А.С. Спирин

Молекулярная биология:

Лекция 2.

Мир РНК

19 февраля 2014 г.

Функции РНК

ДНК

РНК

Белки

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

Кодирующая функция:программирование белкового синтеза

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

(1) Показано, что РНК (как и ДНК!) могут служить матрицей для собственного воспроизведения через комплементарные цепи РНК:

1962-1964 – открытие самовоспроизведения полиовирусной РНК в животных клетках (D. Baltimore).

1965-1966 – открытие самовоспроизведение РНК бактериофагов типа R17 и MS2 в бактериальных клетках (S. Spiegelman).

(2) Показано, что РНК могут служить матрицей для синтеза ДНК:

1970 – открытие обратной транскрипции (H.M. Temin, D. Baltimore).

ДНК

РНК

Белки

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

Кодирующая функция:программирование белкового синтеза

Репликативная функция: копирование генов, обратная транскрипция, саморепликация

БИОПОЛИМЕРЫ

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ:

Линейная последовательность мономеров в цепи

кодирование,

репликация.

ПОЛИПЕПТИДЫ (БЕЛКИ):

Свернутая структура трехмерный рисунок поверхности

трехмерное узнавание лигандов,

катализ.

A. S. Spirin (1960) On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol. 2: 436-446.

КОМПАКТНОЕ СВОРАЧИВАНИЕ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК

КОМПАКТНОЕ СВОРАЧИВАНИЕ ЦЕПИ тРНК В СПЕЦИФИЧЕСКУЮ ТРЕТИЧНУЮ СТРУКТУРУ

J.D. Robertus, J.E. Ladner, J.T. Finch, D. Rhodes, R.S. Brown, B.F.C. Clark and A. Klug (1974) Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature 250: 546-551.

S.H. Kim, F.L. Suddath, G.J. Quigley, A. McPherson, J.L. Sussman, A.H.-J. Wang, N.C. Seeman and A. Rich (1974) Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science 185: 435-440.

Atomic model of yeast phenylalanine tRNA

ТРЕТИЧНЫЕ СТРУКТУРЫ ДВУХ РИБОСОМНЫХ РНК В СОСТАВЕ РИБОСОМЫ

M.M. Yusupov, G.Zh. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T.N. Earnest, J.H.D. Cate, H.F. Noller (2001) Science 292: 883-896

16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ РНК (РИБОЗИМЫ)

(1) Открытие природных рибозимов:

K. Kruger, P.J. Grabowski, A.J. Zaug, J. Sands, D.E. Gottschling and T.R. Cech (1982) Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequences of Tetrahymena. Cell 31: 147-157.C. Guerrier-Takada, K. Gardiner, T. Marsh, N. Pace and S. Altman (1983) The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857.

(2) Создание искусственных рибозимов:

D.L. Robertson and G.F. Joyce (1990) Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature 344: 467-468.Reviewed in: T.R. Cech and B.L. Golden (1999) Building a catalytic active site using only RNA. In The RNA World, 2nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL Press, New York.

•Гидролиз фосфоэфирных связей•Трансэстерификация •Лигирование и полимеризация нуклеотидов, в том числе на матрице ДНК или РНК •Алкилирование и аминоацилирование нуклеотидов•Синтез амидных (пептидных) связей между аминокислотами•Транспептидация•Синтез углерод-углеродных связей

Разнообразие активностей природных и искусственных рибозимов:

ФУНКЦИЯ УЗНАВАНИЯ МАЛЫХ ЛИГАНДОВ (СУБСТРАТОВ)

(1) E. Cundliffe (1986) Involvement of specific portions of ribosomal RNA in defined ribosomal functions: A study utilizing antibiotics. In Structure, Function, and Genetics of Ribosomes (Eds. B. Hardesty and G. Kramer), p.p. 128-142. Springer-Verlag, New York.«До сих пор не подозреваемая способность РНК узнавать малые молекулы».

(2) Открытие и создание аптамеров. Методология SELEX’a.А. Ellington and J. Szostak (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822.C. Tuerk and L. Gold (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Science 249: 505-510. (3) Демонстрация специфических взаимодействий природных РНК с малыми молекулами.D. Fourmy, M.I. Recht, S.C. Blanchard and J.D. Puglisi (1996) Structure of the A site of E. coli 16S rRNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science 274: 1367-1371.

Трехмерные структуры комплексов РНК с аминогликозидными антибиотиками.(a) Paromomycin-A-site RNA complex. (b) Tobramycin-RNA aptamers complex.Reproduced from J.D. Puglisi and J.R. Williamson (1999) In The RNA World, 2nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL Press, New York.

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ РНК 

(1) Кодирующая функция:

программирование белкового синтеза линейными последовательностями

полирибонуклеотидов.

(2) Репликативная функция:

репликация генетического материала через комплементарные

последовательности полинуклеотидов.

(3) Структурообразующая функция (формирование трехмерных структур):

само-сворачивание линейных полирибонуклеотидов в уникальные

компактные конформации.

(4) Функция специфического узнавания лигандов:

специфические пространственные взаимодействия с другими

макромолекулами и малыми лигандами.

(5) Каталитическая функция:

специфический катализ химических реакций рибозимами.

Таким образом, рибонуклеиновые кислоты способны осуществлять

все основные функции, свойственные как ДНК, так и белкам.

Следовательно, ансамбли молекул РНК с разными взаимодополняющими функциями

могут быть самодостаточными в качестве ассимилирующих, метаболизирующих,

структурообразующих и реплицирующихся систем, т. е. быть прототипами живых систем.

Таким образом, рибонуклеиновые кислоты способны осуществлять

все основные функции, свойственные как ДНК, так и белкам.

Следовательно, ансамбли молекул РНК с разными взаимодополняющими функциями

могут быть самодостаточными в качестве ассимилирующих, метаболизирующих,

структурообразующих и реплицирующихся систем, т. е. быть прототипами живых систем.

МИР РНК:

САМОДОСТАТОЧНОСТЬ!

ОДНОПОЛИМЕРНЫЙ ЖИВОЙ МИР – ДРЕВНИЙ МИР РНК?

ПРОИСХОЖДЕНИЕ СОВРЕМЕННОЙ ЖИЗНИ НА ОСНОВЕ ДРЕВНЕГО МИРА РНК?

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ЖИЗНИ

«В теплом маленьком пруду, содержащем наборы аммонийных и фосфорных солей, при наличии света, тепла, электричества, и т.п., можно представить себе химическое образование белкового компонента, который бы далее подвергался еще большему усложнению…; в наши дни такой материал был бы немедленно съеден или поглощен, чего не случилось бы, пока не образовались живые существа».

Ч. Дарвин, 1871

DARWIN POND: “a small lake or pond with soluble compounds accumulating from a surrounding drainage area”.S.J. Mojzsis, R. Krishnamurthy and G. Arrhenius (1999) Before

RNA and after: Geophysical and geochemical constraints on molecular evolution. In: The RNA World, 2nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), p.p. 1-47. CSHL Press, New York.

«ДАРВИНОВСКИЙ ПРУД»:

Небольшое озерко или прудик с

растворимыми компонентами из

окружающей дренажной области.

Происхождение жизни по А.И. Опарину (1924)

А Б И О Г Е Н Н Ы Е А М И Н О К И С Л О Т Ы

П О Л И П Е П Т И Д Ы ,т р ан сп еп ти д а ц и я

Б Е Л К Ис у н и ка л ь н ы м и т р ех м ер н ы м и

ст р у кту р ам и

К Л Е Т К И

О б р а зо ван и е н ад м о л екул я р н ы х

ст р у кту р , р азд е л е н и е ф а з

К ат а л и ти ч е ск и еак ти в н о с ти ,

Ф Е Р М Е Н Т Ы

К ат а л и ти ч е ск и а кти в н ы е К О А Ц Е Р ВАТ Ы

А сс и м и л я ц и я ,р о ст,

р азм н ож ен и е

АБИОГЕННЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

S.L. Miller (1953) A production of amino acids under possible primitive Earth conditions. Science 117, 528-529.

H2 + CH4 + NH3 + H2O

H2N-CHR-COOH

H2N-CHR-CONH2

H2N-CHR'-CONH2 + H2N-CHR''-COOH = = H2N-CHR'-CO-NH-CHR''-COOH + NH3

Происхождение жизни из древнего мира РНКGilbert, W. (1986). Origin of life: The RNA world. Nature 319, 618.

А Б И О Г Е Н Н Ы ЕР И Б О Н У К Л Е О Т И Д Ы

П О Л И Р И Б О Н У К Л Е О Т И Д Ы

К ат а л и ти ч е с к и е ак ти в н о с ти(р и б о зи м ы )

С ам о п р о ц е с си ру ю щ и е с я и с ам о р е п л и ц и ру ю щ и е с я

м о л екул ы Р Н К

С и н те з бе л к а

К О А Ц Е Р ВАТ Ы

О Л И Г О Р И Б О Н У К Л Е О Т И Д Ы ,т р ан с эс те р и ф и кац и я

К Л Е Т К И

• Возникновение и существование мира РНК на Земле требовало жидкой водной среды с нейтральной рН и растворенными солями одновалентных металлов (в первую очередь K+ и Na+) и Mg2+.

• Скорее всего, мир РНК мог возникнуть и существовать в мелких водоемах (лужах, «дарвиновских прудах»), где могли концентрироваться абиогенно возникающие органические вещества (океанские просторы едва ли годились для этого).

• Появление и присутствие РНК-репликазной активности в водной среде РНК-содержащей лужи или пруда должно было давать в результате эффект амплификации всех олиго- и полирибонуклеотидов этого водоема, т.е. рост общей популяции молекул РНК.

Древний мир РНК

DNA RNA Proteins

RNA Proteins

RNA

Ancient RNA world as precursor of life

on the Earth

(1) Цепи РНК в растворе при температурах от 5° до 37°C время от времени обмениваются частями своих последовательностей; обмен может осуществляться как между разными молекулами (транс-перестройки), так и внутри одной и той же молекулы (цис-перестройки).

(2) Эти перестройки не специфичны по отношению к последовательности и могут происходить в любом месте цепей.

(3) В отличие от рибозимных и ферментативных реакций, 3´-гидроксилы не участвуют в спонтанной реакции, а части РНК реагируют друг с другом внутренними районами.

(4) Реакция зависима от присутствия Mg2+.

(5) Скорость спонтанных перестроек – одно событие в час на миллиард нуклеотидов; это означает, что 0.002% – 0.02% цепей РНК с длиной 800 – 8000 нуклеотидных остатков спонтанно перестраиваются в популяции РНК в течение 24 часов.

Итак, реакция не требует никаких других компонентов, кроме самой РНК и Mg2+, и, таким образом, может рассматриваться как присущее РНК химическое свойство и должна происходить повсюду в живой и неживой природе.

“Spontaneous rearrangements in RNA sequences”

H.V. Chetverina, A.A. Demidenko, V.I. Ugarov and A.B. Chetverin

FEBS Letters 450: 89-94 (1999)

Мир РНК:Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная длина полирибонуклеотидов и непрерывная генерация вариантов

Мир РНК:Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная длина полирибонуклеотидов и непрерывная генерация вариантов –

Появление полирибонуклеотидов-рибозимов с различными каталитическими активностями, включая:

рибозимы, катализирующие реакции синтеза предшественников нуклеотидов и самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов), и

рибозимы, катализирующие комплементарную репликацию полирибонуклеотидов(РНК-полимеризующие рибозимы).

Мир РНК:Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная длина полирибонуклеотидов и непрерывная генерация вариантов –

Появление полирибонуклеотидов-рибозимов с различными каталитическими активностями, включая:

рибозимы, катализирующие реакции синтеза предшественников нуклеотидов и самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов), и

рибозимы, катализирующие комплементарную репликацию полирибонуклеотидов(РНК-полимеризующие рибозимы).

Реплицирующаяся («размножающаяся») популяция разнообразных и разнообразящихся полирибонуклеотидов – «прудовая коммуна РНК».

Проблемы:

       

        Прудовая коммуна полирибонуклеотидов! («РНК-Солярис»). «От каждого – по способностям, каждому – по потребностям»!

        Идентификация функционально лучших? Удержание «гена» и «признака» рибозима и его продукта вместе?

Отсев «негодных»? отбор нужных и лучших? дальнейшая эволюция?

Мир РНК:Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Чтобы естественный отбор начал работать, необходима какая-то форма компартментализации - обособления отдельных ансамблей РНК, в которых рибозимы и их продукты удерживались бы вместе. Только тогда естественный отбор мог отличить те РНК, чей продукт лучше, и те ансамбли, чьи РНК функционально лучше дополняют друг друга.

Лучшие обособленные ансамбли РНК – первозданные особи – должны расти быстрее других, перерастать других, тем самым обеспечивая отбор лучших.

КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ КАК НЕОБХОДИМОЕ УСЛОВИЕ ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА И ЭВОЛЮЦИИ

ОБОСОБЛЕНИЕ(КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ):

Структурная агрегация?

Коацервация?

Мембранная оболочка!?

RNA COLONIES ON A GEL SURFACE:replicable RNA molecules (RQ RNAs) are air-borne

Petri dish was closed Petri dish was open for 1 hour

1 hour incubation at 25º C with replicase

A.B. Chetverin, H.V. Chetverina and A.V. Munishkin (1991)On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qβ replicase. J. Mol. Biol. 222, 3-9.

Если различные молекулы РНК и РНК-реплицирующий рибозим оказываются в одном месте на влажной твердой поверхности в результате подсыхания лужи, то, при наличии необходимых органических и энергетических субстратов для их синтеза на поверхности или вокруг, они могут начать амплифицироваться и формировать смешанные колонии РНК.

 

Мир РНК:

Смешанные колонии на твердых средах

 

Такая смешанная колония-ансамбль должна включать молекулы РНК, обладающие различными, необходимыми друг для друга активностями, а именно:

 Лиганд-связывающие молекулы РНК для избирательной адсорбции необходимых веществ из окружающей среды и их накопления (концентрирования) в колонии.

Набор рибозимов, катализирующих метаболические реакции для синтеза предшественников нуклеотидов и самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов).

Рибозим, катализирующий комплементарную репликацию всех РНК колонии (РНК-полимеризующий рибозим).

Мир РНК:

Смешанные колонии на твердых средах

Смешанные колонии РНК на твердых или полутвердых поверхностях и могли быть первыми эволюционирующими бесклеточными ансамблями, где одни молекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали структуры, необходимые для успешного существования (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами, ответственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза РНК.

Такая бесклеточная ситуация создавала условия для очень быстрой эволюции: колонии РНК не были отгорожены от внешней среды и могли легко обмениваться своими молекулами – своим генетическим материалом.

КОЛОНИИ РНК КАК ПЕРВИЧНЫЕ ОСОБИ

(1) Когда функционально различные молекулы РНК, включая РНК-реплицирующий рибозим, оказываются в одной луже, вся популяция РНК количественно увеличивается, а благодаря реакциям спонтанной трансэстерификации (реакция Четверина) и ошибкам репликации увеличивается и разнообразие молекул.

(2) Когда лужа подсыхает, молекулы РНК оказываются на влажной поверхности глины или другого минерального субстрата, и при наличии в данном месте молекулы РНК-реплицирующего рибозима и нескольких других молекул РНК, обеспечивающих связывание нужных веществ и катализ нужных реакций, образуется и растет смешанная колония РНК; наиболее успешные колонии (т.е. колонии с наиболее активными и лучше всего дополняющими друг друга молекулами РНК) растут быстрее других.

(3) Последующее затопление подсушенного водоема или его части растворяет колонии, и в общем водоеме опять начинается общая амплификация, но уже в популяции, обогащенной «хорошими», т.е. активными и функционально дополняющими друг друга молекулами.

Таким путем чередующиеся затопления и подсушивания РНК-содержащих водоемов (луж) обеспечивают систематическое обогащение популяции РНК функционально лучшими молекулами («систематическая эволюция путем экспоненциального обогащения»).

СЦЕНАРИЙ ПЕРВОБЫТНОГО SELEX’a

ABIOGENOUS RIBONUCLEOTIDES  

OLIGORIBONUCLEOTIDES, TRANSESTERIFICATION

POLYRIBONUCLEOTIDES, RECOMBINATIONS 

LIGAND RECOGNITIONS, CATALYTIC ACTIVITIES    

CATALYTIC REPLICATION OF RNAs:COMMUNAL RNA POOL IN A “DARWINIAN PUDDLE”

  DRYING OUT

  

SELECTION OF APT RNAs:GROWTH OF MIXED RNA COLONIES ON MOIST SOLID SURFACE

   

RIBOCYTES    ORIGIN OF PROTEIN SYNTHESIS,

UNIVERSAL GENETIC CODE; ORIGIN OF DNA

PROGENOTES

CELLS, ORGANISMS

FLOODING

RNA WORLD:Evolution by

cycles of replication -

selection

ORIGIN OF MODERN LIFE

“UNIVERSAL ANCESTOR”

BIRTH AND EVOLUTION OF RNA WORLD:

КОНЕЦ ЛЕКЦИИ

Именно таким путем чередования стадий размножения и селекции мог развиваться и эволюционировать древний мир РНК.

Две ипостаси этого мира РНК сосуществовали и переходили друг в друга:

коммунальные сообщества размножающихся и разнообразящихся индивидуальных молекул РНК, растворенных в водной среде луж, где реализовался принцип «от каждого по способностям, каждому по потребностям», и

конкурирующие особи в виде смешанных колоний РНК, временно существующих и растущих на влажных поверхностях.

Две ипостаси древнего мира РНК

Эволюционный процесс должен был быть исключительно быстрым благодаря трем обстоятельствам.

(1) Непрерывные спонтанные рекомбинации и перестройки молекул РНК, а также низкая точность примитивных механизмов репликации, обеспечивали широчайшее поле вариантов для отбора.

(2) Свободный латеральный перенос и обмен молекулами РНК между колониями через воду и атмосферу делал любые полезные инновации достоянием всех и позволял колониям быстро совершенствоваться в течение короткого времени их существования.

(3) Экспоненциальное обогащение всей популяции «лучшими» молекулами РНК в циклах амплификации-селекции создавало мощный эволюционный двигатель для всего коммунального мира РНК в целом.

ВЫСОКАЯ СКОРОСТЬ ЭВОЛЮЦИИ ДРЕВНЕГО МИРА РНК

Отсутствие клеточной стенки (внешней мембраны).

Отсутствие трансляции (синтеза белков).

Поле вариантов РНК благодаря спонтанным перестройкам.

Латеральный перенос молекул РНК –

Быстрое распространение любых инноваций;

Очень высокий темп эволюции.

Коммунальное сообщество, эволюционирующее как целое.

Именно это сообщество, а не отдельная колония или возникшая из нее клетка, было универсальным предшественником, из которого выросли разные филогенетические ветви клеточных организмов, с универсальным генетическим кодом.

 

Колонии РНК как универсальный коммунальный предшественник мира живых существ

(Ср. с «прогенотами» C. Woese (1998) The Universal Ancestor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6854-6859.)

ОТ КОЛОНИЙ РНК К РИБОЦИТАМ

Колонии РНК, которые приобрели свойство синтезировать или адсорбировать на себе какие-то гидрофобные вещества, покрывающие их снаружи и удерживающие весь ансамбль вместе в водной среде даже во взвешенном, оторванном от поверхности состоянии, получали колоссальные преимущества, сохраняя свои эффективные функциональные наборы молекул после затоплений. Это уже был прообраз клеточной организации.Такие ограниченные оболочкой ансамбли молекул РНК, обладающих разными адсорбирующими и каталитическими функциями, были названы рибоцитами (M. Yarus).

В первичных рибоцитах отсутствовала ДНК и белки – это были так называемые «одно-полимерные системы» (single-polymer systems). Благодаря многообразию функций РНК и самодостаточности РНК как омнипотентного полимера, рибоциты могли жить, размножаться, конкурировать друг с другом и эволюционировать.

Решающим моментом в эволюции рибоцитов было возникновение аппарата синтеза белка. Белки гораздо эффективнее РНК и как структуро-образующие полимеры, и как катализаторы. «Изобретение» аппарата белкового синтеза (трансляции) на основе РНК значительно усовершенствовало структуру и метаболизм рибоцитов и, тем самым, дало им громадный эволюционный импульс.

Аппарат белкового синтеза строится на основе рибосомы, которая является универсальной белок-синтезирующей машиной во всем живом мире. Ее универсальность доказывает, что вся современная жизнь началась с рибосомы.

Рибосома могла возникнуть путем объединения предсуществовавших разнофункциональных коротких РНК, когда-то оказавшихся в одном месте, в одной колонии или рибоците, и вместе давших этой колонии или рибоциту новое функциональное качество.

Имеются все основания предполагать, что первобытная рибосома состояла только из РНК.

Вполне вероятно, что рибоцит мог обходиться всего одной рибосомой для синтеза своих, поначалу немногочисленных, белков.

«ИЗОБРЕТЕНИЕ» БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА В РИБОЦИТАХ:ВОЗНИКНОВЕНИЕ РИБОСОМЫ