מגישים: חגית פיליפ ורונן ביאלסקי

מנחה: ד"ר דורון גרבר

פיתוח תוכנת עיבוד תמונה לניתוח תוצאותפיתוח תוכנת עיבוד תמונה לניתוח תוצאותMicrofluidicsMicrofluidicsניסויים המבוצעים במערכות ניסויים המבוצעים במערכות

DNADNAלחקר אינטרקציות חלבון-חלבון / חלבון-לחקר אינטרקציות חלבון-חלבון / חלבון-

סדנה לפרוייקטיםהמגמה לביולוגיה חישובית

אוניברסיטת בר-אילן2010אוגוסט

מדוע חוקרים אינטרקציות חלבון-חלבון ?DNAוחלבון-

רשתות בקרהנושא מרכזי בביוכימיה, בחקר מעבר אותות, חקר •

תהליכים ביולוגיים רבים מאוד מבוססים על אינטרקציות בין חלבונים•

, פולימראזות, נוקלאזותפקטורי שעתוק: DNAחלבונים קושרי •

מודלים של התאולבניית בביולוגיה מערכתית הבנת האינטרקציות חיונית •

2

פיתוח אנטיביוטיקות חדשות ו"מלחמה" בוירוסים

3

וירוסים משתמשים ברשתות אינטראקציה מורכבות מאוד ליצירת ממשק עם שלו כדי שיבצע את "מבוקשם". machineryהמארח ולחטיפת ה-

הוירוסים משפיעים על רשתות המארח ברמות הגנום, הטרנסקריפטום והפרוטאום.

על ידי מיפוי רשתות האינטראקציה של חלבונים ויראליים עם המארח, ניתן יהיה לגלות את הממשקים בין וירוסים למארחים שלהם.

כיצד נוכל להשפיע או "לכבות" את הממשקים האלה בין וירוסים למארח?

והחסרונות שיטות לחקר האינטראקציות בין חלבונים שלהן

• yeast two-hybrid (Y2H) לא ניתן להשתמש בשיטה עבור חלבונים –false positiveממבראנליים, שיעור גבוה של תוצאות

סינון על בסיס אפיניות עם ספקטרומטריה – פרוצדורות אגרסיביות של •שטיפה המשפיעות על רגישות השיטה

– קשה לזהות אינטרקציות חלשות או microarray שיטות מבוססות •ארעיות

4

?Microfluidicsמה זה תחום העוסק בחקר ההתנהגות ומניפולציה של נפחים זעירים של נוזל - •

ננוליטרים או פיקוליטרים.

מהיישומים העיקריים של מיקרופלואידיקה הוא מחקר בתחום הביולוגיה •המולקולרית, בפרט על ידי שילוב מערכות מיקרופלואידיות עם

microarrays.

PING (protein interaction networkמערכת ה-generator)

לאיתור in vitro לביצוע ניסויים מרובי תפוקה microfludics פלטפורמת •אינטראקציות בין חלבונים.

, המכיל תבנית DNA מולקולות 2 מערך שעל גבי כל תא שלו הודפסו •המקודדת לחלבונים, מיושר ומחובר עם המתקן המיקרופלואידי.

על הצ'יפ, יחד עם מבחן אפיניותin vitro סינתזת חלבונים •.in situמיקרופלואידי

( בעקבות שטיפות,prey מדידת אינטראקציות ללא איבוד ה"פתיון" )•יכולה לזהות אינטראקציות חלשות או ארעיות בין חלבונים.

5

PINGשלבי הניסוי במערכת ה-( שמים נוגדן אשר מזהה את chamberעל פני אזור מעגלי שבתוך כל תא )1(

חלבון ה"פתיון".

,E. Coli על ידי מילוי כל תא עם מיצוי של in vitroמבטאים חלבונים 2( שהודפס.DNAהמאפשר שעתוק ותרגום של ה-

מודדים אינטראקציות בין "פתיון" ל"חכה" על ידי נוגדנים מסומנים 3(פלורוסנטית.

6

יתרונות השיטה

על גבי מתקן יחיד ניתן לבטא אלפי קומבינציות של חלבונים, ללא צורך •( או יידע מוקדם לגבי המצב האוליגומרי של החלבון.purificationבטיהור )

מונע סיבוכים הנגרמים בגלל החיּות והפיזיולוגיה של in vitroביטוי חלבונים • מאפשרת מדידה ביופיזיקלית ישירה של אינטראקציות עבור PINGתאים,

חלבונים שונים.

כל תגובה מתרחשת בתא נפרד - אין מגבלות הנובעות כתוצאה מ"זיהום •( או דיפוזיה.cross-contaminationסביבתי" )

7

:microarrayהתוצאות המתקבלות מניסויי

עוצמת האור בכל תא מעידה על חוזק • החלבונים שנמצאים 2האינטראקציה בין

בו.

כל ניסוי מכיל אלפי זוגות חלבונים.•

תוכנה המנתחת את המידע המתקבל •מניסויים אלה.

8

PING )microfluidics(

Microarray

מדוע לא ניתן להשתמש בתוכנות קיימות?

הן בעלות אופי מיוחד:PINGהתמונות המתקבלות מניסויים בשיטת

נקודות האור בתמונה מופיעות בגדלים שונים 1.

9

מדוע לא ניתן להשתמש בתוכנות קיימות?

הן בעלות אופי מיוחד:PINGהתמונות המתקבלות מניסויים בשיטת

. טבעת אפלה2

10

11

יצירת תוכנה שיודעת:

לאתר את אזורי התגובה בתמונה.1.

להוציא את המידע המספרי עבור אזורי התגובה.2.

ליצור טבלה המכילה את המידע לגבי עוצמות האור 3.שנאספו מאותם אזורים.

12

MATLABפיתחנו את התוכנית ב-

13

קלט התוכנית: – קובץ עבור כל ערוץ קריאה באורך גל TIF קבצי תמונה מסוג 2

מסוים )ערוץ ירוק וערוץ אדום(

פלט התוכנית:טבלת אקסל שבה מפורטות עוצמות האור של הנקודות שבתמונות

14

התמונה המקורית:

15

לאחר יצירת הגריד:

16

לאחר מחיקת העיגולים הגדולים:

תחילה אנו מגבירים את ניגודיות התמונה, כך שהנקודות יהיו ברורות יותר.

17

.matlab של edge detectionלאחר מכן אנו מפעילים את פונ' ה-

18

הסרה של נקודות בודדות

19

מילוי חורים )במידה ויש לנו צורה סגורה, אנו "ממלאים" אותה(

20

ומעלה( שחורים גם כן.5מחיקה של תאים שרוב השכנים שלהם )

21

ביצוע תהליך של "סחיפה". תהליך זה מתרחש באופן הבא: עבור תא מסוים, שכניו ולוקחים את הערך המינימאלי מביניהם )ניתן לעשות את 2מסתכלים על

אותו התהליך אך לקחת את הערך המקסימאלי(. ערך זה יהיה הערך החדש של שכנים 2התא עליו עבדנו. באופן זה אנו בעצם מוחקים את כל התאים שאין להם

לבנים.

22

תהליך ניקוי אחרון ו.. סיימנו! התקבלה תמונה מושלמת! כמעט.. טוב נו.. אף אחד לא מושלם..

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

ד"ר דורון גרבר

• Gerber D, Maerkl SJ, Quake SR. "An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks" Nature Methods 6:1 Jan 2009 10.1038/NMET.המקור

• Hong JW, Chen Y, Anderson WF, Quake SR. "Molecular Biology on a Microfluidic Chip" J. Cond. Matt. Phys . 2006 18 )18(:S691-S701 May 10 2006