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辅助生育技术（辅助生育技术（ ARTsARTs ））

南京医科大学第一附属医院妇产科江苏省生殖医学重点实验室

临床生殖医学中心 冒韵东

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迷迷人人的的领领域域

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不孕、不育的定义和概念不孕症 一对有正常性生活的配偶，未经避孕在一年

后仍未怀孕。原发性不孕 过去从未怀孕过。

继发性不孕 过去曾经怀孕过。

不育症 不孕，或虽然怀孕，但反复胎儿丢失， 不

能获得孩子。

受孕力 一对配偶在一段特定时间内受孕的可能性， 通常的特定时间是指一个月。

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不孕症的发病率

美国 8.4%

北欧 8.4-21%

发展中国家 10-30%

上海 10-15%

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不孕症发病率升高的原因妇女的社会地位的改变；婚姻延迟；生育延迟；避孕方法的广泛采用；人工流产的解禁；对环境和生态问题的关注；经济条件的不利；

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不孕的发生率随年龄增长而明显上升 年龄 不孕（ % ）

20-24 7.0 25-29 8.9 30-34 14.6 35-39 28.7 40-44 33.0

> 45 ~87

不孕与年龄

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不孕与时间 时间 受孕比例 受孕力 半年 75%

1 年 86% 0.2

2 年 9.6%

3 年 2.5% 0.08

4 年 0.06

5 年 0.04

6 年 0.02

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不孕症（ 2 年） = 低受孕率者 + 无能力受孕者

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不孕的病因

排卵因素 10-15%

盆腔因素 30-40%

男性因素 30-40%

宫颈 - 精子因素 10-15%

不明原因 10%

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不孕症治疗的新方法 ARTs Assisted Reproductive Technologies 辅助生育技术 对精卵和胚胎进行显微操作治疗不孕症的方法

体外受精和胚胎移植 输卵管配子移植 卵巢刺激 胚胎冷冻 单精子卵浆内穿刺 胚胎共培养 赠卵和代孕母亲 囊胚培养 胚胎种植前基因诊断 卵子体外成熟 卵子库 卵巢移植

人类克隆 伦理和法规

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））原理： 任何能够增加到达受精部位的精子数的

方法都会促进受精的机会； 促排卵可以选择卵子和大量精子相遇的

最佳时间； 帮助精子通过宫颈屏障； 促排卵可增加雌激素水平，改善宫颈粘液的质量和数量。

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））适应症： 宫颈原因的不孕（粘液分泌异常、 ASAB＋）； 男女性生殖道畸形及心理因素导致性交不能； 轻度男性少、弱精，液化不良（精子计数大于 20

00 万 /ml ，活率 >40% ， a+b级精子 >25% ）； 轻微子宫内膜异位症； 非特异性免疫性不孕； 不明原因的不孕（经腹腔镜检证实）。

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））禁忌症： 女方因输卵管因素造成的精子和卵子结合障碍。 女方有生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病。 女方有遗传病、严重躯体疾病、精神心理障碍。 有先天缺陷婴儿出生史并证实为女方因素所致。 女方接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用

期。 女方具有酗酒、吸毒等不良嗜好。

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排卵的监测

基础体温测定 最低点宫颈黏液 Insler评分 8-10分B超监测 最大卵泡直径 22-24 mm激素的测定 尿黄体生成激素（ LH） + 血清雌激素 (E2)

选择最佳扳机时间注射hCG

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））精子的处理：洗涤法 上游法梯度离心法 PERCOLL

ISOLATE

注射精子的容量为 0.3-0.5ml

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宫腔内人工授精（宫腔内人工授精（ IUIIUI ））

并发症 子宫痉挛 盆腔感染 刺激抗精子抗体产生

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体外受精和胚胎移植（体外受精和胚胎移植（ IVF-ET)IVF-ET)

1880 年 开始最早的哺乳动物体外受精实验； 1931 年 Huxly 第一次在科幻小说中描述人类体外

受精的过程。英国的 Pincus开始人卵实验； 1959 年 中国学者 Chang 第一次成功进行兔的体外

受精和胚胎移植； 1968 年 英国的 Edwards 和 Steptoe 医生一道进行

人的体外受精实验；

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体外受精和体外受精和胚胎移植（胚胎移植（ IVF-ET)IVF-ET)

19781978 年世界第一例试管婴儿年世界第一例试管婴儿诞生。诞生。

人类体外受精人类体外受精 -- 胚胎移植（胚胎移植（ inin-vitro fertilization embryo tra-vitro fertilization embryo transfer, IVF-ETnsfer, IVF-ET ）方法的建立）方法的建立。。

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试管婴儿试管婴儿的先驱者的先驱者SteptoeSteptoe 与与EdwardsEdwards ((1985) 1985) 在在英国剑桥英国剑桥

附近的附近的 Bourn Hall cli

nic 。

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19881988 年年 20002000 助孕婴儿助孕婴儿 (( 试管婴儿为主试管婴儿为主 )) 大聚会大聚会

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1993 年 10 月 Louise Brown( 右 )

与全家在加拿大Montreal 。 Louise 的妹妹也为试

管婴儿。

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试管婴儿的先驱试管婴儿的先驱 EdEdwards(1994)wards(1994)

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EDWARDS EDWARDS 与张丽珠教授与张丽珠教授 (( 西安西安 ,2002-4),2002-4)

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体外受精和胚胎移植（ IVF-ET)

适应症： 输卵管因素 子宫内膜异位症轻度男性因素 不明原因的不孕 反复 IUI 治疗失败免疫性不孕

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输卵管造影输卵管造影 (HS(HSG)G)

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双输卵管积水双输卵管积水

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体外受精和胚胎移植（体外受精和胚胎移植（ IVF-ET)IVF-ET)

基本步骤控制性促超排卵 B超下穿刺取卵 精子的处理 体外受精和培养 胚胎移植健黄体治疗

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经阴道 B超下取卵术

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: ARTs冒韵东 49IVFIVF

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胚胎移植术

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江苏省首例试管婴儿诞生江苏省首例试管婴儿诞生

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显微操作辅助受精显微操作辅助受精南京医科大学第一附属医院南京医科大学第一附属医院 //

江苏省人民 医院 妇产科江苏省人民 医院 妇产科江苏省生殖医学重点实验室江苏省生殖医学重点实验室

临床生殖医学中心临床生殖医学中心冒韵东冒韵东

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引 言引 言 对部分原因不明的不育及严重男性因素 对部分原因不明的不育及严重男性因素

不育症 的治疗，常规不育症 的治疗，常规 IVF-ETIVF-ET 技术已不技术已不能 完全适应临床需要。能 完全适应临床需要。

显微操作辅助受精技术。显微操作辅助受精技术。

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以往治疗男性不育，效果不佳。以往治疗男性不育，效果不佳。 近十多年来也用近十多年来也用 IVF-ETIVF-ET 治疗男性不育治疗男性不育

症症 ,, 每周期自然妊娠率仅为每周期自然妊娠率仅为 1%-2%1%-2% 。。 提高精子质量，效果甚微或无效。提高精子质量，效果甚微或无效。 抗精子抗体，抗透明带抗体的存在及透 抗精子抗体，抗透明带抗体的存在及透

明带增厚，精子质量正常卵子不能受精明带增厚，精子质量正常卵子不能受精 ,,目前常规 目前常规 IVF-ETIVF-ET 技术难以克服技术难以克服。。

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生化方法在透明带 上钻孔让精子易达卵细胞膜生化方法在透明带 上钻孔让精子易达卵细胞膜使卵细胞受精。使卵细胞受精。

透明带部分切除（透明带部分切除（ partial zona dissectionpartial zona dissection ，， PZPZDD ）辅助受精， 获得首例活产。）辅助受精， 获得首例活产。

激光方法打孔。激光方法打孔。 透明带下受精（透明带下受精（ Subzonal inseminationSubzonal insemination ， ， SUZSUZ

II 或或 subzonal sperm insertionsubzonal sperm insertion ，， SZISZI透 明带下透 明带下精子注入）精子注入）

卵细胞浆内单精子注射卵细胞浆内单精子注射 (intracyto-plasmic sper(intracyto-plasmic sperm injectionm injection ， ， ICSIICSI ）。）。

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获世界首例PZD 活产的

Dr Jean Cohen

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机械法机械法 PZDPZD

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19921992 年，比利时布鲁塞尔自由大学中心的 年，比利时布鲁塞尔自由大学中心的 PalermoPalermo等将等将精子直接注射到卵细胞浆内，结 果发现被注射的卵子受精子直接注射到卵细胞浆内，结 果发现被注射的卵子受精、卵裂均正常。由此诞生了人类首例精、卵裂均正常。由此诞生了人类首例 ICSIICSI 法试管婴法试管婴儿。儿。 19931993 年其受精率即已达年其受精率即已达 44%-64%44%-64% ，远较当时，远较当时 SUZSUZI I 的受精 率的受精 率 14%-18%14%-18%为高。仅有约为高。仅有约 8%8% 的卵细胞受损的卵细胞受损。 临床妊娠率分别为。 临床妊娠率分别为 35%(35%(每个周期每个周期 )) 和和 39%(39%(每胚胎移每胚胎移植植 )) ，每胚胎移植后胚胎种植持续，每胚胎移植后胚胎种植持续 ((妊娠妊娠 )) 率为率为 20.8%20.8% 。。

19951995 年，年， CohenCohen等报告等报告 335335 例例 ICSIICSI 与以前的与以前的 921 921 例例 SUSUZI/PZDZI/PZD 比较，单精受精率分别为比较，单精受精率分别为 65%65% 和和 21%21% ；临床妊；临床妊娠率分别为娠率分别为 42%42% 和和 24%24% ；有趣的是两者胚胎种植率类；有趣的是两者胚胎种植率类似，分别为似，分别为 22%22% 和和 19%19% 。。

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世界首例世界首例 ICSIICSI的完成者的完成者

G.D.PalermoG.D.Palermo

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DevroeyDevroey教授教授 ((西安西安 ,2002-4),2002-4)

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显微操作辅助受精

显微操作辅助受精

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ICSIICSI 受精的生物学特点：受精的生物学特点： 正常受精：产生顶体反应的精子与卵膜 正常受精：产生顶体反应的精子与卵膜

的融合，卵子激活以及女性、男性原核 的融合，卵子激活以及女性、男性原核 形成。形成。

ICSIICSI ：注射时精子的顶体状态不明，而 ：注射时精子的顶体状态不明，而 卵与精子质膜的融合也不存在。卵与精子质膜的融合也不存在。

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精卵融合精卵融合

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ICSIICSI 的适应症的适应症 严重少精症（严重少精症（ Severe oligospermiaSevere oligospermia ）） 弱精症（弱精症（ AsthenospermiaAsthenospermia ）） 畸精症（畸精症（ TeratospermiaTeratospermia ）） 严重的少、弱、畸精子症：严重的少、弱、畸精子症：以上三种异以上三种异

常的任何组合；常的任何组合； ““ 死精”（不活动的活精子〕。死精”（不活动的活精子〕。

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阻塞性无精子症阻塞性无精子症 生精功能障碍生精功能障碍 男性免疫性不育男性免疫性不育 以往以往 IVFIVF 时所有卵细胞均不受精或受精率低下时所有卵细胞均不受精或受精率低下

(<20%) (<20%) 精子无顶体（园头精子）或顶体功能异常精子无顶体（园头精子）或顶体功能异常 射精障碍（如截瘫或逆向射精）。射精障碍（如截瘫或逆向射精）。 注意：在没有明显益处时应强调避免应用注意：在没有明显益处时应强调避免应用 ICSIICSI

，因为 ，因为 ICSIICSI 对胚胎或胎儿可能产生的危害目对胚胎或胎儿可能产生的危害目前尚不清楚。前尚不清楚。

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其它：其它： ICSIICSI尚可用于一些特殊情况，尚可用于一些特殊情况，– 如需要高受精率者（自然周期）；如需要高受精率者（自然周期）；– 不成熟卵在试管中培养成熟者；不成熟卵在试管中培养成熟者；– 用于种植前诊断的胚胎活检。用于种植前诊断的胚胎活检。– 因睾丸癌行各种化疗后精子密度、活动度，受精、妊娠率因睾丸癌行各种化疗后精子密度、活动度，受精、妊娠率均降低，可用均降低，可用 ICSIICSI 获后代，但因化疗、放疗 可造成获后代，但因化疗、放疗 可造成 DNDNAA 断裂等永久性损害，故理论上增加了后代发生遗传缺陷断裂等永久性损害，故理论上增加了后代发生遗传缺陷的可能性。故最好在化、放疗前冷冻保存患者精液。的可能性。故最好在化、放疗前冷冻保存患者精液。

ICSIICSI也可用于常规也可用于常规 IVFIVF 后后 1-21-2天未受精的卵，或冻天未受精的卵，或冻--融的成熟卵子。融的成熟卵子。

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ICSIICSI 的禁忌症的禁忌症

染色体异常染色体异常严重先天畸形严重先天畸形

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ICSI ICSI 的技术操作的技术操作精子来源及处理精子来源及处理 手淫法取精。手淫法取精。 附睾取精（ 附睾取精（ Surgical epididymal / microepididSurgical epididymal / microepidid

ymal sperm aspirationymal sperm aspiration ，， MESAMESA ）） ::适用于阻适用于阻塞性无精症。近期有人用经皮精子抽吸法（塞性无精症。近期有人用经皮精子抽吸法（ PPerculaneus sperm aspirationerculaneus sperm aspiration ， ， PESAPESA ）。）。

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PESA 法附睾取精

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MESA及附睾精子

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睾丸取精（睾丸取精（ Testicular sperm extractionTesticular sperm extraction ，， TESETESE ））： 主要适用于非阻塞性无精症，切取一小块睾丸组织： 主要适用于非阻塞性无精症，切取一小块睾丸组织的 方法获取精子或精子细胞（开放式活检）。也可用的 方法获取精子或精子细胞（开放式活检）。也可用细针组织抽吸睾丸活检法。细针组织抽吸睾丸活检法。

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活检枪及抽吸法睾丸取精活检枪及抽吸法睾丸取精

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卵子的来源与处理卵子的来源与处理 卵子一般在促超排卵后卵子一般在促超排卵后 ,, 经阴道经阴道 BB 超介超介导导 ,, 用用 16G16G 或或 17G17G 穿刺针经阴道获取。穿刺针经阴道获取。

取卵后取卵后 44 小时，进行去卵丘结构处理。小时，进行去卵丘结构处理。

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显微注射显微注射 设备；设备； 显微操作皿的准备；显微操作皿的准备； 显微注射；显微注射； 精子制动与获取；精子制动与获取； 固定卵子与注射；固定卵子与注射；

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设 备设 备

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ICSIICSI 示意图示意图

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ICSIICSI 操作过程操作过程

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ICSIICSI 过程过程 (A)(A)

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ICSIICSI 过程过程 (B)(B)

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注射注射 15-1815-18 小时后，检查是否受精（小时后，检查是否受精（ ICSICSI I 后精卵结合过程一般较正常为快，后精卵结合过程一般较正常为快， 66小时内小时内 33%33% 可出现原核，可出现原核， 8-208-20 小时小时 8989%-91% %-91% 出现原核）。出现原核）。

受精卵继续培养受精卵继续培养 2424 小时，观察有无卵裂小时，观察有无卵裂,, 然后经阴道移植然后经阴道移植 3-43-4 个质量优良的胚胎个质量优良的胚胎。。

剩余胚胎冷冻保存。剩余胚胎冷冻保存。

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江苏省首例第二代试管婴儿江苏省首例第二代试管婴儿(2000(2000 年年 44 月月 1616 日日 ))

江苏省首例第二代龙凤双胎试管婴儿江苏省首例第二代龙凤双胎试管婴儿(2000(2000 年年 44 月月 1919 日日 ))

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与男性不育有关的与男性不育有关的遗传异常与遗传异常与 ICSIICSI

男性不育患者，除输精管道阻塞（手术、损伤或炎症性等后天性因素），排精障碍（如截瘫，阳痿等）外，遗传性改变也是一个重要因素。

1976 年， Tiepolo 和 Zuffardi 等发现 6 例无精症患者均有 Y 染色体长臂的缺失，因此推测 Yq11 上存在“ Y 染色体精子生成基因”。由于许多男性无精症患者均有此类异常，故将其称为“无精子因子” (azoospermia factor, AZF) 。

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目前已发现的此类基因有 YRRM1(Y Chromosome RNA recognition motif) ， YRRM2 和 DAZ (Deleted in Azoospermia) 等。

这类基因缺失在无精症和 / 或严重少弱畸精症中的发生率为 3~29% 不等，多数集中在 13~15% 。此类含有基因微缺失的患者完全可以通过ICSI 将此类遗传缺陷传给其男性后代。

Jiang 等（ 1999 ）报道了 1 例有 DAZ 基因缺失的严重少弱精症患者，通过 ICSI 将相同的 DAZ 基因缺失传给了儿子，其子成人后极有可能也为严重少弱精症患者。

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ICSIICSI 妊娠的后代随访妊娠的后代随访对对 ICSIICSI 安全性的忧虑：安全性的忧虑：

ICSIICSI 操作对卵子是具创伤性的；操作对卵子是具创伤性的；ICSIICSI 在全面的动物实验之前就广泛应用于人类；在全面的动物实验之前就广泛应用于人类；选用的精子原是属于被自然淘汰的；选用的精子原是属于被自然淘汰的；睾丸采集的精子可能未发育成熟，基因印迹尚未发睾丸采集的精子可能未发育成熟，基因印迹尚未发

育完成；育完成；少弱及无精子的缺陷是否会殃及后代。少弱及无精子的缺陷是否会殃及后代。

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ICSIICSI 技术的安全性问题技术的安全性问题 就在就在 IVF-ETIVF-ET 应用之初，人们已开始担应用之初，人们已开始担

心此类技术的安全性。心此类技术的安全性。 19931993 年，一项涉及年，一项涉及 1818 个国家的个国家的 327327 个生个生

殖中心的世界性统计显示，殖中心的世界性统计显示， 78447844 次取卵次取卵后获后获 21802180 个新生儿， 在资料完整的个新生儿， 在资料完整的 10810822 例中，例中， 1515 例例 (1.4%)(1.4%) 有大体畸形。有大体畸形。

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19981998 年由美国生殖医学会年由美国生殖医学会 // 辅助生殖技术注册协会报辅助生殖技术注册协会报告的告的 19951995 年美国、加拿大年美国、加拿大 ARTART 结果显示，在常规结果显示，在常规 IVIVFF 的的 67546754 例分娩中出生缺陷率（指结构与功能障碍）例分娩中出生缺陷率（指结构与功能障碍）为为 0.7%0.7% ，，如果加上供卵，冷冻胚胎及代孕母亲，则在如果加上供卵，冷冻胚胎及代孕母亲，则在1125911259 例例 IVFIVF 婴儿中，缺陷率为婴儿中，缺陷率为 0.73%0.73% 。。这一出生缺这一出生缺陷率与普通人群相比，并无显著升高。陷率与普通人群相比，并无显著升高。– 这可能与常规这可能与常规 IVFIVF 的对象多为女性因素不孕，而且其中绝大的对象多为女性因素不孕，而且其中绝大多数为无明显遗传因素的输卵管因素，男性不育因素所占比例多数为无明显遗传因素的输卵管因素，男性不育因素所占比例较低较低 ((较高的报告为较高的报告为 21.3%)21.3%) ，即使为男性因素，也仅为精子，即使为男性因素，也仅为精子数量偏少等非“绝对”不育因素数量偏少等非“绝对”不育因素 , , 此类病人中遗传因素比例很此类病人中遗传因素比例很低。低。

– 常规常规 IVFIVF 过程对配子、胚胎的干扰相对较轻过程对配子、胚胎的干扰相对较轻 ,, 有可能增加遗传有可能增加遗传缺陷的年龄因素在普通人群中同样也存在。缺陷的年龄因素在普通人群中同样也存在。

– 在在 IVFIVF应用的最初应用的最初 1010多年中，因为具有令人乐观的遗传学结多年中，因为具有令人乐观的遗传学结果，所以相关的遗传风险并未引起足够的重视果，所以相关的遗传风险并未引起足够的重视。。

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随着随着 ICSIICSI 技术的出现与迅猛发展，人们开始对其可能带来的技术的出现与迅猛发展，人们开始对其可能带来的遗传危害越来越担忧，虽然近年来的遗传危害越来越担忧，虽然近年来的 ICSIICSI结果仍是令人乐观结果仍是令人乐观的，如美国、加拿大的，如美国、加拿大 19951995 年的统计，在年的统计，在 11851185 例例 ICSIICSI 后出生后出生的婴儿中的婴儿中 ,,出生缺陷率也仅为出生缺陷率也仅为 1.1%1.1% 。。

ICSIICSI 的鼻祖的鼻祖 Palermo GD 1996Palermo GD 1996 年报告了在美国纽约年报告了在美国纽约 CornellCornell 医医学中心生殖医学与不孕中心出生的学中心生殖医学与不孕中心出生的 ICSIICSI 法所获婴儿，其严重法所获婴儿，其严重大体畸形（指需手术纠正或严重影响功能者）发生率为大体畸形（指需手术纠正或严重影响功能者）发生率为 1.6%1.6%，，甚至低于他们中心常规甚至低于他们中心常规 IVFIVF 后的严重大体畸形发生率后的严重大体畸形发生率 3.5%3.5%和纽约州正常人群的出生缺陷率和纽约州正常人群的出生缺陷率 3.7%3.7% 。。如加上小的畸形（指如加上小的畸形（指无需手术或对功能无严重影响者）发生率无需手术或对功能无严重影响者）发生率 1%1% ，，总的出生缺陷总的出生缺陷也才也才 2.6%2.6% 。。

ICSIICSI 的发源地比利时的发源地比利时 BrusselsBrussels自由大学总结了自由大学总结了 19911991至至 19971997 年年6397 6397 个个 ICSIICSI周期的结果，在周期的结果，在 19661966 例活产中发现例活产中发现 4646 例例（（ 2.32.3%)%) 大体畸形大体畸形 , , 与该国常规与该国常规 IVFIVF 的出生缺陷率类似。的出生缺陷率类似。

: ARTs冒韵东 93

其它多数研究均未发现染色体异常或大体畸形其它多数研究均未发现染色体异常或大体畸形率明显升高，如率明显升高，如 Liebaers ILiebaers I等发现等发现 585585 例因例因 ICSICSII妊娠的胎儿中仅妊娠的胎儿中仅 66 例例 (1%)(1%)染色体异常；染色体异常； 877877例例 ICSIICSI 后出生的婴儿后出生的婴儿 2323 例例 (2.6%)(2.6%) 有严重畸形有严重畸形。。

WisanoWisano等，等， (1996)(1996)报告报告 904904 例例 ICSIICSI婴儿，结婴儿，结果显示其先天性畸形的发生率并不比标准果显示其先天性畸形的发生率并不比标准 IVFIVF高。这些都是让人舒心的结果。高。这些都是让人舒心的结果。

由于由于 ICSIICSI 技术在进行全面动物研究之前就已用技术在进行全面动物研究之前就已用于人类临床。因此必须对于人类临床。因此必须对 ICSIICSI 产生的后代行长产生的后代行长期随访，而且必须持续至他们的生育年龄，这期随访，而且必须持续至他们的生育年龄，这样才能全面了解该技术的安全性样才能全面了解该技术的安全性。

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已有一些研究结果暴露已有一些研究结果暴露 ICSIICSI 技术令人担忧的一面。技术令人担忧的一面。 澳大利亚澳大利亚 (Kurinczuik(Kurinczuik 等，等， 1997)1997) 比较比较 420420 例例 ICSIICSI 后后

代与正常受孕后生育的代与正常受孕后生育的 100,454100,454 例婴儿，结果发现例婴儿，结果发现 ICSICSII 后代较大出生缺陷比一般婴儿高后代较大出生缺陷比一般婴儿高 22倍倍，而小出生缺陷，而小出生缺陷比一般婴儿高比一般婴儿高 50%50% 。。

MeshedeMeshede 等（等（ 19971997 ）报道）报道 ICSIICSI 后性染色体异常在分后性染色体异常在分娩婴儿中增加到娩婴儿中增加到 1%1% 。。

Martin(1996)Martin(1996) ，， PandiyanPandiyan等等 (1996)(1996) 均发现均发现 ICSIICSI 时非时非整倍体增加的现象，尤其是在用不育男性的精子时。整倍体增加的现象，尤其是在用不育男性的精子时。

胚胎如果携带非整倍染色体，一般不会发育到种植或胚胎如果携带非整倍染色体，一般不会发育到种植或分娩阶段，因为异常核型常可在自然流产时发现 分娩阶段，因为异常核型常可在自然流产时发现 （（ BaschatBaschat等，等， 19961996 ）。）。

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Bowen JR(1998)Bowen JR(1998) 比较了比较了 11岁的岁的 ICSIICSI 儿、常规儿、常规 IVFIVF 儿及自儿及自然受孕儿的智力发育指数然受孕儿的智力发育指数 (mental development index, MDI(mental development index, MDI) ) 三组三组MDIMDI分别为分别为 95.995.910.7, 101.810.7, 101.88.5, 102.58.5, 102.57.6, ICSI7.6, ICSI组明显低组明显低于其它两组于其它两组 (p<0.0001), (p<0.0001),

ICSIICSI组有组有 17%17% (15/89) (15/89) 在在 11岁时有轻度或明显智力发育延迟岁时有轻度或明显智力发育延迟 (MDI(MDI<85), <85), 而相比之下而相比之下 IVFIVF组为组为 2%2% (2/84), (2/84), 自然受孕组为自然受孕组为 1%1% (1/80), I (1/80), ICSICSI组亦明显高于其它两组组亦明显高于其它两组 (p<0.0001)(p<0.0001) 。。

Govaerts Govaerts 等在等在 5555 例例 ICSIICSI 胎儿中发现胎儿中发现 44 例例 7.3%7.3% 核型异常核型异常, ,

少数研究发现染色体异常或大体畸形明显上升，但不被大少数研究发现染色体异常或大体畸形明显上升，但不被大多数人认可，多数人认可，

如如 In’t VeldIn’t Veld等一年内对等一年内对 1515 例因母亲年龄大而在例因母亲年龄大而在 ICSIICSI 后行后行围产诊断的胎儿中发现围产诊断的胎儿中发现 55 例例 (33%(33% ，实为误解，此研究并，实为误解，此研究并未检查所有未检查所有 ICSIICSI 后的胎儿后的胎儿 ))染色体异常，而其在染色体异常，而其在 384384 例例 IICSICSI婴儿中仅发现婴儿中仅发现 55 例例 (1.3%)(1.3%) 性染色体异常。性染色体异常。

: ARTs冒韵东 96

ICSIICSI 安全性问题近期结果安全性问题近期结果————————————————————————————————————

作者 年代 病例数 大体畸形 (%) 染色体异常 (%) 方法 国别 ICSI N 常 性 结 N

________________________________________________________________________

Pruksananonda 2001 75 1.3 ? 回顾性 泰国Aboulghar 2001 430 1.86 1.40 0 前瞻 , 对照 埃及Sutcliffe 2001 208 4.8 4.5 ( 平均随访 17m) 对照 英国Ericson 2001 9111 5.66 3.85 全国对照 瑞典 ( N 管缺陷 , 消化道闭锁 尿道下裂上升 3 倍 )

Porcu-Buisson 2001 111 6.3 ? 回顾性 法国La Sala 2000 289 2.4 1.5(IVF) 0.3 0.6(IVF) 回顾性 意大利 Wennerholm 2000 1192 7.3 3-4 2.7 0 ? 回顾性 瑞典Bonduelle 1999 1987 3.7 ? 0.83 0.83 0.92 ? 回顾性 比利时 Van Golde 1999 120 1.7 3.0(IVF) 回顾性 西班牙________________________________________________________________________

: ARTs冒韵东 97

ICSIICSI 小结小结 ICSIICSI本身并不产生遗传异常，作为一项技术，它仅有 本身并不产生遗传异常，作为一项技术，它仅有

的“罪过”就是 允许用原先不能结合的配子结合， 发的“罪过”就是 允许用原先不能结合的配子结合， 发生受精形成胚胎。生受精形成胚胎。

ICSIICSI并不造成永久的物理性损伤，却象辅助“破壳” 并不造成永久的物理性损伤，却象辅助“破壳” 与复合培养一样，被用作提高胚胎种植能力（与复合培养一样，被用作提高胚胎种植能力（ Tucker Tucker ， ， 19961996 ）。）。

如果应用得当，如果应用得当， ICSIICSI至少应与传统授精技术一样成功 至少应与传统授精技术一样成功 （（ TuckerTucker ，， 1995 1995 ），所以它可以用于任何潜在受精 ），所以它可以用于任何潜在受精 希望很小的病例。同样可以用于各种类型的男性因素 希望很小的病例。同样可以用于各种类型的男性因素 不育，从最严重的少弱畸精症到精索静脉曲张的影响不育，从最严重的少弱畸精症到精索静脉曲张的影响 , , ICSIICSI也适用于“清洁”那些须行种植前基因诊断的胚也适用于“清洁”那些须行种植前基因诊断的胚胎胎 ,, 或用于卵或用于卵 (( 冻冻 )-)-融以后融以后 (Tucker(Tucker 等等 ,1996,1996 ； ； PorcuPorcu等，等， 1997)1997) 和所有不明原因的受精失败的病人。和所有不明原因的受精失败的病人。

: ARTs冒韵东 98

辅助“破壳”辅助“破壳”（（ Assisted hatchingAssisted hatching ，， AHAH ））

AHAH 技术目的是为提高胚胎的种植率，通技术目的是为提高胚胎的种植率，通过使胚胎更易从透明带中孵出。过使胚胎更易从透明带中孵出。

典型的方法是用典型的方法是用 TyrodeTyrode 酸性溶液酸性溶液 (PH2.(PH2.4),4), 用显微注射针注射以“腐蚀”透明带用显微注射针注射以“腐蚀”透明带。。 AHAH 常用于妊娠结果不佳的患者。常用于妊娠结果不佳的患者。

: ARTs冒韵东 99

辅助“破壳”辅助“破壳”

: ARTs冒韵东 100

辅助孵出辅助孵出 (AH)(AH)

88细胞期细胞期 AHAH 晚期囊胚晚期囊胚 AHAH

: ARTs冒韵东 101

（卵）细胞浆及核移植（卵）细胞浆及核移植 最近用显微操作将供体卵胞浆移入较老的卵内最近用显微操作将供体卵胞浆移入较老的卵内 ,, 用用

以治疗人类不孕症，此方法可以促进这些预后不佳以治疗人类不孕症，此方法可以促进这些预后不佳的合子的活力。该方法可以提高获得活婴的成功率的合子的活力。该方法可以提高获得活婴的成功率，而这些卵仅仅从供卵处获得，而这些卵仅仅从供卵处获得 5%5% 的卵胞浆。的卵胞浆。

Cohen(1997)Cohen(1997) ，， ZhangZhang等（等（ 19971997 ）已成功的地把）已成功的地把核从一个胚泡期的卵中移到另一个去核的胚泡期供核从一个胚泡期的卵中移到另一个去核的胚泡期供卵中，其后成功地将其培养成熟，至可以受精。这卵中，其后成功地将其培养成熟，至可以受精。这预示着临床上已能够行预示着临床上已能够行 100%100% 的供卵胞浆，这可以的供卵胞浆，这可以用来纠正年龄较大的妇女卵的非整倍性，而且很明用来纠正年龄较大的妇女卵的非整倍性，而且很明显，常规的临床核移植将适用于多种治疗。显，常规的临床核移植将适用于多种治疗。

: ARTs冒韵东 102

1997 年，美国新泽西州 St Barnabas医学中心的 Jacques Cohen医生报道了 世界首例行卵胞浆移植婴儿的诞生。他们使一位曾 4次常规 IVF 失败的39岁妇女获得了后代。

: ARTs冒韵东 103

结 论结 论 1010 年前，显微操作已在人类不孕症治疗方面有了年前，显微操作已在人类不孕症治疗方面有了更广泛的用途。已建立了常规的、高敏的辅助生育更广泛的用途。已建立了常规的、高敏的辅助生育技术——技术—— ICSIICSI ，目前仍在不断拓展胚胎显微操作，目前仍在不断拓展胚胎显微操作和卵胞浆及核移植的潜能。然而，这些操作随着数和卵胞浆及核移植的潜能。然而，这些操作随着数量的增加，检出其对后代的不良影响的可能性也在量的增加，检出其对后代的不良影响的可能性也在不断增加，虽然目前的结果已大大减轻了我们当初不断增加，虽然目前的结果已大大减轻了我们当初对这项用于人类生殖的高技术的忧虑。尽管还需要对这项用于人类生殖的高技术的忧虑。尽管还需要不懈的努力，去建立更加完善，全面的胚胎质量检不懈的努力，去建立更加完善，全面的胚胎质量检测系统，即种植前活检，我们还是应该采用所有可测系统，即种植前活检，我们还是应该采用所有可以提供的技术在胚胎种植前检测其正常与否。以提供的技术在胚胎种植前检测其正常与否。

: ARTs冒韵东 104

人工赠卵人工赠卵适应症 丧失产生卵子的能力丧失产生卵子的能力

– 符合卵巢早衰的诊断，子宫发育正常者；符合卵巢早衰的诊断，子宫发育正常者；– 年龄大于年龄大于 4040 岁，血清岁，血清 FSHFSH 值反复大于值反复大于 1818

u/Lu/L ，阴道，阴道 BB 超提示卵巢内储备卵泡极少超提示卵巢内储备卵泡极少（少于（少于 22枚）；枚）；

– 年龄小于年龄小于 4040 岁，血清岁，血清 FSHFSH 值反复大于值反复大于 1818u/Lu/L ，经雌孕激素序贯疗法治疗，经雌孕激素序贯疗法治疗 66 个月以个月以上仍无排卵者；上仍无排卵者；

: ARTs冒韵东 105

女方是严重的遗传性疾病基因携带者或患者女方是严重的遗传性疾病基因携带者或患者– 女方为染色体数目和结构异常，不能或拒绝进行胚女方为染色体数目和结构异常，不能或拒绝进行胚

胎种植前遗传学诊断者；胎种植前遗传学诊断者；– 女方为单基因遗传性疾病基因携带者，不能或拒绝女方为单基因遗传性疾病基因携带者，不能或拒绝

进行胚胎种植前遗传学诊断者；进行胚胎种植前遗传学诊断者； 具有明显影响卵子数量和质量的因素具有明显影响卵子数量和质量的因素

– 经较大剂量的促性腺激素（经较大剂量的促性腺激素（ FSH FSH 或或 HMG HMG 不多于不多于66 支支 // 天）促排卵治疗，卵巢反应较差，卵泡数少天）促排卵治疗，卵巢反应较差，卵泡数少于于 33枚者；枚者；

– IVFIVF 治疗治疗 22 个周期以上，均提示卵子质量差，受精个周期以上，均提示卵子质量差，受精后胚胎质量评分较低者；后胚胎质量评分较低者；

: ARTs冒韵东 106

: ARTs冒韵东 107

代孕母亲代孕母亲（卫生部暂禁）（卫生部暂禁）

先天性子宫缺如； 因病行子宫切除术； 女方有妊娠或分娩禁忌症；

: ARTs冒韵东 108

胚胎冷冻胚胎冷冻1983 年人类第一次冷冻胚胎成功适应症 IVF 或 ICSI 治疗中的多余胚胎； 治疗周期发生 OHSS ，不适宜妊娠； 胚胎移植发生困难； 胚胎种植前诊断等待结果； 人工赠卵等待受者子宫内膜同步；建立胚胎库；

: ARTs冒韵东 109

: ARTs冒韵东 110

ARTs的并发症

多胎妊娠

围产儿并发症 早产和低体重 平均孕周 双胎 37

三胎 33.5

四胎 31.5

: ARTs冒韵东 111

ARTs的并发症多胎妊娠罹病率与死亡率 大脑性麻痹 是单胎的 双胎 3-7倍 三胎 >10倍 围产儿死亡率 双胎 5倍 三胎 8倍 新生儿死亡率 多胎 7倍

: ARTs冒韵东 112

ARTs的并发症多胎妊娠 支出费用 产科护理 新生儿护理

双胎 2.1倍 13倍 三胎 4.5倍 41倍 四胎 7 倍 77倍

产科并发症 妊高征 贫血 羊水过多 产后出血

: ARTs冒韵东 113

: ARTs冒韵东 114

促排卵的并发症

卵巢过度刺激综合征（ OHSS ）OHSS 的易患因素 年轻且瘦小 多囊卵巢综合征患者（ PCOS ） 卵泡个数 > 15 个， 血清 E2水平 > 5500pmol/ml B超卵巢图象呈“项链”征 HCG 刺激剂量较大，时间较长， 妊娠

: ARTs冒韵东 115

促排卵的并发症 卵巢过度刺激综合征（ OHSS ） 轻度 OHSS

Ⅰ级 腹胀与不适 Ⅱ级 Ⅰ级 + 恶心、呕吐 和 /或腹水，卵巢增大至 5-12cm 中度 OHSS Ⅲ级 轻度 OHSS征象 + B超显示腹水 重度 OHSS Ⅳ级 中度 OHSS征象 + B超显示腹水和 /或胸水，呼吸困难 Ⅴ级 所有以上征象 + 血容量改变，因血液浓缩引起的血液 粘稠度增加，凝血功能异常，肾灌注不足，肾衰

116: ARTs冒韵东

受精受精 ((孕孕 ))前、种植前遗传学诊断在前、种植前遗传学诊断在辅助生殖技术中对遗传缺陷的防范辅助生殖技术中对遗传缺陷的防范

南京医科大学妇产科江苏省生殖医学重点实验室

冒韵东

: ARTs冒韵东 117

引言引言 辅助生殖技术 (assisted reproductive t

echnology, ART) 卵细胞浆内单精子注射 (intracyto-pla

smic sperm injection, ICSI) 遗传危险 遗传咨询围产诊断

118: ARTs冒韵东

受精受精 (( 孕孕 )) 前、种植前遗传学诊断 前、种植前遗传学诊断 (pr(preconception & preimplantationeconception & preimplantation ge genetic diagnosis, PGD)netic diagnosis, PGD)

: ARTs冒韵东 119

1. PGD1. PGD 的指征的指征 : : 不孕夫妇中女方年龄较大 ( 如 >35岁 , 也

有 人认为年龄更大者 )； 不孕夫妇患 X-伴性遗传病或为 X-伴性遗

传病的携带者，有 X-伴性遗传病家 族史 ;胚胎质量差，反复 IVF 失败； 胚胎分裂过快； 严重男性因素不育；

: ARTs冒韵东 120

夫妇中任何一方或双方有染色体核型异 常 (数目及结构异常 )；

习惯性流产患者； 不孕夫妇中一方或双方患有已明确为基 因突

变所致疾病 (单基因遗传病 ) ，或为携带者，或有家族史者，如染色体显性遗 传病；

染色体微缺失综合征； 与精子发 生相关的染色体微缺失。

: ARTs冒韵东 121

2. PGD2. PGD 的方法的方法

取材 : 内径为 5~40m 的活检针。 极体、 2-10细胞 ( 或更多 )胚胎的卵裂球 细胞、胚囊的壁滋养外胚层细胞。

: ARTs冒韵东 122

取卵裂球过程

: ARTs冒韵东 123

卵裂球活检卵裂球活检

: ARTs冒韵东 124

聚合酶链反应 (PCR)：– 单细胞 PCR 、巢式 PCR 、半巢式 PCR ，结

合 (linkage)PCR ，荧光 PCR 等。 PCR 的扩增成功率在 90% 以上，个别 71

% ，极体 66.1%左右。 PCR 的优点：需要样本量少，快速。

: ARTs冒韵东 125

PCR 的缺点：无法检测染色体的非整倍 体、 染色体数目异常及某些结构异常 ( 如易位 ),

易受 DNA污染的影响， 等位基因退出 (Allele drop-out, ADO) 出现率 为 0~2

3% ，– 误诊可能 ( 可用高度多形结合标志物 highly polymorphic

linked markers 基因 , 的方法加以避免 ) 。– 巢式 PCR ADO 率：

单卵裂球： 22.8%(- 珠蛋白基因 ), 33.3%(-F508)第一极体 : 5.9% --9.6%

: ARTs冒韵东 126

: ARTs冒韵东 127

: ARTs冒韵东 128

荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization ， FISH)– 固定，特异探针 ( 已标上荧光素 )去杂交标记物，荧 光显微镜下观察有无发出不同颜色荧光的亮点及数目以了解该极体 / 细胞是否正常。

– 人类 22种常染色体及 X ， Y 染色体的探针均已商品化– 针对许多致病基因，基因突变位点的探针也已商品化。– 自行制备针对某一患者的特异探针。– 一次最多可杂交 5-7种探针 ( 不同颜色 ) 。– 重复 FISH 的方法，– 常检测 X,Y,1,5,7,8,11,13,16,18,21,22号等较常发生异常的染色体

。

: ARTs冒韵东 129

: ARTs冒韵东 130

PGDPGD 用于性别鉴定用于性别鉴定

: ARTs冒韵东 131

FISH 的优点 :– 既可用于间期 ( 卵裂球细胞通常处于间期或 有丝分裂期 )又可用于中期细胞。

– 费时少，过去杂交约需 6小时，现可仅用 1分钟~2小时，仍能保持 94%--98% 的信号出现 率。

– 不受 DNA污染的影响。– 可用于检测染色体 (尤其是性染色体 ) 数目及 结构异常。

– 不存在 ADO ，有很高的敏感性与特异性。

: ARTs冒韵东 132

FISH 的缺点：– 受探针特异性影响较大，交叉杂交。 – 受荧光染料颜色的限制，一次最多只能杂交 5-7种 探针 ( 重复 FISH 可以部分克服此缺陷 ) 。

– 在用多色探针时对杂交条件十分敏感，存在一定的杂交失败，正常胚胎 约 7% ，异常胚 胎则明显增 高。

– 固定时有一定比例细胞丢失率，有报道达 23% 。– FISH 的效率一般在： 80% 以上– 信号丢失率：低于 10%– 活检后胚胎崩解：低于 5%– 其它 : 无细胞核， >1 个核等也会影响结果。

: ARTs冒韵东 133

4. PGD4. PGD 发展评估及展望发展评估及展望 PGD产生之前的遗传性疾病的诊断、问 题；

PGD优势：– 可以避免终止妊娠的痛苦和道德上的问题。– 提高了在高危夫妇中筛选出正常胚胎的效率。累积妊娠率优于自然周期。

– 目前结果：不影响种植前胚胎的发育；提高种植率，降低流产率； PGD 后的产科结果与常规IVF 无明显区别。

: ARTs冒韵东 134

PGD 发展相对缓慢的原因，与 ICSI 比较– PCR 、 FISH 等方法的局限，嵌合体诊断困 难，早期胚胎细胞数量减少，极体 PGD 的 局限。

– 大众对 PGD 的看法与接受程度。– 相应的法律、法规。

PGD 发展形势喜人。 PGD 与围产诊断的互补和相辅相成。

: ARTs冒韵东 135

PGD 的发展方向– 捐胚、废胚的“ PGD” ，理论与实践上的准备。– PGD 性别鉴定，避免 X伴性遗传病的下传。– 胚胎性染色体及常染色体数目异常的 PGD ，防止

这类遗传异常在后代的发生。– 筛查种植前胚胎的非整倍体与嵌合体，降低流产率

，提高种植率。– 筛查需 ICSI 的男性患者中的遗传缺陷，对有缺陷者

的胚胎及用形态异常精子、不 成熟精子及精子细胞 等受精的胚胎行常规 PGD检查。

– 对年龄较大、有异常孕产史者（如畸形儿，治疗性流产，反复流产）常规行 PGD 。

– 如条件允许，可对染色体结构异常的夫妇（如易位，倒位，重复，缺失）进行 PGD 。

: ARTs冒韵东 136

展望未来，在建立人类基因库并了 解了人类全部基因（正常与致病）功能 的基础上，，对所有带有致病基因或有 产生有遗传缺陷后代可能的高危人群均 行 PGD ，则最终消灭所有遗传性疾病应 该不是一种梦想！

: ARTs冒韵东 137

辅助生育技术的发展方向辅助生育技术的发展方向

提高妊娠率和活产率，帮助不孕夫妇获得孩子；

实现真正的生育调控和计划生育；研究配子和胚胎发生发育的调控机制，发现人类生殖的奥秘；

研究辅助生育技术中的伦理问题，制定相应的法规和法律；

研究人类克隆问题。

: ARTs冒韵东 138

谢谢谢谢 !!