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第三章 基因工程载体第三章 基因工程载体

载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的 DNA 大分子称之为载体（ vector ）。

2

作为一个理想的载体，应具备以下条件：作为一个理想的载体，应具备以下条件： （ 1 ）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；

（ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源 DNA片段插入其中；

（ 3 ）具有容易检测的筛选标记；

（ 4 ）载体 DNA的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；

（ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

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载体的种类：载体的种类：

1.克隆载体（ cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立 DNA文库和 cDNA文库，其上有复制子即可；

2.表达载体（ expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；

3.穿梭载体（ shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。

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第一节 质 粒第一节 质 粒

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一、质粒的一般特性一、质粒的一般特性 (( 一一 ) ) 质粒的分布、大小、数目质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地质粒广泛地分布分布于于原核原核生物细胞中，也存在于某生物细胞中，也存在于某些真核细胞些真核细胞（酵母的（酵母的 2μ2μ 环状质粒）。环状质粒）。

质粒质粒 DNADNA 分子量范围分子量范围为为 1—200×106Da1—200×106Da 。。 一个细胞内的质粒一个细胞内的质粒数量数量变化也很大，有变化也很大，有 11 至几个至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。的，也有几十个的，甚至有数百个。

（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有细胞只有 11 个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有胞中质粒有 10-20010-200 拷贝数。）拷贝数。）

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(( 二二 )) 质粒质粒 DNADNA 的的构型构型 三种不同的构型：三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为

共价闭合环形共价闭合环形 DNA(cccDNA)DNA(cccDNA) ，这样的，这样的 DNADNA 通常呈现超通常呈现超螺旋的螺旋的 SCSC 构型；构型；

如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA) 。。

若质粒若质粒 DNADNA 的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为为 LL 构型构型。 。

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单链切割 连接

单链切割 连接 共价闭合环形 DNA（ SC型）

开环 DNA（ oc型）

线性 DNA（ L 型）

环形双链的质粒 DNA分子具有三种不同构型

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(( 三三 )) 质粒质粒 DNADNA 的理化性质的理化性质

质数质数 DNADNA 具有一般核酸分子的理化特性。具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定在一定 pHpH 下可解离而带电荷下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。比较能抗切割和抗变性。

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(( 四四 )) 质粒质粒 DNADNA 的生物学特的生物学特性性 (1)(1) 寄生性：寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)(2) 稳定性：稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)(3) 同源性：同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)(4) 重组性：重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质

粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。色体之间的重组。

(5)(5) 不相容性：不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。间的相互干扰造成的。

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(6)(6) 传递性传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。的质粒带有一套与传递有关的基因。

(7)(7)消除性消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。将其去除。

(8)(8) 复制类型复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 质合成的严格控制。

(9)(9) 表现型表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。抗性等。

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(( 五五 )) 质粒的命名原则质粒的命名原则

19761976 年提出一种质粒命名的原则，用小写字母年提出一种质粒命名的原则，用小写字母pp 代表质粒，在代表质粒，在 pp 字母后面用两个大写字母代表字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如发现这一质粒的作者或实验室名称。如 pUC118, pUC118, 字母字母 pp 代表质粒，代表质粒， UCUC 是构建该质粒的研究人员是构建该质粒的研究人员的姓名，的姓名， 118118 代表构建的一系列质粒的编号。代表构建的一系列质粒的编号。

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二、组建理想质粒载体必须具备的条件二、组建理想质粒载体必须具备的条件 (( 一一 )) 质粒拷贝数较高质粒拷贝数较高 质粒拷贝数质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒个细菌细胞中所含有的质粒 DNADNA 分子的数目。分子的数目。

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根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：

严紧型严紧型

松弛型松弛型 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-6010-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒型”复制控制的质粒 (relaxed (relaxed plasmid)plasmid) 。。

低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-31-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒复制控制的质粒 (stringent plasmid)(stringent plasmid) ；；

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(( 二二 )) 分子量较小分子量较小

低分子量的质粒如下优点低分子量的质粒如下优点

•通常拷贝数较高通常拷贝数较高•克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大•限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。酶切点，便于制作酶切图谱。•外源外源 DNADNA 容量较大，容量较大，•容易转化，当质粒大于容易转化，当质粒大于 15kb15kb 时，将成为转化效率的时，将成为转化效率的制约因素。制约因素。•遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。

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(( 三三 )) 带有可供选择的标记带有可供选择的标记

常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性霉素抗性 (Ampr)(Ampr) 、卡那霉素抗性、卡那霉素抗性 (Kanr)(Kanr) 、四、四环素抗性环素抗性 (Tetr)(Tetr) 等，而且希望各抗性基因内有等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。若干单一的限制酶切点。

在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗抗性基因失活、性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。这样较易检查到克隆是否成功。

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β-β- 半乳糖苷酶筛选系统：半乳糖苷酶筛选系统： 载体上带有一个来自大肠杆菌的载体上带有一个来自大肠杆菌的 laclac操纵子的操纵子的 DNADNA 区段，这一区区段，这一区

段编码段编码 β-β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。 IPTG(IPTG(异丙基异丙基 --β-D-β-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 )) 可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的主细胞所编码的 β-β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补 (α-(α-互补互补 )) 。故暴露于诱导物。故暴露于诱导物 IPTGIPTG 的细菌含有编码的细菌含有编码 laclacZZ 的质粒可的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物 X-gal(5-X-gal(5-溴溴 -4--4-氯氯 -3--3-吲哚吲哚 -β--β-半乳糖苷半乳糖苷 )) 的培养基上生长，将形成蓝色茵落。的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入将一连串克隆位点克隆入 β-β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNADNA 插入质粒的多克隆位点后可使插入质粒的多克隆位点后可使 β-β-半乳糖苷酶的氨基端片段半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了灭活，从而破坏了 α-α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。子从空载体中筛选出来。

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lacZ

β- 半乳糖苷酶

分解半乳糖

i P O

调控蛋白P

大肠杆菌的 β- 半乳糖苷酶基因 lacZ 系统

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a- 互补显色反应（蓝白斑筛选）

lacZ -

β- 半乳糖苷酶 -

分解半乳糖

i P O

调控蛋白P

α- 肽段

分解 X-gal

产物呈现蓝色

诱导剂 IPTG

β- 半乳糖苷酶基因 lacZ 突变体 M15

19

互补显色反应互补显色反应

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(( 四四 )) 带有尽可能多的单一限制性酶切位点带有尽可能多的单一限制性酶切位点

单一的限制性酶切位点单一的限制性酶切位点可供外源可供外源 DNADNA 定点插入；定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点的多克隆位点 (MCS(MCS)) 即具有该功能。即具有该功能。

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( 五 ) 具有复制起始点 (origin, ori)

这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件．可使繁殖后的细胞维持一定数量粒拷贝数的重要元件．可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。的质粒拷贝数。

例如含例如含 ColE1ColE1或或 pMB1pMB1 复制起始点复制起始点的质粒即为的质粒即为松弛型质松弛型质粒粒。。

在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，穿梭质粒含有两个复制子，一个是一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。两类细胞中均能得到扩增。

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三、常用的质粒载体三、常用的质粒载体

pSC101pSC101 质粒载体是第一个成功用于克隆真核质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNADNA 的大肠杆菌质粒载体。的大肠杆菌质粒载体。

pBR322pBR322 是用人工方法构建的符合理想质粒载体是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。

(( 一一 )) 克隆载克隆载体体

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1. 质粒1. 质粒

重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体

松弛型复制 松弛型复制

pBR322

4363 bp

Origin of Replication

ROP

ROI

Sal I

BamH I

Tcr

Pvu I

Pst I

Pst I

EcoR ICla IHind III

Hind II

Bal I

Apr

pBR322 ：pBR322 ：

氯霉素可扩增氯霉素可扩增

拷贝数 50 - 100 / cell拷贝数 50 - 100 / cell

用于基因克隆 用于基因克隆

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25

2.pUC质粒载体

(1)来自 pBR322质粒的复制起点 (ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因 (Ampr)，但它的 DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；

(3)大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 (lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端 α-肽链的DNA序列 , 此结构特称为 lacZ1基因；

(4)多克隆位点 (MCS)区段：位于 lacZ 基因中的靠近 5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的 DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏 lacZ 基因的功能。

pBR322

4363 bp

Origin of Replication

ROP

ROI

Sal I

BamH I

Tcr

Pvu I

Pst I

Pst I

EcoR ICla IHind III

Hind II

Bal I

Apr

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pUC18 / 19 ：

pUC18 / 19 ：

拷贝数 2000 - 3000 / cell拷贝数 2000 - 3000 / cell

用于基因克隆和测序 用于基因克隆和测序

装有多克隆位点（ MCS）装有多克隆位点（ MCS）

正选择颜色标记 lacZ’正选择颜色标记 lacZ’

Bam HI

pU C182686 bp

Ap r

lacZ'

ori

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

396 452

EcoRI SstI KpnI Sm aI XbaI SalI PstI SphI HindIII

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pUC18pUC18 质粒载质粒载体体 优点优点 :: (1)(1) 具有更小的分子量具有更小的分子量 在基础上构建在基础上构建 pUCpUC 质粒载体时，仅保留下质粒载体时，仅保留下 pBR322pBR322 的氨卞青霉的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多．如素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多．如pUC8pUC8为为 2750bp2750bp，， pUC18pUC18为为 2686bp2686bp 。。

更高的拷贝数：更高的拷贝数： pBR322pBR322 质粒的复制起点内部发生了自发的质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即突变，即 roprop 基因的缺失。由于该基因编码的共基因的缺失。由于该基因编码的共 6363 个氨基酸组个氨基酸组成的成的 RopRop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得得 pUC8pUC8 质粒的拷贝数比带有质粒的拷贝数比带有 pMBlpMBl或或 ColE1ColE1 复制起点的质粒载复制起点的质粒载体都要高得多，体都要高得多，

平均每个细胞即可达平均每个细胞即可达 500-700500-700 个拷贝。所以由个拷贝。所以由 pUC8pUC8 质粒重组体质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆 DNADNA 分子。分子。

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(2)(2) 便于重组子的检测便于重组子的检测 ::

pUC18pUC18 质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌 laclac 操纵操纵子的子的 laclacZ’Z’ 基因，所编码的基因，所编码的 α-α- 肽链可参与肽链可参与 α-α-互补作用。因此，在应用互补作用。因此，在应用 pUC18pUC18 质粒为载体的质粒为载体的重组实验中，可用重组实验中，可用 X-galX-gal 显色法一步实现对重显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。组子克隆的鉴定。

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lacZ’lacZ’

N 端 C 端

缺陷型大肠杆菌

完整的 β- 半乳糖苷酶

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pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理

pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理

pUC18/19pUC18/19PlacPlac lacZ’lacZ’MCSMCS

b-半乳糖苷酶的 a-肽段

b-半乳糖苷酶的 a-肽段

aabb

O

HH

HOH

HOH

H OH

CH2OH

O

N

Cl

Br

Cl

Br

Cl

Br

O

N

N

5-溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 -b-D-半乳糖苷

5-溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 -b-D-半乳糖苷 X-galX-gal

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(3)(3) 具有多克隆位点具有多克隆位点 (MCS)(MCS) 区段区段

pUC18pUC18 质粒载体具有与质粒载体具有与 M13mP8M13mP8 噬菌体载体相同噬菌体载体相同的多克隆位点的多克隆位点 (MCS)(MCS) 区段，它可以在这两类载区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在因此，克隆在 MCSMCS 当当中的外源中的外源 DNADNA 片段，可以方便地从片段，可以方便地从 pUC18pUC18 质粒质粒载体转移到载体转移到 M13mp8M13mp8 载体上，载体上，

也正是由于具有也正是由于具有 MCSMCS 序列，可以使序列，可以使具两种不同粘具两种不同粘性末端性末端 (( 如如 EcoRIEcoRI和和 BamHl)BamHl) 的外源的外源 DNADNA 片段片段，，无需借助其它操作而直接克隆到无需借助其它操作而直接克隆到 pUCl8pUCl8 质粒载质粒载体上。体上。

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3.pGEM系列

总长度为 2743bp 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个 lacZ’编码基因

一段含有 EcoR I、 Sat I、 Kpn I、 Ava I、Sma I、 BamH I 、 XbaI、 Sall、 AccI、 Hinc I、 Pst II、 Sph I和 Hind II等识别序列的多克隆位点。

此序列结构几乎与 pUC18克隆载体的完全一样。

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pGEM系列与 pUC系列之间的主要差别

pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即 T7启动子和SP6启动子，它们为 RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。

由于这两个启动子分别位于 Lac z’基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别 T7或SP6启动子的 RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的 mRNA。

质粒载体 pGEM-3Z和 pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于 SP6和 T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。

pGEM-3Z：pGEM-3Z：

多拷贝多拷贝

装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子

装有多克隆位点（ MCS）装有多克隆位点（ MCS）

正选择颜色标记 lacZ’

正选择颜色标记 lacZ’

用于外源基因的高效表达 用于外源基因的高效表达

注意： T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合注意： T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合

2743

bp

2743

bp

MCSMCS

lac

Z’

lac

Z’ PT7PT7

oriori

AprApr

pGEM-3ZpGEM-3ZPSP6PSP6

酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如：酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如：E.coli BL21（ DE3）等E.coli BL21（ DE3）等

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( 二 ) 表达载体

条件：一个条件：一个强启动子强启动子及其两侧的及其两侧的调控序列调控序列 ;; 有有 SDSD 序列且该序列与起始密码于序列且该序列与起始密码于 ATGATG 之间要有之间要有合适的距离合适的距离

在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有源基因下游有转录终止子转录终止子等。等。

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1. pKK1. pKK 表达质粒载体表达质粒载体 pKKpKK启动子为启动子为 PtacPtac ，由大肠杆菌强启动子，由大肠杆菌强启动子 PtrpPtrp和和PlacPlac杂合组成。杂合组成。

pKK233-3pKK233-3 表达载体含有表达载体含有 tactac 启动子、启动子、 lacElacE的的RBSRBS、、 pUC18pUC18 的多克隆位点，在远端还有一个的多克隆位点，在远端还有一个 rrnBrrnB 的的转录终止信号。转录终止信号。

pKK233—2pKK233—2 ，它的特点是，它的特点是 RBSRBS 的下游的下游 88 个核苷酸处有一个核苷酸处有一个个 ATGATG序列，该序列，该 ATGATG 和它的前后核苷酸和它的前后核苷酸 (CCATGG)(CCATGG) 一一起又组成了起又组成了 Nco INco I位点，其后又有可供插入用的位点，其后又有可供插入用的 Pst Pst II 及及 HindIIIHindIII位点，最后接上位点，最后接上 rrn Brrn B 的转录终止信号。的转录终止信号。

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外源外源 DNADNA 可有可有 33 种插人法种插人法①①将将 Nco INco I位点切开补齐后与外源位点切开补齐后与外源 DNADNA平端连接；平端连接；②②如外源如外源 DNADNA亦含翻译起始亦含翻译起始 ATGATG，， Nco INco I位点则可直接位点则可直接连接，如为其他位点可加入连接，如为其他位点可加入 Nco INco I 接头后连接接头后连接 (( 使用使用 88 ，，1010或或 1212 个核苷酸的个核苷酸的 NcoINcoI 接头以获得正确的读码框接头以获得正确的读码框架架 )) ；；③③使用使用 Pst IPst I或或 HindHind皿位点，但此时会在表达蛋白的皿位点，但此时会在表达蛋白的N-N-末端增加末端增加 2-52-5 个氨基酸。较新的表达载体是个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-IpKK388-I ，它亦含有，它亦含有 tactac 启动子及启动子及 rrnBrrnB 抗终止序列、抗终止序列、RBSRBS 以及下游以及下游 88 个核苷酸处的个核苷酸处的 Nco INco I位点，紧接着是位点，紧接着是来自来自 pUCl8pUCl8 的多位接头，最后是的多位接头，最后是 rrnBrrnB 的转录终止信号。的转录终止信号。

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2.2.融合表达载体系统融合表达载体系统 组成成分：组成成分： 含有启动子含有启动子 (tac)(tac)及及 laclac 操纵基因、操纵基因、 SDSD 序列序列 谷胱苷肽巯基转移酶谷胱苷肽巯基转移酶 (GST)(GST) 基因，而克隆的外基因，而克隆的外源基因则与源基因则与 GSTGST 基因相连。当基因表达时，表达基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。

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该载体具有以下优点：

①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。 IPTG可诱导 tac启动子进行高效表达。②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶谷胱苷肽巯基转移酶 GST分子量为 25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。

40

③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶( 如凝血酶、 prescission protease， Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及 DNA蛋白质相互作用的研究等。

41

QIAexpress 6×His表达系统

该系统为 Ni-NTA基质对带 6 个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，

优点：① 6×His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把 6×His切除。②生理 pH条件下 6×His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。③因5×His免疫原性差，所以无需去除 6×His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。

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第二节噬菌体载体第二节噬菌体载体

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一、一、 λλ 噬菌体噬菌体

λλ 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。

基因组长度：约为基因组长度：约为 50kb50kb 的双链的双链 DNADNA 分子，实际分子，实际大小为大小为 48502bp48502bp 。。

DNADNA 是线状双链分子带有单链的互补末端，末端是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长长 1212 个核苷酸，称为粘性末端，简写个核苷酸，称为粘性末端，简写 coscos，， 1212个碱基的序列为个碱基的序列为 5'-GGGCGGCGACCT-3'5'-GGGCGGCGACCT-3' 。当噬。当噬菌体感染宿主细胞后，双链菌体感染宿主细胞后，双链 DNADNA 分子通过分子通过 coscos而成环状。而成环状。

44

GGGCGGCGACCT

CCCGCCGCTGGA

T

A C

G

环化作用

45

图 3-1 λ 噬菌体基因组结构

6161 个基因，每个个基因，每个基因平均为基因平均为1000bp1000bp ，其中，其中3232 个较为重要，个较为重要，它们的分布和排它们的分布和排列与其功能有一列与其功能有一定关系。定关系。

46

47

基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成： （（ 11 ）左臂，）左臂， 19.6kb19.6kb ，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因， AA ～～ JJ 的的 1212 基因都基因都

是构成外壳蛋白的基因，其中是构成外壳蛋白的基因，其中 AA ～～ E5E5 个基因与头部形成有关，个基因与头部形成有关， GG ～～ J5J5 个基因与个基因与尾部形成有关。尾部形成有关。

噬菌体左右两臂包含了噬菌体左右两臂包含了 λλ 复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区中央片段为非必需区，，即位于即位于 JJ 基因和基因和 NN 基因之间的片段可被其他大肠杆菌基因之间的片段可被其他大肠杆菌 DNADNA 片段所替换。片段所替换。

48

（（ 22 ）中央片段，）中央片段， 12kb12kb～～ 24kb24kb，含，含 PLPL控制控制 redred和和 gamgam基因。基因。

非必需区非必需区

49

（（ 33 ）右臂，）右臂， 9kb9kb～～ 11kb11kb ，含，含 λDNAλDNA 复制和溶菌有关的蛋白复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的编码基因。与裂解有关的 SS 和和 RR 基因、与基因、与 DNADNA 复制有关的复制有关的 OO 基基因和因和 PP 基因等也都分别聚集在一起。基因等也都分别聚集在一起。

非必需区非必需区

50

调节元件或调节基因 产物及功能PL,OL, PR,OR 左右向转录的启动子和操纵子tR (1,2,3,4,5) 右向转录的终止子tL(1,2) 左向转录的终止子PRE  CⅠ蛋白建立启动子，受 CⅡ蛋白调控PI int基因启动子，受 CⅡ蛋白调控PaQ Q蛋白反义 RNA启动子，受 CⅡ蛋白调控PRM CⅠ蛋白基因维持启动子，受 CⅠ浓度调控PR′ 晚期转录的启动子nutL, nutR N蛋白左右两个反终止结合位点qut Q蛋白反终止结合位点cro PL和 PR的阻遏蛋白，并可阻遏 PE ，抑制 CI  表达cI PL 和 PR 的主要的阻遏物，并可自主调控 PRM

cⅡ 可以启动 PRE 、 PI 和 PAQ，使 λ进入溶原化途径

51

cⅢ 和 CⅡ组成复合物，启动 PE产生 cⅠ及 cro的反义 RNA

N tR1, tR2及 tL1的反终止蛋白Q tR4的反终止蛋白 . 

O, P DNA复制所需的蛋白S, R, R2 裂解宿主所需的裂解酶int 整合酶，使 λ整合到宿主的染色体中xis 切除酶，帮助 λ在 att位点和宿主连接bet, exo 重组蛋白，帮助 λ和宿主进行重组W, B, N u3, C, D, E, FⅠ, FⅡ,Z

头部蛋白基因

U, V, G, T, H, M, L, K, I, J 尾部蛋白基因

cos (cohesive) 12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点， A 蛋白切割位点

A 末端酶，识别 cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组

52

λλ 噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即式，即溶菌性反应与溶源性反应溶菌性反应与溶源性反应。。

在感染早期，当 在感染早期，当 噬菌体 噬菌体 DNA DNA 进入宿主细胞进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA DNA 分子，而后在宿主细胞的 分子，而后在宿主细胞的 DNA DNA 连接酶和连接酶和旋促酶（旋促酶（ gyrasegyrase ）作用下，形成封闭的环状 ）作用下，形成封闭的环状 DNA DNA 分子，充当转录的模板。分子，充当转录的模板。

53

噬菌体的两条复制途径：噬菌体的两条复制途径： （一）裂解生长：（一）裂解生长： 噬菌体立即进行 PL和 PR启动子启动的 N 和 ro基因转录。早期转录产生的 N 蛋白可使 RNA聚合酶越过早期终止子而启动 O 、 P 和 Q 基因转录。

O 、 P 产物与复制有关，Q 基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。λDNA进入 θ 复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌

体。经过 40～ 45min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。

54

（二）溶源性生长： 感染细菌后，感染细菌后， λλ 噬菌体的噬菌体的 cⅠcⅠ 基因产物基因产物 λλ 抑制蛋白结合于抑制蛋白结合于 OLOL和和 OROR 操纵子操纵子，，

阻断早期转录，阻断早期转录， λλ 噬菌体则关闭自己的大部分基因并噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体整合到宿主染色体，然，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。

55

λλ 噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷与改造

λλ 噬菌体的改造噬菌体的改造

⑴ 基因组太大（ 49kb ）；

⑵ 酶切点太多，它有 5个 BamH1 位点（ G↓GATCC ）， 6个 BgⅠ位点（ A↓GATCT ）， 5个 EcoRⅠ 位点（ G↓AATTC ）。

⑶ 野生型只能接纳一定长度的 DNA 。若相当于 λ 噬菌体的 75-

105% ，那么只能接纳 49kb×5%=2.45kb的 DNA 。

⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（ 2.5kb 或更大）；

⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留 1-2 个切口；

⑶ 增加标记基因（ remarke gene ）。

(4) 引入无义突变．

λ 噬菌体的缺陷：

56

二、二、 λλ 噬菌体载体噬菌体载体 野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才

能用作载体：能用作载体： ①① 现在用的现在用的 λλ 载体大都载体大都减少或增加某些限制性内切酶减少或增加某些限制性内切酶的的

酶切位点酶切位点：野生型有：野生型有 6565 种限制酶酶切点，除种限制酶酶切点，除ApaⅠApaⅠ、、 NaeⅠNaeⅠ、、 NarⅠNarⅠ、、 NheⅠNheⅠ、、 Sna Sna BⅠBⅠ、、 XbaⅠXbaⅠ和和 XhoⅠXhoⅠ等等 77 种限制酶各有一个切点外，种限制酶各有一个切点外，其余都多于其余都多于 22 个。有些酶切点在个。有些酶切点在 λλ 增殖所必需的基因区增殖所必需的基因区域内。域内。

②②将将 λλ 噬菌体的噬菌体的非必需区做部分切除非必需区做部分切除 ③③ 插入了某种插入了某种报告基因报告基因

57

1.λ噬菌体载体的类型

两种类型：两种类型： ① ① 置换型置换型

② ② 插入型插入型

置换型载体：可被外源 DNA置换的 λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。

插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源 DNA 的载体，这类 λ噬菌体载体称插入型载体。

58

① 置换型载体 特殊性质：中间区域约长 18kb，这一段 DNA可以被外源置换而不会影响 λ噬菌体裂解生长的能力。只有 λDNA的长度大于野生型 λ噬菌体 DNA长度的 75％而不超过其 105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当 DNA的长度短于野生型的 75%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求 λ 载体 DNA和外源 DNA长度之和在 39～53kb之间。

59

这一特殊性质作为选择标记： 重组子被包装：当 EcoRⅠ切开 λDNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。

非重组子不被包装：如果没有外源 DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。

60

Xgal蓝色噬菌斑试验

区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法： 噬菌体载体带有编码 β-半乳糖苷酶的基因，当这种噬菌体感染 lac宿主细

胞并在含有 X-gal的培养基上生长时，半乳糖苷酶与 X-gal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。

蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑 ---------- 含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成无色透明噬菌斑无色透明噬菌斑 -------- 含外源含外源 DNADNA 的重组噬菌体形成的噬菌斑的重组噬菌体形成的噬菌斑

61

加装选择标记 lacZ加装选择标记 lacZ

lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产生蓝色透明斑

lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产生蓝色透明斑

62

Eg.Eg. 凯伦噬菌体载体 凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如这类载体有插入型的，如 Charon2Charon2 ；也有替换型；也有替换型的，如的，如 Charon30Charon30 。在基因操作中用途很广。。在基因操作中用途很广。

CharonCharon 载体上具有适当数量的限制酶切位点，载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的带有来自大肠杆菌的 β-β- 半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因 lacZlacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝 //白斑筛选阳性克隆。白斑筛选阳性克隆。

CharonCharon 载体的特点是容量大，对研究大范围内载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。的染色体结构很有用处。

63

②插入型载体： 有一类只含一个限制性位点可供插入外源 DNA的载体，这类 λ噬菌体载体称插入型载体。①失去了非必需区②仅保留了 EcoRⅠ的单一切点③切点又位于报告基因上，故在切开 DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选

④可插入长度为 10kb的外源 DNA

64

插入型载体 --λgtλgt 系列系列

cⅠ基因内保留 HindⅢ和 EcoRⅠ单酶切位点，当有外源 DNA在这酶切位点插入时，使 cⅠ基因失活，感染 hf -Ⅰ 大肠杆菌后可形成空斑。

65

插入型载体 --λgtλgt 系列系列 --λgtll--λgtll 在噬菌体在噬菌体 DNADNA 插入的插入的 lacZlacZ 基因末端设有单一的基因末端设有单一的 EcoRⅠEcoRⅠ酶切酶切位点位点。在此处插入外源基因，可表达。在此处插入外源基因，可表达 β-β-半乳糖苷酶的融合蛋白半乳糖苷酶的融合蛋白，，利用特异性抗体或利用特异性抗体或 DNADNA 测序方法可测序方法可筛选重组筛选重组 DNADNA 。这类载体适。这类载体适宜构建宜构建 cDNAcDNA 文库文库

66

注意： λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。

体外包装： λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白

λλ 噬菌体载体是主要用于噬菌体载体是主要用于 cDNAcDNA 文库构建，文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。也经常用于外源目的基因的克隆。

67

三、柯斯质粒三、柯斯质粒

19781978年年 CollinsCollins和和 HohnHohn 构建一种新型的大肠构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为杆菌克隆载体，命名为 cosmid(cosmid( 柯斯质粒柯斯质粒 )) ，，又叫粘粒。又叫粘粒。

柯斯质粒（柯斯质粒（ cosmidcosmid）） = cos= cos 序列序列 ++ 质粒。质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同 λλ噬菌体的噬菌体的 coscos 位点构成。 位点构成。

68

1.粘粒的组成及性质：

它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达 45kb

①质粒复制起点（ colE1） 象质粒一样转化和增殖

②抗性标记 ampr ③ cos位点 ④有的粘粒载体含有两个 cos位点

69

pHC79pHC79

6400

bp

6400

bp

Tc

r

Tc

r

l fragmentl fragmentcoscos

or

i

or

i

AprAprPst

I

Pst

I

BamHIBamHI

Sal

I

Sal

I

l-DNA cos序列和质粒复制子的l-DNA cos序列和质粒复制子的

cos site - carrying

plasmid

cos site - carrying

plasmid

1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段

1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段

装载范围为 31 - 45 kb 装载范围为 31 - 45 kb

70

2.柯斯质粒 pHC79系 由质粒由质粒 pBR322pBR322和和 λλ 噬菌体的噬菌体的 coscos位点的一段位点的一段 DNADNA 构成，全长构成，全长43kb43kb 。。

在包装时，在包装时， coscos位点打开而产生位点打开而产生 λλ 噬菌体的粘性末端。由于噬菌体的粘性末端。由于pHC79pHC79有有 pBR322DNApBR322DNA ，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。性两个标记。

凡具有凡具有 coscos位点的任何位点的任何 DNADNA 分子只要在长度相当于噬菌体基因组，分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似 λλ 噬菌体的颗粒。噬菌体的颗粒。

因此，插入柯斯质粒的外源因此，插入柯斯质粒的外源 DNADNA 可大于可大于 40kb40kb 。重组的柯斯质粒。重组的柯斯质粒可象可象 λλ 噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNADNA总量的总量的 50%50% 左右。左右。

71

3.柯斯质粒有以下优越性： ① ① 能象能象 λ-DNAλ-DNA 一样体外包装，并高效导入受体一样体外包装，并高效导入受体细胞；细胞；

②② 可以装载比质粒或可以装载比质粒或 λ-DNAλ-DNA 大得多的外源大得多的外源 DNADNA片段，如片段，如 coscos 区及附近顺序长为区及附近顺序长为 1.7 kb1.7 kb ，质粒，质粒长为长为 3.3kb3.3kb ，则该柯斯质粒最大可装载，则该柯斯质粒最大可装载 46.5kb46.5kb的外源的外源 DNADNA ；；

③ ③ 由于携带质粒的选择标记，便于筛选；由于携带质粒的选择标记，便于筛选； ④ ④ 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。

72

常用的粘性粒有常用的粘性粒有 PHC79PHC79、、 PJB8PJB8、、 MUA-3MUA-3和和KOSIKOSI 等，它们大多具等，它们大多具有一种或多种限制性内切有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组减少构建基因组 DNADNA 文库的重组克隆数目，减少文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。合高等真核基因的克隆工作。

73

4.采用柯斯质粒作载体的困难 ①① 载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的 1/101/10 左右，左右，因此往往会出现因此往往会出现载体同载体自身连接载体同载体自身连接，结果在一，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；

74

②②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出 3030～～45kb45kb 的外源的外源 DNADNA 插入载体插入载体 DNADNA ，此时，，此时，每个载体只可每个载体只可能插入一个外源片段能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；装成噬菌体颗粒的限度；

75

③ ③ 细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一筛选所需的含某一 DNADNA 片片段的菌落很费时间。段的菌落很费时间。

现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外插入的大片段外源源 DNADNA 有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。所以最常使用的还是噬菌体载体。

76

77

四、 M13 噬菌体载体 单链 DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状 DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。

M13噬菌体是单链 DNA噬菌体中的一个典型的代表。

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1.M13噬菌体的组成和结构

M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

79

M13M13 噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状 M13M13 噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状 M13 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链噬菌体由外壳包装蛋白和正链 DNADNA 组成 组成 M13 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链噬菌体由外壳包装蛋白和正链 DNADNA 组成 组成

M13 DNAM13 DNA 全长全长 64076407 个核苷酸个核苷酸 M13 DNAM13 DNA 全长全长 64076407 个核苷酸个核苷酸 M13 DNAM13 DNA 上至少有上至少有 1111 个基因个基因 M13 DNAM13 DNA 上至少有上至少有 1111 个基因个基因

27002700 个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子 27002700 个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子

M13 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

80

单链 DNA，由 6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有 11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因

Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和 DNA合成的元件。

2.M13噬菌体的基因组

编码 3 类蛋白质：① 复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）② 形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③ 结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和

Ⅸ）

81

3. M13噬菌体载体的构建

M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；②M13噬菌体 DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将 M13噬菌体 DNA导人宿主菌中；③M13噬菌体的包装不受 DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随 DNA的大小而改变，即使 DNA的大小比本身DNA的大小超出 6 倍，仍能进行包装。

82

M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：

⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链 DNA的酶切和连接是比较困难的。

⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区 ----M13不像 λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因Ⅱ /Ⅳ和基因Ⅷ /Ⅲ之间）。

83

4.mp系列载体

现在所使用的现在所使用的 M13M13 噬菌体载体是噬菌体载体是 MessingMessing 及其及其同事建立的同事建立的 mpmp 系列载体，以基因系列载体，以基因ⅡⅡ和基因和基因ⅣⅣ之之间的区域作为外源 间的区域作为外源 DNA DNA 插入区。 插入区。

84

mpmp 系列载体系列载体 M13mpM13mp 载体系列是由载体系列是由 M13mp1M13mp1 改造而来的，改造而来的， M13mp1M13mp1在在IRIR 区内插入了一个编码区内插入了一个编码 β-β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 NN 端端 146146氨基酸氨基酸的基因序列的基因序列

当选用含有当选用含有 F’F’ 因子的因子的 β-β-半乳糖苷酶基因缺陷突变体作半乳糖苷酶基因缺陷突变体作为宿主菌时为宿主菌时，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失 NN 端第端第1111－－ 4141位氨基酸，因此缺陷型的位氨基酸，因此缺陷型的 β-β-半乳糖苷酶没有半乳糖苷酶没有生物活性生物活性

未插入外源基因的未插入外源基因的 M13mp1M13mp1 与该缺陷型基因可以产生互与该缺陷型基因可以产生互补作用，常称为补作用，常称为 αα互补。 互补。

85

大肠杆菌的 M13 单链噬菌体 DNA大肠杆菌的 M13 单链噬菌体 DNA

M13 DNA 载体的构建：M13 DNA 载体的构建：

III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII

野生型 M13RF-DNA野生型 M13RF-DNA

III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII

M13mp 系列载体M13mp 系列载体

lacZ‘lacZ‘polylinkerpolylinker

86

III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII

M13mpM13mp 系列载体系列载体M13mpM13mp 系列载体系列载体

lacZ‘lacZ‘lacZ‘lacZ‘polylinkerpolylinkerpolylinkerpolylinker

宿主菌缺陷型缺失宿主菌缺陷型缺失 NN端第端第 1111－－ 4141位氨基酸：位氨基酸： β-β-半乳糖苷酶没有生物活性半乳糖苷酶没有生物活性

未插入外源基因的未插入外源基因的 M13mp1M13mp1 与该缺陷型基因可以产生互补与该缺陷型基因可以产生互补插入外源基因的插入外源基因的 M13mp1M13mp1 与宿主不互补与宿主不互补

编码编码 β-β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 NN端端146146氨基酸的基因序列氨基酸的基因序列

87

如果将未置换的载体转人携带有 F’附加体的宿主菌中，并放在含有异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷 (IPTG)和 X-gal的培养基上，就会产生蓝色噬斑

在 M13mp1的 LacZ区域插入外源基因片段，便会破坏α-互补作用，结果产生的克隆重组体仅形成淡蓝色或无色的噬斑

通过观察噬斑颜色的变化，就能很容易识别和挑选重组体。

88

使用使用 M13M13 噬菌体作为载体的优点噬菌体作为载体的优点 特别适用于克隆单链特别适用于克隆单链 DNADNA 例如：例如： M13mp18M13mp18和和 M13mp19M13mp19 用于克隆单链用于克隆单链 DNADNA和测序和测序

89

M13mp18 和 M13mp19 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。

当 RF DNA被两种不同的限制酶切割以后， M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链 DNA片段时，方可闭合成环。

90

M13mp18 和 M13mp19 这一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。

这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链， M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。

故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源 DNA的任意一条链互补的 DNA探针。

91

M13噬菌体产生单双链 DNA的机制：

1 、以（ + ）链 DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（ RFDNA）。

2 、 RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约 200个拷贝。

3 、单链特异的 DNA结合蛋白结合在（ + ）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（ + ）链 DNA 。

4 、游离出来的（ + ）链 DNA先与基因 V 的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因 V 的蛋白质从（ + ） DNA链上脱落下来，余下的 M13（ + ）链 DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

92

++

-

+

-

+

-

+

-+

-

+

-

单链结合蛋白

RF型 DNA

复制约200copy

++

+ + +

以 -链 DNA 为模板合成 +链DNA

93

M13M13 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期 M13M13 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期

+ DNA+ DNA + DNA+ DNA

（（++））DNADNA （（++））DNADNA

RFDNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNA

RFDNARFDNA RFDNARFDNA-DNA-DNA-DNA-DNA

II

II

II

II

VV VV

94

第三节 其他载体

95

病毒载体概述（ 1 ）要求： 1 、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 、介导外源基因转移和表达 3 、对机体不致病

容量：自身基因组大小的 105%~110%

类型： 1 、重组型病毒载体

2 、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型

可复制型

复制缺陷型

组成： 1 、病毒复制和包装元件 2 、病毒基因 3 、插入的外源基因或元件 4 、病毒外壳 / 外膜

用途：基因转移和表达 1 、基因治疗 2 、疫苗 3 、器官移植 4 、组织工程 5 、转基因动物 6 、基因功能研究

一、病毒载体

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病毒载体概述（ 2 ）

优点： 1 、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；

2 、复杂的装配过程由细胞完成； 3 、不同的病毒载体具有不同的表达特点。

存在的问题： 1 、安全性

2 、靶向性

3 、有效性

细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶向性转录靶向性转导效率靶向性基因表达水平和持续时间表达的可调控性

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病毒载体 生物学特性 适用范围

反转录病毒载体 单链 RNA病毒 8~10kb

可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；

Ex vivo基因治疗；肿瘤基因治疗。

腺病毒载体 双链 DNA病毒 36kb

可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；

In vivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。

AAV病毒载体 单链 DNA病毒 ~5kb

可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；

In vivo 基 因 治疗；Ex vivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。

HSV病毒载体 双链 DNA病毒 152kb

具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；

神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。

常用的病毒载体的特点：

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◆ Ti 质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤 (grown gall tumors) 。

致毒区

Ti质粒复制起始点

冠瘿碱代谢

酶编码基因

与 Ti质粒转移功能

有关的遗传座位

冠瘿碱合成基因

T-DNA区

右边界

生长素合成基因 细胞分裂素合成基因

左边界

◆Ti 质粒。 Ti 质粒的一部分 DNA 叫做转移 DNA（ T-DNA ），当 T-DNA 整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱 (opine), 作为土壤农杆菌的碳源和氮源 。

二、 Ti 质粒

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（ 1） T-DNA 区（ transferred-DNA regions ） T-DNA 是农杆菌侵染植物细胞时，从 Ti 质粒上导入植物细胞的一段 DNA 。 T-DNA 两端各有一段 25bp 的重复序列 (LB, RB) 。 T-DNA 携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。Ti 质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA 两端的末端序列，然后用外源 DNA 插入或直接取代野生型 T-DNA 的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。

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（ 2） Vir 区（ virolence region ）Vir 区段上的基因与 T-DNA 从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。 Vir 区段总长度大约 35kb ，由 7 个互补群组成，分别命名为 VirA、 VirB、 VirC、 VirD、 VirE、 VirG和 VirH 。（ 3） Con区 (regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（ tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。 （ 4） Ori区 (origin of replication) 该区段基因调控 Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。

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（ 1 ）双元载体系统（ binary vector ）具有两个质粒——穿梭质粒和 Ti 质粒。（ 2 ）共整合载体（ integrated vector ）共整合载体系统包括在 T-DNA 上的激素合成区经

过突变后的 Ti 质粒和中间载体两部分。

Ti 质粒的衍生载体

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　　三、酵母人工染色体载体 （ yeast artificial chromosome, YAC ）

四、细菌人工染色体

（ bacterial artificial chromosome, BAC ）

动物病毒 DNA 改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）

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人基因组十分庞大，约含 4×109bp ，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome,YAC ）载体应运而生。 YAC含有酵母染色体端粒（ telesome ）、着丝点 (centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb 的外源 DNA ，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要

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the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping

The functional elements of a yeast chromosome

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正常酵母人工染色体含有：

* 四膜虫端粒（ tel)

* 酵母自主复制序列（ ARS)

* 酵母着丝点 (CEN)

•酵母的选择标记 (TRP1 、 URA1)

YAC 载体

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BAC 载体

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Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.

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PAC 载体

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质粒质粒 λλ 噬菌体噬菌体 柯斯质粒柯斯质粒 单链噬菌体单链噬菌体

克隆克隆 DNADNA 大片段大片段 ±±** ++ ++ --

构建基因组文库构建基因组文库 -- ++ ++ --

构建构建 DNADNA文库文库 ++ -- -- --

常规的亚克隆化常规的亚克隆化 ++ -- -- --

构建新型的构建新型的 DNADNA 结构结构 ++ -- -- --

序列分析序列分析 ++ -- -- ++

单链探针单链探针 ++**** -- -- ++

外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达 ++ -- -- --

四种常用载体的比较

* 外源 DNA如超过 10kb ，则重组质粒的转化率和 DNA得率都非常低** 已有个别材料可用于此目的　　　　　　　　　　

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质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA 重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（ Simian Virus 40 ）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。　　

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猴病毒 40（ SV40 ）的基因组常用来作为克隆载体，把外源 DNA 转入哺乳类细胞。猴病毒 40 是球形动物病毒，直径 40nm ，呈 20面体，有一个共价闭环的双链 DNA 基因组，全长 5244bp 。它在猴肾中增殖。被 SV40 感染的细胞都会出现 SV40的 T抗原。早已证明完整的小鼠染色体 β 珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在 SV40 中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β 珠蛋白的初级转录本。

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SV40 作为克隆载体有其局限性：①SV40 基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源 DNA 的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组 DNA片段的大小受体限制。

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逆转录病毒是 RNA 病毒，它有三个基因： gag-编码病毒的核心蛋白； pol-编码逆转录酶； env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（ vonc ），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（ defective virus ）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。

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Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的 DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（ helper virus ）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的 RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒 RNA ，进入骨髓细胞，病毒DNA 插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。