Моделирования белков на примере ядерного рецептора CAR

и его лиганд-рецепторных комплексов

Доклад подготовили : Зинина Валерия, Свешникова Анастасия

219 группа, кафедра молекулярной биологии

Актуальность работыСАR:

• регулирует экспрессию множества генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма лекарств и ксенобиотиков

• его активация способна вызвать изменения в метаболизме липидов, гомеостазе глюкозы и других процессах

перспективы в лечении заболеваний печени и сахарного диабета, холестаза и желтухи

новорожденных

Молекулярная архитектура

N N-Концевой домен

Домен-линкер

Домен, взаимо-действующий с лигандом

C

Консер-вативный домен, взаимодействующий с ДНК (ДВД)

Участок лиганд-зависимой активации в С-концевой спирали Н12 (AF2)

Механизмы активации ядерных рецепторов

связывание с агонистом

связывание с антагонистом

Изменение конформации Н12,

Н12 приобретает неупорядоченную

структуру

Нарушение центра связывания

коактиватора

Возникновение гидрофобной области (спирали Н3, Н4, Н12)

Связывание коактиватора

Конститутивно-активный андростановый рецептор человека (CAR)

Конститутивная базальная активность!!! Механизм действия:

Взаимодействие агониста с гидрофобным центром связывания рецептора

Перемещение рецептора в ядре

Образование гетеродимера с другим ядерным рецептором

Особенности проекта• Недоступность кристаллографических

данных о структуре рецептора

• Было известно лишь несколько лигандов СAR

• По своим лигандам CAR совершенно отличается от родственных рецепторов

метод моделирования по гомологии

Моделирование по гомологииИдентичность в последовательностях различных белков

Сходство в структуре

Порядок действий:1) Поиск белков, родственных изучаемому белку2) Идентификация консервативных и вариабельных областей3) Выравнивание последовательностей в консервативных

областях4) Конструирование консервативных областей с

использованием координат шаблонного белка5) Конструирование структурно вариабельных областей6) Моделирование боковых цепей7) Оптимизация структуры с помощью методов минимизации

энергии и молекулярной динамики

Выбор шаблонного белка для моделирования

1) для VDR и PXR были построены модели с использованием другого белка в качестве шаблона, затем эти модели сравнивались с экспериментальными структурами

2) модели были оптимизированы, чтобы исключить возможные стерические затруднения, возникшие в ходе моделирования

 

Модели существенно отличались от экспериментальных структур

• Вывод: использование только одного шаблона не позволяет построить качественную модель рецептора

Модель CAR была построена на основе двух структур-шаблонов с выбором координат VDR и PXR вручную

множественное выравнивание аминокислотных последовательностей CAR, VDR и PXR было осуществлено с помощью известной программы CLUSTALW

модель CAR была построена на основе двух рассмотренных выше шаблонных белков с помощью модуля Homology программного комплекса INSIGHT II

Для моделирования координат боковых цепей была использована программа SCWRL

Для уточнения отдельных моделей CAR была проведена минимизация энергии, а затем моделирование молекулярной динамики с помощью программы GROMACS в силовом поле GROMOS96

Анализ моделей,

полученных в результате

моделирования молекулярной

динамики

Взаимодействия домена АF-2

Такая схема уникальна среди ядерных рецепторов!

Связывание коактиватора

Ряд аминокислот, образующих гидрофобную бороздку

SRC-1

Связывание SRC-1 с ДВЛ фиксирует остаток Leu342 домена AF-2 в гидрофобной полости, образованной аминокислотами ДВЛ и SRC-1

Анализ мутантных вариантов1) определены остатки, ответственные за полость

связывания рецептора 2) у 22 кислот проведены мутации с заменой на аланин 3) их базальную активность проанализировали и

сравнили с hCAR 4) сравнили с моделью и подтвердили участие этих

аминокислот в образовании полости связывания Для большинства мутантов CAR простой визуальный

анализ модели, построенной по гомологии, четко показывает причину, по которой конститутивная активность резко снижается

Моделирование комплексов рецептора CAR с лигандами

• Молекулярный докинг в построенную по гомологии модель рецептора

• Использовалась программа докинга GOLD• Были изучены два известных активатора –

клотримазол и трис-n-метилфенилфосфат

Не образует прямые взаимодействия с AF-2,

ароматические фрагменты лиганда взаимодействуют в основном с ароматическими остатками центра связывания

Связывается гораздо ближе к области взаимодействия ДВЛ и

AF-2.

Наложение модели и кристаллической структуры

Зеленый – модель

Фиолетовый – кристаллическая структура

Плюсы + выявляется хорошее общее соответствие

вторичных структурных элементов при визуальном анализе

+ если исключить участок Н2-Н3 (аминокислоты 139-153), то rmsd = 1,8 А

+ значения для отдельных цепей кристаллической структуры CAR rmsd составляют 0,4-0,68 А

Минусы- у модели в спиралях Н3 и H10/11 есть дополнительный виток - наиболее значительное отличие наблюдалось в области,

соединяющей Н2 и НЗ. В кристаллических структурах имеется дополнительная спираль (Н2'), тогда как в модели CAR имеется гибкая петля.

- ориентация петли Н2—НЗ в модели отличается от ориентации в экспериментальной структуре.

- значения rmsd атомов основных цепей составляют 3,4—3,8 А, что является признаком недостаточно высокого качества моделей

Чем же объясняется конститутивная активность CAR?

• гидрофобный барьер, образованный остатками Phel61, Asnl65, Phe234 и Туг326, которые взаимодействуют со спиралью Н12 и удерживают ее в активированном состоянии

• небольшой размер спирали Н12 (С-концевого домена) по сравнению с другими ЯР

• дополнительная спираль («спираль X»), находящаяся между спиралями Н11 и Н12, которая способствует переориентации Н12 в активированное положение и ее взаимодействию с гидрофобным участком

Но!

• ароматические и гидрофобные остатки, в особенности Туг326, действительно обеспечивают взаимодействие со спиралью AF-2

• солевой мостик между Lysl95 и Ser348 является артефактом процедуры кристаллизации и не вносит существенного вклада в конститутивную активность CAR

• имеющиеся структурные данные не подтверждают существенную роль «спирали X» в проявлении базальной активности CAR

Виртуальный скрининг 1) тестирование программ докинга

2) программа GOLD с модифицированной оценочной функцией GoldScore выбрана лучшей

3) база данных LeadQuest2 (85 000 соединений)

4) исключены молекулы, нарушающие правила Липински, а также производные стероидов

5) с помощью модуля UNITY программы SYBYL проведен поиск соединений, удовлетворяющих 3D-зaпpocy (=>9700 соединений)

6) молекулярный докинг с помощью программы GOLD

7) соединения, имеющие лучшие оценки в обоих случаях, анализировали визуально и сравнивали с результатами докинга известных активаторов (=>66 соединений)

8) экспериментальное исследование (=>17 агонистов)

Заключение• тщательный и критический подход к сочетанию

теоретических и экспериментальных данных привел к получению новых знаний о механизмах действия

• использованный подход позволил найти новые активаторы рецептора CAR, принадлежащие к новым структурным классам

• найденные с помощью виртуального скрининга производные сульфонамида и тиазолидинона— самые сильные из известных в настоящее время активаторы CAR и интересные фармакологические инструменты исследования CAR

Спасибо за внимание!