View
237
Download
16
Category
Preview:
DESCRIPTION
antibograma
Citation preview
Antibiograma: testarea sensibilitatii in vitro a mieroorganismelor fata de antibiotiee (TSA - testarea
suseeptibilitatii fata de antibiotiee)
Antibiotice
substante eu efect antibaeterian produse de diferite microorganisme
substante semisintetiee, sintetiee (ehimioterapeutiee)
1. al~tibiotice~-lactamice
peniciline
penicilina
peniciline eu speetru larg (ampicilina, amoxieilina)
penieiline antistafiloeoeiee (oxaeilina)
penieiline antipseudomonazice (piperaeilina, ticarcilina)
cefalosporine (gen I-IV)
gen I - cefazolin, cefalotin.
gen II - eefuroxim
gen III - eeftazidim, eeftriaxon, cefotaxim,
gen IV - cefpirom, cefepim
cefamicine (cetoxitin)
monobactame (aztreonam)
carbapeneme (ertapenem, imipenem, meropenem)
combinatii ~-lactamine + inhibitori de lactamaza (amoxieilina+acid c1avulanie,
ampicilina+sulbactam, piperaeilina+tazobaetam, ticarcilina+c lavulanat)
2. macrolide, lincosamide
eritromicina, c1aritromieina, azitromieina
c1indamicina
3. Uuorochinolone
norfloxacin, eiprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, moxifloxaein
4. tetraciclinetetraciclina, doxiciclina, minociclina
5. gJicilcicline
tigeciclina
6. aminoglicozide
kanamicina, gentamicina, amikacina, netilmicina
7. glicopeptide
vancomicina, teicoplanin
7.Oxazolidinone
linezolid
8. fenicoli
Illdicatiile efectuarii antibiogramei:
- in cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a caror susceptibilitate nu este predictibiHi
(~onditie: existenta standardizarii privind specia, antibioticul de testat)
ijecesitatea efectuarii antibiogramei se decide de catre medicul microbiolog in functie de:
felul produsului din care s-a izolat germenul,
specia bacteriana
Cand relevanta unui izolat este incerta, medicul microbiolog se consulta cu medicul curant ~i se ia 0
~ecizie in comun pe baza datelor clinice.
Metode:• metode calitative
o metoda difuzimetrica
• metode cantitative
o determinarea eMI (concentratia minima inhibitorie)
Metoda difuzimetrica Kirby-BauerSe testeaza sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate in cultura pura ~i identificate.
Este metoda utilizata de rutina pentru testarea susceptibilitatii izolatelor clinice.
FiiJ,'ld0 metoda calitativa, nu permite cuantificarea nivelului de rezistenta, rezultatele fiind exprimate
in sensibil, intermediar sau rezistent:
sensibil
• tulpina este sensibila [ata de antibioticul testat la 0 concentratie realizabila de catre
antibiotic in ser
• bacteriilor sensibile nu dispun de mecanisme de rezistenta
intermediar
• raspunsul terapeutic in cazul acestor izolate poate fi mai slab decat in cazul izolatelor
sensibile
• aeeasta categorie reprezinta totodata 0 zona de tampon care, in caz de erori tehnice minore
necontrolate, previne crearea unor discrepante majore in interpretare
• in caz de sensibilitate intermediara antibioticul poate fi utilizat clinic in anumite situatii:
o in infectii urinare - acele antibiotice, care se concentreaza in urina (realizeaza
concentratii mai mari in urina decat in ser)
o candpot fi administrate doze crescute (13-Iactamine)
• bacteriile rezistente nu pot fi inhibate de antibiotic la concentratia serica realizabila prin
administrare uzuala
in efectuarea ~i interpret area antibiogramelor calitative se urmaresc standarde intemationale. Inprezent standardul acceptat in cele mai multe tan (inc1usiv Romania) este eel american, elaborat de
CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Este in curs de elaborare un standard european de
catre EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing), care va avea ill vedere
caracterisiticile tulpinilor circulante ~ial infectiilor mai importante ill Europa.
Reailizareaantibiogramei conform standardului CLSI
.1. Prepararea inoculului:
se suspensioneaza 2-3 colomi izolate in ser fiziologic
turbiditatea suspensiei se controleaza nefelometric sau comparand cu tuburi etalon (contin
suspensii de particule latex/sulfat de Ba avand turbiditate determinata);
. se ajusteaza la 0.5 McFarland (1,5xI08 CFU/ml).
2. Insamantare:se alege un mediu corespunzator speciei bacteriene testate
• Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor
• Mueller-Hinton cu sange pentru pretentio~i (de ex. streptococi)
• medii speciale (pentru Haemophilus spp . neisserii)
se introduce un tampon in suspensia bacteriana, se stoarce pentru indepiirtarea excesului de lichid
se ~tergeuniform toata suprafata mediului de 3x
3. Depunerea microcomprimatelor de antibiotice
se aleg antibiotice1e care trebuie testate in functie de specia bacteriana testata si in functie de
localizarea infec!iei (anexa 1)
se depun discurile de antibiotic la 1.5 cm distanta de marginea cutiei Petri si la 3 cm distan¢ unul
fata de celi'ilalt(pot fi depuse max. 12 discuri)
15 min. temperatura camerei
4. Incubare
in functie de specia bacteriana: in atmosfera obi~nuita sau in atmosfera de CO2 (de ex.
streptococi, neisserii.)
16-18 ore (in cazu1germenilor pretentio~i pana la 20-24 de ore)
24 de ore in cazul testarii vancornicinei
apare 0 cultura bacteriana confluenta, in jurul rnicrocornprirnatelor apar zone de inhibitie (lipsa
cre~terii bacteriene)
se citesc diametrele zone lor de inhibitie
se compara diametrele citite cu diametre standard in funetie de antibiotic, cantitatea de antibiotic
din cornprimat, specia bacteriana testata
l) Tabel: Exemple de diametre standard, conform standardelor CLSI (Clinical Laboratory
Standards Institute USA).
Standard Specii bacteriene Antibiotic Rezistent Intermediar Sensibilsensibil
CLSI Staphylococcus levofloxacin 10 ug S; 15 mm 16-18 2: 19 mmi aureus
Streptococcus levofloxacin 10 ug S; 13 mm 14-16 2: 17mmpneumoniae
fenomene de sinergisrn/antagonism care reflecta diferite mecanisme de
rezistenta
6. Interpretarea antibiogramelor:
rezultatul se raporteaza: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) la antibioticul
testat
fiecare rezultat de antibiograma se interpreteaza!
nu se comunica diametrele citite (metoda calitativa)
Vartiabilele care influenteaza rezultatele:compozitia mediului (continut de cationi, timidina)
pH (optim: 7,2-7,4)
grosimea geIozei (standard: 4 nun)
inocuIul - 0,5 McFarland
microcomprimate (valabilitate, continut, conditii de pastrare)
timpul, temperatura de incubare
citirea diametrelor (lumina refractataJreflectata, colonii izolate, prezenta unui val, margini
crenelate)
Control de calitatemicrocomprimateIe
loturile noi de medii de cuItura se testeaza cu tulpini de referinta
- permit stabilirea concentratiei minime inhibitorii (eMI) a unui antibiotic
CMI: cantitatea cea mai mica de antibiotic care inhiba compIet multiplicarea unei bacterii
Este recomandata testarea cantitativa in urmatoareIe situatii:
cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)
rezultate incerte cu metoda difuzimetrica / sensibilitate nedeterminata
situatii speciale (de ex. testarea sensibilitatii pneumococului la penicilina printr-o metoda
cantitativa cfmd diametrul zonei de inhibitie la oxacilina este sub 20 nun) ~
eMI obtinut se raporteaza la punctele de ruptura superior ~i inferior date de CLSI
~pecii bacteriene Sensibil Intermediar Rezistentsensibil
Stafilococi :::;0,25 - ~ 0,5Enterococi :::;8 ~16
Enterobacterii :::;8 16 ~32
Metoda dilupilor (macro/microdilupe)se realizeaza dilutii succesive din antibioticul de testat in mediu de cultura lichid
se adauga cantitiiti fixe din cultura bacterianii cercetata
incubare 18 ore 3SoC
concentratia minimacontrol de cre~tere
concentratiamaxima
Metoda dilupiIor in agarse realizeaza dilutii succesive din antibioticul testat in geloza Mueller-Hinton se insamanteaza
cultura bacteriana in spoturi
citire: eMI - concentratia cea mai mica care inhiba complet cre§terea sau apare maximum 0
colonie
E-testepe suprafata mediului de cultura solid §i insamantat se aplica :fa§iidin plastic impregnate ell
antibiotic in concentratie crescandii - la un capat concentratia este minima, Ia celalalt este
maxima; gradatiile sunt notate pe fa~ie;
incubare
Genul Staphylococcus
Stafiloeoci eoagulazo-pozitivi: S. aureus
Stafilococi coagulazo-uegativi (SCN) eu importanta clinica: S. lugdunensis, S. schleiferi, $.
hyicus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus
Produs patologic
portaj: secretie din cavitatea nazaHi anterioara, secretie faringeana, probe de pe tegumente
(zona axilara, perianala)
plagi, otite, infectii tegumentare => puroiul (S. aureus)
infectii urinare => urina (S. saprophyticus, S. aureus)
infectii gastro-intestinale, toxiinfectii alimentare => materii fecale, vomismente, alimente.
meningite => LCR
septicemie, febra puerperala => sange (S. aureus, SCN)
pneumonie => sputa.
infectii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM) , SCN meticilino-
rezistent
1. Examenul direct aI pp:
macroscopic: puroi cremos, filamentos, galbui.
microscopic: coloratia Gram: coci gram (+), dispu~i in gramezi asemanatoare
ciorchinilor de strugure
2. Izolare:
mediul de imbogatire: mediul hiperclorurat lichid
Chapman (Ch)
nepretentios, poate fi cultivat pe geloza simpla sau geloza sange
Incubare aeroba la 37°C, 18 - 24 ore.
3. Identificarea bacteriei:
- Caraetere morfotinetoriale: frotiu din cultura pura => coci Gram (+), in gramezi.
Caractere de cultura: col "S" cu pigment galben-auriu pana la citrin
Caractere biochimice:
catalaza +
oxidaza -
coagulaza libera +: S. aureus;
coagulaza libera -: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)
coagulaza legata + (clumping factor - CF): S.aureus, S. lugdunesis, S. schleiferi
producerea de DN-aza: S. aureus, S. schleiferi, S. hyicus
descompunerea manitolului - pe mediul Chapman => Ma(+); tulpini patogene;
producere de pigment: de la auriu la portocaliu, galben citrin (S. aureus, S.
lugdunensis, S. chromogenes, ~.a.)
producerea de hemolizine - pe geloza-sange
hemoliza ~ (S. aureus, S. haemolyticus, ~.a.)
nu prezinta hemoliza (majoritatea tulpinilor SCN)
Identificare pe baza rezistentei la novobiocina a S. saprophyticus
R. ag-ac: determinarea enterotoxinei produsa de stafilococ
4. Determinarea patogenitiitii:
in vitro: producerea de coagulaza, hemolizine, descompunerea manitolului
in vivo: inoculare la animale de laborator (cobai, iepure)
pentru identificarea sursei de infectie
- prin lizotip ie (determinarea sensibilitatii stafilococului fata de bactreiofagi; este 0 sensibilitate
stabilii a stafilococului)
- prin metode de biologie moleculara
Genu) Streptococcus
S. pyogenes
S. agalactiae
S. grup viridans
S. pneumoniae (Pneumococ)
S. pyogenes: secretie faringiana, secretie din leziuni tegumentare, siinge pentru serologie
S. agalactiae: secretie vaginala, secretia canalului cervical-la mama
LCR, sange, aspirat bron~ic - la nou-nascut
S. grup viridans: se gasesc in mod normal in seereiia faringiana; prin leziuni ale mucoasei
bueale pot patmnde in sange, cauzand endocardita subacuta la pacienii cu leziuni ale
endocardului valvular
Pneumococ: sputa, LCR, sange
1. Examen direct
a. Exam. macroscopic:
S. pyogenes, S. de gmp vilidans, enterococii - nu este necesar exam macroscopic
a produsului patologic
Pneumococ => sputa mginie
b. Exam. microscopic:
col GRAM: eoci gram(+)
o S. pyogenes: coci rotunzi, dispu~i in lanturi
o S. de gmp viridans: coci rotunzi sau ovalari dispu~i in laniUri
o Pneumocoeii: coci lanceolaii, dispu~i dip 10 eu capetele ascuiite spre
exterior ~i inconjurati de 0 capsula proprie.
2. lzolarca bacterici:
mediul de imbogatire: PIKE
Geloza-sange
Bulion-sange; Bulion ser; Bulion glucozat; Geloza ser
3. Identificare:
emt: (vezi anterior)
Caractere de eultura:
o eol "S" eu hemoliza ~ (clara, transparenta) => Streptoeoei ~-hemolitici
sensibilitate rata de
BACITRACINA - din peretele bacterian prin reacrii de
precipitare ~i aglutinare - stabilirea
grupelor Lancefield
Bila Optochina Inulina Esculina Rafmoza IS. de grup viridans Rezistent Rezistent - - + !
iI
Pneumoeoci Sensibil Sensibil + - - .~4. Antibiograma
Streptococul de grup A: ~i-a pastrat sensibilitatea fata de penicilina - nu se efectueaza
ABG (numai in situatii speciale, de ex. alergie la penicilina sau monitorizarea rezistentei'
la penicilina ~i alte antibiotice, lara comunicarea rezultatului)
Pentru ceilalti streptococi se efectueaza ABG
5. Evidentierea Ac
Streptolizina "0" = SLO= Ag => detennina fonnarea de Ac anti-SLO = ASLO
ASLO cre~te 'in primele 7 zile pana 'in saptamanile 3-4 dnd se mentine 'in platou ~i apoi
scade titrul pana la valori norrnale pana la 6 lun~ daea s-a intervenit eu un tratarnent
corespunzator (vindecare); sau poate sa creasca titrul Ac daea nu a fost tratat bolnavul sau s-
a produs 0 complicatie (RAA, afectare cardiaca, glomerulonefrita renala acuta, coreea minch
etc.).
Tehnica de lucru:
o dilutii suecesive ale serului bolnavului (Ae anti-SLO) ~i SLO (timp de reactie)
hematii
o daca exista Ac ace~tia se leaga de SLO, SLO se neutralizeaza: eritrocitele nu se
lizeaza => reactie (+).
o daca nu existi'i Ac => SLO lizeaza eritrocitele => hemoliza => reactie (-).
o Se cauta ultima eprubeta in care existi'i hematii nelizate => este titrul de Ac cautat.
Dg (+) la titrul de 1/200 UI/ml
Val < 1/200 ill/ml => nu exista infeqie streptococica
Val> 1/200 VI/ml => este infectie streptococica in evolutie.
- Ac anti-streptokinaza = ASK
- Ac anti-streptodornaza = ASD
Gen ulEnterococcusenterococii au fost inclusi initial in grupa D Lancefie1d a genului Streptococcus
in 1984, pe baza diferente10r genetice, genul Enterococcus s-a separat din genul
Streptococcus
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Podus patologic:urina
secretie uretrala, secretie prostatica, secretia canalului cervical
puroi din plagi
bila
materii fecale
sange
1. Examen direct
Exam. microscopic:
• se face doar pentru produsele pato10gice in mod normal sterile
• coci Gram +, ova1ari, mari, dispu~i in 1anturi scurte sau in dip10, imobili,
necapsu1ati, nesporu1ati
2. Izolarea bacteriei:
• geloza sange
• ABE (agar-bila-escu1ina)
• incubare la 37°e, 18 - 24 ore
3. Identificare:
Cmt: (vezi anterior)
Caractere de cultura:
o colonii S, <X hemo1itice sau nehemolitice
C. biochimice:
o cata1aza-
o oxidaza-
o rezistent 1abila
o hidrolizeaza esculina in prezenta a 40% hila sau saruri biliare
• pe mediu1 ABE - coloratie neagrii
-6-
o pe baza fermentiirii zaharurilor se pot impiirti in 5 grupe, in cadrul ciirora se
pot diferentia speciile tot pe baza fermentiirii zaharurilor
Esculina Xiloza Arabinoza
Enterococcus spp. + + +E. faeeium + - +
E. faeealis + - -
4. Identificare antigenica
latexaglutinare
5. Antibiograma
sunt germeni eu rezistenta creseuta la antibiotiee
antibiograma se efeetueazii obligatoriu
secretie uretraHi, secretie glande
Bartholini, secretie vaginaHi, secretie
prostatica
la femei se recolteaza in timpul sau
la sfar~itul cidului menstrual
secretie faringiana
secretie conjunctivali'i
urina
secretie faringiana
sange
LCR
Rezistenta: foarte sensibili la temperatura camerei, la uscaciune => recoltarea ~iinsamantarea
se fac la patul bolnavului!!!
1. Examenul microscopic:
coci Gram( -) sub forma de boaba de
cafea, dispu~i diplo
in infectii acute => se gasesc
intracelular
in infectii cronice => se giisesc intra-
~i extracelular
coci gram (-), dispu~i diplo
sunt capsulati
2. Izolarea: (sunt germeni foarte pretentio~i)
se insamanteaza imediat dupa recoltare
se inciilze~te mediulla 37°C
mediile de cultura utilizate: Geloza-chocolat, PElZER-STEFFEN, THAIER-MARTIN
• Incubarea se face cu CO2 obligatoriu 10% 24-48 ore la 37°C.
cc- col "S" friabile, asemanatoare perielor.
Incadrarea in genul Neisseria: Testul oxidazei => oxidazo( +)=Neisseria
Incadrarea in specie:
- Testul de umflare a capsulei => (+)=> N meningitidis => se stabile~te ~i serogruPlill
acesteia
- Fermentarea zaharurilor:
Gonococ Meningococ Neisserii saprofite
GLUCOZA + + +
MALTOZA - + + 1I
ZAHAROZA - - + I
Diagnostic rapid: bazat pe reactii Ag-Ac
- se pun in evidenta Ag meningococice direct din LCR
- Reaqii de precipitare inelara
- Reac!ii de aglutinare.
Produs patologic
• secre!ie nazo-faringiana - de la poarta de intrare• puroi -in otite, sinuzite• sputa - In pneumonii• LCR - In meningita
• sange - In septicemie
Recoltare ~i transport
• ! in meningita - recoltarea LCRo la patul bolnavuluio transport rapid la 37°C, este interzisa refrigerarea
• macroscopico LCR cu aspect purulent
• microscopico direct din pp. sau dupa centrifugare pentru concentrarea gerrneniloro frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen
• celule inflamatorii• cocobacili G-, capsulati. In culturi vechi l~i pierd capsula• izolati,in gramezi sau lanturi scurte, intraJextraleucocitar
• gerrnen pretentios• necesita incubare in CO2 10%, atmosfera umeda, 370C• necesita factori de cre~tere
o mediu Chocolato ! S. aureus produce factor de cre~tere V
• c.m.t.
• C.c.o colonii S sau Mo asemanatoare cu picaturile de rouao coloniile sunt mai numeroase in jurul coloniilor de S. aureus (satelitism)
• c. biochimiceo indol pozitive (majoritatea)o fermenteaza inconstant zaharurileo in prezent se folosesc teste API
• identificare antigenicao identificarea Ag capsular K
• reactii de umflare a capsulei• RIP, ELISA, latexaglutinare
• identificarea ANo se folosesc sonde nucleotidice produse comercial
Diagnostic serologic
• folosit pentru verificarea raspunsului imun dupa vaccinare
• ELISA, RIA
Antibiograma
• obligatorie• se face pe medii speciale (Haemophilus test medium - HTM)
Produsul patologic
falsa membrana, secretie faringiana,
secrelie nazala la purtatori
secretie conjunctivaH'i, vulvara, din plagi
Recoltarea se face cu 3 tampoane
1. eu primul tampon se efectueaza 3 frotiuri
frotiu colorat Gram - pentru observarea morfologiei ~idispozitiei spatiale
o C. diphtheriae - bacil Gram pozitiv, u~or Incurbat, cu capetele maciucate, dispus
caracteristic (litere chineze~ti, chibrituri aruncate pe masa)
frotiu colorat Neisser - pentru evidentierea corpusculilor metacomatici Babe~-Ernst
o C. diphtheriae - prezinta corpusculi metacromatici la capete
frotiu colorat Giemsa - pentru diagnosticul diferential cu angina fuso-spiralara
o pe frotiu se evidentiaza fusobacterii ~i forme spiral ate (Treponema vincenti)
2. Tamponul al doilea se insamanteaza pe mediul de imbogapre oeST
incubare 12-18 ore, dupa care se izoleaza pe medii caracteristice
3. Tamponul al treilea se descarca pe medii de cultura folosite pentru izolare, identificare
mediul Loffier - colonii caracteristice, circulare, u~or crenelate, alb-galbui
geloza sange - colonii albe-gri, perlate, friabile
mediul Gundel Tietz - se diferentiaza cele trei tipuri de bacil difteric
o tipul gravis - colonii negre, de tip R, plate, cu margini crenelate, centrol
mamelon at, cu striatiuni radiare, ca 0 "floare de margareta",
o tipul mitis - colonii negre, de tip S
o tipul intermedius - colonii de tip S-R
bulion: tipul gravis - formeaza pelicula la suprafata,restul mediului ramane clar
o tipul mitis - tulbura uniform mediul
o tipul intermedius - formeaza inella suprafata, depozit ~i tulbura uniform mediul
Caractere biochimice
producerea de H2S - se studiaza pe mediul PISU (cu cistina)
fermentarea zaharurilor
o In funciie de fermentarea glucozei, maltozei ~i zaharozei, bacilii difterici
se pot Incadra In specie (c. difteriae, hoffmanii, xerosis)
o in funciie de fermentarea dextrinei, amidonului ~i glicogenului, ti
incadram In tip (gravis, mitis ~i intermedius)
Caractere de patogenitate - cercetarea producerii de exotoxina difterica
teste in vivo
teste in vitro
o testul Elek - reaciie de precipitare In gel
• se toarna geloza peste 0 hfutie de filtru impregnatii fn ser antidifteric
• se insamanieaza In striuri tulpinile de cercetat
• daca 0 tulpina produce exotoxina difterica (Ag), aceasta este eliberata Jhmediu ~i apare 0 banda de precipitare
o testul Ramon - reactie de floculare prin care se dozeaza putere toxica a toxinei
Diagnosticul indirectIDR Shick - IDR de neutralizare
o se injecteaza strict intradermic 1 unitate de toxina
• dad organismul nu are anticorpi, toxina i~i exercita efectul eritematos ~i la
locul inocuIarii apare un eritem - organism receptiv.
• dadi organismul are anticorpi, ace~tia vor neutraliza toxina, deci nu apar
modificiiri la locul inoculiirii - organism imun
Bacillus anthracis -diagnosticul de laborator al infectiei dirbunoasc
in dirbunele cutanat - exudat din pustula maligna
In carbunele intestinal - materii fecale
In carbunele pulmonar - sputa
In formele septicemice - sange
pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe
o bacB Gram pozitiv, cu capetele retezate sau u~or concave, a~ezati in lanruri, Cll
aspect ce imita trestia de bambus.
o pe medii solide - colonii de tip R cu suprafata rugoasa, centrul ombilicat, margini
dantelate Cll prelungiri laterale (cap de Medusa)
diagnostic diferential fata de alti germeni din genul Bacillus (B. cereus)-6-
o sensibilitatea la penicilina - B. Anthracis este sensibil, B. cereus esterezistent
sensihilitatea fata de bacteriofagi
4. Diagnostic retrospectiv
reaclia Ascoli - reaqie de precipitare inelara
o evidenliaza prezenla antigenelor in fragmente de organe recoltate de la cadavre
Recommended