complejo enzimático y está formada por 12 subunidades tanto en procariotas como en eucariotas

Por anaplerosis.- La mayor parte del piruvato se oxida a acetil-CoA, pero una cierta cantidad se convierte en oxalacetato (proceso anaplerótico), permitiendo que la acetil-CoA se combine con este último para que el ciclo de Krebs funcione adecuadamente.

Por inhibición competitiva.- Tanto la acetil-CoA como el NADH son inhibidores competitivos; de esta manera, cuando el aporte de acetil-CoA es suficiente a expensas de los ácidos grasos, la enzima es inhibida, evitando así el desperdicio innecesario de piruvato derivado de la glucosa.

REGULACIÓN 2 Por el proceso de fosforilación defosforilación.- Existen dos

formas interconvertibles de la piruvato deshidrogenasa: una, fosforilada, o forma inactiva, la otra desfosforilada, es la forma activa.

La intervonversión es catalizada por dos enzimas: la piruvato deshidrogenasa cinasa, que requiere ATP, y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa.

Ambas enzimas forman parte del complejo, asociadas a la dihidrolipoil transacetilasa.

La principal función reguladora es ejercida por la cinasa que al fosforilar la piruvato deshidrogenasa la convierte en su forma inactiva; esto ocurre cuando hay exceso de ATP en la célula.

Cabe destacar el papel estimulador que ejercen sobre la cinasa la acetil-CoA y el NADH, y el papel inhibidor del piruvato y el ADP.

REGULACIÓN 3

Por actividad endócrina.- La actividad del complejo piruvato deshidrogenasa también es regulada por algunas hormonas.

De entre ellas cabe destacar la insulina que incrementa la forma activa (desfosforilada) en tejido adiposo;

Las catecolaminas como la adrenalina pueden activar la piruvato deshidrogenasa en el tejido cardiaco.

Piruvato deshidrogenasa Localización En las células eucariotas la descarboxilación del

piruvato para producir Acetil-CoA, se realiza dentro de las mitocondrias. Esto requiere que el piruvato sea transportado a través de la membrana mitocondrial

La difusión pasiva del piruvato al interior de la mitocondria es imposible porque el piruvato lleva una carga negativa.

En consecuencia se sabe que el transporte del piruvato se hace por medio de una proteína transportadora y requiere el gasto de energía.

Piruvato deshidrogenasa Localización Una vez dentro de la mitocondria el piruvato es

rápidamente descarboxilado y convertido en Acetil-CoA. Esta reacción es irreversible y atrapa la Acetil-CoA en el interior de la mitocondria.

La Acetil-CoA puede ser transportada fuera de la matriz mitocondrial utilizando el llamado “desvío” (Shuttle) del citrato

El CO2 es pequeño y apolar y difunde fácilmente fuera de la mitocondria.

En los procariotas, que no tienen mitocondrias, esta descarboxilación se realiza en el citosol, o no se realiza.

Para recordar la secuencia en el Ciclo de Krebs, recordemos que está formado por tres fases: a) Componentes de 6 átomos

de carbono (en verde) b) Componentes de 5 átomos

de carbono (en purpura) c) Componentes de 4 átomos

de carbono (en azul)

1. Citrato Sintetasa

2. Aconitasa

3. Isocitrato Deshidrogenasa

4. α-cetoglutarato Deshidrogenasa

5. Succinil-CoA Sintetasa

6. Succinato Deshidrogenasa

7. Fumarasa

8. Malico Deshidrogenasa

Es una serie de reacciones enzimáticas cuya actividad es de importancia central para todas las células vivas que utilizan oxígeno durante el proceso de respiración celular.

Constituye una vía Anfibólica, es decir: contribuye tanto al catabolismo, como al anabolismo celular.

Culmina la utilización aeróbica de la glucosa convirtiéndola finalmente en CO2 y H2O, utilizando oxígeno como parte de la respiración celular.

Proporciona muchos precursores para producir algunas moléculas fundamentales para la célula, entre ellas el cetoglutarato y el oxalacetato precursores de algunos aminoácidos.

El ciclo de Krebs ocurre en las mitocondrias de las células eucariotas y en el citoplasma de las células procariotas.

Los componentes y reacciones del ciclo del ácido cítrico fueron establecidos por Albert Szent-Györgyi y Hans Krebs.

LOCALIZACIÓN

Los componentes del ciclo se encuentran en las mitocondrias.

Sin embargo algunas enzimas y metabolitos también se encuentran en el citosol (extramitocondrial).

Dentro de las mitocondrias, las enzimas se localizan en la membrana interna y en la matriz mitocondrial, y próximas al sitio donde radican las de la cadena respiratoria.

Esta proximidad facilita el adecuado acoplamiento de ambos procesos.

El ciclo de Krebs como vía anabólica

En los organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es el anillo de

conjunción de las rutas metabólicas responsables del catabolismo y degradación de los carbohidratos, las grasas y las proteínas convirtiéndolos finalmente en CO2 y H2O.

El Ciclo de Krebs, ligado al proceso de fosforilación oxidativa, constituye el proceso donde se produce la mayor cantidad de energía que finalmente puede ocupar la célula para el resto de sus funciones y metabolismo.

La acetil-CoA constituye el principal sustrato del ciclo. Su inicio consiste en la condensación de acetil-CoA con

oxalacetato, generándose ácido cítrico. De aquí uno de los nombres que ha recibido esta vía enzimática.

“Glorieta Bioquímica"

Una vía metabólica es anfibólica cuando puede funcionar tanto en sentido catabólico como en sentido anabólico.

Desde este punto de vista nos parece muy adecuado el considerar al ciclo de Krebs como una “Glorieta Bioquímica", ya que presenta diversos puntos de entrada y de salida que facilitan el que el material que llega, sea de fuentes hidrocarbonadas o de otras fuentes, pueda abandonarlo para formar grasa, sintetizar amino ácidos o regenerar carbohidratos (gluconeogénesis) para su almacenamiento o utilización en otras vías o en otros destinos.

CoA

Citrato Sintetasa La reacción inicial del Ciclo de Krebs, es la

condensación de la acetil-CoA con oxalacetato (último producto del ciclo) para producir el primero de los ácidos tricarboxílicos que participan en el Ciclo y por los cuales lleva uno de sus nombres, Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA).

Esta reacción de condensación es catalizada por la enzima Citrato Sintetasa (también llamada enzima condensante de Ochoa).

El citrato producido por la enzima, es capaz de inhibir competitivamente la actividad de la enzima.

La reacción supone la hidrólisis del enlace tioéster de la acetil-CoA. Esta reacción es sumamente exoergónica (ΔG'°=-31.4 kJ/mol), motivo por el cual este paso es irreversible.

Condensación de la Acetil-CoA con Oxalacetato Se inicia el Ciclo de Krebs

Aconitasa El citrato es convertido en isocitrato por medio de la

enzima aconitasa (aconitato hidratasa). La reacción tiene lugar en dos pasos: deshidratación hasta cis-aconitato (el cual permanece unido a la

enzima) y rehidratación hasta isocitrato

Las concentraciones (en condiciones estándar) de citrato (91%), del intermediario cis-aconitato (3%) y de isocitrato (6%), conducen la reacción hacia la producción de isocitrato.

Además, el consumo de isocitrato y la producción continua de citrato in vivo, por ley de acción de masas, hace que la reacción esté desplazada hacia la conversión citrato- isocitrato.

La aconitasa reacciona en forma asimétrica, actuando sobre la parte del citrato que deriva del oxalacetato.

Isocitrato Deshidrogenasa

El isocitrato es oxidado por deshidrogenación, en una reacción catalizada por la enzima isocitrato deshidrogenasa.

La enzima requiere NAD+ y Mg++. La reacción se lleva a cabo en dos pasos:

1. Deshidrogenación, en la que se forma oxalosuccinato que permanece unido a la enzima, y

2. Descarboxilación para formar el α-cetoglutarato. En esta reacción irreversible se produce CO2 y el primer

NADH + H+ del ciclo. El citosol posee también una isocitrato deshidrogenasa

pero esta isozima requiere NADP+ como coenzima, a diferencia de la enzima mitocondrial que participa en el ciclo de Krebs, la cual requiere NAD+.

La enzima requiere NAD+ y Mg++. Este último facilita la liberación de CO2

La reacción se lleva a cabo en dos pasos: 1. Deshidrogenación, en la que se forma oxalosuccinato que

permanece unido a la enzima, y 2. Descarboxilación para formar el α-cetoglutarato.

El isocitrato es oxidado por deshidrogenación, en una reacción catalizada por la enzima Isocitrato Deshidrogenasa.

α-Cetoglutarato Deshidrogenasa

El ciclo prosigue mediante la actividad de la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa, la cual convierte el α-cetoglutarato (o 2-oxo-glutarato) en succinil-CoA.

La α-cetoglutarato deshidrogenasa es un complejo multienzimático, cuya acción es análoga a la piruvato deshidrogenasa y utiliza los mismos cofactores: pirofosfato de tiamina (TPP), ácido lipoico, NAD+, FAD y coenzima A.

La reacción es prácticamente irreversible y en ella se forma el segundo CO2, que proviene del oxalacetato.

Para que la acetil-CoA convierta en CO2 su radical acetato, el ciclo ha de dar dos vueltas.

α-Cetoglutarato Deshidrogenasa

Succinil-CoA la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa convierte el α-cetoglutarato (o 2-oxo-glutarato) en succinil-CoA.

La α-cetoglutarato deshidrogenasa es un complejo multienzimático, cuya acción es análoga a la piruvato deshidrogenasa y utiliza los mismos cofactores: pirofosfato de tiamina (TPP), ácido lipoico, NAD+, FAD y coenzima A. Esta enzima también es un complejo de 3 subunidades y el mecanismo de la reacción se semejante

Succinil-CoA Sintetasa El ciclo continúa con la liberación de la CoA y la conversión

de succinil CoA en succinato. La succinil CoA es un tioéster de alta energía (su ΔG°′ de

hidrólisis está en unos -33.5 kJ mol-1, parecido al del ATP que es de -30.5 kJ mol-1).

En este punto del ciclo de Krebs se realiza una fosforilación a nivel del sustrato, y puede generarse ATP.

Sin embargo, la transferencia del enlace de alta energía no se hace directamente al ADP, sino que se realiza la fosforilación de GDP (guanosina difosfato) que pasa a GTP (o de IDP, inosina difosfato, que pasa a ITP).

Ambos nucleótidos pueden ser utilizados para la formación de ATP por acción de una enzima, la nucleósido difosfato cinasa o fosfocinasa.

Curiosamente la enzima que cataliza esta reacción es más conocida por su actividad en sentido inverso, por lo cual se llama succinil-CoA sintetasa, que por su actividad real, por la cual debe llevar el nombre de succinato tiocinasa

GTP

Otras Enzimas

Una reacción alternativa en tejidos extra-hepáticos es la transferencia de la CoA de la succinil-CoA al acetoacetato, para producir acetoacetil-CoA

Esta reacción, de gran importancia en algunos estados metabólicos, permite la incorporación de cuerpos cetónicos al ciclo de Krebs y es catalizada por la enzima succinil CoA transferasa (o tioforasa).

En el hígado se puede producir la desacilación directa de la succinil-CoA por la actividad de una succinil-CoA deacilasa, produciéndose succinato y, lo que es importante, aumentando los niveles de CoA libre.

Parte final del ciclo

La parte final del ciclo consiste en la reorganización de moléculas de cuatro átomos de carbono, hasta la regeneración del oxalacetato.

Para que esto sea posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un carbonilo.

Como ocurre en otras rutas, por ejemplo en la beta oxidación de los ácidos grasos, tal conversión ocurre mediante tres pasos: una primera oxidación, una hidratación y una segunda oxidación.

Estos tres pasos, además de regenerar oxalacetato, permiten la extracción ulterior de energía mediante la formación de FADH2 y NADH.

succinato

fumarato

Succinato Deshidrogenasa

FAD

FADH2

Por acción de la succinato deshidrogenasa, el succinato es deshidrogenado a fumarato,

Esta enzima utiliza FAD como coenzima, el cual en estado reducido (FADH2) constituye una fuente directa de electrones para la cadena respiratoria a nivel de la coenzima Q.

Esta es la única enzima del ciclo integrada a la membrana mitocondrial interna, directamente ligada a la cadena respiratoria.

Se reúnen así, anatómica y fisiológicamente, el ciclo de Krebs el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa.

H2O Fumarasa

Málico Deshidrogenasa

El fumarato presenta luego una serie de cambios para regenerar el oxalacetato, los cuales comprenden una hidratación catalizada por la fumarasa (fumarato hidratasa) para formar L-malato, el cual luego se oxida o oxalacetato por medio de la deshidrogenasa málica y el NAD+ como coenzima.

L-malato

REGULACIÓN

La regulación del ciclo de Krebs se realiza principalmente por la disponibilidad de sustrato y por la retro-inhibición por acumulación de los productos del ciclo

El aumento en la concentración de NADH, inhibe a la piruvato deshidrogenasa, a la isocitrato deshidrogenasa y a la citrato sintetasa

La acetil-CoA inhibe a la piruvato deshidrogenasa. La succinil-CoA inhibe a la succinil-CoA sintetasa y a la citrato sintetasa Aunque los niveles de ATP son consistentemente conservados in vivo y no

cambian más del 10% entre el reposo absoluto y el ejercicio más activo, in vitro, el ATP es un potente inhibidor alostérico de la citrato sintetasa y de la α-cetoglutarato deshidrogenasa

El Calcio también funciona como regulador. Activa tres de las deshidrogenasas que participan en el ciclo: la piruvato deshidrogenasa, la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa y por lo tanto aumenta el flujo continuo a través del ciclo.

Recordemos adem´<s que el citrato es un inhibidor de la fosfofructocinasa (la enzima que es paso limitante de la glucólisis) y actúa eficientemente disminuyendo el aporte de sustrato inicial, piruvato, para el ciclo de Krebs

La proximidad intracelular física y funcional del ciclo del ácido cítrico y la cadena respiratoria, determina que la actividad de uno dependa de la otra y viceversa.

A su vez, ambas vías metabólicas están reguladas por las concentraciones relativas de ATP/ADP y NADH/NAD+.