医院感染及其实验诊断

临床微生物学实验室在医院感染控制中的作用

赵 虎

上海复旦大学附属华东医院检验科

医院感染及其实验诊断主要内容

医院感染的概念与特点

临床微生物学实验室的作用

微生物检验的流程

医院感染的控制原则

医院感染及其实验诊断

一、医院感染的概念、 特点与临床类型

医院感染及其实验诊断( 一 )概 念

医院感染日趋严重。目前我国每年大约有 5000 万住院病人 ,其中约有 500 万患者出现医院感染（ 10% 左右的发病率）。

每年造成的额外的医疗消费约 100 亿人民币。

医院感染及其实验诊断（一）概 念

医院感染（ nosocomial infection ），又称医院获得性感染（ hospital acquired infection ）

广义定义：是指所有人在医院内接触病原体所获得的一切感染。

狭义定义：特指住院病人在住院期间受病院微生物侵袭引起的感染（入院时不存在、也没有处在感染潜伏期；出院后发病，证实住院期间感染者）。

医院感染及其实验诊断概 念

流行（ epidemic ） 某医院或病区在一定时间内，某种医院感染病例不断发生，其发病率与平常或往年相比，具有显著性升高（ P>0.05 ）

暴发（ outbreak ） 短时期内某病区或病人群体中突然发生数例（ 3例或以上）同种同源病原体引起的感染，又称病例集聚性发生。暴发是医院感染流行的一种方式。

医院感染及其实验诊断概 念

医院感染发病率、医院感染主要致病菌和医院感染病原菌的耐药绿的统计分析方法：

同一患者同一部位取第一次送检样本，痰和咽拭同时送检仅取其一，以阳性者计。

同一患者不同部位分别统计。

医院感染及其实验诊断（二）特 点

病原学

感染来源

易感宿主

医院感染及其实验诊断1. 病原学

微生物种类：细菌、病毒、真菌、 寄生虫

细菌种类：条件致病菌细菌来源：主要来自病人细菌的量：引起健康人和病人感染 所需的细菌的量差别很大不同时期主要病原菌不同

医院感染及其实验诊断

MRSA

肠球菌念 珠 菌

不同时期引起医院感染的主要微生物

医院感染及其实验诊断病原菌分布 细菌名称 百分比（ % ）

1 铜绿假单胞菌 30.722 大肠埃希菌 14.683 嗜麦牙窄食单胞菌 11.154 肺炎克雷伯菌 9.845 金黄色葡萄球菌 7.456 肠球菌 6.887 鲍曼不动杆菌 3.538 阴沟肠杆菌 2.799 劳菲不动杆菌 1.9910 洋葱伯克霍德菌 1.38

医院感染及其实验诊断2. 感染来源

内源性感染 病人本身的正常菌群引起。

外源性感染

病人身体以外的微生物。

医院感染及其实验诊断

病原微 生物储源 （ 病 人，

带 菌 者， 环 境〕

空气传播 间接传播（工作人员护理、便盆、尿壶等） 直接接触

注射或接种（污染的血液制品、各种液体） 医疗器械未彻底灭菌或污染 昆虫媒介

外源性传播途径

医院感染及其实验诊断3. 易感宿主

主要是由于各种原发疾病导致机体抵抗力低下的住院病人。

医院感染及其实验诊断（三）临床类型

呼吸道感染：误吸、气管切开、血源泌尿道感染：留置导尿胃肠道感染：口服抗生素所致菌群失调伤口感染：手术器械或医护人员手污染， 胃肠道、泌尿生殖道或皮肤 正常菌群污染血液感染：输液、血透或拔牙、手术等皮肤和软组织感染：直接接触

医院感染及其实验诊断（四）与传染病比较

医院感染 传染病 病原学 病原体 条件致病菌为主 典型致病菌 耐药性 常呈多重耐药 不如前者突出 病原学诊断 不易判断 较易判断 流行病学 感染来源 内源性＋外源性 外源性 传播方式 常为特殊方式 常见途径 感染对象 病人，尤其免疫低下人群 健康人群 爆发频率 医院内严重 社会爆发多 传染性 低 高 隔离意义 保护性隔离 病原性隔离 临床疾病学 临床表现 复杂和不典型 单纯和典型 诊断 定性、定量、定位分析 临床和流行病学分析， 治疗 较难 较易

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二、微生物学实验室在医院感染控制中的作用

医院感染及其实验诊断

医院感染的病原学诊断爆发流行时的分型鉴定抗菌药物的合理使用医院感染的流行病学调查环境细菌的检测消毒灭菌效果评价

微生物实验室的作用

医院感染及其实验诊断（一）医院感染的诊断

临床症状与体征发热局部症状：咳嗽咳痰、尿路刺激症状、腹痛腹泻等

局部体征：肺部罗音、局部压痛等影像学检查实验室检查（血象、 C 反应蛋白等）病原学检查

医院感染及其实验诊断病原学诊断

染色镜检—有无细菌培养鉴定—细菌的种类（活菌）血清学诊断—细菌、病毒的种、型分子生物学诊断—细菌病毒的种类病原菌分型技术—血清型或生物型

医院感染及其实验诊断病原学诊断

从病人体内的标本中分离培养出病原菌（致病菌或条件致病菌）是诊断医院感染的最重要的指标（金标准）。•确定感染•确定感染部位•确定感染的来源

医院感染及其实验诊断（二）病原菌分型

在医院感染流行暴发时，对病原菌除做到种的鉴定外 ,还必须做到型的鉴别 ,即分型技术，以确定从不同病人、不同病房或不同病区分离到的同一种细菌为同一传染源。

医院感染及其实验诊断病原菌分型

细菌分型技术表型分型（抗菌谱等） ——简单，但重复性差，分辨率低

基因型分型 ——重复性好，分辨率高

医院感染及其实验诊断病原菌分型 —基因分型

基因型分型质粒指纹图谱DNA 探针随机扩增 DNA 多态性分析 (RAPD)脉冲场凝胶电泳 (PFGE)

医院感染及其实验诊断基因分型 —质粒指纹图谱

•质粒分析的间接分子生物学技术•包括用琼脂糖凝胶电泳检测细菌的质粒特征和采用限制性内切酶对质粒 DNA做同源性分析

•简单快速•质粒属于染色体外 DNA，易丢失或不稳定•无质粒的菌株不能分型

医院感染及其实验诊断基因分型 —质粒指纹图谱

医院感染及其实验诊断基因分型 — DNA 探针

•是指能识别特异性碱基系列的一小段单链DNA分子，与被测定的核苷酸互补。

•通过 DNA-DNA 杂交，探查受检标本中有无某种微生物特有的 DNA 片段，获得病原学诊断。

•标记了同位素的标准株 DNA 探针同待测菌株 DNA 进行杂交，再进行琼脂糖电泳和转移，以测定杂交株的 DNA区带。

医院感染及其实验诊断基因分型— RAPD （随机扩增 DNA 多态性分析）

•一种 PCR方法•对病原菌染色体的某一部分特性进行分析，检测基因组 DNA 多态性的方法

•运用技术简单、快速、方便•受人为因素影响多：引物序列、离子浓度、退火温度

•分辨力和重复性相对低

医院感染及其实验诊断基因分型— RAPD （随机扩增 DNA 多态性分析）

医院感染及其实验诊断基因分型— PFGE （脉冲场凝胶电泳）

• 目前所有分型方法中的金标准•理想的感染流行监测手段•利用稀有酶切位点对病原菌完整染色体组酶切片段行多态性分析

•从整体上反映不同菌株全部基因的相关性

医院感染及其实验诊断基因分型—— PFGE （脉冲场凝胶电泳）

•制好的胶块可较长期保存，再次研究时可方便地直接电泳加以分析

•方便流行病研究 •结果易于判断，重复性好，特异性、敏感性高

•缺点：仪器要求高、试剂费用高、实验周期长

医院感染及其实验诊断基因分型—— PFGE （脉冲场凝胶电泳）

医院感染及其实验诊断（三）抗菌药物合理使用

我国严重地存在着抗菌药物使不合理甚至滥用的现象 ,据调查在我国住院病人中：

• 80% 患者给予抗菌药物 ,• 14%(4%-34%) 有药物敏感试验结果• 86%经验用药 加强与临床的联系 ,及时采集标本进行细菌鉴定及药物敏感试验 ,以减少临床抗菌药物的不合理使用。

医院感染及其实验诊断 1. 药敏试验目的与指征

临床分离菌株必须进行常规药敏试验以提供临床选择药物时参考。

临床因治疗的反应差而考虑更换抗菌药物时。

了解所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁情况。

评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性。

对细菌耐药谱进行分析和分型有助于某些菌种的鉴定，并作为医院感染流行病学调查的手段之一。

医院感染及其实验诊断1。

细菌可通过基因突变、质粒介导和转位因子插入等，产生抗生素灭活酶、改变细菌细胞膜的结构或抗生素结合位点等，使抗生素失去对其杀灭或抑制作用，从而产生对抗生素的耐药性。

2. 耐药机制

医院感染及其实验诊断耐药机制

产生灭活酶：如 -内酰胺酶等水解酶和乙酰转移酶等钝化酶。

抗菌药物渗透障碍：细菌细胞壁和细胞膜结构对阻止抗生素进入菌体起重要作用，如铜绿假单胞菌突变株因缺乏 D2膜孔蛋白而对碳青霉烯类耐药。

抗生素主动外排机制：有些细菌的外膜上有特殊的药物泵出系统。

药物作用靶位的改变：改变细菌细胞膜上或菌体内抗生素结合靶位，使之不易与抗生素结合。

代谢途径改变

医院感染及其实验诊断3. 药敏试验临床意义

指导临床合理选择敏感的抗菌药物，及时控制细菌感染。

减少不必要的抗菌药物的使用，降低治疗费用，也降低对病人机体的损害。

减少耐药菌株的产生。辅助鉴定细菌。

医院感染及其实验诊断4. 实验方法

纸片扩散法（ disk diffusion test）

定性测定稀释法（ dilution test） 定量测定E试验法（ E test） 定量测定

医院感染及其实验诊断5. 耐药酶的检测

-内酰胺酶（ - lactamase ）超广谱 -内酰胺酶（ ESBLs ）Amp C -内酰胺酶（ AmP C 酶）耐甲氧西林葡萄球菌（ MRSA）耐万古霉素肠球菌（ VRE）

医院感染及其实验诊断（四）流行病学调查

定期（ 3-6月）向临床科室反馈病原谱及细菌耐药性检测结果。

多种全自动微生物分析系统的专家系统，如 MicroScan ，能够自动分析病原菌的种类、排序和比例，分析各种细菌的耐药率以及耐药率的变迁。

医院感染及其实验诊断流行病学调查

信息反馈的内容医院感染的主要病原菌种类，包括革兰阳性和革兰阴性常见病原菌的种类，尤其非发酵菌的比例。

产酶（ ESBLs 、 Amp C和 MRSA 等）率。主要病原菌（革兰阳性和革兰阴性菌）耐药率。

医院感染及其实验诊断流行病学调查

信息反馈的意义了解引起医院感染的常见菌的种类，包括革兰阳性和革兰阴性细菌的类型及各自的比例。

了解抗生素的敏感程度和耐药趋势。经验用药的依据。控制耐药率快速升高的抗生素的使用，减少耐药菌株的产生。

医院感染及其实验诊断

检测空气、水源、物体表面、医护人员手部等部位细菌的含量、种类等。

——了解医院感染的传播途径。检测消毒后物品的含菌量和细菌的种类

——评价消毒灭菌的效果

（五）环境细菌的检测

医院感染及其实验诊断 1.空气的监测

检测空气中细菌的含量和种类

了解空气污染的程度

了解空气消毒的效果

判断医院感染的传播途径

医院感染及其实验诊断

沉降法采样监测 ——同一平面五个不同的点，打开平皿水平静置 30 min 。

采样器采样监测 ——空气采样器在同一平面五点采样。

空气的监测

医院感染及其实验诊断

检测物体表面细菌的含量和种类了解物体表面污染的程度了解物体表面消毒的效果判断是否为医院感染的传播途径

2. 物体表面的监测

医院感染及其实验诊断物体表面的监测

涂抹法 ——无菌棉拭， 5cm5cm 区域涂抹 10 次，放入定量无菌盐水中混匀、接种。

压印法 ——Rodac 平皿（直径 5cm,表面积 19.63cm2 ，培养基高出平皿 1～ 2mm ），直接压贴在待查物体表面 10～ 20s 。

医院感染及其实验诊断

目的通过定性和定量检查，了解手部细菌污染情况

评价手的清洁和消毒效果方法涂抹法压印法

3.手部检测

医院感染及其实验诊断

细菌总数标准

病原体指标

4.环境细菌监测 的卫生学标准

医院感染及其实验诊断

表 1 各类环境中的细菌总数卫生学标准环境类别 范围 空气 物体表面 医务人员手 （ CFU/m2 ） （ CFU/m2 ） （ CFU/m2)

I类 ① 10 5 5II类 ② 200 5 5III类 ③ 500 10 10IV类 ④ － 15 15①层流洁净手术室、层流洁净病房；②普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌区、 烧伤病房、重症监护病房；③儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室的清洁区、 重症抢救室、化验市、各类普通病房；④传染病科及病房。

1 ）细菌总数标准

医院感染及其实验诊断2 ）病原体指标

物体表面和医务人员手：婴儿室、儿科病房－－不得检出沙门菌；内科、外科、妇产科－－不得检出铜绿假单胞菌；

空气：各科室、门诊－－乙型链球菌不超过 20/m3；外科、妇产科－－不得检出铜绿假单胞菌。

凡消毒后的医疗用品不得检出病原菌；凡灭菌后的用品不得检出任何微生物。

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高压蒸汽灭菌

紫外线消毒

化学消毒剂消毒

（六）消毒效果的评价

医院感染及其实验诊断1. 高压蒸汽灭菌

生物指标的监测为直接检查灭菌效果，通常应用嗜热脂肪芽胞杆菌（ NCTC 10003 ，或 ATCC 7953 ）。

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生物学监测用枯草芽胞杆菌黑色变种（ ATCC9372 ）。

要求对试验微生物的杀菌率达到 99.9% 以上。

2.紫外线消毒

医院感染及其实验诊断3.化学消毒剂消毒

消毒剂使用过程中污染细菌的监测稀释中和法：加入相应浓度的中

和剂，中和消毒剂的杀菌作用。滤膜过滤法：用火棉胶微孔滤膜

（孔径 0.22~0.45µm ）过滤、洗涤、培养。

医院感染及其实验诊断

消毒剂应用效果的监测常用菌种：金葡 ATCC6538 ，大肠 ATCC8099 绿脓 ATCC9027 ，枯草 ATCC9372 白念 ATCC10231培养基：细菌－营养琼脂 真菌－沙保培养基方 法：定性试验 定量试验

化学消毒剂消毒

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三、微生物检验的流程

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标本采集原则标本采集方法

（一）标本采集与处理

医院感染及其实验诊断1. 标本采集原则

及时采集无菌操作立即送检定量或半定量培养药敏试验分级报告和限时报告

医院感染及其实验诊断2.标本采集方法

血液标本上呼吸道标本尿标本粪便标本

医院感染及其实验诊断（ 1）血液标本

1 ）送检指征①症状指征发热： 高热（ 39C以上），拌有明显 的 毒血症状，以间歇迟张热多见。皮疹： 革兰阴性菌—瘀点 伤寒—玫瑰疹 斑疹伤寒—暗红色斑丘疹肝脾肿大：革兰阴性菌败血症关节疼痛：革兰阳性菌神志昏迷或休克：革兰阴性菌毒血症状

医院感染及其实验诊断血液标本

②疾病指征化脓性病灶或损伤粘膜损伤性疾病肝脏疾病糖尿病血液疾病及恶性肿瘤呼吸道感染或呼吸衰竭：吸入或血源长期输液或导管介入疾病血液透析患者

医院感染及其实验诊断血液标本

2）标本采集① 采血时间与次数 抗菌药物治疗前 发热初期或高峰期； 连续 2～ 3 次。②采血部位：肘静脉 , 同时对侧采血 (最好同时做厌氧菌培养）

采集方法：注射器，最好是负压针 采血量：成人 5-10ml ，儿童 1-2ml

医院感染及其实验诊断（ 2）上呼吸道标本

1）送检指征①症状指征 咳嗽： 痉挛性、持续性—日咳

咳痰： 铁锈色痰—大叶性肺炎 黄粘痰—细菌感染 咯血： 痰中带血或泡沫血痰 呼吸困难：肺源性，常拌胸痛 发热： 稽留热—大叶性肺炎 长期低热—肺结核

医院感染及其实验诊断

②疾病指征 肺炎 支气管炎 气管炎 肺脓肿 肺结核 白喉 百日咳

上呼吸道标本

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2 ）标本采集①采集时间痰：晨痰 支扩或有空洞者作体位引流 抗生素治疗前咽拭子：晨起后、进食前 抗生素治疗前

上呼吸道标本

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②采集方法痰液标本 自然咳痰法—晨起后清水反复漱口后 无痰或痰少者可雾化吸入 支气管镜采集法— 气管穿刺或直接肺穿刺—厌氧菌培养咽拭子 晨起后漱口，用无菌棉拭子涂抹咽后壁

上呼吸道标本

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中段尿：最常用两侧肾盂尿：单侧肾脏感染膀胱穿刺：厌氧菌培养

（ 3）尿标本

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自然排便：最常用

直肠试子：排便困难 或婴儿

（ 4）粪便标本

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染色镜检分离培养生化鉴定血清学鉴定体外药敏试验

（二）微生物学检查

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直接镜检 湿片法或悬滴法，观察细菌动力。 革兰染色镜检 革兰阳性－紫色；革兰阴性－红色 抗酸染色镜检 抗酸菌－红色 其它特殊染色镜检 a.荚膜染色； b.鞭毛染色； c.异染颗粒染色

1. 染色镜检

医院感染及其实验诊断2. 分离培养

1 ）培养基的选择• 增菌培养基：肉汤、碱性蛋白胨水• 基础培养基：营养琼脂、 M-H琼脂• 选择培养基：麦康凯琼脂、 SS琼脂• 鉴别培养基：胆汁七叶苷琼脂• 厌氧培养基：厌氧血平板

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2 ）接种方法

•肉汤增菌：血液、脑脊液等•蛋白胨水增菌：粪便（弧菌）•平板划线接种：其他标本 （四区划线法）

分离培养

医院感染及其实验诊断分离培养

3 ）初代培养

•初代培养最好含 5～ 10％ CO2

（尤其是嗜血该菌、奈瑟菌等）

•35～ 37 C，培养 18～ 24h

（分枝杆菌 2～ 4w）

医院感染及其实验诊断

4 ）分离纯化

初代培养分不出单个菌落时应重新分区划线接种。

分离培养

医院感染及其实验诊断

利用细菌可以分解、发酵不同的底物（葡萄糖、乳糖等糖类，氨基酸、盐类等等），产生不同的代谢产物（酸性、碱性、产气等等）的特性，鉴定不同种类的细菌。

3.生化鉴定

医院感染及其实验诊断 4.血清学鉴定

观察待检菌株与已知抗体的凝集反应，鉴定各种细菌，并分型。（如沙门菌、志贺菌、致病大肠埃希菌、霍乱弧菌等抗血清。）

医院感染及其实验诊断(三 ) 体外药敏试验

纸片扩散法 最常用，定性检测稀释法（肉汤稀释法和琼脂稀释法） 繁琐，定量测定 MICE试验法 简单，定量测定 MIC，但价格昂贵

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四、医院感染的控制原则

医院感染及其实验诊断（一）医护人员的医德 和专业教育

医德医风教育自觉遵守各项无菌操作、 消毒隔离和洗手等制度。消毒隔离的专业培训

医院感染及其实验诊断（二）消毒灭菌质量控制

高压蒸汽灭菌效果化学消毒剂消毒效果不耐热医疗器械消毒效果药品无菌血液污染控制

医院感染及其实验诊断（三）合理使用抗生素

及早确立病原学诊断，根据细菌培养 和药敏结果及治疗情况调整用药；掌握对应药物的性能。如抗菌谱、抗 菌活性、药代、药动学、适应症、适 当剂量和不良反应等；根据患者生理、病理和免疫状态，合 理用药。

医院感染及其实验诊断（四）建立感染控制制度

各种诊疗手段的无菌操作制度保护性隔离制度重点区域卫生保洁制度合理使用抗生素制度

医院感染及其实验诊断

谢 谢 谢 谢