caracterización de las proteinas

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PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE

LAS PROTEINAS.

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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.

2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).

3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.

4)Fraccionamiento cromatográfico.

Principio de separación Tipo de cromatografíaForma y tamaño Filtración por gelCarga neta Cromatografía de intercambio iónico.Punto isoeléctrico CromatoenfocadoHidrofobicidad Cromatografía de interacción

hidrofóbicaCromatografía en fase reversa

Función biológica Cromatografía de afinidadAntigenicidad InmunoadsorciónContenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas

inmobilizadasGrupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalenteCapacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos

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Eliminacion de moleculas chicas por dialisis.Se requiere, en general, despues de una precipitacion con sulfato de amonio.

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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.

2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).

3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.

4)Fraccionamiento cromatográfico.

Principio de separación Tipo de cromatografíaForma y tamaño Filtración por gelCarga neta Cromatografía de intercambio iónico.Punto isoeléctrico CromatoenfocadoHidrofobicidad Cromatografía de interacción

hidrofóbicaCromatografía en fase reversa

Función biológica Cromatografía de afinidadAntigenicidad InmunoadsorciónContenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas

inmobilizadasGrupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalenteCapacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos

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FILTRACION POR GEL

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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.

Se explota el hecho de que todaproteina es capaz de interaccionar

con uno o mas ligandos. Fijandolos a una matriz, se puede

purificar selectivamente a la proteina en estudio.

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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE

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Purificacion step TotalProtein

Totalactivity

SpecificActivity

Purificationfactor

Yield

Cell-free extractConA-SepharoseMono QMono P

mg

227.5 5.6

0.67 0.36

unitsa

56.0043.7525.9514.70

unitsa/mg

0.246 7.8138.7340.83

Fold

1 31.75 157.44 165.97

%

100 78.1

46.34 26.25

Tabla de purificacion y determinacion de homogeneidad proteica.

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ELECTROFORESIS.

V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en un campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carganeta de la proteína. f = 6πηr es el coeficiente friccional. η es la viscosidad del medio.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas

(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE): IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.

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Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)

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DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.

Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)

Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa).

A) Proteína nativa:

1) Ultracentrifugación.

2) Filtración por gel.

3) Espectrometría de masa.

B) Subunidad:

1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

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SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.

Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína purificada. La purificación puede consistiren obtener la proteína pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como una bandadiscreta en un gel de SDS-PAGE.

Para secuenciar una proteína siempre se la debefragmentar para obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por distintos procedimientos. Estafragmentación se hace enzimáticamente (proteasas) o químicamente (p.ej.: BrCN).

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Luego pueden aplicarse dos métodos:

1) Método de Edman:

Previa separación de los péptidos por HPLC en fase reversa, secuenciarlos químicamente por reacción con el reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, en un secuenciador automático.

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1er.Ciclo

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3er.

DEGRADACION DE

EDMANREACCION DEL

RESIDUO N-TERMINAL CON ISOTIOCIANATO

DE FENILO

1er. Ciclo

2o. Ciclo

3er. Ciclo

Secuenciaciónautomática porel Método de

Edman

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2)Espectrometría de masa (MS):

2a) Sin separar los péptidos, determinar las masas de un ciertonúmero de los mismos por MS e identificar a la proteína en los bancosde datos por comparación con las masas de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Optimo cuando el genoma del organismo del cual proviene la proteína está completamentesecuenciado.

2b) Seleccionar un péptido determinado por MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las masas de los fragmentosresultantes (MS/MS, espectrometría de masa en tandem con cámarade colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente , Post Source Decay).

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Espectrometría de Masa• La Espectrometría de Masa es una técnica que

permite determinar la masa de moléculas por mediode la medida de la relación masa/carga (m/z).

• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de ionesmoleculares en fase gaseosa.

• Cada molécula puede originar iones molecularescon distinto número de cargas ( y distintas m/z).

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Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:1) Fuente de iones.

2) Analizador de masas.

3) Sistema de detección y adquisición de datos.

Técnicas actuales para trabajo biológico:1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida pormatriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)

2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisisde masas por cuadrupolo)

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Espectrometrode masa,

MALDI-ToF

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DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA.

La estructura terciaria de las proteínas puede determinarse por dos métodos principales:

Cristalografía de rayos X.

Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR).

Cristalografía de rayos X: Requiere la obtención de cristales de la proteína, de calidad suficiente como para que, al irradiarlos con rayosX, se pueda obtener la información suficiente para reconstruirmatemáticamente la estructura tridimensional de la proteína, aplicandola transformada de Fourier. Actualmente se utiliza fundamentalmentela radiación X generada en un sincrotrón, que tiene un espectro ampliode logitudes de onda y acorta mucho el tiempo de exposición de los cristales a la radiación. Además se los enfría durante la irradiación, lo cual aumenta su estabilidad. Cuello de botella: la obtención de cristales adecuados.

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DIFRACCION DE RAYOS X.

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(A)Fotografia de un cristal de mioglobina.

(B) Fotografia de la difraccionde un cristal de mioglobina.

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(A) Fotografia del Partenon; (B) esquema de difraccion optica del Partenon; (C y D) imagenes reconstruidas del Partenon a partir de (B). En (D) se usaron mas datos y esomejora la calidad de la imagen.

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2) NMR de proteínas: Se basa en las propiedadesmagnéticas de átomos como el 1H o el 13C. Requiereel uso de aparatos de NMR de alta potencia (hasta 800 MHz). Utiliza proteínas en solución concentrada, por lo que no se requiere su cristalización. Pero es aplicablea proteínas de tamaño relativamente pequeño, hastaunos 30 kDa.

En los casos en que se ha hecho la comparaciónexperimental, la estructura de una proteínadeterminada por ambos métodos es muy similar. Ellose debe a que lo cristales tienen una alto contenido de agua, y la conformación que adopta la proteína serámuy similar a la que tiene en solución.

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PROPIEDADES MAGNETICAS DE ISOTOPOS NUCLEARES

Isótopo Spin Abundancia natural1H 1/2 99.98 %13C 1/2 1.108 %15N 1/2 0.37 %31P 1/2 100 %

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LAS INTERACCIONES INTERNUCLEARES (COUPLINGS)

PROVEEN INFORMACION ESTRUCTURAL.

Pueden ser:

1) Dipolares (a través del espacio):

Dan distancias internucleares.

2) Escalares (a través de uniones químicas):

3) Dan los ángulos dihedros.

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ESPECTROS DE NMR UNIDIMENSIONAL.

(A) Espectro de 1H-NMR del etanol. (B) Espectro de 1H-NMR de un fragmento (55 residuos de aminoacidos) de una proteina.

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El efecto nuclear Overhauser (NOE) permite identificar pares de protones que se encuentran muy cercanos. (B) Espectro NOESY (Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy). Los picos fuera de la diagonal indican que los protones 2 y 5 estan cercanos (a menos de 4 A de distancia).

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Espectro NOESY para un dominio de 55 residuos de aminoacidos.

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Modificacion post-traduccional de las proteinas.Muchas proteinas sufren modificaciones, ya sea por proteolisis parcial, o por modificacionquimica de residuos de aminoacidos. Como el DNA solo predice el aminoacido original, las modificaciones solo se detectan por quimica de proteinas.