锦鲤鱼抗氧化酶作为硝基苯类污染生物标志物试验研究

姓名：沈 洪 艳

• 1 研究背景和意义• 2 急性毒性研究及安全评价• 3 亚急性毒性研究• 4 结　　论

内 容

研究背景 1

制药废水经过处理后能够达标排放，但排放的废水中仍含有一些危害性大、有毒的物质，如苯胺类、硝基苯类、有机硫、氰化物等。

研究背景 2 生物毒性能正确反映出水体的污染与生物效应的关系 ——生物标志物

1. 研究背景

制药废水经过处理后能够达标排放，但排放的废水中仍含有一些危害性大、有毒的物质，如苯胺类、硝基苯类、有机硫、氰化物等。

研究背景 4

1. 研究背景

研究背景 3

2004 年由河北省环境科学研究院、华北制药集团、河北科技大学三家联合成立了国家环境保护制药废水污染控制工程技术中心 ，《制药工业污水排放标准》制定

河北省科技厅项目中小城市污水处理新技术研究（ 02276725 ）项目的资助 。

可以揭示污染物低剂量暴露对生物的影响 意义一

教学模式 揭示毒性作用机理

意义四 为水质标准的制定提供科学依据

意义二

意义三 为环境安全评价、生态风险评价提供生物学依据

1. 研究意义

染毒试验生物标志物指标

恢复试验生物标志物指标

亚急性毒性

筛选生物标志物

联合毒性

毒性作用类型

单一急性毒性

① ②

③

技 术 路 线

锦鲤鱼——模式动物• （ 1 ）锦鲤鱼具备模式动物的基本条件• 我国传统鱼种，• 分布广泛，能大量得到；• 适应能力强，• 对化合物反应比鲤鱼、金鱼敏感，• 易在实验室培养和繁殖；• 捕获和驯化的代价低；• 具有生态学代表意义；• 能代表很大数量的物种或种群。

• （ 2 ）我国鱼类急性毒性试验中推荐的鱼种为剑尾鱼、斑马鱼、稀有鮈鲫，这些鱼种虽然对化学物质敏感，但是需要专门的培养和繁殖技术，分布也不普遍，

• 因此扩展急性和亚急性毒性实验的模式动物具有广阔的发展前景。

• （ 3 ）幼鱼在环境条件变化下的生理、生化反应较成鱼更为敏感。

• 基于上述考虑，将锦鲤鱼 1龄幼鱼作为本研究的模式动物，开展急性毒性、联合毒性和亚急性毒性试验。

受试化学品急性毒性效应受试化学品急性毒性效应

急性毒性试验

材料和方法

试验结果

数据处理

讨 论 毒性等级和亚急性毒性试验毒性等级和亚急性毒性试验

目目的的

结结论论

• 预试验 急性毒性试验

表 2.2 预试验和急性毒性试验方案 单位：mg/L

预试验浓度 急性毒性试验浓度 化合物

1组 2组 3组 4组 5组 6组 (1)组 (2)组 (3)组 (4)组 (5)组

P-NCB 40 30 20 10 5 - 40 23.71 14.13 8.41 5

M-DNB 40 30 20 10 5 - 30 22.91 17.38 13.18 10

CDNB 2 1 0.7 0.5 0.3 0.1 1 0.841 0.708 0.596 0.5

2 急性毒性试验

急性毒性试验结果 预试验 急性毒性试验

动物中毒症状

试验结果

预试验结果

化合物名称 24h LC100 96h LC0

P-NCB 40 5

M-DNB 30 10

CDNB 1.0 0.5

3 种化合物对锦鲤鱼的 24h LC100 和 96h LC0

表 2.15 对氯硝基苯对锦鲤鱼急性毒性（ 2 种计算方法）

计算方法 暴露时间（ h ） 回归方程 相关系数 (R2)

LC50 （ mg/

L ） 95% 置信区间

概率法

24y = 3.9918x – 0.952

0.9748 30.9824.71 ～ 38.8

4

48y = 5.6771x –

2.92550.9744 24.89

21.23 ～ 29.18

72y = 3.2883x +

0.4674 0.9998 23.90

18.16 ～ 31.45

96y = 2.5089x +

1.7397 0.9953 19.93

13.91 ～ 28.56

寇氏法

24 — － 29.7423.70 ～ 37.3

3

48 — － 25.4520.69 ～ 31.3

0

72 — － 20.3516.23 ～ 25.5

1

96 — － 17.3213.44 ～ 22.3

2

急性毒性试验结果

表 2.18 间二硝基苯对锦鲤鱼急性毒性（2种计算方法）

计算方法 暴露时间（h） 回归方程 相关系数

(R2) LC50（mg/L） 95%置信区间

24 y = 9.000x – 7.910 1 27.19 24.31～30.42

48 y = 7.3333x – 4.6433 1 20.65 18.00～23.70

72 y = 7.3333x –3.8633 0.9098 16.17 14.09～18.55 概率法

96 y = 8.5833x – 4.8467 0.9837 14.03 12.48～15.79

24 — － 24.15 22.06～26.43

48 — － 20.31 17.90～23.04

72 — － 16.17 14.11～18.53 寇氏法

96 — － 14.41 12.74～16.29

急性毒性试验结果

表 2.21 2，4-二硝基氯苯对鲤鱼的急性毒性（2种计算方法）

计算方法 暴露时间（h） 回归方程 相关系数(R2) LC50（mg/L） 95%置信区间

24 y = 10.800x +5.8267 0.8991 0.838 0.764～0.921

48 y = 17.267x +7.330 0.9638 0.733 0.691～0.777

72 y = 16.933x +7.450 0.9104 0.717 0.675～0.761 概率法

96 y = 13.640x +7.355 0.8977 0.672 0.624～0.723

24 — — 0.834 0.762～0.912

48 — — 0.738 0.685～0.795

72 — — 0.727 0.674～0.784 寇氏法

96 — — 0.691 0.635～0.752

急性毒性试验结果

安全浓度与地表水环境质量标准值的比较 表 2.27 受试化合物 96hLC50（寇氏法）与地表水环境质量标准比较 单位：mg/L

P-NCB M-DNB CDNB 染毒时间(h) LC50 SCⅠ SCⅡ LC50 SCⅠ SCⅡ LC50 SCⅠ SCⅡ

24 29.74 5.59 24.15 4.31 0.834 0.17

48 25.45 20.31 0.738

72 20.35 16.17 0.727

96 17.32 1.732 14.41 1.441 0.691 0.0691

地表水环境质量标准限值

0.05 0.5 0.5

CDNB 安全浓度均低于标准限值P-NCB 、 M-DNB 安全

浓度没有超过标准限值

急性毒性试验结果

表 2.22 锦鲤鱼中毒反应

浓度组 化学品名称

1组 2组 3组 4组 5组

P-NCB 40 mg/L 23.71 mg/L 14.13 mg/L 8.41 mg/L 5 mg/L

中毒反应 1～2浓度组的鱼逐渐失去平衡，丧失游泳能力，最后出现麻痹状态，侧卧于水面

3～5 浓度组的鱼基本适应环境，并能正常游动

M-DNB 30 mg/L 22.91mg/L 17.38 mg/L 13.18 mg/L 10 mg/L

中毒反应

1 组在染毒两个小时后出现症状，鱼体失去平衡，有的测游，有的竖游，有的上下翻滚，呼吸困难

2～5浓度组的鱼基本适应环境，并能正常游动

CDNB 1 mg/L 0.841 mg/L 0.708 mg/L 0.596 mg/L 0.5 mg/L

中毒反应

1.000mg/L和0.840mg/L浓度组的鱼开始兴奋，阵发狂热，有的鱼竖立游行，身体抽搐，逐步转为时游时停，呼吸缓慢，失去平衡，丧失游泳能力，最终出现麻痹状态，侧卧于水面死亡。

3～5 浓度组的鱼基本适应环境，并能正常游动

从染毒过程中试验鱼的中毒症状来看有下面两种情况。（ 1）受试化合物不同，个体的中毒症状不同（ 2） 3种化合物对锦鲤鱼的毒性效应与处理浓度呈正相关

3. 硝基苯类化合物对鱼肝脏抗氧化酶影响

受试化学品亚急性毒性效应受试化学品亚急性毒性效应

亚急性毒性试验

材料和方法

试验结果

数据处理

讨 论 抗氧化酶变化及其敏感标志物抗氧化酶变化及其敏感标志物

目目的的

结结论论

化合物 试验名称 抗氧化酶

间二硝基苯染毒试验 SOD 、 GPx 、 CAT

恢复试验 √

对氯硝基苯 染毒试验 SOD 、 POD 、 CAT

测 定 指 标

间二硝基苯对蛋白含量的影响

0. 0

0. 4

0. 8

1. 2

1. 6

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

(mg/

L)蛋白含量

6d 12d 18d 24d 30d

• 染毒组蛋白含量随时间变化显著，并且以蛋白含量下降为主要特征，并且染毒组蛋白含量低于对照组。

0. 5

0. 7

0. 9

1. 1

1. 3

3 7 14 21 28

(d)天数

(g/L

)蛋白含量

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 4.3 染毒时间对锦鲤鱼肝脏蛋白含量的影响

0. 0

0. 2

0. 4

0. 6

0. 8

1. 0

1. 2

1. 4

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组(g

/L)

蛋白含量

3 7 14 21 28

图 4.4 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏蛋白含量的影响

对氯硝基苯对蛋白含量的影响

020406080

100120140160

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

CAT

(U/m

gpro

t)值

6 12 18 24 30

图 3.9 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 CAT活性影响

0

50

100

150

6 12 18 24 30

(d)天数

CAT

(U/m

gpro

t)值

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 3.6 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 CAT活性影响

间二硝基苯对 CAT 的影响

0

20

40

60

80

100

120

140

160

3 7 14 21 28

(d)天数

CAT

(U/m

gpro

t)活性

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 4.5 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 CAT 活力影响

0

20

40

60

80

100

120

140

160

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

CAT

(U/m

gpro

t)活性

3 7 14 21 28

图 4.8 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 CAT活性影响

对氯硝基苯对 CAT 的影响

0

500

1000

1500

2000

6 12 18 24 30

(d)天数

GPx

(U/m

gpro

t)活性

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 3.7 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 GPx活性影响

0

500

1000

1500

2000

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

GPx

(U/m

gpro

t)活性

6 12 18 24 30

图 3.10 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 GPx活性影响

间二硝基苯对 GPx 的影响

0

50

100

150

200

250

6 12 18 24 30

(d)天数

SOD

(U/m

gpro

t)值

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 3.8 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 SOD活性影响

0

50

100

150

200

250

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

SOD

(U/m

gpro

t)值

6 12 18 24 30

图 3.11 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 SOD 活力影响

间二硝基苯对 SOD 的影响

406080

100120140

3 7 14 21 28

(d)天数

SOD活性

(U/m

gpro

t)

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 4.6 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 SOD 活力影响

0

20

40

60

80

100

120

140

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

SOD

(U/m

gpro

t)活性

3 7 14 21 28

图 4.9 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 SOD活性影响

对氯硝基苯对 SOD 的影响

对照组 SOD 活性比较稳定，染毒期内基本没有出现波动。

SOD 活性均不同程度被诱导，但 SOD 活性诱导反应比 CAT 和 GPx滞后

SOD 活性在染毒期间被显著诱导后波动性小。

2 种硝基苯化合物对 SOD 的影响

0. 00. 51. 01. 52. 02. 53. 03. 54. 0

3 7 14 21 28

(d)天数

POD

(U/m

gpro

t)活性

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC501/ 2LC50 cont rol

图 4.7 染毒时间对锦鲤鱼肝脏 POD活力影响

011223344

1/ 6LC50 1/ 4LC50 1/ 3LC50 1/ 2LC50 cont rol

浓度组

POD(U/

mgprot

)活性

3 7 14 21 28

图 4.10 染毒浓度对锦鲤鱼肝脏 POD活力影响

对氯硝基苯对 POD 的影响

• 7天恢复试验表明，生物有自我修复功能，恢复期间 GPx 、SOD 、 CAT 活性均下降，接近于对照组水平。

间二硝基苯恢复试验对酶活性的影响

表 4.23 恢复期鱼肝生化指标与染毒浓度相关关系

鱼肝生化指标 回归方程 相关系数（R2）

蛋白含量 Y=0.0244x2 – 0.2519x +

1.2913 0.6577

SOD活性 Y= -4.0024x2 + 36.385x +

19.737 0.4721

CAT活性 Y= 62.677Lnx - 15.74 0.9226

GPx活性 Y=44.493x2 – 463.39x +

1243.5 0.9445

污染解除后，染毒组蛋白含量、抗氧化酶活性都有恢复到对照组水平的趋势，说明在本研究的染毒状态下，没有超出锦鲤鱼的抗氧化能力。

恢复试验结论

• 在污染胁迫下，比较三种抗氧化酶在染毒和恢复期响应速度、稳定性后发现，每种酶均有优缺点，不能单独作为生物标志物，

• 建议将 GPx 作为首选生物标志物，• 以 SOD 和 CAT 作为辅助生物标志物，

推荐间二硝基苯生物标志物

表 5.17 生化指标对比分析

生化指标名称 浓度－效应关系

时间－效应关系

对照组稳定性 反应灵敏性

蛋白含量 显著 显著 √ 灵敏

SOD 显著，被诱导后波动性小 显著 √ 滞后

CAT 显著，被诱导后活性持续上升 显著 × 灵敏

POD 显著 比较显著 × 灵敏

空白组 SOD 和蛋白含量比 CAT 、 POD 相对稳定，染毒后 SOD 和蛋白含量具有显著的暴露—效应关系，因此认为 SOD 、蛋白含量、 CAT 和 POD耦合指标适宜作为对氯硝基苯染毒后推荐的生物标志物。

推荐对氯硝基苯生物标志物

√

√√

• （ 1 ）确定了对氯硝基苯、间二硝基苯、 2 ， 4－二硝基氯苯 3 种化合物的 24hLC100和 96h LC0 ； 3 种化合物毒性顺序和毒性水平； 96h LC50 。

• （ 2 ）采用毒性单位法和相加指数法评价混合体系联合毒性结果不一致。硝基苯类化合物混合体系的联合毒性决定于 -NO2取代基的数量是否相同。

5 、结　　论

• （ 3 ）锦鲤鱼染毒后体重下降，体长增长变慢。

• 3 种化合物导致鱼肝蛋白含量明显降低，抗氧化酶活力（ SOD 、 CAT 、 GPx 、 POD ）、 MDA 含量与对照组比较均出现显著变化。

• 推荐生物标志物： CAT 与 POD 、 SOD 与 MDA 、 GPx 、SOD 、 MDA 、蛋白含量

• 恢复试验表明，锦鲤鱼具有自我修复功能，恢复期间受到抑制的指标均不同程度上升或者受到诱导的指标回落，接近于空白对照的水平。

谢 谢！