Trao đổi trực tuyến tại:

http://www.mientayvn.com/Y_online.html

PHAÛN ÖÙNG

Khaùng nguyeân – Khaùng theå

PGS. TS. Cao Minh Nga

BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Dược TP. HCM

KHAÙI NIEÄM

ÑN: Laø nhöõng phöông phaùp mieãn dòch hoïc (MDH)

Muïc ñích:

Xaùc ñònh hoaëc / vaø

- chuaån ñoä moät KN

- ñònh löôïng hieäu giaù moät KT

- ño löôøng moät phöùc hôïp KN-KT

- ño löôøng caùc nhaân toá tham gia / heä thoáng MD.

VD: kieåm tra hoaït tính cuûa boå theå.

Nguyeân lyù phaûn öùng KN-KT

Tính ñaëc hieäu

a

b

b a

c

Khaùng nguyeân A

c

Khaùng nguyeân

• Điểm quyết định KN (epitope):

phần trên phân tử KN có khả

năng liên kết đặc hiệu vào phần

liên kết với KN trên phân tử KT

Tương tác KN - KT

Hiện tượng vùng

PHAÂN LOAÏI

A. PƯ döïa treân söï taïo thaønh “haït”:

1. PƯ keát tuûa (precipitation reaction): KN hoøa tan.

2. PƯ ngöng keát (agglutination reaction): KN höõu hình

B. PƯ döïa treân hoaït ñoäng sinh hoïc cuûa KT:

1. PƯ keát hôïp boå theå (complement binding reaction)

2. PƯ trung hoøa (neutralization reaction)

C. PƯ MD ñaùnh daáu:

1. PƯ MD huyønh quang (immunofluorescence reaction)

2. PƯ MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

3. PƯ MD phoùng xaï (radio immmuno assay - RIA).

4. Thöû nghieäm xaùc ñònh Westein Blot (daáu thaám MD).

Caùc phaûn öùng MD coù ñoä nhaïy khaùc nhau

Loaïi phaûn öùng MD Ngöôõng phaùt hieän (g/ml)

Keát tuûa / moâi tröôøng loûng

Keát tuûa / thaïch:

- khueách taùn ñôn (Mancini)

- khueách taùn keùp (Ouchterlony)

- MD ñieän di (Immuno electrophoresis )

20

10

3

50

Ngöng keát: - tröïc tieáp

- giaùn tieáp

- NK vi khuaån

0,5

0,001

0,001

Coá ñònh boå theå (CF) 0,1

Mieãn dòch huyønh quang (IF) 0,1

Ñònh löôïng MD phoùng xaï (RIA) 0,0001

Ñònh löôïng MD enzym (EIA) 0,0001

* Caùc phaûn öùng MD thöôøng duøng trong Vi sinh laâm saøng

A. PƯ ngöng keát (agglutination reaction)

- Ngöng keát: nhoùm maùu, nhoùm VKÑR, …

- Latex, ngaên ngöng keát (HI)

B. PƯ MD ñaùnh daáu:

- MDHQ (IF),

- ELISA

A. PƯ ngöng keát

(agglutination reaction)

Khaùng nguyeân

IgG

IgM

A

C B

Phaûn öùng ngöng keát

- A: khoâng xaûy ra khi caû 2 vò trí cuûa IgG ñeàu gaén

vaøo moät KN

- B: xaûy ra khi IgG trôû thaønh caàu noái giöõa caùc KN

- C: raát deã xaûy ra khi KT laø loaïi IgM

Kháng nguyên

Tạo mạng

Phaûn öùng NK hoàng caàu giaùn tiếp

(thuï ñoäng)

* NK hồng cầu thuï ñoäng

KN hoaëc hapten KT / maãu

gaén treân giaù khoaùc

Phaûn öùng NK hoàng caàu giaùn tiếp

(thuï ñoäng) - 2

* NK hồng cầu thuï ñoäng ñaûo ngöôïc

KT / giaù khoaùc KN / maãu

PHAÛN ÖÙNG NGAÊN NGÖNG KEÁT HOÀNG CAÀU

(Hemagglutination Inhibition - HI)

B. Caùc phaûn öùng MD ñaùnh daáu

1. MD huyønh quang (immunofluorescence - IF)

VD: RSV, theå neùgri / beänh daïi, Chlamydiae, …

* Ñeám teá baøo doøng chaûy (flow cytometry):

ñeám & phaân loaïi TB.

2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).

VD: HBV, HCV, HIV, Rubella, …

1. PƯ MD huyønh quang

(immunofluorescence reaction) - IF

1. PƯ MD huyønh quang: nguyeân lyù

Ñònh tyùp virus DEN baèng IF vôùi KT ñôn doøng

(thuoác nhuoäm fluorescein )

Virus sôûi taïo hôïp baøo töø caùc TB Vero bò nhieãm.

Chaát huyønh quang gaén vaøo KT khaùng virus sôûi ñaõ bieát.

(thuoác nhuoäm rhodamin )

2. PHAÛN ÖÙNG ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )

* Muïc ñích: ñònh löôïng KN hoaëc KT hoøa tan / dòch sinh hoïc.

* Nguyeân lyù cô baûn:

KT/pha raén + KN/maãu + KTE

+ Subtrate

KN/pha raén + KT/maãu + Khaùng KT

E + Subtrate

maøu: So maøu (maét / maùy ño OD)

* Kyõ thuaät thöïc hieän: - "Caïnh tranh”

- "Khoâng caïnh tranh"

ỏ

ỏ

E E E E E H2SO4

E E E E E

E E E E E TMB

a. MD caïnh tranh ELISA:

Nguyeân lyù kyõ thuaät ñònh löôïng KT

MD cạnh tranh ELISA

Phản ứng màu tỉ lệ nghịch

với nồng độ kháng thể

b. ELISA theo phương pháp “sandwich”

c. ELISA “Toùm baét”: MAC-ELISA

(IgM antibody capture-ELISA)

Máy đo quang

Máy ủ Máy rửa

Kháng IgM

IgM /maãu

KN ñaõ bieát

Cộng hợp

Cơ chất

Đo Mật độ quang (OD)

Gieáng ñaõ ñöôïc gaén moät löôïng KN nhaát ñònh

ELISA

Öu ñieåm cuûa kyõ thuaät ELISA

- xeùt nghieäm ñoàng thôøi nhieàu maãu

- duøng maùy töï ñoäng (±) => thao taùc caù nhaân

- ñoïc keát quaû khoâng phuï thuoäc vaøo chuû quan ngöôøi laøm

XN

- döõ lieäu keát quaû löu ñöôïc kieåm tra chaát löôïng

- giaù thaønh xeùt nghieäm reû.

- là công cụ chủ yếu / bệnh nhiễm virus

ELISA

Nhöôïc ñieåm cuûa kyõ thuaät ELISA

- Thôøi gian thöïc hieän XN laâu hôn, kyõ thuaät phöùc

taïp

- Chi phí maùy moùc ban ñaàu, chi phí baûo haønh baûo

döôõng

- Nhaân vieân xeùt nghieäm phaûi ñöôïc ñaøo taïo kyõ

- soá maãu xeùt nghieäm ít => toán keùm do phaûi laøm

nhieàu chöùng

CÁC THỬ NGHIỆM NHANH

(test nhanh)

Nguyên lý

- Agglutination

- Immunodot

- Immunofiltration

- Immunochromatography

Nhoû maãu

Ghi nhận keát quaû

(1) : döông tính

(2) : aâm tính

(3) : khoâng yù nghĩa

CAÙC THÖÛ NGHIEÄM NHANH

(test nhanh)

Öu ñieåm:

- xeùt nghieäm vôùi soá löôïng maãu nhoû

- deã thöïc hieän, cho keát quaû nhanh

- khoâng ñoøi hoûi thieát bò ñaëc bieät, sinh phaåm deã baûo quaûn

- coù theå thöïc hieän ôû caùc tuyeán cô sôû

- xeùt nghieäm vieân coù theå ñöôïc ñaøo taïo nhanh

CAÙC THÖÛ NGHIEÄM NHANH

(test nhanh)

Nhöôïc ñieåm:

- giaù thaønh cao

- khoâng thuaän lôïi khi xeùt nghieäm soá maãu lôùn

- khoâng löu ñöôïc döõ lieäu kyõ thuaät

- moät soá test nhanh coù ñoä nhaïy keùm hôn so vôùi ELISA

XEÙT NGHIEÄM KHAÚNG ÑÒNH

WESTERN BLOT

Nguyeân lyù :

- ñieän di proteine virus phaân taùch theo PM / gel

polyacrylamide

- chuyeån sang giaáy nitrocellulose: caùc proteine ñònh vò theo PM

- KT / beänh phaåm + KN ñaëc hieäu töông öùng

- phaùt hieän phöùc hôïp KN-KT baèng coäng hôïp -KT gaén enzyme

- phaûn öùng hieän maøu vôùi cô chaát: ñoïc ñöôïc baèng maét

caùc baêng maøu ôû vò trí coù KT ñaëc hieäu vôùi KN töông öùng

BIEÄN LUAÄN KEÁT QUAÛ

WB (-): khoâng coù baêng naøo

WB (+): : coù ít nhaát 2 baêng töông öùng vôùi proteine voû

HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41

HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36

ngoaøi ra coù caùc baêng töông öùng vôùi saûn phaåm cuûa gen gag/pol

WB chöa xaùc ñònh : coù baêng ôû vò trí khaùc tieâu chuaån WB (+)

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Ñoä nhaïy (ngöôõng phaùt hieän haøm löôïng KN&KT):

Moãi phaûn öùng coù ngöôõng phaùt hieän nhau

------> neân ñònh löôïng.

2. Hieäu giaù ranh giôùi: ranh giôùi giöõa bình thöôøng & beänh lyù.

VD: hieäu giaù ranh giôùi cuûa ASLO laø 1:200

(200 ñôn vò/ml huyeát thanh)

------> (+) khi 400 ñ.v/ml.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ (2)

3. Tieán trieån cuûa hieäu giaù KT trong HTh BN:

“huyeát thanh keùp”

4. Keát quaû (+) tính giaû:

---------> thöôøng duøng nhieàu phaûn öùng cuøng luùc.

5. Ñaùp öùng KT: coù thay ñoåi veà lôùp Ig

- IgM: xuaát hieän tröôùc

- IgG: xuaát hieän sau, thay theá nhanh choùng cho IgM.