Биоорганическая химия, № 6, 20014

Обзорная статья УДК 577.152.3

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ СИСТЕМЫ ПЛАЗМИНОГЕН/ПЛАЗМИН

2014 г. Р. Б. Айсина, Л. И. Мухаметова

* Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского

государственного университета имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, 119992 Москва

Поступила в редакцию 24.04.2014 г. Принята к печати 30.04.2014 г.

Система плазминоген/плазмин, помимо тромболизиса, играет важную физиологическую и

патологическую роль в ряде других жизненно-важных процессах: деградации внеклеточного

матрикса, эмбриогенезе, миграции клеток, ремоделировании тканей, заживлении ран,

ангиогенезе, воспалении и миграции опухолевых клеток. В обзоре рассмотрены структурные

особенности плазминогена, регулирование его активации физиологическими активаторами

плазминогена, ингибиторами плазмина и активаторов плазминогена, роль связывания

плазминогена с фибрином, клеточными рецепторами и внеклеточными лигандами в

выполнении разнообразных функций образующимся плазмином.

Ключевые слова: плазминоген, плазмин, активаторы плазминогена, ингибиторы,

ангиостатины, фибринолиз, воспаление, ангиогенез, онкогенез.

ВВЕДЕНИЕ

В крови циркулирует плазминоген – профермент плазмина (КФ 3.4.21.7).

Плазминоген синтезируется в печени, во многих органах и тканях и значительные его

количества найдены во внесосудистых жидкостях [1, 2]. Активация плазминогена в плазмин

регулируется активаторами плазминогена тканевого (tPA, КФ 3.4.21.68) и урокиназного типа

(uPA, урокиназа, КФ 3.4.21.31), ингибиторами активаторов плазминогена типа 1 и 2 (PAI-1 и

PAI-2) и ингибиторами плазмина (α2-антиплазмином (α2-AP) и α2-макроглобулином (α2-

Сокращения: PA – активаторы плазминогена; 6AHA – 6-аминогексановая кислота; ACE – ангиотензинпревращающий фермент; α2-AP – α2-антиплазмин; ECM – внеклеточный эндотелиальный матрикс; uPA – двухцепочечная урокиназа; PAI-1 и PAI-2 – ингибиторы активаторов плазминогена типа 1 и 2; K – крингл-домен; LBS – лизинсвязывающий участок; α2-MG – α2-макроглобулин; MMPs – металлопротеиназы; scuPA – одноцепочечная проурокиназа; F – пальцевидный домен; Pm – плазмин; Pg – плазминоген; Glu-Pg и Lys-Pg – Glu- и Lys-формы плазминогена; proMMPs – прометаллопротеиназы; RAS- ренинангиотензиновая система; uPAR – рецептор урокиназы и проурокиназы; VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста; NTP – N-терминальный пептид; tPA – тканевый активатор плазминогена; tAMCHA – транс-(4-аминометил)циклогексанкарбоновая кислота (или транексамовая кислота); PDGF – фактор роста тромбоцитов; FGF – фактор роста фибробластов; EGF – эпидермальный домен фактора роста. Автор для связи (тел.: +7 (495) 939-50-83; факс: +7 (495) 939-54-17; эл. почта: aisina2004@mail.ru).

MG)). Активаторы плазминогена (tPA и uPA) специфически расщепляют одну единственную

активационную связь Arg561-Val562 в одноцепочечной молекуле плазминогена, в результате

чего образуется двухцепочечный фермент плазмин. Появились данные о том, что некоторые

протеазы, такие как калликреин, факторы XIa и XIIa также способны активировать

плазминоген [3, 4]. Для понимания механизмов вовлечения плазмина в различные

физиологические и патологические процессы необходимо рассмотреть структурные

особенности плазминогена, его активаторов, ингибиторов активаторов и ингибиторов

плазмина, участвующих в регуляции активности системы плазминоген/плазмин, их

взаимодействие друг с другом при связывании с фибрином, клеточными рецепторами и

внеклеточными лигандами.

Под термином «система плазминоген/плазмин» в статье подразумевается комплексное

действие плазминогена, его активаторов, ингибиторов активаторов и ингибиторов плазмина

(табл. 1), т.е. рассматривается роль плазмина не только в фибринолизе, но и в ряде других

физиологических и патологических процессах, в которых фибрин либо не участвует, либо не

играет доминирующей роли.

Следующие разделы статьи посвящены рассмотрению структуры отдельных

ключевых компонентов системы плазминоген/плазмин и влияния связывания их с фибрином,

клеточными рецепторами и лигандами внеклеточного эндотелиального матрикса (ECM) на

специфические взаимодействия их друг с другом.

ПЛАЗМИНОГЕН

Структура плазминогена. Нативный Glu-плазминоген является одноцепочечным

гликопротеином (Glu в качестве N-концевой аминокислоты, 2% углеводов, 93 кДа), который

содержит N-терминальный пептид (NTP), пять гомологичных крингл-доменов (K1-К5) и

протеазный домен (PD) (рис. 1). Каждый крингл содержит около 80 а.о., скрепленных тремя

дисульфидными связями [7, 8]. В присутствии следовых концентраций плазмина

отщепляется NTP (остатки 1-77) и образуется Lys-плазминоген (85 кДа, Lys-Pg), N-концевой

аминокислотой которого является лизин или метионин. После расщепления специфической

связи Arg561-Val562 активаторами плазминогена (PA) с одновременным отщеплением NTP

одноцепочечный Glu-плазминоген превращается в двухцепочечный плазмин, в котором

"тяжелая" А-цепь (60 кДа) и "легкая" B-цепь (25 кДа) соединены двумя дисульфидными

связями. Активный центр плазмина, содержащий триаду аминокислотных остатков Ser741,

His603 и Asp646, локализован в “легкой” B-цепи (в PD) [7].

Особенностью плазмин(оген)а является наличие в его кринглах лизинсвязывающих

участков (LBS), обеспечивающих связывание плазмин(оген)а с фибрином, α2-

антиплазмином, клеточными рецепторами и внеклеточными лигандами, сродство к которым

Табл. 1.

Рис.1.

отдельных кринглов разное. Отдельные кринглы К1, К4 и К5 или их комбинации

рассматриваются как связующее звено между плазминогеном и различными типами клеток

[9, 10] и фибрином [11]. Крингл 1 обладает высоким сродством к 6-аминогексановой кислоте

и аминогексиловым лигандам [12], а также к α2-антиплазмину [13] и к богатым гистидином

гликопротеинам [14]. Сродство к интакному фибрину, содержащему только внутренние

лизины, – низкое у крингла 1, умеренное у крингла 2 и высокое у крингла 5, в то время как

крингл 4 практически не имеет сродства к интактному фибрину, хотя может

взаимодействовать с частично деградированным фибрином, содержащим С-концевые

лизины [11]. Крингл 5 обладает самым высоким сродством к эндотелиальным клеткам

человека, то есть взаимодействие плазминогена с эндотелиальными клетками происходит в

основном через крингл 5 [10].

В зависимости от условий молекула плазминогена может принимать разные

конформации. Glu-плазминоген может иметь компактную “закрытую” α-конформацию,

которая поддерживается двумя внутримолекулярными взаимодействиями (между LBS на

крингле 5 и N-терминальным пептидом, и между LBS на крингле 4 и лигандом на крингле 3),

“полуоткрытую” β-конформацию, когда одно из двух взаимодействий еще сохраняется, и

полностью “открытую” γ-конформацию при разрушении обоих лизинзависимых

внутримолекулярных взаимодействий [15]. Lys-плазминоген, лишенный N-терминального

пептида, может иметь только β- или γ-конформацию и активируется быстрее, чем Glu-

плазминоген [16].

Ингибиторы плазмина (L-лизин и структурно подобные ему ω-аминокислоты – 6-

аминогексановая (6AHA) и транексамовая кислоты (tAMCHA)) в низких концентрациях

повышают, а в высоких – ингибируют активациию Glu-плазминогена под действием uPA и

tPA [17], а также рекомбинантной стафилокиназы [18]. Причиной стимулирующего эффекта

низких концентраций ω-аминокислот, которые связываются с LBS крингла 5, является

разрушение одной внутримолекулярной связи и переход “закрытой” конформации Glu-

плазминогена в легче активируемую “полуоткрытую” конформацию. С другой стороны, ω-

аминокислоты вызывают дозозависимое торможение фибринолиза, индуцированного uPA,

tPA [17], стафилокиназой [18] и стрептокиназой [19], что объясняется насыщением этими

ингибиторами высокоаффинных LBS плазминогена и вытеснением его с поверхности

фибрина. Таким образом, при связывании плазминогена через кринглы с высоко- и

низкомолекулярными лигандами его молекула приобретает более открытую, легче

активируемую конформацию.

В плазме крови плазминоген присутствует в виде двух гликоформ, имеющих

одинаковую аминокислотную последовательность [7]. Гликоформа 1 содержит О-связанную

и N-связанную углеводные цепи, а гликоформа 2 – только О-связанную углеводную цепь. N-

Связанный олигосахарид расположен на крингле 3 (на Asn289), а О-связанный олигосахарид

– между кринглами 3 и 4 (на Thr346) (рис. 1). Гликоформа 1 активируется под действием

uPA и tPA медленнее, чем гликоформа 2 [20]. На примере активации Glu- и Lys-форм

плазминогена, индуцированной стафилокиназой, нами показано, что меньшая скорость

активации гликоформы 1, по сравнениию с гликоформой 2, вызвана увеличенным значения

KPg активации гликоформы 1 при идентичных с гликоформой 2 значениях kPg [21]. Фибрин

стимулирует активацию гликоформы 2 обоих плазминогенов (снижение KPg) в большей

степени, чем активацию их гликоформы 1. Следовательно, N-гликозилирование крингла 3

плазминогена создает стерические затруднения как для образования фермент-субстратного

комплекса в растворе, так и изменения конформации этого комплекса на поверхности

фибрина. Таким образом, функциональные свойства плазминогена определяются не только

специфичностью его кринглов к определенным лигандам и конформацией молекулы, но и

типом гликозилирования.

Рецепторы плазминогена. Рецепторы плазминогена существуют на поверхности

клеток различных типов, таких как моноциты, макрофаги, тромбоциты, фибробласты,

эндотелиальные и раковые клетки и др. Установлено, что специфическими рецепторами

плазминогена на клеточной поверхности являются α-энолаза, аннексин II, актин, p11, αIIβ3 и

др. [16]. Эти рецепторы, опознающие LBS на кринглах плазминогена, могут быть как

белковой, так и не белковой природы. Их характерной особенностью является относительно

низкое сродство к LBS плазминогена и необычайно высокая плотность на многих клетках.

Плазминоген связывается также с тетранектином во внеклеточном матриксе [22].

Связывание плазминогена с клеточными рецепторами и внеклеточными лигандами

облегчает его активацию благодаря происходящим при этом конформационным изменениям

его молекулы и защищает образующийся связанный плазмин от инактивации ингибиторами.

АКТИВАТОРЫ ПЛАЗМИНОГЕНА

Структура активаторов плазминогена (tPA и uPA). tPA синтезируется

клетками эндотелия и яйцеклетками, а uPA – лейкоцитами, опухолевыми клетками,

макрофагами и фибробластами [5]. Активаторы плазминогена экспрессируются в виде своих

одноцепочечных предшественников – tPA-1 и scuPA, которые под действием плазмина и

калликреина, соответственно, быстро превращаются в двухцепочечные молекулы tPA и uPA.

Они специфически расщепляют активационную связь Arg561-Val562 плазминогена, в

результате чего образуется фермент плазмин.

Все три протеазы – плазмин, tPA и uPA – являются трипсино-подобными

ферментами, но, в отличие от трипсина, наряду с протеазным доменом (или легкой В-

цепью), который локализован в С-терминальной области их молекул, содержат и другие

доменные структуры. Эти домены, расположенные в тяжелой А-цепи молекул, являются

модулями с замечательной структурно-функциональной автономией, сохранившими

структуру в ходе эволюции [5, 23] (табл. 2). Вставка, дублирование или удаление этих

доменов – процессы, которые можно объяснить перестановкой экзона, – изменяли

специфичность ферментов, создавая, таким образом, эволюционное дерево сериновых

протеаз. Структурные модули тяжелых А-цепей молекул tPA и uPA существенно отличаются

от модулей тяжелой цепи плазмина (рис. 2).

Различие плазминогенактиваторных функций tPA и uPA определяется структурными

модулями их тяжелых А-цепей. Молекула tPA через пальцевидный домен (F) и крингл 2

связывается с фибрином (о функции крингла 1 нет данных) [24], а эпидермальный домен

фактора роста (EGF) ответственен за связывание tPA с клеточными рецепторами. Подобно

плазминогену, tPA обладает высоким сродством к фибрину. Скорость активации

плазминогена под действием tPA в растворе очень низка, но резко увеличивается в

присутствии фибрина. Молекула uPA не содержит пальцевидный домен, а через домен

фактора роста она связывается с рецепторами. Единственный крингл uPA (и scuPA), в

отличие от кринглов tPA и плазмин(оген)а, не имеет сродства к фибрину [25]. Поэтому

фибрин практически не влияет на плазминогенактиваторную активность uPA. На рис. 3

приведены наши экспериментальные данные, которые демонстрируют, что с увеличением

концентрации растворимого фибрина скорость активации плазминогена под действием tPA

значительно повышается, в то время как фибрин не влияет на скорость активации

плазминогена под действием uPA.

Рецепторы tPA. Рецепторы tPA, содержащиеся на поверхности клеток различных

типов, выполняют либо профибринолитическую функцию, либо функцию выведения

активатора из циркуляции. Клетки сосудистого эндотелия богаты рецепторами, которые

локализуют tPA на своей поверхности. Некоторые связывающие центры на поверхности

клеток являются общими для tPA и плазминогена (например, мембранный белок анексин II),

что способствует повышению скорости активации плазминогена и играет важную роль в

поддержании жидкого состояния крови [26]. Основным органом, участвующим в быстром

клиренсе tPA (τ1/2 = 3-5 мин), является печень, эндотелиальные и паренхимальные клетки

которой содержат гетерогенные рецепторы, распознающие разные участки tPA [27].

Плазминогенактиваторная активность tPA существенно увеличивается и при его

взаимодействии с белками ECM такими, как коллаген-IV, ламинин-1 и тромбоспондин, что

может способствовать протеолизу соединительной ткани [28].

Рецепторы uPA. Специфический рецептор uPA и scuPA – uPAR, обнаружен на

моноцитах и опухолевых клетках. Обе формы активатора через домен фактора роста,

расположенный в N-концевой части их молекул, связываются с этим рецептором.

Рис. 2.

Табл.2

Связывание uPA и scuPA с uPAR (Kd ~ 10-9–10-10 М [29]) стимулирует превращение мало

активной формы scuPA в высокоактивную uPA и плазминогена в плазмин. Активация

плазминогена во внеклеточном матриксе под действием uPA, связанной с uPAR на

поверхности клеток, играет ключевую роль в процессах деградации ECM, пролиферации и

миграции клеток и ангиогенеза [30–32]. После нейтрализации uPA, связанной с u-PAR на

поверхности клеток, специфическим ингибитором PAI-1 происходит быстрый захват

комплекса uPA-PAI-1 внутрь клетки и его деградация в лизосомах [33]. На поверхности

гепатоцитов, макрофагов и фибробластов имеется другой рецептор: белоксвязанный

рецептор липопротеинов низкой плотности/2-макроглобулиновый рецептор (LRP), который

также играет важную роль в интернализации uPA. При этом LRP может действовать сообща

с uPAR.

ИНГИБИТОРЫ АКТИВАТОРОВ ПЛАЗМИНОГЕНА И ПЛАЗМИНА

В нейтрализации активности tPA и uPA решающую роль играет быстро действуюший

ингибитор активаторов плазминогена PAI-1 (концентрация PAI-2 в плазме на порядок ниже).

Основным и быстро действуюшим ингибитором плазмина является α2-AP, в то время как

менее специфичный 2-MG начинает инактивировать плазмин только после исчерпания

запаса 2-AP. Физико-химические свойства ингибиторов приведены в табл. 1. PAI-1 и α2-AP,

регулирующие активность системы фибринолиза, относятся к классу серпинов.

Ингибирование tPA, uPA и плазмина серпинами происходит через взаимодействие активного

центра протеаз с экспонированной мобильной реактивной петлей ингибиторов. Механизм

ингибирования протеаз (E) серпинами (I) двухстадийный:

E + I E*I E-I (1)

Ингибитор активаторов плазминогена типа 1. При взаимодействии PAI-1 с uPA

или tPA сначала образуется нековалентный стехиометрический комплекс uPA*PAI-1 или

tPA*PAI-1 (ki > 107 М-1с-1) [34]. На второй стадии происходит расщепление связи Arg346-

Met347 (P1-P1’) в реактивном центре PAI-1 с образованием ковалентной связи между

остатком Arg346 ингибитора и серином активного центра uPA (Ser356) или tPA (Ser478) и

прочных ковалентных комплексов uPA-PAI-1 и tPA-PAI-1 [33]. PAI-1 с одинаковой силой

инактивирует одно- и двухцепочечный tPA, однако он ингибирует uPA значительно сильнее,

чем scuPA.

PAI-1 синтезируется в клетках различных типов, включая гепатоциты, тромбоциты,

эндотелиальные клетки, сосудистые гладко-мышечные клетки, моноциты и макрофаги. Он

k-i

k2 ki

присутствует в плазме и в ECM. Уникальной особенностью PAI-1 является отсутствие

дисульфидных связей, поэтому он циркулирует в плазме в трех формах: активной,

неактивной и латентной [35]. Секретируясь в активной форме, молекула PAI-1 легко (1/2 = 5

мин) переходит в латентную неактивную форму благодаря конформационным изменениям, в

результате которых петля молекулы маскирует его реактивный центр [36]. Латентная форма

может реактивироваться под действием отрицательно заряженных фосфолипидов. Третья,

неактивная форма PAI-1 образуется в результате расщепления его протеазами по

«субстратному» пути. В плазме в комплексе с витронектином, а также в матриксе PAI-1

остается активным намного дольше, чем в свободном состоянии [33].

В патологических условиях, включая тромбозы, воспалительные и другие процессы,

экспрессия PAI-1 разными клетками может стимулироваться цитокинами, ангиотензином-II,

фактором роста, гормонами, липидами, альдостероном, интерлейкином-1, фактором некроза

опухоли и др. [35], что приводит к локальному концентрированию ингибитора. Это особенно

важно в случае тромбоцитов, которые содержат большие количества PAI-1 в латентной

форме [34]. При активации и агрегации тромбоцитов PAI-1 высвобождается и связывается с

фибрином, что объясняет относительную сопротивляемость к лизису тромбов, богатых

тромбоцитами. Фибрин содержит два класса PAI-1-связывающих участков: небольшое число

высокоаффинных с Kd < 1 нМ и большое количество низко-аффинных участков с Kd 3.8 мкМ

[37].

α2-Антиплазмин. На первой стадии реакции плазмина (Pm) с α2-AP образуется

нековалентный фермент-ингибиторный комплекс Pm*α2-AP (ki = 2-4 107 М-1с-1) за счет

взаимодействия остатка лизина С-терминального домена молекулы α2-AP и

комплементарного ему лизинсвязывающего участка на крингле 1 молекулы плазмина [13].

На второй стадии происходит расщепление связи Arg364-Met365 (P1-P1’) в реактивном

центре ингибитора с образованием ковалентной связи между остатком Arg364 ингибитора и

Ser741 активного центра плазмина. Поскольку С-терминальный домен молекулы ингибитора

остается нековалентно связанным с кринглом 1 плазмина, то образуется чрезвычайно

прочный ковалентный комплекс Pm-α2-AP, в котором плазмин имеет, по крайней мере, один

открытый LBS [38].

α2-AP синтезируется клетками печени и тромбоцитами [34]. Он имеет участки

специфического связывания с плазмином и фибрином [38]. В отличие от PAI-1, α2-AP

поперечно сшивается с фибрином и около 20% плазменного ингибитора включается в тромб

[34]. N-Терминальный домен α2-AP связывается с фибрином, средний домен, содержащий

петлю с реактивным центром, взаимодействует с активным центром плазмина, а С-

терминальный домен, содержащий 51 а.о., является уникальным среди серпинов и служит

для связывания с тяжелой цепью плазмина. α2-AP регулирует фибринолиз по трем

механизмам: (1) нейтрализует плазмин в плазме; (2) ингибирует связывание плазмин(оген)а с

фибрином и (3) повышает сопротивляемость сгустка лизису, включаясь в фибриновую сетку

с участием фактора XIIIa (трансглутаминазы), который катализирует образование пептидных

связей между остатком Gln14 N-терминального домена α2-AP и остатком лизина С-концевого

участка α-цепи фибрина [39].

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ СИСТЕМЫ ПЛАЗМИНОГЕН/ПЛАЗМИН

Плазмин специфически расщепляет в белках пептидные связи, образованные

карбоксильными группами L-лизина и L-аргинина [40]. Активный плазмин помимо фибрина,

может разрушать фибриноген, факторы V, VIII [41] и X [42], активировать некоторые

проферменты, включая, tPA-1, scuPA [43] и матричные прометаллопротеазы (proMMPs) [44,

45]. Связывание плазминогена через LBS в его кринглах с фибрином и клеточными

рецепторами промотирует его активацию в плазмин и защищает образующийся связанный

фермент от инактивации α2-AP. Локализация плазминогена на поверхности клеток, имеющих

различные биологические функции, приводит к формированию клеточных поверхностей с

широким спектром протеолитической активности плазмина [46]. Поэтому система

плазминоген/плазмин участвует во многих физиологических и патологических процессах,

включая тромболизис, деградацию внеклеточного матрикса, эмбриогенез, миграцию клеток,

ремоделирование тканей, заживлении ран, ангиогенез, воспаление, онкогенез и

метастазирование [47, 48].

Система плазминоген/плазмин и фибринолиз. Профермент плазмина –

плазминоген – циркулирует в крови в концентрации 2 мкМ. Основной физиологической

функцией плазмина явлется растворение фибрина. Фибрин не является пассивным

субстратом плазмина. С одной стороны, связывание с фибрином превращает закрытую

конформацию плазминогена в открытую, легко активируемую конформацию, с другой

стороны, фибрин защищает образующийся плазмин от ингибирования α2-AP. При

образовании кровяного сгустка (тромба) форменные элементы и белки крови прошиваются

фибриновыми нитями. В физиологических условиях образование фибрина инициирует

активацию плазминогена его активаторами, которые специфично взаимодействуют друг с

другом на поверхности сгустка, генерируя плазмин, эффективно разрушающий фибрин

сгустка до растворимых фрагментов. Особенно ярко влияние фибрина проявляется при

активации плазминогена под действием tPA, который, подобно плазминогену, обладает

высоким сродством к фибрину. Такая солокализация на поверхности фибрина значительно (в

1000 раз) увеличивает скорость активации плазминогена tPA [24, 49]. Кроме того,

образующийся плазмин, лизируя фибрин, создает на его поверхности возрастающее число С-

терминальных лизинов – новых центров связывания плазминогена и tPA, что, в свою

очередь, приводит к значительному увеличению их концентрации на фибрине [50].

В лизисе фибрина тромба доминирующую роль играет tPA [51], в то время как uPA,

не имеющая сродства к фибрину, активирует, в большей степени, плазминоген в плазме и в

ECM [29]. Образование высоких концентраций плазмина в кровотоке при дефиците

ингибиторов фибринолиза может привести к разрушению фибриногена, факторов V, VIII и

X, вызывая серьезный дефект коагуляции и, как следствие, не останавливаемые

кровотечения. При недостаточной экспрессии активаторов плазминогена или высоком

уровне их ингибиторов, приводящих к дефициту плазмина, тромб может частично или

полностью перекрывать просвет сосуда, что является причиной инфаркта миокарда,

инсульта и других тромбоэмболических заболеваний.

Взаимосвязь системы плазминоген/плазмин с ренин-ангиотензиновой системой

(RAS) в циркуляции. Ангиотензинпревращающий фермент (ACE) – ключевой фермент

RAS – катализирует превращение неактивного декапептида ангиотензина-1 (AT-I) в мощный

вазоконстриктор AT-II. Известно, что ингибиторы ACE применяются в качестве

гипотензивных агентов при терапии сердечно-сосудистых заболеваний (инфаркта миокарда,

ишемии и атеросклероза). Имеются данные о некоторых опосредованных функциональных

связях между системой плазминоген/плазмин и RAS в циркуляции. AT-II, связываясь с

рецептором типа I, индуцирует сужение сосудов и секрецию PAI-1 эндотелиальными

клетками, способствуя тем самым развитию тромбоза [52]. Другой основной субстрат ACE

брадикинин вызывает расширение сосудов и стимулирует секрецию tPA эндотелиальными

клетками, повышая тем самым фибринолитический потенциал [53], а деградация

брадикинина под действием ACE увеличивает риск тромбоза. Ингибиторы ACE снижают

продукцию AT-II, предотвращают деградацию брадикинина и агрегацию тромбоцитов [53,

54].

Нами было проведено in vitro исследование перекрестного влияния синтетических

ингибиторов плазмина (6AHA и tAMCHA) и ACE (каптоприла, лизиноприла и

эналаприлата), применяемых в медицине в качестве антифибринолитических и

гипотензивных агентов, соответственно, на активности двух систем [55]. Было обнаружено,

что ингибиторы ACE могут ингибировать, стимулировать или не оказывать влияния на

активацию плазминогена и активность плазмина. Модулирующий эффект зависел от типа

боковых заместителей в молекуле ингибитора и от фибринспецифичности активатора

плазминогена [55]. Лечебные концентрации ингибиторов ACE в плазме относительно низки

(<0.01 мМ) и не влияют на системную активацию плазминогена. Однако в результате

связывания с циркулирующими белками или с поверхностью клеток при длительном

применении ингибиторы ACE могут накапливаться в определенных тканях и прямо влиять

на генерацию плазмина из плазминогена. С другой стороны, ингибиторы плазмина

подавляли активность ACE дозозависимым образом [55] (рис. 4). Этот результат, возможно,

объясняет упоминаемый в литературе побочный гипотензивный эффект действия этих

антифибринолитических агентов [56].

Полученные результаты показывают, что между системой плазминоген/плазмин и

RAS помимо связей, основанных на изменениях секреции компонентов одной системы под

действием изменений секреции компонентов другой системы, могут существовать другие

связи, которые основаны на прямых воздействиях экзогенных ингибиторов одной системы

на активность ферментов другой системы.

Роль системы плазминоген/плазмин в процессах ангиогенеза и воспаления.

Система плазминоген/плазмин играет важную роль в деградации ECM. Связывание с

клеточными рецепторами и внеклеточными лигандами изменяет конформацию плазминогена

в более открытую легче активируемую конформацию [16, 22]. tPA также связывается с

рядом внеклеточных белков, что существенно увеличивает его плазминогенактиваторную

активность и может способствовать протеолизу соединительной ткани образующимся

плазмином [28]. Активация плазминогена урокиназой, связанной с uPAR на поверхности

клеток, играет ключевую роль в процессах деградации ECM, пролиферации и миграции

клеток и ангиогенеза [29–32]. В деградации ECM участвует плазмин, прямо разрушая ряд

белков (ламинин, фибронектин, тромбоспондин и др.), а также через активацию матричных

прометаллопротеиназ (proMMPs) [48]. Секретируемые в виде зимогенов pro-MMPs

активируются вне клеток различными протеиназами [57, 58]. Показано, что плазмин может

активировать простромелизин-1 (proMMP-3), прожелатиназу B (proMMP-9) и

проколлагеназу-3 (proMMP-13) [59]. Активные MMPs, c различными субстратными

специфичностями, могут разрушать большинство компонентов ECM. Плазмин также

активирует и высвобождает сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор

роста фибробластов (FGF), промотируя тем самым ангиогенез [60].

Для ангиогнеза – образования в органе или ткани новых кровеносных сосудов из

существующих, – необходима миграция и пролиферация эндотелиальных клеток, чему

способствует деградация ECM. Система плазминоген/плазмин участвует в нормальном

(физиологическом) и патологическом ангиогенезе. Физиологический ангиогенез (от развития

плода, его рождения и до образования нормальных сосудов во взрослом организме)

протекает с умеренной интенсивностью и ускоряется при некоторых процессах, таких как

регенерация повреждённых тканей, реканализация тромбов и образование рубца. В отличие

от нормальной сосудистой сети, патологический ангиогенез (т.е. при росте и

Рис.4.

метастазировани опухолей, инфаркте миокарда, заживлении ран, хронических

воспалительных заболеваниях и др.) развивается ненормально: сосуды – неоднородны,

нерегулярно разветвлены, имеют множество отверстий и гиперпроницаемы для плазменных

белков [61].

Воспаление и ангиогенез два тесно связанных процесса. Неоваскуляризация

поддерживает условия хронического воспаления (включая псориаз, ревматоидный артрит,

грануломатозные заболевания и др.), поскольку новые несовершенные капилляры облегчают

проникновение лейкоцитов в воспаленный участок. Причина, вызывающая воспалительную

реакцию, может носить биологический, иммунный, химический или метаболический

характер. Воспаление является защитной реакцией организма на различные повреждения и

целенаправлена на устранение причины повреждения, его локализацию, удаление

поврежденных тканей с последующей их регенерацией или восстановлением их функций.

Система плазминоген/плазмин участвует во всех фазах процесса заживления раны. При этом

происходит разрушение фибрина и других белков ECM, а также миграция ороговевших и

воспаленных клеток, регуляция высвобождения и/или активация факторов роста, proMMPs,

ангиогенез и ремоделирование коллагена [62, 63].

Мы изучили участие системы плазминоген/плазмин в процессе воспаления глаза

кролика, вызванного щелочным ожогом роговицы [64, 65]. Рис. 5 демонстрирует повышение

уровней плазмина и плазминогена в различных тканях глаза кроликов (сосудистых и

бессосудистых) и во влаге передней камеры в острой фазе воспалительного процесса,

наблюдаемого на 3-и сутки после ожога [64]. А на рис. 6 представлена динамика изменения

уровней плазмина, плазминогена и его активаторов на разных сроках воспалительного

процесса глаза кролика в слезной жидкости, которая отражает метаболический статус как

внешних, так и внутренних структур глаза [65].

Воспалительный процесс начинался с разрушения верхнего слоя эпителия и

помутнения роговицы, что сопровождалось высвобождением в слезу tPA, uPA и их субстрата

плазминогена и через 2 cут, когда дефект эпителия закрывался, а отек и проницаемость

сосудов увеличились, наблюдался первый пик повышения уровней активаторов и

плазминогена в сравнении с их контрольными уровнями. В последующие дни вновь

обнажалась строма роговицы, в которой начинался процесс изъязвления. Пик изъязвления

роговицы (14 – 21-е дни) сопровождался повторным повышением уровней всех агентов.

Через 28 сут, когда воспалительный процесс затухал, и на месте ожога формировалась

рубцовая ткань, уровни всех агентов падали практически до исходных значений.

Наблюдаемые результаты объясняются тем, что сначала плазмин стимулирует

высвобождение клетками активаторов плазминогена, активирует проколлагеназы, которые

деградируют коллаген в базальной мембране и строме, и разрушает фибронектин в эпителии,

Рис. 5

Рис. 6.

что приводит к развитию повреждения роговицы. Впоследствии плазмин индуцирует

высвобождение эндотелиальными клетками кровеносных сосудов факторов роста,

индуцирующих ангиогенез, а также ингибиторов протеаз и фибронектина, что способствует

заживлению тканей. Плазмин участвует и в удалении рубцовой ткани путем расщепления

фибрина и фибронектина, выполнивших свои функции. Результаты демонстрируют, что

система плазминоген/плазмин играет важную роль не только в развитии воспаления, но и в

заживлении раны.

Роль системы плазминоген/плазмин в онкогенезе. Ключевым процессом для роста,

инвазии и метастазирования опухолей является деградация ECM, в которой принимают

участие несколько протеаз, включая плазмин и матричные MMPs, некоторые из которых

активируются плазмином. Показано, что система плазминоген/плазмин активна практически

во всех типах опухолей, в то время как разные MMPs селективно активны в опухолях разных

типов [29]. Как было сказано ранее, uPA, связанная с uPAR на поверхности клеток, играет

ключевую роль в процессах деградации ECM, пролиферации и миграции клеток и

ангиогенеза, которые способствуют развитию и метастазированию опухоли [30–32].

Считается, что tPA вовлекается, в основном, в процессы фибринолиза [51, 66]. Однако

отмечено, что uPA и tPA могут функционально, до некоторой степени, взаимозаменять друг

друга. Например, специфическое взаимодействие tPA с аннексином на мембране

панкреатических опухолевых клеток активирует плазминоген и промотирует инвазию этих

клеток [67], а uPA (в отсутствие ее рецептора и tPA) может эффективно растворять фибрин

[68]. Показано, что uPA экспрессируется большинством злокачественных клеток, а tPA –

ограниченным числом опухолей (меланомы, нейробластомы, острой не лимфоцитарной

лейкемии и др.). Кроме того, ткани ряда опухолей отличаются повышенной концентрацией

плазминогена [69–71].

Таким образом, опухолевые клетки высвобождают активаторы плазминогена и их

рецепторы, стимулируя тем самым активацию плазминогена вне клеток. Образующийся

плазмин вместе с активированными MMPs вызывают деградацию белков ECM, создавая

условия для миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, необходимых для

формирования новых сосудов [61, 72]. Новые сосуды способствуют росту первичной

«дремлющей» опухоли (< 3 мм3), так как для этого ей требуются все большие количества

кислорода и питательных веществ, а также удаление продуктов ее метаболизма. Кроме того,

в результате разрушения ECM и базальной мембраны плазмином и MMPs опухолевые

клетки вырываются из первичного места локализации, мигрируют через соединительную

ткань и вторгаются в капилляры. После адгезии из кровотока к стенкам сосудов других

органов или тканей они вторгаются в них и пролиферируют, образуя метастазы.

Исследования последних десятилетий убедительно доказали участие системы

плазминоген/плазмин в развитии и метастазировании опухолей [29–32, 61, 72].

Следует отметить, что начало неоваскуляризации «дремлющей» опухоли происходит

из-за сдвига баланса между стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза, которые

высвобождаются и опухолевыми клетками, и стромальными клетками (фибробластами,

макрофагами, лейкоцитами, тромбоцитами и др.). Включение проангиогеного состояния

может быть вызвано либо повышением экспрессии стимуляторов ангиогенеза (сосудистого

фактора роста (VEGF), факторов роста фибробластов (bFGF и aFGF), фактора роста

тромбоцитов (PDGF) и др.) либо подавлением экспрессии ингибиторов ангиогенеза,

действующих локально (тромбоспондина-1 и -2, интерферона-α и др.) или системно (PAI-1,

α2-антиплазмина, эндостатина, вазостатина, ангиостатина и др.) [61, 72].

АНТИАНГИОГЕННАЯ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КРИНГЛ-

ФРАГМЕНТОВ ПЛАЗМИН(ОГЕН)А.

Открытие ангиостатина – ингибитора ангиогенеза – было значимым событием,

которое иллюстрирует связь между системой плазминоген/плазмин и регуляцией

ангиогенеза. Ангиостатин (38 кДа), представляющий собой продукт деградации

плазмин(оген)а и содержащий первые четыре крингла (К1-4) из пяти кринглов его тяжелой

цепи, впервые был обнаружен в мышах с опухолями как системно действующий ингибитор

ангиогенеза [73]. Позднее в тканях опухоли мозга и рака яичников был обнаружен

ангиостатин К1-4.5 (52 кДa), содержащий кринглы 1-4 и часть крингла 5 [74]. Описаны

возможные различные механизмы образования ангиостатинов in vivo.

Один из предполагаемых механизмов образования ангиостатина К1-4 раковыми

клетками PC-3 следующий. Сначала плазминоген под действием uPA или tPA превращается

в плазмин, который, разрушая ECM, стимулирует миграцию клеток, ангиогенез и рост

опухоли (рис. 7). Затем плазмин подвергается автолизу в присутствии свободного

сульфгидрильного донора (R-SH), который, вероятно, участвует также в изменении

конформации плазмина, экспонируя для протеолиза ранее недоступные участки фермента.

Другой механизм предполагает, что фосфоглицераткиназа (PGK), секретируемая

клетками фибросаркомы, может восстанавливать плазмин, облегчая тем самым его автолиз.

Кроме того, различные матричные MMPs могут расщеплять плазмин(оген) [75]. В опухолях

мышей и в клеточной культуральной среде была обнаружена еще одна форма

антиангиогенного фрагмента плазминогена – А61 (61 кДа), который содержит кринглы 1-4 +

7 остатков крингла К5 (Lys78-Lys468) [75]. Образование А61 индуцировалось также при

инкубации клеток HT1080 фибросаркомы с плазминогеном. При этом образование плазмина

Рис. 7.

из плазминогена, автолиз и восстановление связи Cys462-Cys541 фермента стимулируются

рецептором плазмин(оген)а – тетрамером аннексина II [76].

Был предложен также механизм образования ангиостатина опухолевыми клетками без

участия SH-доноров. Плазминоген, связанный через свои кринглы с остатками лизина β-

актина (другого его клеточного рецептора) на поверхности опухолевых клеток (карцинома

простаты PC-3, фибросаркома HT1080 и рак груди MDA-MB231), превращается под

действием uPA в плазмин. В результате протеолиза β-актинсвязанного плазмина в

отсутствие SH-донора происходит образование ангиостатина К1-4.5 [77].

Обнаруженная противоопухолевая активность ангиостатина К1-4 стимулировала

интенсивные исследования крингл-структуры плазминогена. К настоящему времени

получены как отдельные кринглы, так и различные формы природных ангиостатинов, а

также рекомбинантные варианты некоторых из них (recК1-3 и recК1-4). Ангиостатины,

полученные путем гидролиза плазминогена различными протеазами (эластазой,

прокатепсином D, металлоэластазой, пепсином и др.) или автолиза плазмина в различных

условиях, имели значительные вариации молекулярных масс и C- или N-концевых

аминокислотных остатков [75-78]. В табл. 3 суммированы свойства как отдельных кринглов

плазминогена, так и различных ангиостатинов, полученных из плазминогена к настоящему

времени. Две формы ангиостатина, которые в дополнение к К1-4 содержат 7 (К1-4+7rК5) или

69 остатков крингла 5 (К1-4+69rК5), оказались самыми эффективными ингибиторами

пролиферации. Продемонстрирован мощный ингибирующий эффект ангиостатинов К1-4 и

K1-4+69rК5 на рост первичных и метастазирующих опухолей: легочной карциномы Льюиса,

Т241 фибросаркомы, клеточной саркомы ретикулума, карциномы толстой кишки и простаты

[77, 79].

Показано, что в связывании ангиостатинов участвуют, по крайней мере, три

рецептора на поверхности эндотелиальных клеток: ATP-синтаза, интегрин ανβ3 и актин.

Связывание ангиостатинов двумя первыми рецепторами, вероятно, необходимо для передачи

антиангиогенного сигнала внутрь клетки [80]. Известно, например, что ангиостатин

связывается c субъединицами ATP-синтазы на поверхности эндотелиальных клеток, вызывая

цитоплазматический приток H+-ионов и цитолиз [81]. Предполагается, что различные

клеточные компоненты или сигнальные пути вовлекаются в посредничество ингибирующего

эффекта, вызванного ангиостатинами. Механизм антиопухолевого действия ангиостатинов

сложен и до конца не изучен.

Поскольку для роста и метастазирования опухолей необходим постоянный транспорт

питательных веществ к опухоли за счет новообразованных сосудов, то механизм подавления

роста и метастазирования опухоли ангиостатинами, вероятно, связан с ингибированием

ангиогенеза. Нами были получены ангиостатины К1-3, К1-4, К1-4.5 и К1-5 и исследованы их

Табл. 3.

Рис.8.

свойства in vivo и in vitro. Показано, например, что ангиостатин К1-4.5 тормозит

неоваскуляризацию роговицы глаза кроликов, вызванную щелочным ожогом (рис. 8) [65].

Для проверки возможного ингибирования ангиостатинами активности системы

плазминоген/плазмин нами было изучено влияние ангиостатинов К1-3, К1-4, К1-4.5 и К1-5 на

скорость активации нативного Glu-плазминогена под действием uPA и tPA [82]. Выяснилось,

что ангиостатины не влияют на собственные амидазные активности плазмина, uPA и tPA, но

ингибируют дозозависимым образом реакцию превращения плазминогена в плазмин,

индуцированную физиологическими активаторами. При этом ингибирующий эффект

ангиостатинов повышался в ряду: К1-3 < K1-4 < K1-4.5 < K1-5 (рис. 9). Изучение влияния

ангиостатина К1-4.5 на кинетические константы активации Glu-плазминогена (kPg и KPg) его

активаторами показало, что ангиостатин ингибирует активаторную активность uPA (в

растворе) по конкурентному типу, в то время как активаторную активность tPA (в

присутствии растворимого фибрина) по смешанному типу [83]. Из анализа результатов был

сделан вывод, что ангиостатин, содержащий те же кринглы, что и плазминоген, но не

имеющий протеазного домена, конкурентно вытесняет плазминоген из его комплексов с uPA

и tPA, а также плазминоген и tPA с поверхности фибрина, ингибируя тем самым генерацию

плазмина. Полученные результаты указывают, что ингибирование ангиостатинами активации

плазминогена под действием его физиологических активаторов, вовлекается в сложный

механизм их антиангиогенного и противоопухолевого действия. В условиях in vivo

ангиостатины,имитируя плазминоген-связывающую активность, могут ингибировать

активацию Glu-плазминогена, связанного с клеточными рецепторами и различными белками

ECM (включая фибрин), и подавлять, таким образом, миграцию клеток, ангиогенез, рост и

метастазиование опухоли.

Таким образом, многообразие физиологических и патологических процессов, в

которых участвует система плазминоген/плазмин, связано с уникальной структурой

нативного плазминогена, благодаря которой активность высоко эффективного фермента

плазмина находится под жестким контролем конформационных изменений молекулы

плазминогена. Связывание плазминогена через LBS в кринглах с лизиновыми остатками в

субстратах или рецепторах вызывает превращение его закрытой конформации в открытую.

Отрытая форма плазминогена быстро активируется под действием tPA или uPA, а

образующийся связанный плазмин остается защищенным от инактивации α2-антиплазмином.

При активации фибринсвязанного плазминогена активность плазмина фокусируется на

расщеплении его физиологического субстрата фибрина. Локализация плазминогена на

поверхности клеток, имеющих различные биологические функции, и связывание с

внеклеточными лигандами служит основой для участия системы плазминоген/плазмин в

таких процессах как деградация ECM, эмбриогенез, миграция клеток, ремоделирование

тканей, заживление ран, ангиогенез, воспаление и метастазирование опухолей. В дополнение

к этим функциям, плазмин(оген) в результате протеолитической деградации in vivo способен

генерировать ангиостатины (крингл-фрагменты тяжелой цепи), которые обладают

антиангиогенными и противоопухолевыми свойствами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Raum D., Marcus D., Alper C.A., Levey R., Taylor P.D., Starzl T.E. // Science. 1980. V.

208. P. 1036–1037.

2. Zhang L., Seiffert D., Fowler B.J., Jenkins G.R., Thinnes T.C., Loskutoff D.J., Parmer R.J.,

Miles, L.A. // Thromb. Haemost. 2002. V. 87. P. 493–501.

3. de Souza L.R., M. Melo P., Paschoalin T., Carmona A.K., Kondo M., Hirata I.Y., Blaber

M., Tersariol I., Takatsuka J., Juliano M.A., Juliano L., Gomes R.A., Puzer L. // Biochem. Biophys.

Res. Communs. 2013. V. 433. P. 333–337.

4. Miles L.A., Castellino F.J., Gong Y. // Trends Cardiovasc. Med. 2003. V. 13. P. 21–30.

5. Binder B.R. // Fibrinolysis. 1995. V. 9 (Suppl. 1). P. 3–8.

6. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и

возможности терапии. М.: Изд-во «Спорт и культура». 1999. 463 c.

7. Ponting C.P., Marshall J.M., Cederholm-Williams S.A. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1992.

V. 3. P. 605–614.

8. Soff G.A. // Cancer Metastasis Rev. 2000. V. 19. P. 97–107.

9. Miles L.A., Dahlberg C.M., Plescia J., Felez J., Kato K., Plow E.F. // Biochemistry. 1991.

V. 30. P. 1682–1691.

10. Wu H.L., Wu I.S., Fang R.Y., Hau J.S., Wu D.H., Chang B.I., Lin T.M., Shi G.Y. // Biochem.

Biophys. Res. Communs. 1992. V. 188. 703–71.

11. Thorsen S., Clemmensen I., Sottrup-Jensen L., Magnusson S. // Biochim. Biophys. Acta.

1981. V. 668. P. 377–387.

12. Matsuka Iu.V., Novokhatniĭ V.V., Kudinov S.A. // Ukr. Biokhim. Zh. 1990. V. 62. P. 83–86.

13. Wiman B., Lijnen H.R., Collen D. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 579. P. 142–154.

14. Lijnen H.R., Hoylaerts M., Collen D. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 10214–10222.

15. Rijken D.C., Sakharov D.V. // Thromb. Res. 2001. V. 103. P. S41–49.

16. Castellino F.J., Ploplis V.A. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 647–654.

17. Takada A., Makino Y., Takada Y. // Thromb. Res. 1986. V. 42. P. 39–47.

18. Levashov M.Yu., Aisina R.B., Gershkovich K.B., Varfolomeyev S.D. // Biochemistry

(Moscow). 2007. V. 72. P. 707–715.

19. Айсина Р.Б., Гайсарян Е.C., Снитко Я.Э., Варфоломеев С.Д. // Биоорган. Химия. 1993.

V. 20. P. 182–189.

20. Davidson D.D., Castellino F.J. // J. Clin. Invest. 1993. V. 92. P. 249–254.

21. Aisina R., Moukhametova L., Gershkovich K., Varfolomeyev S. // Biochim. Biophys. Acta.

2005. V. 1725. P. 370–376.

22. Mogues T., Etzerodt M., Hal C., Engelich G., Graversen J.H., Hartshorn K.L. // J. Biomed.

Biotechnol. 2004. V. 2. P. 73–78.

23. Lijnen H.R., Collen D. // Baillieres Clin. Haematol. 1995. V. 8. P. 277–290.

24. Rijken D.C., Hoylaerts M., Collen D. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 2920–2925.

25. Duffy M.G. // Fibrinolysis. 1993. V. 7. P. 295–302.

26. Cesarman-Maus G., Hajjar K.A. // Brit. J. Haematol. 2005. V. 129. P. 307–321.

27. Otter M., Kuiper J., van Berkel T.J., Rijken D.C. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992. V. 667. P. 431–

442.

28. Stack M.S., Gately S., Bafetti L.M., Enghild J.J., Soff G.A. // Biochem J. 1999. V. 340. P.

77–84.

29. Dano K., Behrendt N., Hoyer-Hansen G., Johnsen M., Lund L.R., Ploug M., Romer J. //

Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 676–681.

30. Vassalli J.D. // Fibrinolysis. 1994. V. 8. P. 172–181.

31. Stillfried G.E., Saunders D.N., Ranson M. // Breast Cancer Res. 2007. V. 9. P. R14.

32. Ploug M. // Curr. Pharmaceut. Design. 2003. V. 9. P. 1499–1528.

33. van Meijer M., Pannekoek H. // Fibrinolysis. 1995. V. 9. P. 263–276.

34. Booth N.A. // Fibrinolysis and Proteolysis. 2000. V. 14. P. 206–213.

35. Ha H., Oh E.Y., Lee H.B. // Nat. Rev. Nephrol. 2009. V. 5. P. 203–211.

36. Francis C.W. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2002. V. 126. P. 1401–1404.

37. Smolarczyk K., Boncela J., Szymanski J., Gils A., Cierniewski C.S. // Arterioscler. Thromb.

Vasc. Biol. 2005. V. 25, P. 2679–2684.

38. Mutch N.J., Thomas L., Moore N.R., Lisiak K.M., Booth N.A. // J. Thromb. Haemost. 2007.

V. 5. P. 812–817.

39. Kimura S., Aoki N. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 15591–15595.

40. Фибринолиз: Cовременные фундаментальные и клинические концепции. Пер. c англ.

// Под ред. П. Дж. Гаффни., С. Балкув-Улютина. М.: Медицина. 1982. 240 с. (Fibrinolysis:

current fundamental and clinical concepts. Patrick J. Gaffney. International Society of Hematology.

European and African Division. Academic Press. 1978. 240 р.)

41. Ogiwara K., Nogami K., Nishiya K., Shima M. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2010. V. 21. P.

568–576.

42. Pryzdial E.L., Lavigne N., Dupuis N., Kessler G.E. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 8500–

8505.

43. Waisman D.M. // Plasminogen: Structure, Activation and Regulation. Springer. 2003. 318 p.

44. Gavrilovic J., Murphy G. // Cell Biol. Int. Rep. 1989. V. 13. P. 367–375.

45. Santala A., Saarinen J., Kovanen P., Kuusela P. // FEBS Lett. 1999. V. 461. P. 153–156.

46. Miles L., Parmer R. // Semin. Thromb. Hemost. 2013. V. 39. P. 329–337

47. Law R.H.P., Abu-Ssaydeh D., Whisstock C. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2013. V. 23. P.836–841.

48. Syrovets T., Simmet T. // Cell Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 873–885.

49. Medved L., Nieuwenhuizen W. // Thromb. Haemost. 2003. V. 89. P. 409–419.

50. Rijken D.C., Sakharov D.V. // Thromb. Res. 2001. V. 103. P. S41–49.

51. Collen D., Lijnen H.R. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 627–630.

52. Mogielnicki A., Chabielska E., Pawlak R., Szemraj J., Buczko W. // Thromb. Haemost. 2005. V.

93. P. 1069–1076.

53. Pretorius M., Rosenbaum D.A., Vaughan D.E., Brown N.J. // Circulation. 2003. P. 107. P. 579–

585.

54. Brown N.J., Ryder D., Gainer J.V., Morrow J.D., Nadeau J. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. //

V. 279. P. 703–712.

55. Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Биневский П.В., Айсина Р.Б., Кост О.А., Никольская

И.И. // Биоорг. химия. 2008. Т. 34. С. 471–478. (Mukhametova L.I., Gulin D.A., Binevskii P.V.,

Aisina R.B., Kost O.A., Nikol'skaia I.I. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2008. V. 34. Р.

421–427.)

56. Энциклопедия лекарств / Ред. Ю.Ф. Крылов. М.: «РЛС-2001». 2001.

57. Birkedal-Hansen H., Moore W.G., Bodden M.K., Birkedal-Hansen B., DeCarlo A., Engler J.A.

// Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1993. V. 4. P. 197–250.

58. Kleiner D.E., Stetler-Stevenson W.G. // Curr. Opin. Cell. Biol. 1993. V. 5. P. 891–897.

59. Ugwu F., Van Hoef B., Bini A., Collen D., Lijnen H.R. // Biochemistry 1998. V. 37. P. 7231–

7236.

60. Mulligan-Kehoe M.J., Drinane M.C., Mollmark J., Casciola-Rosen L., Hummers L.K., Hall A.,

Wigley F.M., Simons M. // Arthritis Rheum. 2007. V. 56. P. 3448–3458.

61. Dvorak H.F. // J. Thromb. Haemost. 2005. V. 3. P. 1835–1842.

62. Del Rosso M., Fibbi G., Pucci M., Margheri F., Serratì S. // Front. Biosci. 2008. V. 13. P.

4667–4686.

63. Li W.Y., Chong S.S., Huang E.Y., Tuan T.L. // Wound Repair Regen. 2003. V. 11. P. 239–247.

64. Чеснокова Н.Б., Никольская И.И., Мухаметова Л.И., Кост О.А., Айсина Р.Б., Безнос О.В.,

Столярова Е.П., Гулин Д.А., Биневский П.В. // Российский офтальмологический журнал.

2008. Т. 1. С. 46–50.

65. Гулин Д.А. Кинетические закономерности и механизм регуляции активности

фибринолитической системы различными эффекторами. Диссертация канд. хим. наук. МГУ

им. М.В. Ломоносова М., 2009. 153 с.

66. Melchor J.P., Strickland S. // Thromb. Haemost. 2005. V. 93. P. 655–660.

67. Díaz V.M., Hurtado M., Thomson T.M., Reventós J.Ю, Paciucci R. // Gut. 2004. V. 53. P. 993–

1000.

68. Bugge T.H., Flick M.J., Danton M.J., Daugherty C.C., Romer J., Dano K., Carmeliet P., Collen

D., Degen J.L. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5899–5904.

69. Burtin P., Chavanel G., Andre J. // Int. J. Cancer. 1985. V. 35. P. 307–314.

70. Clavel C., Chavanel G., Birembaut P. // Cancer. Res. 1986. V. 46. P. 5743–5747.

71. Burtin P., Chavanel G., Andre-Bougaran J., Gentile A. // Int. J. Cancer. 1987. V. 39. P. 170–

178.

72. Wojtukiewicz M.Z., Sierko E., Klementyz P., Rakz J. // Neoplasia. 2001. V. 3. P. 371–384.

73. O’Reilly M.S., Holmgren L., Chen C., Folkman J. // Nat. Med. 1996. V. 2. P. 689–692.

74. Gately S., Twardowski P., Stack S., Cundiff D., Grella D., Castellino F.J., Enghild J., Kwaan

H.C., Lee F., Kramer R., Volpert O., Bouck N., Soff G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94.

P. 10868–10872.

75. Kassam G., Kwon M., Yoon C.-S., Graham K.S., Young M.K., Gluck S., Waisman D.M. // J.

Biol. Chem. 2001 V. 276. P. 8924–8933.

76. Kwon M., Waisman D.M. // Plasminogen: Structure, Activation and Regulation / Ed. Waisman

D.M. N.Y.: Kluwer Academic/Plenum Publishers. 2003. P. 135–156.

77. Cao R., Wu H.L., Veitonmaki N., Linden P., Farnebo J., Shi G.Y., Cao Y. // Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 1999. V. 96. P. 5728–5733.

78. Wu H.-L., Chang B.-I., Wu D.-H, Chang L.-C., Gong C.-C., Lou K.-L., Shi G.-Y. // J. Biol.

Chem. 1990. V. 265. P. 19658–19664.

79. Cao Y. // Haematologica. 1999. V. 84. P. 643–650.

80. Chen Y.-H., Wu H.-L., Li C., Huang Y.-H., ChiangC.-W, Wu M.-P., Wu L.-W. // Thromb.

Haemost. 2006. V. 95. P. 668–677.

81. Moser T.L., Stack M.S., Asplin I., Enghild J.J., Jrup P., Everitt L., Hubchak S., Schnaper

H.W., Pizzo S.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 2811–2816.

82. Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Гулин Д.А., Левашов М.Ю., Присяжная Н.В.,

Гершкович К.Б., Варфоломеев С.Д. // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 1356–1367. (Aisina R.B.,

Mukhametova L.I., Gulin D.A., Levashov M.Y., Prisyazhnaya N.V., Gershkovich K.B.,

Varfolomeyev S.D. // Biochemistry (Moscow). 2009. V. 10. P. 1104–1113.)

83. Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Присяжная Н.В., Гулин Д.А., Левашов М.Ю.,

Гершкович К.Б. // Биоорг. химия. 2011. Т. 37. С. 1–8. (Aisina R.B., Mukhametova L.I.,

Prisiazhnaia N., Gulin D.A., Levashov M.Y., Gershkovich K.B. // Russian Journal of Bioorganic

Chemistry. 2011. V. 3. P. 319–326.)

Таблица 1. Биохимическая характеристика основных компонентов системы

плазминоген/плазмин [5, 6].

Компонент

Амино-кислоты

Мол. масса,

кДа

Концен-трация

в плазме

Время полужизни

в плазме

Активный центр

Плазминоген 791 93 0.2 мг/мл 53 ч (Glu-Pg) 19 ч (Lys-Pg)

His603 Asp646 Ser741

Тканевый активатор плазминогена (tPA) 530 70 5-10 нг/мл 3-5 мин

His322 Asp371 Ser478

Урокиназа (uPA) 411 55/33 1 нг/мл 5-10 мин His204 Asp255 Ser356

2-Антиплазмин (2-AP) 452 67 0,07 мг/мл 50 ч Arg364 Met365

2-Макроглобулин (2-MG) 4 160 2,5 мг/мл - -

Ингибитор активаторов плазминогена типа 1 (PAI-1) 379 52 50 нг/мл 5-7 мин Arg346

Met347 Ингибитор активаторов плазминогена типа 2 (PAI-2) 393 46/60 < 5 нг/мл - Arg358

Thr359

Таблица 2. Структурные модули ферментов системы плазминоген/плазмин [5].

Символ Модули Функция

Крингл-домен (K) Связывание Lys- и Arg-остатков

Эпидермальный домен

фактора роста (EGF) Связывание с рецептором

Витамин-К-зависимый Са2+-

связывающий домен Связывание кальция

Пальцевидный домен (F) Связывание с фибрином

Протеазный домен (PD) Расщепление Lys- и Arg-связей

в субстратах

Таблица 3. Ингибирующие эффекты крингл-фрагментов плазминогена на

пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, на опухолевую активность и их

связывающая способность с 6AHA и tAMCHA [75].

Кринглы Ингибирование пролиферации

IC50, нМ

Ингибирова- ние миграции

Связывание с 6АHA,

мкМ

Связывание с tAMCHA,

мкМ

Ингибирование опухолевой активности

K1 320 +/- 12 1 ?

K2 ? + 560 94 ?

K3 460 + – – ?

K4 – + 26 5 ?

K5 40 + 140 22 ++

K1-4 135 +++ +++ +++ ++

K1-3 70 +/- +++ +++ ++

К1-4+7rК5 35

К1-4+69rК5 0.05 ++ +++ +++ +++

К2-3 – ++ +++ +++ ?

recK1-3 и recK1-4 17

Обозначения: - отсутствие эффекта; +/- – минимальный эффект потенцирования; +, ++

и +++ – различные степени потенцирования и «?» – эффект неизвестен.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Структура молекулы Glu-плазминогена [8]: PD – протеазный домен плазмина

(остатки Val562-Asn791); K1 – К5 – крингл-домены; NTP – N-терминальный пептид

(остатки 1-77); – центры гликозилирования; Большая стрелка с надписью PA – пептидная

связь Arg561-Val562, расщепляемая активаторами плазминогена; Маленькие стрелки – места

расщепления другими протеазами; * — остатки цистеинов, образующих S=S-связь между К2

и К3; ● – аминокислоты активного центра фермента H603, D646, S741

Рис. 2. Схематичное представление строения двухцепочечных молекул сериновых

протеаз системы плазминоген/плазмин.

Рис. 3. Зависимость скорости активации Glu-плазминогена (1 мкМ), инициированной

0.25 МЕ/мл tPA (1) и 0.25 МЕ/мл uPA (2), от концентрации растворимого фибрина (37ºC, pH

7.4) (p<0.01) [65].

Рис. 4. Дозозависимое влияние ингибиторов плазмина 6AHA (1) и tAMCHA (2) на

активность ACE [55] (p < 0.01).

Рис. 5. Удельная активность плазмина (а) и удельная потенциальная активность

плазминогена (б) в гомогенатах тканей глаза кроликов: 1 – хрусталик; 2 – стекловидное тело;

3 – радужка; 4 – цилиарное тело; 5 – сетчатка; 6 – хориоидея; 7 – роговица; 8 – конъюктива.

На вставках активность плазмина (а) и плазминогена (б) во влаге передней камеры. Темные

столбцы – здоровые животные, светлые – третьи сутки после ожога роговицы [65] (p<0.01).

Рис. 6. Динамика изменения уровней активаторов tPA (1) и uPA (2) (а), а также

плазминогена (1) и плазмина (2) (б) в слезной жидкости при воспалительном процессе глаза

кроликов, вызванном щелочным ожогом роговицы, в сравнении с их контрольными

уровнями [65].

Рис. 7. Механизм генерации ангиостатина, опосредованный опухолевыми клетками.

(а) – Плазминоген превращается в плазмин в результате расщепления пептидной связи

Arg561-Val562 активаторами плазминогена; (б) – Плазмин, являясь проангиогенной

протеиназой, способен деградировать белки ECM, облегчая миграцию эндотелиальных

клеток и ангиогенез; (в) – Плазмин благодаря автолизу в присутствии сульфгидрильного

донора превращается в ингибитор ангиогенеза ангиостатин [74].

Рис. 8. Влияние ангиостатина К1-4.5 (1) на неоваскуляризацию роговицы глаза

кроликов, вызванную щелочным ожогом, (2) – Контроль [65].

Рис. 9. Дозозависимое влияние ангиостатинов К1-3(1), К1-4 (2), К1-4.5 (3) и К1-5 (4)

на активацию Glu-плазминогена под действием uPA в отсутствие фибрина (а) и под

действием tPA в присутствии фибрина (б). p<0.05 [83].

Structure and functions of plasminogen/plasmin system R. B. Aisina# and L. I. Mukhametova

#Phone: +7 (495) 939-50-83; fax: +7 (495) 939-54-17; e-mail: aisina2004@mail.ru

Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory, Moscow, 119992

Russia

The main physiological function of plasmin is a blood clot fibrinolysis and restore normal blood

flow. To date, however, it became apparent that in addition to thrombolysis plasminogen/plasmin

system plays an important physiological and pathological role in the degradation of extracellular

matrix, embryogenesis, cell migration, tissue remodeling, wound healing, angiogenesis,

inflammation and tumor cells migration. This review focuses on the structural features of

plasminogen, the regulation of its activation by physiological plasminogen activators, inhibitors of

plasmin and plasminogen activators, the role of the plasminogen binding to fibrin, cellular receptors

and extracellular ligands in performing various functions by formed plasmin.

Keywords: plasminogen, plasmin, plasminogen activators, inhibitors, angiostatins, fibrinolysis, inflammation, angiogenesis, oncogenesis

Рис. 1.

Рис. 2.

[Растворимый фибрин], нM0 20 40 60 80

Ско

рост

ь ак

тива

ции,

%

0

20

40

60

80

100

1 2

Рис. 3

[Ингибитор], мM1 10 100

Акт

ивно

сть,

%

0

20

40

60

80

100

1

2

Рис. 4.

Рис. 5.

0 1 3 7 14 21 280

200

400

600

0 1 3 7 14 21 280

200

400

600

Cутки

1

21

2

(а) (б)

Акт

ивно

сть,

%

Cутки

Рис. 6.

Рис. 7.

Рис. 8.

Рис. 9.