Ο ρόλος της πρωτεΐνης TRAF5 στη μεταγωγή σήματος από την πρωτεΐνη

LMP1 του ιού Epstein Barr

Μερόπη ΚαρακιουλάκηΕπιβλέπων καθηγητής: Γεώργιος Μόσιαλος

Θεσσαλονίκη, Ιούλιος 2016

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΟΛΟΓΙΑΣ

Epstein Barr Virus (EBV)

• γ-ερπητοϊός

• Δομή:

Δίκλωνο γραμμικό DNA

Εικοσάεδρο καψίδιο

Εφυμενίδα

Λιπιδιακός φάκελος (πρωτεΐνες εισόδου)

• Στόχοι:

1. Επιθηλιακά κύτταρα

2. Β-λεμφοκύτταρα

• Μετάδοση μέσω σιέλου

• Μόλυνση επιθηλιακών κυττάρων ρινοφάρυγγα

• Πολλαπλασιασμός μέσω της λυτικής οδού

νέα ιοσωμάτια

μόλυνση άλλων κυττάρων/ ξενιστών

ανοσολογική απόκριση

λοιμώδης μονοπυρήνωση

Λυτική οδός

Λυσιγονική οδός• Πολλά αντίγραφα στον σίελο

• Β-λεμφοκύτταρα λεμφικών οργάνων

ρινοφάρυγγα

• Ξεφεύγει από τους μηχανισμούς

άμυνας του ξενιστή

• Διατήρηση ιϊκού φορτίου

• Ανάπτυξη υπερπλασιών

Υπερπλασίες

• Ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός Β-λεμφοκυττάρων

• Τύποι καρκίνων:

• λέμφωμα Burkitt

• λέμφωμα Hodgkin

• ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα

• γαστρικό καρκίνωμα

• 90% του πληθυσμού έχει μολυνθεί με τον EBV

• Λίγοι άνθρωποι με νεοπλασίες

ανοσοκατεσταλμένα άτομα (AIDS)

μετά από μεταμόσχευση

άτομα που πάσχουν από άλλες μολύνσεις

Υποσιτισμός

• Στρατηγική επιβίωσης του ιού:

Φυσική Επιλογή μικρές βλάβες στα άτομα που μολύνει

Μόλυνση ασυμπτωματική

Εκφράζονται ελάχιστες πρωτεΐνες αποφυγή εντοπισμού από το ανοσοποιητικό

σύστημα

Λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs)Αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές B- λεμφοκυττάρων που έχουν μολυνθεί με τον ιό EBV in vitro.

6 πυρηνικά αντιγόνα (EBV nuclear antigen- EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C, LP)

3 λυσιγονικές μεμβρανικές πρωτεΐνες (LMP1, 2A, 2B)

2 μη κωδικές αλληλουχίες RNA (EBER 1, 2)

2 BamHIA reading frames, BARFs

LMP1

• Κύρια ογκογόνος πρωτεΐνη του EBV

• κλασσικό ογκογονίδιο

• απαραίτητη για τον μετασχηματισμό των

B-λεμφοκυττάρων από τον EBV in vitro

• Μιμείται έναν συνεχώς ενεργοποιημένο CD40 υποδοχέα.

• Συνεχές και ψευδές σήμα Τ-λεμφοκυττάρων στα μολυσμένα B-

λεμφοκύτταρα.

• Πολλαπλασιασμός και αναστολή απόπτωσης

LMP1- μοριακή σηματοδότηση

LMP1- μοριακή σηματοδότηση

• ομο- ή ετεροδιμερή

• έκφραση πολλών γονιδίων:

κυτταρικός πολλαπλασιασμός

διαφοροποίηση

απόπτωση

ογκογένεση

φλεγμονή

NFκΒ (Nuclear Factor K-chain in B-cells)

NFκΒ και LMP1

Συνεχής έκφραση του NF-κΒ

Μετασχηματισμός κυττάρων

Κυτταρική αύξηση

Ραγδαίος πολλαπλασιασμός νεοπλασίες

Οικογένεια TRAF (TNF receptor associated factors)

• Μεταγωγή σήματος

• Σύνδεση σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς ΤΝFR / CD40

• Στρατολογούν πρωτεΐνεςφωσφορυλίωση και ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών

TRAFs και LMP1

• TRAFs σύνδεση στην LMP1

• ενεργοποίηση του NFκΒ

• Μετασχηματισμός Β-

λεμφοκυττάρων

• επιβίωση

TRAF5 (TNF receptor associated factor 5)

• λιγότερο μελετημένη

δεν παίζει σπουδαίο ρόλο στη μεταγωγή σήματος από τον CD40

Όμως...

Η LMP1 χρησιμοποιεί τις TRAF με διαφορετικό τρόπο!

TRAF5 και CD40

• ποντίκια στα οποία δεν εκφράζεται η TRAF5

υγιή

φυσιολογική ενεργοποίηση του NF-κΒ και JNK από τον υποδοχέα

CD40

TRAF5 και LMP1• TRAF5 ουσιώδης για τη μεταγωγή σήματος από την LMP1

• in vivoδεν παρατηρείται αύξηση στο μέγεθος των δευτερογενών λεμφικών

οργάνων (π.χ. σπλήνας)

Μειωμένη ιντερλευκίνη 6

• in vitro δεν ενεργοποιείται το μονοπάτι των κινασών JNK και Akt

Λιγότερο αποτελεσματική φωσφορυλίωση του αναστολέα ΙκΒα

Ρόλος TRAF5 στη βιωσιμότητα των

μολυσμένων με EBV Β- λεμφοκυττάρων

Bιωσιμότητα LCLs shRNA καταστολή έκφρασης του mRNA της TRAF5

LCL- WT (EBV+) BJAB (ΕBV-)

Μείωση βιωσιμότητας Καμία επίδραση

Paul Hadweh(unpublished)

• TRAF5 σημαντική για βιωσιμότητα μολυσμένων με EBV κυττάρων

Με ποιά πρωτεΐνη του EBV αλληλεπιδρά η TRAF5 ?

Σκοπός της διπλωματικής εργασίας

Αλληλεπίδραση TRAF5 με την LMP1

έκφραση της TRAF5 απαραίτητη για την βιωσιμότητα των κυττάρων

όταν εκφράζεται η LMP1?

Μεθοδολογία

1. Σταθερές κυτταρικές σειρές (HEK293FT) που εκφράζουν μόνιμα την

LMP1 - Σειρές ελέγχου

2. Καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης TRAF5

3. Επίδραση της καταστολής αυτής στη βιωσιμότητα των κυττάρων

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν την LMP1

• Πλασμιδιακοί φορείς:

1. pcDNA3-LMP1 γονίδιο LMP1

2. pE-selectin-Zeo γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό Zεοσίνη

pE-selectin-ZeopE-selectin-Zeo γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό Zεοσίνη

Υποκινητής: 3 ρυθμιστικές περιοχές του NF-κΒ

LMP1 ενεργοποιεί NF-κB ενεργοποιεί γονίδιο ανθεκτικότητας

Επιβίωση μόνο κυττάρων με LMP1 σε θρεπτικό με Ζεοσίνη (επιλογή)

Παραμονή του φορέα που φέρει το γονίδιο της LMP1 στο κύτταρο

NFκΒ

zeoLMP1

NFκΒ

Επιμόλυνση με BES και CaCl2

5 μέρες επιλογή

Κλώνοι1000 κύτταρα

HEK293FT

Western BlotΈλεγχος έκφρασης της LMP1

Έλεγχος έκφρασης της LMP1

Κλώνος 3 (LMP1+)

Κλώνος 8 (LMP1 -) Κλώνος 67 (LMP1 +)

Paul Hadweh

Παρεμβολή RNA (RNA interference)

• siRNA TRAF5

• siRNA luciferase

5000/well

MTT

24 h

3 μέρες

Επιμόλυνση με siRNALipofectamine RNAiMAX Reagent

10μl MTT/ well

• 4h

• Αφαίρεση θρεπτικού

• Κρύσταλλοι Φορμαζάνης

• όξινη ισοπροπανόλη

• 1h

• Φωτόμετρο ELISA

Φωτομέτρηση • Περισσότερα ζωντανά κύτταρα περισσότερη φορμαζάνη μεγαλύτερη οπτική απορρόφηση (ΟD)

• Πρότυπες καμπύλες οπτικής απορρόφησης

Αποτελέσματα ΜΤΤP value=0,04

Έκφραση της LMP1 και καταστολή της TRAF5

Ποσοστά αποσιώπησης της TRAF5

p value=0,011 p value=0,010

Καταστολή έκφρασης TRAF5

Μείωση βιωσιμότητας κυττάρων που εκφράζουν την LMP1

Δεν μειώνεται η βιωσιμότητα κυττάρων που δεν εκφράζουν την LMP1

Παρουσία TRAF5 και αλληλεπίδραση με LMP1 σημαντική για την επιβίωση κυττάρων

Παρουσία TRAF5 και αλληλεπίδραση με LMP1 σημαντική για την επιβίωση κυττάρων

TRAF5 δεν παίζει τόσο μεγάλο ρόλο στη μεταγωγή σήματος από τον υποδοχέα CD40

+

TRAF5 στόχος αντινεοπλασματικών θεραπειών Αναστολή σηματοδότησης LMP1

Δεν διαταράσσεται η λειτουργία CD40

Mεταλλαγμένη μορφή LMP1 (δεν αλληλεπιδρά με TRAF5) απαιτεί

ταυτόχρονη έκφραση TRAF5 για τη βιωσιμότητα των κυττάρων?

Υπερέκφραση TRAF5 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με

LMP1, σε σχέση με κύτταρα που δεν εκφράζουν LMP1 ?

TRAF5 απαραίτητη για βιωσιμότητα με LMP1

• TRAF5 επιδρά άμεσα στη μεταγωγή σήματος από την LMP1?

• Ασκεί μια έμμεση επίδραση?

• επιδρώντας σε άλλους παράγοντες καθοδικά της LMP1

• Σταθεροποιώντας άλλες πρωτεΐνεςTRAF

Πλήρης εικόνα αλληλεπίδρασης LMP1-TRAF5

Αντινεοπλασματικές προσεγγίσεις

• αναστολείς της TRAF5 (τοξικότητα)

• θεραπεία (νεοπλασίες του αιμοποιητικού συστήματος)

στόχος το γονίδιο της TRAF5

μείωση βιωσιμότητας καρκινικών κυττάρων (LMP1+)

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ• Επιβλέπων καθηγητής: Γεώργιος Μόσιαλος• Μέλος εξεταστικής επιτροπής: Δήμητρα Ντάφου

• Δρ. Πωλ Χάντουε

• Υποψήφιος διδάκτορας Αθανάσιος Ψευτογκάς• Υποψήφιος διδάκτορας Χρήστος Γωνίδας• Μεταδιδακτορική ερευνήτρια Πανωραία Κοταντάκη • Μεταπτυχιακή φοιτήτρια Βούλα Κυριζάκη• Μεταπτυχιακός φοιτητής Θανάσης Σαχινίδης

CD40 (TNFR- Tumor Νecrosis Factor Receptor)

• T- βοηθητικό λεμφοκύτταρο αναγνωρίζει

το αντιγόνο που του παρουσιάζεται από

κάποιο Β-λεμφοκύτταρο

• CD40L του Τ- βοηθητικού λεμφοκυττάρου

συνδέεται στον CD40 υποδοχέα του Β-

λεμφοκυττάρου

CD40 (TNFR- Tumor Νecrosis Factor Receptor)

• CD40 ολιγομερίζεται και ενεργοποιείται:

• Πολλαπλασιασμός Β-λεμφοκυττάρων

• Διαφοροποίησή σε πλασματοκύτταρα ή κύτταρα μνήμης

• Αύξηση της χημικής συγγένειας των αντισωμάτων προς το

αντιγόνο.