临床医学五年制

实验诊断学

许 建 成 讲师

一、标本采集和运送二、检测方法三、临床感染常见病原学实验诊断四、抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查五、医院感染的实验诊断

一、标本采集和运送

1. 基本原则

2. 各论

标本采集和运送基本原则

1. 采集的标本无外源性污染

2. 标本在应用抗菌药物或伤口局部处理前收集

3. 采集后及时送检

4. 不要在标本中添加任何防腐剂

5. 在检验申请单上医生应提供患者的临床资料

标本采集和运送各论

1. 血液标本

2. CSF 与其他无菌体液标本

3. 尿液标本

4. 呼吸道标本

5. 粪便标本

6. 泌尿生殖道标本

7. 创伤、组织和脓肿标本

1. 血液标本

采集时间：发热初期和高峰期 (≥38℃）或低温（≤ 36℃）

已用抗菌药物治疗者，在下次用药前采集采血量：

成人 5 ～ 10ml/ 次，婴儿和儿童 1 ～ 2ml/ 次

采集次数： 24小时内收集 2～ 3次采血部位：多次采血时应在不同的部位采集

2.CSF 与其他无菌体液标本

第一管（第二管）做微生物培养

运送：用带盖的无菌容器立即送检

培养：接种前应离心取沉淀或做增菌培养

3. 尿液标本

1. 中段尿：最常用 清洁外阴、包皮 消毒尿道口 留取中段尿

2. 肾盂尿采集法

3.耻骨上膀胱穿刺术

4.留置导尿管取尿法

应在用药前或停药 5 d 后留取标本，并使尿液在膀胱中停留 6 ～ 8h 以上

4. 呼吸道标本

1. 自然咳痰法：以清晨第一口痰为宜，留 出气管深处痰液

2. 支气管镜采集法：不宜接受3. 气管穿刺法：厌氧菌培养4. 鼻咽拭子

应在用药前或停药 1d 后留标本对较粘稠的标本，用胰蛋白酶消化后再接种

5. 粪便标本

1. 自然排便法：

取含脓、血或粘液的粪便

根据细菌种类选用合适运送培养基

2. 直肠拭子法

7. 创伤、组织和脓肿标本

创伤：首先清除污物，消毒皮肤

开放性脓肿：取脓液及病灶深部分泌物

封闭性脓肿：穿刺抽取厌氧培养

二、检测方法

（一）直接显微镜检查

（二）病原体分离、培养和鉴定

（三）病原体抗原检测

（四）病原体核酸检测

（五）病原体抗体检测

（六）细菌毒素检查

（一）直接显微镜检查

1. 不染色标本镜检

2. 染色标本镜检

1. 不染色标本镜检

1 ）普通光学显微镜检查：悬滴法或压滴法——观察细菌动力

2 ）暗视野显微镜检查法：检查细菌动力及螺旋体形态和运动

3 ）电子显微镜检查：观察病毒

2. 染色标本镜检

1) 单染色

2) 复染色

a. Gram 染色

b. 抗酸染色

3) 特殊染色a. 鞭毛染色b. 荚膜染色c. 细胞壁染色d. 异染颗粒染色e. 芽孢

4) 负染色

意义：观察病原体形态、染色性、特殊结构，宿主细胞内包涵体

革兰染色

抗酸染色

2. 染色标本镜检

1) 单染色

2) 复染色

a. Gram 染色

b.抗酸染色

3) 特殊染色a. 鞭毛染色b. 荚膜染色c. 细胞壁染色d. 异染颗粒染色e. 芽孢

4) 负染色

意义：观察病原体形态、染色性、特殊结构，宿主细胞内包涵体

2. 染色标本镜检

1 ）单染色

2 ）复染色① Gram 染色

② 抗酸染色

3 ）特殊染色① 鞭毛染色② 荚膜染色③ 细胞壁染色④ 异染颗粒染色⑤ 芽孢

4 ）负染色

意义：观察病原体形态、染色性、特殊结构，宿主细胞内包涵体

二、病原体分离、培养和鉴定

1. 培养基的选择

2. 细菌培养方式

3. 接种技术

4. 鉴定

（二）、病原体分离、培养和鉴定

1. 培养基的选择

2. 细菌培养方式

3. 接种技术

4. 鉴定

2. 细菌培养方式

1. 需氧培养：最常用的培养方式，适用于需氧菌和兼性厌氧菌

2. CO2培养： 5%-10% CO2,适用于苛氧菌

3. 厌氧培养：适用于专性厌氧菌

4. 微需氧培养：幽门螺杆菌、空肠弯曲菌

（二）、病原体分离、培养和鉴定

1. 培养基的选择

2. 细菌培养方式

3. 接种技术

4. 鉴定

3. 接种技术

1 ）液体接种法

2）划线接种法

3）平板划线法

4）斜面划线法

5）穿刺接种法

6）穿刺划线法

7）倾注培养法

（二）、病原体分离、培养和鉴定

1. 培养基的选择

2. 细菌培养方式

3. 接种技术

4. 鉴定

4.鉴定

1 ） 培养特征：菌落性状（大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）

2） 细菌的形态、染色性

3） 生化反应

4） 血清学鉴定

5 ） 动物学试验

4.鉴定

1 ） 培养特征：菌落性状（大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）

2） 细菌的形态、染色性

3） 生化反应

4） 血清学鉴定

5 ） 动物学试验

4.鉴定

1 ）培养特征：菌落性状（大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）

2）细菌的形态、染色性

3）生化反应

4）血清学鉴定

5 ）动物学试验

4.鉴定

1 ） 培养特征：菌落性状（大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）

2） 细菌的形态、染色性

3） 生化反应

4） 血清学鉴定

5 ） 动物学试验

（三）病原体抗原检测用已知抗体检测标本中未知的病原体抗原方法：免疫荧光法、酶免法、化学发光法、乳胶凝集试验

病原体抗原包括细菌菌体抗原、鞭毛抗原、毒素、侵袭性酶、病毒的衣壳蛋白、包膜抗原

（四）病原体核酸检测

检测技术： PCR、 DNA 探针杂交技术

应用于尚不能分离培养或很难分离培养的微生物检测

（五）病原体抗体检测

用已知病原体抗原检测患者血清中相应抗体

常用方法：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫测定、 ELASA

三、临床感染常见病原学实验诊断

1. 细菌感染检查

2. 真菌感染检查

3. 病毒感染检查

4. 寄生虫感染检查

5. 衣原体感染检查

6. 支原体感染检查

7. 立克次体感染检查

8. 性传播疾病检查

临床标本

鸡胚 组织培养 新生小鼠

8~6天 （试管或小瓶培养） 2~14天

收集尿囊液与羊囊液 用红细胞作血凝反应 1~14天

观察 检查 + － 再传代

细胞病变 红细胞吸附 空斑 病毒包涵体 病/死

EM + －

+ － + － + － + －

CF和(或) NT NT/HAd-I NT/空 NT/染色 IEM CF和(或)

HI 和(或)HI 和(或)HI 斑减少 (IF,IP,HE) HI或NT

分

离

初步鉴定

最后鉴定

三、临床感染常见病原学实验诊断

1. 细菌感染检查

2. 真菌感染检查

3. 病毒感染检查

4. 寄生虫感染检查

5. 衣原体感染检查

6. 支原体感染检查

7. 立克次体感染检查

8. 性传播疾病检查

四、抗菌药物敏感性试验 和细菌耐药性检查

（一）抗微生物药物敏感性试验（ AST） 常用 AST方法 AST选择与应用

（二）临床耐药菌检测

1. 常用 AST方法

1 ） K-B 纸片琼脂扩散法2）稀释法3） E试验4）联合药敏试验

常用并比较成熟的方法是 CLSI 推荐的方法

1 ） K-B 纸片琼脂扩散法

a）原理

b） 方法

c） 结果类别与解释

a) 纸片扩散法原理

将含有定量药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸 片周围抑菌浓度范围内测试菌生长被抑制形成无菌生长的透明菌即抑菌圈，它的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。

b)方法：通过测量抑菌圈直径来判断敏感和耐药。c)结果类别与解释Ⅰ. 敏感（ S）：被测菌能被测定药物常规剂

量抑制Ⅱ. 中介（ I）：作为“缓冲域”以防止由于

微小的技术因素失控所导致的结果解释错误

Ⅲ. 耐药（ R）：被测菌不能被组织或血液中抗菌药物常规剂量所抑制

1. 常用 AST方法

1) K-B 纸片琼脂扩散法2)稀释法3) E试验4)联合药敏试验

常用并比较成熟的方法是 CLSI 推荐的方法

2) 稀释法

a) 定量测定抗菌药物抑制细菌生长的体外方法b) 方法：肉汤稀释法、琼脂稀释法c) 结果类别与解释：结果以 MIC （ ug/ml ）数值

报告I. MIC ：所测得的某抗生素能抑制检测菌肉眼可见生长的最低浓度

II. MBC ：能杀死 99.9%测试菌的最低药物浓度

常用 AST方法

1) K-B 纸片琼脂扩散法2)稀释法3) E试验4)联合药敏试验5)一些特殊细菌的药物敏感试验

常用并比较成熟的实验室方法是NCCLS推荐的方法

3)E试验

a) 药敏试验的直接定量技术，结合稀释法和扩散法的原理、特点

b) 方法

c) 结果：直接定量出抗生素对检测菌的 MIC

常用 AST方法

1) K-B 纸片琼脂扩散法2)稀释法3) E试验4)联合药敏试验5)一些特殊细菌的药物敏感试验

常用并比较成熟的实验室方法是NCCLS推荐的方法

联合药敏试验

同时使用两种药物观察其对细菌的作用是否显著大于单独作用总和试验

协同作用：药效大于单个药物使用的总和

拮抗作用：药效小于活性较大药物的药效

2.AST选择与应用1) K-B 纸片琼脂扩散法：技术简单、所用试剂量少、

不需特殊设备、易于判断，自由选择用药，是临床实验室普遍使用的定性药敏试验。

2) 稀释法：定量药敏试验技术，易于标准化，但试验费时，多用于研究

3) E试验：直接定量药敏技术，结果准确、重复性好、操作简便易行，但试纸条昂贵，多用于研究

4) 联合药敏试验：费时费力，多用于研究

临床耐药菌检测

1. 耐甲氧西林葡萄球菌（ MRS ）检测

2. 耐青霉素肺炎链球菌（ PRSP）检测

3. 耐万古霉素肠球菌（ VRE）检测

4. 超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌（ ESBL）检测

五、医院感染的实验诊断1.定义：患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。

2.医院感染流行病学1.病原学2.感染源和易感人群3.常见的临床类型

3.医院感染病原学监测4.医院环境细菌监测和消毒灭菌效果监测

病原学

细菌为常见的病原体G －杆菌（肠杆菌科和非发酵菌）MRS凝固酶阴性葡萄球菌肠球菌厌氧菌

深部真菌病毒

感染源

1. 外源性感染

交叉感染：住院病人、医务人员、探视者、陪住人员

环境感染：医疗器械、血液制品的污染品

2. 内源性感染：病人自身正常菌群引起

常见的临床类型

1. 下呼吸道感染

2. 尿路感染

3. 手术切口感染

4. 胃肠道感染

5. 血液感染

6. 皮肤和软组织感染

下呼吸道感染为我国最常见的医院感染类型

发病机制：吸入咽部的定植菌

G+ 菌和 G_菌各占48%

80%与使用留置导尿管有关常以大肠杆菌、变形杆菌为主

尿路感染

清洁伤口大部分为外源性感染

腹部手术、妇科手术等伤口感染的病原体常来源于正常菌群

主要见于使用抗生素所致肠炎外科以艰难杆菌占多数

手术切口感染 胃肠道感染

由静脉输液、血液透析、外科手术、下呼吸道感染等引起

凝固酶阴性葡萄球菌、金葡菌、大肠杆菌

血液感染 皮肤和软组织感染

蜂窝织炎、褥疮、烧伤感染

金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌

常见的临床类型

1. 下呼吸道感染

2. 尿路感染

3. 手术切口感染

4. 胃肠道感染

5. 血液感染

6. 皮肤和软组织感染

结论

Right patient

Right timeRight antibiotic