완결과제 최종보고서

일반과제(○), 보안과제( ) (과제번호 : PJ009126)

고면역활성 유산균 증식촉진 농산물 소재 발굴 및 면역기능 증진 식품 개발

(Development of Food for Immune Enhancement through Mixture of Growth-

Stimulatory Plant of Lactic Acid bacteria with High Immune Activity)

국립농업과학원

농촌진흥청

제 출 문

농촌진흥청 장 귀하

본 보고서를 “고면역활성 유산균 증식촉진 농산물 소재 발굴 및 면역기능 증진 식품

개발에 관한 연구”과제의 보고서로 제출합니다.

제1세부연구과제 : 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구

제2세부연구과제 : 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및

원료표준화 연구

제1협동연구과제 : 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구

제2협동연구과제 : 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구

제3협동연구과제 : 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발

2015. 2.

주관연구기관명 : 국립농업과학원주관연구책임자 : 노건민

제1세부연구기관명 : 국립농업과학원 제1세부 연구책임자 : 노건민

참 여 연 구 원 : 박동식, 김소영, 김가람, 이예진제2세부연구기관명 : 국립농업과학원 제2세부 연구책임자 : 노건민

참 여 연 구 원 : 고정숙, 김소영, 김영섭, 김가람제1협동연구기관명 : 충북대학교 제1협동연구책임자 : 이완규

참 여 연 구 원 : 안수빈, 박호흔, 엄현범, 박수민제2협동연구기관명 : 전북대학교 제2협동연구책임자 : 이상명 참 여 연 구 원 : 강경원, 김다희, 고소나, 이희정, 이현철, 최지현

제3협동연구기관명 : 금산국제인삼약초연구소제3협동연구책임자 : 손미례

참 여 연 구 원 : 박종대, 장영부, 김영수, 이환, 김도연, 최경임, 서정화,

김동민, 김다정

주관연구책임자 : 노건민 주관연구기관장 : 전혜경 직인

요 약 문

Ⅰ. 제 목

○ 고면역활성 유산균 증식촉진 농산물 소재 발굴 및 면역기능 증진 식품 개발에 관한 연구

Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성

○ 프로바이틱스 유산균의 성장 및 장내 유용균에 필요한 생육인자를 다빈도 식품에서 탐색하고

이를 이용한 천연배지를 개발하고, 유산균 증식촉진능이 있는 다빈도 식품을 선정하여 이에

의한 성장인자를 분석하여 규명하고자 한다.

○ 국민들이 자주 섭취하고 있는 식품 중에서 면역 활성에 우수한 소재를 찾아내고, 이를 건

강기능성 식품 소재로서 활용하기 위하여 원료의 표준생산 공정을 확립하고자 하였으며,

면역 활성 우수 식물 소재와 유산균과의 혼합에 의한 시너지 효과를 대식세포 및 비장세

포의 활성화를 평가하여 알아보고자 한다.

○ 다양한 식물자원과 유산균주와의 혼합에 대한 면역활성을 in vitro, in vivo상 효능 검정을

통하여 과학적 근거 자료를 마련하고자 한다.

○ 면역반응조절능이 있는 유산균을 선발하고 선발된 유산균이 어떠한 면역학적·분자생물학

적 작용기작으로 감염성질환 또는 염증성질환에 대한 효능을 나타내는지 다양한 실험법

을 사용하여 연구하고자 한다.

○ 국내 다양한 식물자원을 이용하여 유산균 배양용 배지를 개발하고 산업적 유산균 생산이

가능한 최적 배양 조건을 확립하고 유산균 소재의 안정성을 높일 수 있는 보호제 및 소

재 제조 공정을 확립하여 기능성 유산균의 대량생산, 기능성 식품 생산공정 및 산업화 연

구를 수행하고자 한다.

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위

○ 본 연구과제는 2개의 세부과제와 3개의 협동과제로 구성되어 있고, 각 세부 및 협동과제

의 연구개발 내용 및 범위는 다음과 같다.

구분 연구목표 연구개발 내용

제1세부

(농과원)

유산균 증식 촉진능

보유 농산물 소재

발굴 및 관련 물질

규명

○식물자원중유산균증식촉진소재탐색

○면역활성보유상용유산균주를이용한증식촉진평가

○추출용매별 분획 조추출물 제조 및 유산균 증식 촉진능 비교

○면역활성보유 유산균주를 이용한 조추출물의 증식촉진 평가

○증식촉진인자의기기분석을통한물질규명

○최종 후보 시료제조 및 원료표준화 연구

제2세부

(농과원)

면역활성 식물자원과

유산균의 혼합 배양

조건 최적화 및

식물소재의 원료표준화

○ 면역활성평가로우수 식물자원 소재 탐색

○ 식물추출물과유산균의혼합배양최적화

○ 유산균 혼합배양물 첨가 식물소재 최종선정

○ 추출물 소재의 제조법 최적화 및 원료표준화

Ⅳ. 연구개발결과

○ 1세부과제명: 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구

- 유산균 배양에 적합한 저가의 천연 배지 개발 및 산업재산권 출원

․천연배지(pH 7.2)= peptone/yeast extract(1%) + NaCl(0.5%) + 식물추출물(5%)

․‘식물 추출물을 포함하는 유산균 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법’ 특허출원(2014.6)

- 유산균 증식을 촉진하는 소재로 서리태 열수추출물 발굴 및 추출조건 확립

․배양 6시간 경과 후 빠른 증식을 보인 서리태 추출물을 유산균 증식촉진 소재로 발굴

․천연배지에 첨가된 서리태 추출물은 85℃ 열수에서, 3시간 추출 시 합성배지(MRS)보다

상대적으로 빠른 증식을 유도함.

- 유산균 증식촉진능 관여 물질로 탄수화물에 비해 단백질원에 의해 유도됨을 확인하였고,

특히 서리태에만 검출된 메티오닌 아미노산의 역할도 기대됨.

구분 연구목표 연구개발 내용

제1협동

(충북대)

면역활성 증진능

보유 유산균 및

혼합배양액의 효능

검증

○ 다양한 유산균주 확보

○ 유산균주의 생리학적 특성조사 연구

○ 유산균주의 면역활성 특성조사 연구

○ 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 면역활성 검증 연구

○ 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 최적화 연구

○ 동물실험을 통한 면역 활성 검증연구

○ 시제품의 in vitro 면역활성 검증

○ 시제품의 in vivo 면역활성 검증

○ 최종제품에 대한 효능 연구

제2협동

(전북대)

유산균에 의한

사람면역세포 및

감염모델을 이용한

면역학적·분자생물학적

기전 구명

○ 유산균에 의한 사람 면역세포의 활성 조절 면역학적·분

자생물학적 작용기전

○ 유산균에 의한 사람 NK cell 활성 조절 측정

○ L. monocytogenes 감염 모델을 이용한 유산균 효능의

면역학적·분자생물학적 기전 연구

○ DSS에 의해 유도된 염증성 장질환 동물모델 이용 유산균

효능의 면역학적·분자생물학적 기전연구

제3협동

(국제인삼

약초연구

소)

기능성 유산균

대량생산, 기능성식품

생산공정 확립 및

산업화

○ 유산균 배지 조건 확보

○ 유산균 배양 공정 및 조건 연구

○ 유산균 생산 및 소재화

○ 유산균 보호제 개발

○ 유산균 대량농축 공정 개발

○ 유산균 분말화 공정 개발

○ 기능성 유산균 조성물 개발

○ 기능성 배양액 조성물 개발

○ 제형개발(타블렛, 캡슐), 포장개발 및 생산화

○ 2세부과제명: 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및 원료

표준화 연구

- 대식세포 활성 측정을 통한 면역활성 식물소재 선발: 20종(1차)→2종(2차)→1종(최종)

․NF-κB 전사인자 활성능과 Nitric oxide, TNF-α 생성능 우수 소재 선발 : 콩나물, 가죽

나무 등 2종

- 면역활성 우수 복합물로 콩나물 에탄올추출물 선정 및 혼합조건 확립

․콩나물 추출물을 70% 에탄올로 상온에서 3회 추출할 경우 면역활성을 높이고,

Weissella cibaria 사균과 1:0.25비로 혼합 시 IL-1β 생성을 증가시킴.

- 비장세포 내 면역세포 활성 우수 유산균 Weissella cibaria에 의한 B cell 증식 유도능

확인

․마우스 비장세포에서 B220+ cells 증식유도능을 살펴본 결과 Lactobacillus rhamnosus GG 대

조균에 비해 와이셀라 사균은 효능이 좋았음.

○ 1협동과제명: 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구

- 김치유래Weissella cibaria JW15균주를면역활성유산균으로생물자원등록기탁(KACC 91811P)

- ‘신규한 와이셀라 시바리아 JW15 균주 및 이의 용도’ 특허출원(10-2013-0111741)

- JW15균주와 혼합배양물의 면역활성, 최적화, 동물예비효능연구를 실시함.

- 시제품과 혼합배양물의 in vitro, in vivo 동물효능검증을 통해 JW15균주와 콩나물에탄올

추출물의 리스테리아 감염 예방 및 면역활성효과를 확인함.

○ 2협동과제명: 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구

- 사람면역세포를 이용하여 Weissella cibaria JW15 유산균의 면역 활성화 효과 확인

․Weissella cibaria JW15균이 여러 가지 cytokines의 분비 유도, CD4+T cell 및 NK cell를 활성

화시킴을 확인

- Weissella cibaria JW15에 의한 면역반응 조절 효능을 실험동물모델에서 확인

․Weissella cibaria JW15의 경구투여가 Listeria monocytogens에 대한면역반응을일부증가시킴.

- Lactobacillus plantarum 76의 DSS에 의한 염증성대장질환 예방효능을 검증

․TNFα와 IL-1β 등 염증성사이토카인 및 CD4+Th cell의 Th1과 Th17으로의 분화를 억제함.

○ 3협동과제명: 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발

- 서리태 배지를 이용한 유산균 대량 생산 공정 개발

․서리태 추출물 feeding을 이용하여 3.2×1011 cfu/ml 총균수 확인함.

․MRS 배지 이용한 batch culture에 비해 약 100배 증가 확인

- 미량 진세노사이드의 함량을 증진시킨 홍삼전분의 제조방법 개발

․홍삼 농축액 제조 시 발생하는 부산물인 홍삼전분은 진세노사이드 및 유리당을 함유하고

있어 기능성 소재 및 유산균 배지로 가치가 있음.

- 기능성 유산균 W. cibaria JW-15을 활용한 시제품 개발

․캡슐(1×1010 cfu/g 이상) 및 스틱(1×109 cfu/g 이상) 제품 개발

그림 1. 서리태 추출물 배

지에서 W. cibaria의 증식

촉진 효과(6시간 경과)

그림 2. W. cibaria 사균과

콩나물추출 복합물(1:0.25)

의 대식세포 활성 효능

그림 3. 유산균(W. cibaria

JW15)에 의한 사람면역

세포 활성화

그림 4. 최종제품의 면

역활성 효능 검증

Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획

○ 프로바이오틱스 제품의 기능성과 안전성에 대한 검증 및 규정이 강화되고 있으며 이를

대비하는 것은 기업들이 직면한 과제이므로 현재 유통되고 있는 대부분의 유산균 제품들

이 특정 질환에 대한 개선 효능을 밝히는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다.

○ 최근 일본을 비롯한 유럽 시장에서는 식물성 유산균을 포함하는 제품들이 큰 인기를 끌

고 있기에 한국식품의 세계화를 위해서도 한식 유래의 기능성이 우수한 유산균을 발굴하

고 임상연구를 통해 효능입증을 하여 제품 개발을 해야 한다.

○ 기능성 유산균 제품 개발은 그 가공품을 활용한 생산 부문의 고용 창출은 물론이고 기능

성 산업, 식품산업, 제약산업, 포장재산업, 등 연관 산업 부문의 고용이 창출되어 경제활

성화에 기여하여 신규 고용효과를 기대할 수 있다.

○ 기능성 유산균을 생산하여 새로운 가공 기술을 접목하여 다양한 기능성 유산균 제품을 생

산한다면 기존의 유산균의 기능과 면역활성 기능이 융합한 고기능성 신규 건강기능식품

소재 및 제품화로 유산균 시장에 기술경쟁력 강화가 기대된다.

○ 농산물, 폐 농산물을 활용한 유산균 배양 배지 개발 및 상용화를 통해 관련 농가에

새로운 수입원이 될 수 있다.

S U M M A R Y

1. Investigation of the Ingredient with Growth-stimulatory Effect of Lactic Acid

Bacteria and Materials Related to Growth Factor(PJ00912601)

This study was carried out to investigate the ingredient stimulated the growth of lactic

acid bacteria containing Lactobacillus rhamnosus GG, Weissella cibaria JW15 and

Lactobacillus plantarum 425 among 42 kinds of foods frequently consumed by the Korean

elderly and to develop the optimal media using the extract of final selected plant for the

cultivation of LAB isolates with immunoactive effect. Then, the final selected extract was

attempted to establish the standardization of manufacturing process and to explore the

related material on the growth-stimulatory effect of LAB.

As a result, the optimal media developed for the culture of LAB consisted of 1% peptone

or yeast extract, 0.5% NaCl, and 5% plant extract in water. This media was simpler than

commercial media, lactobacilli MRS and showed a fast growth rate after 6 h. In order to

discover a novel ingredient to extend help to the growth of LAB, we evaluated the

growth-stimulatory effect among 42 kinds of foods. At first, 8 samples containing Heoktae,

Seoritae, burdock, lettuce, water dropwort, perilla leaves, chinese cabbage, and banana were

showed the high effect in optimal media added in freeze-dried powdered form. These

samples to be extracted using the solvents such as hot water, ethanol, and acid were

compared to commercial MRS broth for evaluation of the growth-stimulatory effect. As a

result of the secondary experiment, 4 out of 1 hot-water extract of Seoritae and 3 ethanol

extracts containing lettuce, water dropwort, and perilla leaves were selected as candidate

for a composite in optimal media. Of them, the Seoritae extract was shown the highest

effect coequally with MRS broth and then the extract was chosen as a ingredient for

cultivation of LAB.

To study standardization of the manufacturing process for the production of Seoritae

extract, we compared the growth-stimulatory effect of LAB making the extract in the light

of its extraction conditions(temperature, solvent, and time). When was produced for 3 h in

hot water at 85℃, the extract was shown the fast growth of LAB after elapsed time of 6 h.

In addition, we investigated the component to be associated with the growth of LAB in

primary selected samples by analysis of the contents such as total protein, total sugar, free

amino acid and free sugar. As a result, the extracts of Seoritae/Heoktae and

banana/burdock were higher the total protein and sugar than those of 6 other samples,

respectively. Of them, the extract of Seoritae was only indicated methionine content of

approximative 4 mg/mL. Related to the results of the growth-stimulatory data, it is likely

that the effect by the extract of Seoritae consists in the protein source containing essential

amino acid compared to the sugar content.

Consequently, the water extract of Seoritae could be used for the development of novel

component in cultivation media and functional ingredient to stimulate the growth of LAB.

2. Screening of Immunoactive Plant and Investigation of Immune Enhancing Effect

according to Mixture with Lactic Acid Bacteria(PJ00912602)

The objectives of this study were to find out the plant ingredient to enhance immune

activity among 42 kinds of foods frequently consumed by the Korean elderly consisting of

5 food groups(cereals, legumes, starches, fruits and vegetables) and 5 wild plants(Ailanthus

altissima, Prunella vulgaris L., Actinidia arguta, Petasites japonicus, and Aster scaber)

and to explore the immunoactive effect of selected plant and lactic acid bacteria mixture.

Each sample was assessed the immunoactive effect by measuring NF-kB/AP1 gene

expression, nitric oxide and cytokine production in RAW-Blue™ cell.

As a result, soybean sprouts of 47 plants showed the highest NF-kB/AP1 gene

expression at the level of 1.13±0.03(OD 650nm) and seoritae, sweet potato, banana, apple,

garlic, crown daisy, cabbage and Ailanthus altissima also had high activity of NF-kB/AP1

gene in RAW-Blue™ cell stimulated by LPS. NO production of Ailanthus altissima was

significantly higher than that of other plants and 16 plants of glutinous sorghum, black

rice, seoritae, heuktae, sweet potato, banana, apple, garlic, mungbean sprouts, spinach,

crown daisy, young pumpkin, cabbage, soybean sprounts, Actinidia arguta and Aster

scaber were the next best activity. The above results selected 17 out of 47 plant samples.

Moreover, soybean sprouts was showed the significant increase of TNF-α(1509.55±1.38 pg/

㎖) and IL-1β(54.56±1.08 pg/㎖) cytokines in comparison with RAW-Blue cell stimulated

by LPS.

In order to standardize the production process of soybean sprouts extract with immune

enhancing effect, the extraction condition was as follows: three times in 70% EtOH at 25℃

with its head part.

Finally, the immune enhancing effect by Weissella cibaria JW15 and soybean sprout

mixture(Ratio=1:0.25) was increased the production of nitric oxide and IL-1β cytokine in

comparison with each single treatment.

In vitro influence on cell activity of spleen cells by single or the mixture of Weissella

cibaria JW15 with soybean sprouts extract increased CD25 and CD69 expression in T cells.

MHC Ⅱ+ in B cells and macrophage expression were higher in Weissella cibaria JW15

than mixture of JW15 and soybean sprouts extracts. The production of cytokines(IL-6,

TNF-α, IFNγ, IL-10, IL-17, and IL-12) were increased by single treatment of Weissella

cibaria JW15 than mixture of JW15 with soybean sprouts extract.

Consequently, Weissella cibaria JW15 is more likely to be used like Lactobacillus

rhamnosus GG, is a well-known probiotics in the world.

3. Immuno-modulatory Effects of Lactic acid bacteria Mixed with the Plant-derived

extract(PJ00912603)

The purpose of this study was to evaluate the immuno-modulatory properties of lactic

acid bacteria mixed with the plant-derived extracts. Among the 51 strains of lactic acid

bacteria, Weissella cibaria JW15 (JW15) was selected as the immuno-modulating strain

used in this studies. To evaluate the probiotic potential of JW15 isolated from Kimchi,

acid and bile tolerance, adhesion capacity to Caco-2 cell, antimicrobial activity against

pathogenic bacteria, and immunomodulating activity were tested. The acid tolerances of

JW15 in 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 2~7) for 2 hr, was high enough that 86.5%

of the inocula survived. JW15 were highly resistant to bile acid (0.3% oxgall) and had

strong adhesive ability to the Caco-2 epithelium cells in vitro. JW15 exerted antimicrobial

effects against such as Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus and

Listeria monocytogenes. The immunomodulating effects of JW15 was compared with those

of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), a well-known immune enhancer. Murine

macrophage cells stimulated with viable cells of W. cibaria JW15 strain increased the

amounts of pro-inflammatory mediators such as interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis

factor-α (TNF-α) and nitric oxide (NO), NF-κB.

We investigated synergy effect of JW15 and plant-derived extracts (Seoritae, Huktae and

Wooung) on immunomodulation. In this experiment, Seoritae, Huktae and Wooung were

extracted by hot boiling water. Adding Heat-killed JW15 and plant-derived extract of

diluted with PBS to RAW 264.7 of 5.0×105cell/ml or RAW BLUE of 5.0×105cell/ml. After

harvesting sample, NO production was measured by using Griess reagent system

(Promega, USA). Absorbance was then measured at 540 nm by using a microplate reader.

Also by using ELISA kit, IL-1β and TNF-α production were measured. Samples were

assayed in triplicate and read absorbance at 450 nm in a microplate reader. And production

of (NF) - κB was measured by QUANTI-Blue. The well-known Lactobacillus rhamnosus

GG (LGG) of immune activation strain was used as reference strain. As a result, NO and

IL-1β production of Wooung extract mixed with JW15 were measured as higher than

Wooung extract alone and JW15 alone. And IL-1β of Seoritae extract with JW15 was

higher than Seoritae extract alone and JW15 alone. We found that synergistic effects

between plant-derived extract (Seoritae and Wooung) and JW15 were measured in NO and

cytokine production.

To assess the immune enhancement abilities of combination JW15 and plant extracts,

Listeria (L.) monocytogenes challenge mice model was used. Female 7-9 week old BALB/c

mice were given a daily dose of 1×109 CFU of viable JW15, JW15 mixed with plant

extracts in 200 ㎕ PBS for 2 weeks. The negative control group (NC) and positive control

group (PC) was given 200 ㎕ PBS. After 2 weeks, mice were infected with L.

monocytogenes via the tail vein or via oral administration. The NC was injected with 100

㎕ PBS without L. monocytogenes. After 2 or 3 days, mice were euthanized and their body

weights determined. In addition, serum was collected and their livers and spleens were

weighed. Mice serum were analyzed for cytokine (IL-1β and TNF-α) production. The

survival analysis used 5 mice in each group in same way above and monitored the time

until the mice died. Three days after infection with L. monocytogenes, both the JW15-fed

and the plant extracts-fed group had significantly lower numbers of viable L.

monocytogenes in their spleens and liver compared to the PC. The level of IL-6 and TNF-

α in the serum of JW15 mixed with plant extracts-fed mice was significantly higher than

that of the PC and LGG. These results suggest that the oral administration of JW15 mixed

with plant extracts protects mice against infection with L. monocytogenes. We found that

mice fed JW15 mixed with plant extracts has good immune stimulatory activity among

four groups based on organ weight and cytokine production in serum. Therefore, JW15

mixed with plant extracts may have great potential as a feed supplement for controlling

pathogens and enhancing host immune responses in Listeria monocytogenes challenge mice

model.

Collectively, combination W. cibaria JW15 and plant-derived extracts have ability to

induce synergistic immuno-modulative effects and are suitable for consideration as a

functional food for humans and functional feed additives for companion animals.

4. Investigation of Immunological and Molecular Mechanisms of Lactic Acid

Bacteria and Immunoactive Materials(PJ00912604)

Probiotic bacteria are live bacteria that benefit the host through improvement of the

balance of intestinal microflora and by modulation of host immune systems. Lactic acid

bacteria (LAB) including Lactobacilli and Bifidobacteria are commonly used as probiotics.

Recent studies demonstrated immunomodulatory effect of LAB both in human and mice .

The present study aims to evaluate the immunomodulatory potential of LAB isolated from

Kimchi to be used as probiotics for the protection from bacterial infection or improvement

of inflammatory diseases. LAB selected based upon acid tolerance, bile tolerance, heat

tolerance and adherence to enterocyte-like Caco-2 cells were provided by another principle

investigator. Initially, we tested 7 LAB for their ability to induce cytokine production, T

cell activation, and regulatory T cell induction using human peripheral blood mononuclear

cells (PBMC) cultures, and selected 3 LAB (Weissella cibaria JW15, Lactobacillus

plantarum 4-25, Lactobacillus plantarum 76) for further studies.

Weissella cibaria JW15 (JW15) is Gram positive short rod bacteria and one of the most

common LAB isolated from Kimchi. Recent studies demonstrated their potential as

probiotics. Modulation of host immunity is an important potential mechanism by which

probiotics confer health benefits. However, very little information about immunomodulatory

activities of Weissella cibaria is available. we investigated the effect of JW15 on immune

function using human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC). In addition, signaling

pathways affected by JW15 were also explored. JW15 induced higher levels of IL-1β,

TNF-α, and IL-12 compared to Lactobacillus plantarum GG (LGG), which is the most

well-known probiotics strain. Furthermore, JW15 activated CD4+ T cells, evidenced by

increased CD25 and CD69 expression on the surface of these cells, and triggered IFN-γ

production strongly. These immunostimulatory activities induced by JW15 are likely

mediated by multiple signaling pathways, such as NF-κB, ERK, p38, and JNK. In order to

determine whether JW15 boosts immune responses to bacterial infection, we used mice

model of Listeria monocytogens infection. As expected, JW15 was able to partially enhance

the clearance of Listeria from Liver and spleen and boots cytokines production in response

to Listeria infection when mice were fed with this LAB daily.

Next, Lactobacillus plantarum 4-25 (LP 4-25) isolated from Kimchi also possess an

ability to activate in hPBMC to produce significant amount of TNF-α, IL-1β, and IL-12. In

addition, LP4-25 induced stronger T cell activation and Th1 differentiation, evidenced by

increased cell surface expression of CD69 and secretion of IFN-γ, in comparison with and

LGG which is the world’s most documented probiotics. Furthermore, LP4-25 enhanced

tumor cell cytotoxicity of natural killer (NK) cells. These immunostimulatory effect of LP

4-25 could be mediated by multiple signaling pathways including NF-κB and MAPK

pathways. Based upon our results, LP4-25 possesses immunomodulatory activity in hPBMC

and has a potential to be used to stimulate immune responses.

Lactobacillus plantarum 76 (LP76) was the one which didn’t activate human PBMC

efficiently and induced cytokines production weakly compared to LGG and other LAB

tested in the present study. In vitro results indicated that LP76 could down-regulate

inflammatory response by inhibiting cytokine production. Therefore, we evaluated this strain

and LP4-25 for immunomodulatory effects on inflammatory bowl diseases (IBD). When

mice were fed with LP4-25 or LP76 for two weeks prior to DSS treatment to induce IBD

in mice, a significant attenuation of bleeding score and colon length shortening was

observed in LP76 fed mice. Production of proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1

β, IFN-γ and IL-17 were decreased in colon and spleen in the DSS-treated and LP76 fed

mice. These findings indicate that LP76 has the potential to be applied in fermented dairy

products as an alternative therapy for inflamation-mediated intestinal disorder.

Taken together, the present study studied immunological and molecular mechanisms by

which LAB selected for probiotic uses and demonstrated that JW15 and LP4-25 were able

to stimulate not only mouse immune cells but also human PBMC via multiple signaling

pathways including NF-κB and MAPK pathways. In other hands, LP76 weakly activated

human PBMC and was able to attenuate DSS-induced colitis in the mice model of IBD.

5. Process Optimization for Mass Production of Lactic Acid Bacteria and

Development of Functional Food for Immune Enhancement using Lactic Acid

Bacteria(PJ00912605)

Lactic acid bacteria(LAB) strains are one of the microorganisms that are known as

GRAS (generally recognized as safe) microorganisms. The LAB are used extensively in the

food industry. LAB have been known to exhibit various probiotic benefits including

resistance to infectious disease, reduction of blood pressure and serum cholestrol, and

regression of tumors. Since this activity is suggested to be mediated by activation of the

immune system, many studies have been performed on the effect of LAB and fermented

milk on the immune system. The LAB is very important strain in food industry however,

the current high costs associated with the culture of LAB for mass production, have led to

rising LAB prices. To solve this problem, the development of a new medium using plant

for culturing LAB was studied. To reduce the production cost of LAB, we development of

culture medium using red ginseng starch (RGS) and Seoritae (black soybean). The RGS is

one of the by-products of the manufacturing process of red ginseng industry which is

composed of insoluble residues including starch, sugars, phenolic compounds, and

ginsenosides, and could plausibly possess physicochemical properties similar to those of red

ginseng, because it originates from the same process. This by-product of the red ginseng

industry may thereby prove to be a functional cosmetic and food material. The optimal

concentration of red ginseng starch, Seoritae and yeast extract as a medium were 22.5, 7.5,

and 20 g/L, respectively. Under these conditions, the cell mass of Weisella cibaria JW-15

reached 1.5×1010 CFU/mL. These results show a great possibility for the utilization of red

ginseng starch and Seoritae as economic medium sources in the production of cell mass of

lactic acid bacteria. To development of probiotics powder, the relationship between

cryoprotectant and the viability of freeze deied strains has been studied. The most effective

cryoprotectant for W. cibaria JW-15 was found to be 10% skim milk and 10% RGS. The

cultured W. cibaria JW-15 was encapsulated using 1.5% sodium alginate to increase of

acid tolerance and its total viability. As a results, the capsulated W. cibaria JW-15 showd

most effective acid tolerance at pH 2.5 and preservation of viability at 4℃. The application

range for capsulated LAB could be used in the food industry. Lastly, we development of 3

kinds of prototype functional foods using W. cibaria JW-15 including Lactic-acid fermented

milk, capsule and stick type LAB product. In conclusion, our results will be useful to the

development of functional food using LAB.

목 차

제 1 장 서 론 ··························································································································· 1

제 2 장 국내외 기술개발 현황 ······························································································10

제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ···················································································19

1절 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구 ······················································19

2절 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및 원료표준화 연구

·········································································································································· 49

3절 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구 ······················ 96

4절 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구 ················146

5절 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발 ·······································181

제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ···································································211

1절 정성적 연구목표대비 달성도 ······················································································211

2절 정량적 성과 ··················································································································214

제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ·······················································································221

제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ····················································223

제 7 장 기타 중요 변동사항 ··································································································223

제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ·································223

제 9 장 참고문헌 ·······················································································································224

- 1 -

제 1 장 서 론

현재 국내외 건강기능식품 시장 규모 및 개별인정형 제품화 현황을 살펴보면 2011년 세계

건강기능식품 시장규모는 89십억 달러이며, 향후 2016년에는 120 십억 달러를 상회할 것으로

예상되고 있다(Lee et al., 2012). 2011년 기준 국내 건강기능식품 시장은 세계 시장에서 1.4%의

비중을 차지하였지만, 전년 대비 성장률은 28.2%로 매우 높게 나타나고 있으며, 특히 건강기능

식품 상품 중 Vitamins & Mineral의 시장규모는 36십억 달러로 가장 크지만, Herbs/Botanicals도 24십

억 달러를 차지하고 있으며, 성장률은 전년대비 3.9%에서 7.5%로 큰 상승을 보였다. 국내 건강기능식

품 시장의 2012년 총생산액은 14,091억 원으로, 내수시장을 중심으로 빠르게 성장하고 있다. 특

히 건강기능식품 중 홍삼이 가장 큰 시장을 형성하고 있으며, 2012년 전체 건강기능식품 생산

액의 46.0%(6천5백억 원)를 차지하고 있다. 건강기능식품 생산 실적면에서는 프로바이오틱스

제품이 전체 건강기능식품 생산액 중 3.7%(518억원)을 차지하고 전년대비 27.9% 상승으로 급

격한 성장세를 보였다. 2011년도 개별인정형 제품 분야에서도 전년 대비 27.1%로 성장하였고,

1,435억의 수익창출로 계속적인 증가 추세를 보였다. 생산액 1위는 간 건강제품(532억원), 그

다음으로는 면역기능에 도움을 주는 제품(179억원), 관절/뼈 건강제품(153억원) 순으로 나타났

다. 이러한 성장요인은 일본 방사능 유출, 환경오염, 자외선 등으로 인한 면역기능이나 피부건

강에 대한 소비자 관심이 증가하고 있기 때문으로 추측된다.

2011년 12월말을 기준으로 식품의약품안전처가 개별인정형으로 허가한 기능성원료는 총 165

종(동일한 원료에서 2개 이상 기능성이 인정된 경우가 합산)으로 이중에서 ‘면역력 증진’을 기

능성으로 하는 원료는 8종에 불과하다. 이들 중 대부분은 세균, 효모 및 버섯균 유래의 미생물

유래 다당을 기본으로 하는 원료로 식물 유래의 면역활성 다당이 새로운 건강기능식품 소재

또는 의약품으로 개발될 수 있는 가능성은 매우 높다고 할 수 있다. 하지만 국내에서 식물유래

다당류와 이들의 생물활성에 관한 연구는 기타 기능성물질 연구에 비해 상대적으로 미흡하다.

다당류 및 면역 활성에 대한 연구는 향후 건강 유지에 유용한 물질로 재창조할 수 있는 새로

운 소재로서 역할이 기대된다.

사람의 장관에는 약 500종류의 100조에 달하는 정상 장내세균총이 정착되어 있으며, 균수로

는 보통 분변 1g당 1010-11의 매우 높은 세균수로 존재하고 있다(Noverr et al., 2004). 사람의

장내세균총은 Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Enterobacter, Enterococcus,

Escherichia, Eubacterium, Fusobacterium, Klebsiella, Lactobacillus, Peptococcus,

Peptostreptococcus, Proteus, Ruminococcus 속 미생물로 구성되어 있는데, 편성혐기성세균

(Strict anaerobic bacteria)이 우점종을 차지하고 있으며, Bifidobacterium, Lactobacillus,

Enterococcus와 같은 유산균군도 중요한 세균군을 유지하고 있다. 이들 중에서 Bacteroides와

F irmicutes가 가장 많은 수를 차지하는 있으며 사람의 몸에 존재하는 세포의 10배 많은 수의

장내미생물이 존재하여 최근에는 장내세균총을 위장관의 일부분을 구성하는 “초유기체

(superorganism)”로 표현하고 있다 (Qin et al., 2010). 수십 년 동안 이루어진 많은 연구들이

장내세균총이 사람의 건강과 질병에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미친다는 것을 밝혔고 사

람의 장내세균총의 조성은 식이습관에 따라 바뀔 수 있다는 것을 확인했다(Frick and

Autenrieth, 2013). 장내세균총은 크게 유해균과 유익균으로 분류할 수 있으며 서로 경쟁하며

- 2 -

균형을 유지하여 위장관 뿐만 아니라 신체의 항상성을 조절한다 (Frick and Autenrieth, 2013).

대표적인 유익균인 Bifidobacterium속과 Lactobacillus속 세균들은 식이섬유나 발표식품의 섭취

에 의해 우세해지며 서구화된 식이습관과 음주나 흡연, 각종 스트레스는 이러한 유인균의 분포

를 감소시키고 유해균은 증가시킨다. 유익균과 유해균의 균형이 깨지게 되면 이는 질병으로 이

어질 가능성이 매우 높다 (Heselmans et al., 2005; Knight and Girling, 2003). 그러므로 유익

균의 수를 증가시키는 요커트, 치즈, 김치 등의 발효식품의 건강증진 효과는 다양한 연구를 통

해 확인된 바 있다. 이들 장내세균총은 항생제 사용, 노화, 영양불량, 스트레스 등에 의하여 쉽

게 변동될 수 있으며, 여러 가지 질병에서 장내 균총의 이상이 발견되기 때문에 장내균총의 유

지안정은 질병 위험의 감소에 중요한 요소로 생각된다. Probiotics에서 가장 흔하게 사용되는

유산균으로는 Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. delbrueckii, L. cellobiosus, L. curvatus, L.

fermentum, L. lactis, L, plantarum, L. reuteri, L. brevis, Bifidobacterium bifidum, B. adolescentis,

B. animalis, B. infantis, B. thermophilum, B. longum, Enterococcus faecalis, Ent. faecium 등이 있

다. 이러한 장내세균총 안정화에 기여하는 생균제(프로바이오틱스)는 숙주의 면역조절 작용을 통하여

예방의학의 측면에서 매우 중요한 기능을 수행할 것으로 보인다.

최근에는 장내세균총이 면역체계의 발달과 활성조절에 중요함을 증명하는 연구결과들이 발

표되면서 유산균의 건강증진효과에 대한 관심이 더 증가하고 있다 (Rescigno et al., 2009). 수

십년 동안 많은 종류의 유산균이 면역증강 또는 염증억제 활성을 갖는 것으로 보고되었으나

유산균의 면역조절효과에 대한 작용기전은 여전히 잘 알려져 있지 않아 깊이 있는 연구가 필

요하다. Lactobacillus paracasei subsp.paracasei DC412 strain과 L. acidophilus NCFB 1748는

(Kourelis et al., 2010) 실험동물모델에서 강력한 선천성 면역반응을 유도하였으며 이는 유산균

이 장관의 상피세포와 상호작용하여 면역세포들을 감염부위로 침윤시키고 활성화시킴에 의한

것으로 여겨진다. 또한 사람의 PBMC를 유산균과 배양하면 면역반응을 조절하는 사이토카인이

생성되며 사이토카인의 유형은 유산균주 특이적인 것으로 나타났다. 동일한 연구에서 유산균

이 자연살생세포 (natural killer cells, NK cells)의 cytotoxic activity를 증강시켜 바이러스 감

염과 암세포에 대한 방어기능을 향상시킨다고 보고하였다 (Delcenserie et al., 2008).

최근 소비자들의 건강에 대한 관심이 집중되면서 식품분야에서 고기능성, 건강지향성 소재들

에 대한 관심역시 높아지고 있는데, 대표적으로 유산균 시장 규모가 꾸준한 상승세를 보이고

있고 관련 제품 판매도 증가하고 있는 추세이다. Nutrition Business Journal(2011. 1. 4)에 의

하면 세계 프로바이오틱스(Probiotics) 시장은 2009년도 기준 전년대비 24% 신장하였고 프로바

이오틱스는 앞으로도 건강기능성식품 시장을 주도해나갈 것으로 전망하였다. 세계 건강식품 시

장은 2,600억 달러를 상회하는 것으로 추정되고 있는데, 미국이 전체 시장의 30%(780억 달러)

를 차지하고 있고 이중 건강기능식품 시장은 약 33%인 257억 4000만 달러 규모를 형성하고

있다. 유산균 시장은 2008년도 기준 약 21조 원으로, 유럽(33%), 미국(24%). 일본(19%)이 주도

하고 있다. 미국이나 유럽 같은 선진국의 경우 전체 유산균 시장에서 사료용으로의 소비가

46%에 달해, 건강기능식품 소재용과 함께 90%를 점유하며 높은 경쟁률을 보이고 있다. 세계

프로바이오틱스 시장은 연평균 12.6%의 성장률로 2014년에는 326억 달러에 이를 것으로 예상

되고 있다. 현재 아시아와 유럽 지역을 중심으로 프로바이틱스 제품의 총생산량은 2012년에

261억 달러를 차지하였고 Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus등과 같은 유산균을 중

심으로 개발되고 있다(Markets & Markets, 2014). Lactobacillus rhamnosus GG (Valio,

Culturelle), L. casei Shirota (Yakult), Bifidobacterium animalis Bb-12 (Chr. Hansen)과

- 3 -

Saccharomyces cerevisiae Boulardii (Biocodex)은 사람의 건강기능증진 효과에 대한 연구가

가장 많이 이루어진 상용화된 유산균주이다(Foligne et al., 2013; Klein et al., 2010; Vogel,

2010).

현재 유산균의 다양한 용도 개발과 학문적 연구는 활발하게 이루어지고 있으나, 산업화에 필

요한 대량생산 배양공정 및 제제화 공정 등에 대한 기술개발은 부족한 실정이다. 국내 관련 분

야에서는 기술적인 측면에서 저가 비용의 대량생산공정 개발과 사멸하지 않고 살아있는 상태

로 장까지 도달되도록 하는 코팅기술 개발이 주요한 것으로 평가되고 있다. 쎌바이오텍은 유산

균 코팅과 살아있는 유산균 원말 제조 기술로 세계 유산균 원말시장을 주도하고 있다. 에이엠

바이오(주)는 멤브레인을 이용하여 대사산물의 혼입없이 고농도 고순도로 유산균을 생산하는

기술 개발에 성공하여 시장 점유율을 확대해 가고 있다. 비젼바이오켐(캐나다 로셀), 파일약품

(캐나다 하모니움), 매일유업(핀란드 바리이오), 롯데(스웨덴 바이오가이아) 등이 외국에서 원료

를 수입판매하고 있으며, 크리스천한센, 다농 제품도 국내 주요 유업회사를 통해 들어와 판매

되고 있는 상황이다.

그러나, 유산균의 제품화에 앞서 우선적으로 다양한 기능성을 보유한 유산균을 발굴하여 자

원을 확보하는 것이 중요하다. 특히 최근에 주목되고 있는 면역 기능과 관련하여 면역세포의

기능적 손상 방지 및 면역 증강 효과를 가진 유산균을 발굴하고 이를 대량 생산화한다면 기능

성식품 첨가제, 동물약품 및 백신 등 다양한 제품화가 가능하다. 또한 기능성 유산균을 이용하

여 기능성이 강화된 발효식품 특화소재로 개발하여 바이오 헬스 제품을 생산하여 기능성식품

시장의 성장에 크게 기여할 것으로 판단된다..

미생물 중에는 생육 시 대사산물로 유산(또는 젖산, lactic acid)을 생성하는 균이 있는데, 이

러한 균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)이라 한다. 즉, 포도당(Glucose)로부터

다량의 유산을 생성하여 우리가 섭취하는 식품과 사람을 포함한 포유동물의 장내에서 인체에

해로운 물질들(Indole, phenol, ammonia 및 amine 등)은 생성하지 않고 식품의 부패를 방지하

는데 도움을 주는 유익한 균을 뜻한다. 장내 부패 억제, 장의 운동을 촉진하여 변비 방지, 면역

력 증가, 발암 억제, 비타민 B군의 생산 등 여러 가지 생리적 기능을 가지는 것으로 밝혀지고

있다 (Ji GE 1994, Doron et al. 2005, Muller et al. 2009). 그리고 Lactobacillus acidophilus와

Bifidobacterium은 신생아나 면역기능이 감소되는 소아기의 면역 증진을 위한 첨가제로 이용가

능 하다는 연구와 국소 및 전신 면역기능 항진에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Goldin

and Gorbach, 1977, Schiffrin et. al., 1995). 또한 아세트산 및 젖산과 같은 유기산 그리고 박테

리오신 같은 항균 물질 등 다양한 대사산물을 생산하여 장내 부패균 및 유해한 병원성 세균의

생육을 저해하고 있는 것으로 알려져 있어, 다양한 방면에서 연구가 진행 중이다 (Chae et al.

2010, Diep et al. 2006, Mathara et al. 2008, Park et al. 2013). 이들을 유산균 제제로 사용하

기 위해서는 위산에서 기인되는 낮은 pH와 담즙산에서 견디어 장내에 도달할 수 있는 생존능

력 및 균주의 안정성이 고려되어야 한다 (Ozlem et al. 2011). 따라서 요구르트, 유산균 음료,

분말, 과립 및 정제 형태의 유산균 제품이 기능성 식품으로 가장 큰 시장을 형성하고 있다. 뿐

만 아니라 최근 들어 유산균은 장내 미생물 균총의 개선에 의한 건강 증진 효과 이외에 생리

활성 물질 생산균으로 새롭게 부상하고 있으며, 저칼로리당, 세포외 다당류, 올리고당 등의 기

능성 소재 생산과 관련되어 연구가 진행되고 있다 (Ryu et al. 1998). 유산균은 전통적으로 인

류가 오랫동안 사용해온 미생물로서, 발효 유제품은 물론 각종 발효 식품, 장류, 김치에 활용되

고 있으며, 최근에는 사람의 의약품이나 가축의 사료 첨가제에 이르기까지 매우 다양하게 이용

- 4 -

되고 있다. 유산균은 사람이나 동물의 소화관, 각종 발효 식품, 토양 등 자연계에 널리 분포되

어 있다. 대표적인 유산균으로는Lactobacillus, Bifidobacterium, Carnobacterium, Atopobium,

Lactococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus,

Enterococcus, Streptococcus, 그리고 Vagococcus가 잘 알려져 있으며(Lee et al., 1995), 역사

적으로는 1908년에 Metchnikoff가 인체에 이로운 발효 식품의 섭취와 필요성을 주장한 것이

현재의 유산균의 효시가 되었다(Metchnikoff., 1908). 유산균은 처음 19세기 중반에 파스퇴르에

의해 알려지기 시작했고 메치니코프의 장수설로 인해 더욱 큰 관심을 받아왔다. 이후 유산균의

다양한 생리적 기능과 효능은 오랫동안 연구되어 오고 있으며 정장작용(변비개선, 설사예방),

병원성 유해균의 생육 억제, 항암효과, 면역반응 증진효과, 항암작용, 항염작용, 대사질환 개선

효과 등은 보고되었다 (Gill and Prasad, 2008; Ouwehand and Vesterlund, 2003; Santosa et

al., 2006). 하지만 이러한 유산균의 효능은 균주에 따라 매우 상이하기 때문에 우수한 유산균

을 분리하고 선발하는 것은 유산균을 이용한 건강기능성소재 개발에 있어 가장 중요하다고 할

수 있다. 대표적으로 알려진 유산균으로는 인체의 소장에 주로 존재하는 Lactobacillus속과 대

장에 주로 서식하는 Bifidobacterium속이 있다. Lactobacillus는 우유의 유당(Lactose)을 뜻하는

lacto와 막대 모양이라는 bacillus라는 단어가 합쳐진 명칭으로 유당을 분해하는 막대 모양의

간균을 의미한다. 이 균에 관한 다양한 기능성과 미생물학적 특성을 밝히고자하는 연구가 가장

많이 이루어지고 있기에 현재 산업적으로 가장 폭넓은 분야에서 사용되고 있다. Lactobacillus

의 종류는 치즈의 의미를 가진 casei라는 단어가 사용된 Lactobacillus casei가 치즈 제조 및

유청을 원료로 하는 젖산제조에 사용되며, 호기성 젖산균인 Lactobacillus acidophilus는 사람

및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하여 콜레스테롤 저하 효과와 비타민 B의 합성능

을 가지고 있으며 식품에서는 버터나 우유 제조에 사용되고 있다. 김치에서 유래된 유산균 중

가장 잘 알려진 Lactobacillus plantarum은 젖산을 생성하여 김치나 치즈의 풍미를 높여주며,

Lactobacillus rhamnosus는 병원성 미생물에 강한 효능을 비롯한 다양한 기능성이 알려지면서

probiotics로서 전 세계적으로 가장 널리 사용되고 있다. Bifidobacterium은 Lactobacillus 등

다른 유산균과 달리 Actinobacteria문에 속하며 Y자나 V자의 불규칙적인 형태를 하고 있는 혐

기성균이다. 이 균은 사람이나 포유류, 조류의 내장과 구강에 살고 있는 중요한 소화균이며

glucose을 분해하여 acetic acid, lactic acid, formic acid, succinic acid 및 acetic acid 등 유기

산을 생성한다. 최근에 알려진 김치에서 분리한 초저온성 유산균인 Weissella속은 다른 유산균

에 비하여 산 생성량이 상대적으로 낮아 김치 발효 시 산미를 저감시켜 발효용 스타터로 용이

하다. 특히 Weissella cibaria는 발효식품뿐만 아니라 사람과 동물의 분변을 통해 정상적으로

분리되는 세균으로(Bjorkroth et al., 2002), 다른 균과는 달리 강산을 만들지 않아 구취 및 충

치를 억제하는 데 효과적이라 구강건강에 이로운 역할을 한다는 연구 결과도 있다(Kang et

al., 2006).

1965년에 Lilly와 Stillwell이 다른 미생물의 성장을 유도하는 미생물의 생성물질을

“Probiotics" 라고 최초로 명명한 이후, 2001년에 세계보건기구(WHO)와 국제식량기구(FAO)에

서 “Probiotics"를 적정량을 섭취하였을 시 인체 건강에 유익한 영향을 주는 살아 있는 미생물

이라 정의하였다. 많은 미생물 중 probiotics 미생물로 선발되기 위한 조건은 사람과 동물 등

숙주에 유익한 작용을 하기 위해 소화기관을 통과하여 장내에 정착하여야 하므로 인체 소화관

의 위산, 담즙산과 같은 산성에 대한 내성이 필요하다(Saarela et al., 2000). Probiotics는 체내

의 장내 균총을 정상적으로 유지하고 조절하는 중요한 역할을 한다. 즉, 장내에 병원성 세균이

- 5 -

소화관 상피에 부착하는 것을 막아 질병 발생을 감소시키고, 유산균으로부터 생성된 항균 물질

이 인체에 유해한 병원성 미생물이나 장내 부패균을 사멸시키거나 증식을 억제하도록 도와준

다. 그리고 이 미생물은 생육 증식 과정을 거쳐 유산을 생성하고 부산물로 amylase, cellulase,

lipase 및 protease와 같은 소화 효소를 생성하여 섭취한 식품의 소화 흡수를 도우며, 발효과정

으로 생성되는 유기산인 hydroxy methyl glutarate, orotic acid, uric acid 등에 의해 콜레스테

롤 생성도 저해시킨다. 특히 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG) 균주는 1985년 발견 이래 가

장 많이 연구된 대표적 probiotics 유산균으로 병원성 미생물의 성장을 억제하고 아토피성 습

진과 같은 피부염과 장염증 완화의 기능성이 입증되었다(Viljanen et al., 2005). 특히 인체의

소화액에 대한 내성과 장상피 세포 부착능이 뛰어나 섭취하면 인체의 장까지 도달하고 장관

내에 정착하여 살아갈 수 있는 기능으로 인해 발효유와 음료에 사용하기에 가장 적합한 스타

터로 세계적으로 인정받고 있다(Kankainen et al., 2009). 위에서 기술한 것처럼 생균제의 과학

적 기능이 입증된 내용으로는 1) 로타바이러스 설사 개선, 2) 항생제 관련 설사 개선, 3) 유당

불내증 경감, 4) 유아의 식이성 알레르기 증상 경감, 5) 정장 작용 등이며, 동물 실험이나 인체

임상 실험 수준에서 효과가 인정되나 체계적인 임상 시험이 필요로 하는 내용들은 1) 발암 위

험 저감, 2) 면역 기능 조절, 3) 알레르기 저감, 4) 혈압 강하, 5) 위내 H. pylori균 억제, 6) 장

내 환경 개선, 7) 과민성 대장염, 크론병, 궤양성 대장염 경감, 8) Clostridium difficile 설사 저

감, 9) 식이성 콜레스테롤 저감, 10) 유아 및 아동의 호흡기 감염증 억제, 11) 구강 내 감염증

저감 등이 있다(Fuller, 1989; Rolfe, 2000; Lecssard et al, 1987; Kim et al, 2011; Matsuzaki,

1998; Koll et al., 2010).

유산균은 치즈, 발효유, 유산균 음료 등의 발효 유제품을 비롯하여 각종 발효 식품(된장, 김

치, 젓갈, 막걸리 등)의 제조에 전 세계적으로 광범위하게 응용되고 있는 산업적으로 중요한

미생물로 E. coli와 같은 일반 미생물에 비해 매우 복잡한 영양요구성을 지니는 유산균의 생육

효과를 높이기 위해서는 충분한 영양 공급이 이루어져야 한다(Cho et al., 2011). 또한 유산균

은 포도당 및 유당과 같은 당류를 대사시켜 젖산을 생성하고 다른 유기산(초산 등) 및 활성물

질 등을 생성하는데, 이들 물질들에 의해 배양 중 수소이온농도가 높아져 유산균 균체 증식을

저해하는 문제점을 보인다. 유산균의 배양방법으로는 일반적으로 회분식(Batch) 배양과 연속식

(Continuous) 배양으로 나누어지는데, 기존의 산업에서는 주로 고가의 합성배지인 MRS

broth(Difco 사)를 사용하여 회분식배양법이 많이 사용되어져 오고 있다. 현재 영양요구성이 까

다로운 유산균을 대량 배양하기 위한 기술 개발과 함께 천연식물 소재를 이용한 배양배지를

탐색하는 연구도 진행되고 있다. 최근에 부각되고 있는 식물성 유산균은 Plant Originated

Lactic Acid Bacteria(POLAB)로 지칭되어 치즈 등에서 분리된 일반 유산균과 구별하여 식물

원료의 발효 식품에서 분리된 유산균을 말한다(Kumagai T 2009). 이 유산균은 일반 유산균보

다 척박한 환경, 즉 적은 영양소와 천연 항균물질이 포함되어 있는 상황에서 생육하기 때문에

영양소를 분해, 섭취하는 능력이 뛰어나며, 각종 생리활성물질의 생산력도 우수한 것으로 알려

져 있다(Igarash T 2007; Huang 등 2008). 유산균의 배양에 주로 사용하는 질소원은 casein,

meat, soy peptone 등이 사용되고 있는데, 특히 casein peptone은 tryptophan양이 1.3g/100g으

로 높아 현재 유산균 배양에 단백질원으로 casein peptone만을 사용한다. MRS medium/Meat

Extract/Yeast Extract 참고용으로 유산균의 배양 배지에서 중요한 비중을 차지하는 질소원은

Casein peptone, Meat peptone, Soy peptone, Meat Extract, Yeast Extract 등으로 식품첨가용

이어야 한다. 김치 등 발효식품에서 초기에 출현하는 Leuconostoc mesenteroides,

- 6 -

Leuconostoc citreum 등은 적숙기 이후 출현하는 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

sakei보다 아미노산 등 성장인자의 요구성이 훨씬 높다. 성장인자의 요구성이 높을수록 그렇지

않은 유산균보다 증식이 빠르고 앞서기 때문에 Leuconostoc mesenteroides가 먼저 증식하게

된다. 모든 성장인자를 스스로 합성하는 데 소요되는 시간에 비교하여 체외로부터 필요한 성장

인자를 합성하지 않고 직접 섭취하는 시간이 짧기 때문이다. 미생물 배양에 주로 외국으로부터

수입되는 고가 배지성분이 소요되므로 특히 유산균 배양을 위해 배지제조업체간의 경쟁에도

불구하고 제품 생산비를 낮추고 biomass 높이는 한계 개선이 필요하다(Yoon et. al., 2006).

면역이란 인체 내의 자기(Self)와 비자기(Non-self)를 구별하여 인체 내에서 자연적으로 발생

하거나 외부에서 들어온 유해 물질을 인지한 후 제거하여 신체의 항상성(Homeostasis)을 유지

시키는 반응을 뜻한다(Cannon., 2000). 이 반응은 외부로부터 인체에 침입한 바이러스, 박테리

아 및 기생충과 같은 유해균에 저항하고, 내부에 생긴 암세포에 저항하거나 제거하는데 있어서

매우 중요한 역할을 한다. 특히, 면역은 체내에 들어와 항체를 생산하게 하는 원인 물질인 항

원의 특이성에 따라 선천성 면역과 후천성 면역으로 구분할 수 있는데, 선천성 면역은 외부로

부터 항원이 들어오기 전에 이미 존재하는 면역체계로 외부로부터 침입한 미생물에 즉각 반응

한다(Arunachalam et al., 2000). 반면에 후천성 면역은 항원이 침입하게 되면, 그 항원에 의하

여 면역이 획득되어 반응을 유도한 항원에 대하서만 나타나는 특이성을 가지고 있다. 또한 면

역은 특이성을 고려하여 항원비특이적인 선천성 면역반응과 항원 특이적이 획득 면역반응으로

나뉠 수도 있는데, 항원 특이적인 면역반응은 다시 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응으

로 다시 나누어진다. 체액성 면역반응은 항원이 B cells 표면에 발현된 특이적인 항체에 결합

하고 CD4+ helper T cell (CD4+ Th cells)가 분비하는 사이토카인에 의해 활성화됨으로 시작된

다. B cells은 이어서 clonal expansion을 거쳐 항원 특이적인 항체를 생성하여 분비함으로서

침입한 병원체나 독소를 중화시키고 대식세포에 의한 phagocytosis를 촉진하여 세포외에 존재

하는 병원체에 대한 방어작용을 한다. 세포매개성 면역반응은 항원제시세포 (antigen

presenting cells; dendritic cells, macrophages and B cells)에 의해 제시된 항원을 CD4+ Th

cells 과 CD8+ Th cells 이 인식하여 활성화됨으로 시작된다. CD4+ Th cells은 다양한 종류의

사이토카인을 생성하여 다른 면역세포의 활성화, 증식, 분화를 조절하고 CD8+ T cells은 감염

된 세포를 제거하는 기능을 한다. 이러한 Th cells의 활성에 문제가 생기면 감염에 대해 취약

해질 뿐만 아니라 암발생, 알러지, 자가면역질환 등의 원인이 된다(Hirahara et al., 2013).

CD4+ Th cells은 활성화 된 후 항원의 특성에 따라 특이적인 기능을 하는 Th cell로 분화하게

된다. Th1은 주로 IFN-γ를 분비하며 세포내 바이러스와 세균을 제거하는데 기여하고, Th2는

IL-4, -5, -13을 분비하는 세포로 B cell에 의한 항체생성을 조절하여 세포외 병원체에 대한

체액성 면역반응에, 비교적 최근에 알려진 Th17은 IL-17과 IL–22를 분비하여 세포외 세균과

곰팡이에 대한 방어작용에 참여한다(Hirahara et al., 2013., Luckheeram et al., 2012). 따라서

감염에 대한 방어면역에 있어 특정 CD4+ Th cells로의 분화가 매우 중요하다. 반면에 이러한

CD4+ Th cells의 분화가 비정상적으로 조절될 경우엔 자가면역질환 (Th1, Th17), 알러지와 면

역과민반응 (Th2, Th17)과 같은 면역매개질환으로 연계된다. regulatory T cells (Tregs, 조절

T 세포)는 전사조절인자인 Foxp3를 특이적으로 발현하며 IL-10, TGF-β와 같은 억제성 사이

토카인을 통해서 그리고 직접 접촉을 통해 면역세포의 활성을 억제하여 앞에 언급된 면역매개

성 질환의 발생을 억제한다(Josefowicz et al., 2012, Luckheeram et al., 2012).

체내에서 면역반응을 담당하는 중심 세포는 혈액 중의 백혈구인데, 그 중에서도 식균 작용을

- 7 -

하는 대식세포(Macrophage)와 B세포, T세포, 그리고 NK 세포로 구성되어 있어 항체를 생산

하고 바이러스나 암세포를 파괴하는 등 면역반응을 유도하는 림프구(Lyphocyte)가 있다. 이들

면역세포들에 의한 면역반응 중 후천성면역은 B 림프구와 T 림프구에 의해 나타나며 T 림프

구가 활성화됨에 따라 면역반응이 이루어진다(Clerici et al., 1994; Cannon., 2000). 이러한 T

림프구의 활성화는 T 림프구 CD4+ 수용체의 활성화에 의해 분비되는 사이토카인의 종류에 따

라 두 종류의 T-helper type 1(Th1) 세포와 T helper type 2(Th2) 세포가 림프구로 변환되어

나타난다. 인체의 정상적인 면역 반응을 유도하는 Th1 세포로부터 분비되는 사이토카인은 염

증성으로서, 종류는 IL-1, IL-2, IL-12 및 IFN-γ 등이 있다. 이들은 세포독성을 나타내고 세포

성 면역능을 가지기 때문에 이를 통해 면역 증강 기능성을 평가하는데 지표로 사용된다. 반면

에 자가 면역 반응을 유도하는 Th2 세포에서 분비되는 사이토카인으로는 IL-4, IL-5, IL-6 및

IL-10이며, 이들은 항체생성에 의해 조절되는 체액성 면역을 활성화하는 역할을 한다

(Mosmann et al., 2005). 대식세포도 인체의 면역계에 관여하는데, 휴지상태의 대식세포는 면역

반응의 여러 자극에 의해 활성화되어 세포독성 단백질을 분해하고, 높은 수준의 class Ⅱ

MHC(Major histocompatibility complex) 분자도 발현하여 인체 내에서 우수한 항원제시 세포

로 작용한다. 그리고 대식세포는 외부에서 인체로 침입한 세균, 바이러스 등을 포획하여 그것

에 대항하는 면역정보를 림프구에 전달한다. 이러한 대식세포는 M1과 M2의 두 종의 대식세포

아형으로 나눌 수 있는데, 그 중 M1 대식세포는 Th1 세포로부터 분비되는 사이토카인인

IFN-γ에 의한 고전적인 활성화 반응을 일으켜 초기에 염증성 사이토카인을 분비하고, 보체매

개 탐식작용을 통하여 세균과 바이러스 감염에 대한 방어기작으로 작용한다. 반면에 M2 대식

세포는 Th2 세포로부터 분비되는 사이토카인인 IL-4과 IL-13에 의한 선택적 활성화 반응을

통해 항염증반응을 유도하고, 기생충과 곰팡이 등에 대한 방어 작용을 하며 인체 내의 염증반

응을 종결시켜 손상된 조직을 재생시키는 역할을 한다(Martinez et al., 2009).

면역체계는 Toll like receptor (TLR)을 통해 미생물을 인식하며 이는 세포내 신호전달체계

중의 하나인 NF-κB신호경로를 활성화 시킨다 (Kamdar et al., 2013; Napetschnig and Wu,

2013). 전사인자인 NF-κB/REL family는 세포성장과 생존뿐만 아니라 염증작용과 면역반응에

서 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 포유동물의 NF-κB family는

p65(RelA),RelB,c-Rel,p50/p105(NF-kB1),과 p52/p100(NF-kB2)가 존재하는데 이들은 homo- 혹

은 hetero-dimer의 형태로 존재하며 자극받지 않은 세포의 경우 IκB family 단백질들과 결합

한 하여 그 활성이 억제되어 있다. 여러 가지 자극 (스트레스, 감염, TLR ligands, 사이토카인

등)에 의해 IκB가 분해되고 결합되어 있던 NF-κB는 분리되어 핵으로 이동한 후 다양한 종류

의 유전자의 전사를 조절한다. 이는 감염성 질환에 대한 충분한 면역반응을 유도하는데 필수

적이다. NF-κB경로가 적당한 수준으로 활성화 되면 감염성 질환에 대한 충분한 면역반응을

유도하게 되는 반면 과도하게 활성화 될 경우 오히려 지나친 염증성 사이토카인의 분비와 면

역세포의 활성화로 인해 조직손상을 유발할 수 있다 (Kamdar et al., 2013; Napetschnig and

Wu, 2013).

장관의 점막면역(mucosal immunity)체계는 Peyer's patch 같은 림프 구조와 림프구들로 구

성되어 있다. 미생물이 Peyer's patch로 도달하고, dendritic cell, 대식구 같은

antigen-presenting cell(APC)에게 인식된다. APC가 Toll-like receptor(TLR)을 통해 미생물을

인지하여 IL-12를 분비하면 Th1 반응이 활성화된다. 선천 면역(innate immunity)으로 미생물

에 대한 첫 반응이 pattern recognition receptor(PRR)인 TLR을 통해 이루어진다. 면역 세포와

- 8 -

상피세포는 TLR을 통해서 장내 세균(commensal)과 병원성 미생물에 대해 차별적 반응을 한

다. 장내 세균에 대해서는 관용(tolerance) 상태를 유지하며, 병원균 같은 위험에는 면역반응을

일으킨다(Gill., 2003; Isolauri et al., 2001).

Probiotics의 섭취는 염증성 장질환이나 알레르기 환자의 비정상적인 장내균총을 개선하며

Th1/Th2의 균형을 정상화함으로 이들 질환의 예방에 기여할 수 있다. 뿐만 아니라 probiotics

에 의한 NK세포의 활성화는 암 발생 예방에도 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

Probiotics는 매우 안전하며 유제품이나 발효식품에 쉽게 이용될 수 있는 식품 소재로 일상적

으로 섭취하는 것이 건강의 유지 및 증진에 도움이 된다.

최근에는 식생활변화, 노화, 스트레스, 흡연과 음주, 환경오염의 노출 등 여러 가지 요인들에

의해 암, 면역부전, 아토피, 자가 면역 등과 같은 면역계와 관련된 질환이 늘어남에 따라 이들

의 치료 또는 예방을 위해 식품을 소재로 한 면역 관련 연구가 계속 증가하고 있는 추세이다.

그동안 유산균의 효능에 대한 연구는 주로 장질환, 성인병 예방, 항암, 콜레스테롤 생성 저하 등

질병 예방 효과 구명 중심의 연구에 집중되고 있지만, 최근 문제되고 있는 아토피 등과 같은 면

역질환에 대해서도 향후 더 많은 연구가 필요한 실정이지만 아직 체계적인 연구가 이루어지지

못하고 있는 실정이다. 특히 많은 기능성 식물유래물질의 단편적인 생리활성 효과에 대한 연구

는 축적되어가고 있지만, 면역활성 능력을 갖는 우수 유산균주와의 혼합연구는 거의 이루어지

지 않고 있는 상황이다. 기존에 많이 연구된 기능성 식물유래물질과, 유산균의 혼합배양 시 그 시

너지 효과가 기대되지만, 그 면역활성의 기전연구나 생리활성에 대한 in vitro, in vivo 검정은 아직

정확하게 밝혀지지 않은 상황이므로, 과학적인 검증작업이 매우 필요한 실정이다. 현재 사회적으로

도 급속하게 증가하고 있는 면역활성 기능성식품의 효과에 대한 명확한 과학적인 연구 자료의 필요

성이 요구되고 있다. 천연물 소재뿐만 아니라 건강한 사람의 장내 미생물로 존재하는 유산균 또

한 면역시스템을 통하여 인체와 같은 숙주를 보호하여 주기 때문에 면역증강에 관한 연구도

활발히 진행되고 있다. 그러나 식물 소재와 유산균 각각 또는 발효액에 대한 면역 활성 효과에

대한 보고는 널리 알려져 있지만, 면역 활성이 높은 식물소재와 유산균의 복합물에 의한 기능

성과 관련 제품 개발에 관한 연구는 미비한 수준이다. 그리고 유산균의 효과가 알려지면서 소

비자들의 관심이 높아져 요구르트나 치즈 등 발효 제품 이외에 건강기능식품을 비롯한 제품이

다양화되고 있고 LGG와 같이 상용화된 균주와 유사 활성을 보이거나 더 우수한 기능성을 가

지며 풍미를 증진시켜 주는 신규 균주의 개발에 노력을 기울이고 있다. 그러나 면역 기능 개선

에 도움을 주는 식품과 유산균의 혼합에 의한 시너지 효과를 평가하여 보고한 사례는 많지만,

그 면역 활성에 관한 in vitro 또는 in vivo 검정을 통한 기전연구는 아직 부족한 실정이므로

과학적인 검증작업이 매우 필요한 실정이다.

Listeria monocytogenes는 그람양성의 병원성 세균으로 토양, 물, 다양한 식품, 동물, 사람

등에서 발견된다. L. monocytogenes에 오염된 식품을 섭취할 경우 식중독을 일으키며 심할

경우 사망에 이르게 되는 중요 병원체이다. 미국에서는 오염된 햄, 과일, 또는 치즈류 등에 의

한 식중독이 큰 문제가 되었으며 우리나라의 L. monocytogenes 식중독 발생률은 미국에 비해

낮으나 사망률이 최고 30 %에 이르기 때문에 예방의 중요성이 커지고 있다 (Kathariou, 2002).

L. monocytogenes에 대한 면역반응에는 많은 종류의 면역세포들이 관여하지만 특히 대식세포

에 의해 분비되는 TNF-α와 T cell에 의해 분비되는 IFN-γ가 성공적인 면역반응에 중요한 역

할을 하는 것으로 알려져 있다(Pamer, 2004). 따라서 프로바이오틱스가 면역력을 증강시켜 이

러한 사이토카인의 생성을 유도한다면 리스테리아 균에 대한 저항성을 높여줄 것으로 예상된

- 9 -

다.

최근 우리나라의 서구화된 식생활의 영향으로 염증성 장질환(inflammatory bowel disease

(IBD)의 환자수가 급증하고 있다. 염증성 장질환은 만성 염증성 장질환으로 크론씨병과 궤양

성대장염의 두 종류로 나뉘며 발병원인은 불분명하나 유전적 요인, 환경적 요인, 면역학적 요

인을 포함한 복합적 원인에 의한 것으로 알려져 있다 (Scaldaferri et al., 2013). 유전적 요인과

환경적 요인에 의해 장관내의 정상 세균총 또는 세균의 생산물이 장의 상피세포나 M cell을

침입하게 되면 염증유발하고 이것이 염증성 장질환의 시작으로 예상되고 있다 (Arseneau et

al., 2007, Scaldaferri et al., 2013). 즉, 정상적으로는 장내세균총에 대한 면역관용이 유지되나

IBD의 경우엔 이러한 면역관용이 깨지기 때문으로 여겨진다. IBD의 발생에 있어 면역학적 측

면에서는 Th1/Th17과 조절 T cell (regulatory T cell)의 균형이 중요한데 이 세포들의 균형이

깨져 Th17으로의 분화가 촉진되는 것이 특징적이라 할 수 있다 (Arseneau et al., 2007). Th1,

Th17, Tregs 세포의 발달과 활성화에 장내세균총이 중요한 역할을 하기에 유산균이 장내세균

총의 조성을 변화시키고 면역반응을 조절함으로써 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있을

것으로 기대된다(Goto et al., 2012). 유산균에 의한 IBD 개선효과는 여러 연구논문을 통해 보

고되었다. 유산균 투여로 인한 장내세균총 조성의 변화와 염증유발 사이토카인의 생성억제 및

장점막상피세포의 기능성 향상등이 작용기전으로 제시되었다 (Chen et al., 2013;Chen et al.,

2012;Jang et al., 2013;Liu et al., 2011;Yoda et al., 2014;Zakostelska et al., 2011). 이러한 연구

에서 IBD의 개선효과를 확인하기 위해서 DSS (dextran sulfate sodium) 유발 대장염 모델이

광범위하게 사용되고 있다 (Wang et al 2002). 이 모델은 마우스에 1-5%의 DSS 첨가 음용수

를 제공하여 급성 대장염을 유발시키는 것으로 혈변, 체중감소, 대장길이 감소, 점막조직 염증

및 궤양등의 특징을 보인다.

따라서 본 연구에서는 probiotics 성장 및 장내 유용균에 필요한 생육인자를 다빈도 식품에서 탐색

하고 이를 이용한 천연배지를 개발하고자 한다. 또한 유산균 증식촉진능이 있는 다빈도 식품을 선

정하여 이에 의한 성장인자를 분석하여 규명하고자 한다. 또, 국민들이 자주 섭취하고 있는 식

품 중에서 면역 활성에 우수한 소재를 찾아내고, 이를 건강기능성 식품 소재로서 활용하기 위

하여 원료의 표준생산 공정을 확립하고자 하였으며, 면역 활성 우수 식물 소재와 유산균과의

혼합에 의한 시너지 효과를 대식세포 및 비장세포의 활성화를 평가하여 알아보고자 하였다.

분자기전 연구에서는 면역반응조절능이 있는 유산균을 선발하고 선발된 유산균이 어떠한 면역

학적·분자생물학적 작용기작으로 감염성질환 또는 염증성질환에 대한 효능을 나타내는지 다양

한 실험법을 사용하여 연구하였다. 마지막으로 국내 다양한 식물자원을 바탕으로한 유산균 배

양용 배지를 개발 하고 산업적 유산균 생산이 가능한 최적 배양 조건을 확립 하고 유산균 소

재의 안정성을 높일 수 있는 보호제 및 소재 제조 공정을 확립하여 기능성 유산균의 대량생산,

기능성 식품 생산공정 및 산업화 연구를 수행하였다.

따라서 식생활 변화, 노화로 인해 발생되는 면역질환의 개선, 예방을 위하여 다양한 식물유래

물질의 면역활성 효과와 건강증진 효과가 잘 알려진 유산균주의 면역활성을 혼합하여 새로운

기능성 식품소재로 개발하고, 이것에 대한 대량배양생산 조건 확립과 농축시스템을 확보함으로

서 새로운 기능성 식품의 상품화 연구로 수행하였고, 최종적으로는 이와 같은 본 연구 과정을

통해 유산균 및 식물자원의 혼합 기능성식품을 개발하고, 그 효능을 확인하여 친환경적이며 효

과적인 면역활성 제품을 상품화함으로서, 향후 국민 건강 증진에 이바지함이 매우 중요하다.

- 10 -

제 2 장 국내외 기술개발 현황

1절 국내 연구 현황

1. 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구(1세부과제)

정부는 2010년에 2조원인 기능성식품 시장을 2017년까지 4조원 시장으로 육성시키는 식품산

업진흥계획을 발표하였으며, 또한 2015년까지 국가식품클러스터에 ‘식품기능성평가센터’를 설립

하여 식품기능성평가 지, 기업 신제품 개발 촉진 및 국내 농수산물의 고부가가치화에 기여하고

자 계획 중이다. 농립수산검역검사본부는 가축의 병원성 세균에 억제효과를 보이는 새로운 유

산균 균주(락토바실러스 살리바리우스)를 개발, 특허 등록 하였는데, 국내에서는 가축의 사료첨

가용 항생제를 2011년 7월 1일부터 전면금지하게 됨에 따라, 농장에서 발생 우려가 높은 질병

개선에 큰 도움이 될 것으로 기대된다. 국내 국가 연구기관 및 대학에서의 기능성 식품에 대한

연구동향을 살펴보면, 농업 부가가치 증진을 위한 신소재 개발의 주요 연구개발 과제로서, 생

명공학연구원과 같은 국책연구원을 중심으로 한 연구사업과 바이오그린21사업 등과 같은 국가

연구개발사업을 통해 다양한 연구 분야에서 수행되고 있다. 생명공학연구원 및 소속기관에서는

항비만 효과 검정, 항비만 및 항염증 효과 건강보조식품 개발, 노인성 치매예방, 간기능 개선

감자 육성, 항산화 resveratrol 고함유 감자 개발, 치매예방 기능성 당근 개발, 양파를 이용한

기능성 건강 음료 개발, 난지식물을 이용한 암활성 기능성 보조식품 개발, 토종 자원으로부터

항산화 활성 및 항암성 물질 개발 등 다양한 기능성 식품소재를 활용한 개발 연구를 진행 중

에 있다. 바이오그린 21사업에서는 재래 발효식품을 이용한 성인병 예방 기능성 식품원료로 개

발, 유용 미생물의 부산물을 이용한 성인병 예방 및 면역증강 기능성 식품소재 개발, 노인성

질병 면역증강 소재 개발 등 주요 재배작물을 이용한 기능성 식품소재 개발 등 다양한 식물유

래물질을 건강식품 재료로 활용하는 응용연구과제가 수행되고 있다. 최근 유산균의 면역활성

증진 효과에 관심이 집중되고 있다. 서울의료원 아토피천식센터에서 프로바이오틱스의 피부 건

강에 관한 효능을 밝혔고, 광주과학기술원에서는 항염증 효과를 갖는 유산균에 대한 관절염과

같은 자가면역질환 효과를 확인하였으며, 2종류의 유산균(Lactobacillus casei E5,

Bifidobacterium longum BL730)을 이용해 Salmonella 감염에 대해 장내면역에서 유산균이 중

요함을 보고하였다. 또한 우석대학교 연구팀에서는 김치 유래 유산균 균주가 항비만 효능이 있

는 오르니틴(Ornithine)을 생성한다는 사실과, 중성지방 생성을 억제하고 지방산과 중성지방의

합성에 관여하는 단백질과 효소의 농도를 낮춘다는 것을 발견하였다. 영남대 박용하교수는 김

치 유산균인 ‘락토바실러스 사케이 프로바이오 65’ 미생물을 발견하였고, 이를 이용한 아토피

치료 효과를 인체 임상실험을 통해 알아본 결과, 아토피질환이 대조군에 비해 최대 238% 호전

되는 성과를 거두었음을 발표하였고, 쎌바이오텍(주)은 락토바실루스 계열과 비피더스 계열의

유산균 4종 프로바이오틱스 균주로 아토피성 피부염 예방 및 치료 효과에 대한 특허를 출원하

였다. 유산균을 소재로 한 기능성 연구 및 제품 개발 현황으로는 한동대의 LGG를 포함한 유

산균의 신기능성 탐색 연구와 한국야쿠르트에서 국내 간 건강 및 피로회복 효과를 통한 유산

균 제품 ‘쿠퍼스’를 판매중이다. 또한, 유산균들이 생산한 exopolysaccharides(EPS)는

‘food-grade’ 첨가제로 고안되고, 유제품에 조직과 미각의 특성을 부여한느 등의 용도로 인해

- 11 -

많은 관심을 받고 있고, 콜레스테롤 저하 효과, 면역조절능 그리고 항암효과를 보여

nutraceuticals로써 제조하는 연구가 수행되고 있다. CJ제일제당에서는 면역물질의 과분비를 조

절함으로써 가려운 피부 증상을 개선하는 유산균 제품인 ‘피부 유산균 CJLP133’을 2013년 11

월 상용화 하였고, 임상실험을 거쳐 식약처로부터 피부 가려움 개선에 대해 개별인정형 건강기

능식품으로 인정을 받았다. 프로바이오틱스 연구의 최첨단을 달리는 야쿠르트사는 예방의학,

건강장수라는 생각을 기본으로 하여 프로바이오틱스 제품은 “모두 특보제품”이라고 하는 스탄

스(stuns) 상품을 개발하고 있다. 작년에 “야쿠르트 400”이 호황을 이루었고, 프로바이오틱스

해외보급에 총력을 기울이고 있으며, 구미는 물론 우아시아와 중남미에도 판매를 확대하고 있

으며, “프로바이오틱스 건강법”을 해외에 보급하고 있다. 프로바이오틱스는 장에 유익한 미생

물의 대사와 성장을 선택적으로 활성화하여 인체에 유익하도록 영향을 미치는 식이섬유와 같

은 난소화성 성분으로 정의하고, 특히 난소화성 올리고당은 프로바이오틱스로서 탁월한 기능성

을 보이고 있어서 많은 연구자와 산업체에서 다양한 종류의 기능성 유산균들을 생산하고 있다.

유산균들은 다양한 exopolysaccharides(EPS)를 생산하는데, 특히 dextran, mutan, lavan과 같

은 동질다당류들은 유산균들 중 Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc에 의해 생산되며,

이들 다당류 및 유산균은 식품첨가제로 콜레스테롤 저하효과, 면역조절능, 항암효과를 보여

nutraceuticals로써 이용되고 있다.

2. 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및 원료표준화 연구

(2세부과제)

최근 유산균의 프로바이오틱스 기능 중 유산균의 면역활성 증진 효과에 관심이 집중되고 있

다. 프로바이오틱스의 섭취는 염증성 장질환이나 알레르기 환자의 비정상적인 장내균총을 개선

하며 Th1/Th2의 균형을 정상화함으로 이들 질환의 예방에 기여하고, 암 발생 예방에도 중요한

역할을 담당하는 NK세포 활성화에도 관여하여 일상적인 섭취로 건강의 유지 및 증진에 도움

이 된다.

국내외 특허로는 KIPRIS 특허정보 검색 결과 면역활성 관련해서는 총 53,205건에 관한 정보

가 있지만 본 연구에서 수행하고자 하는 유산균과 혼합관련에서 연계 검색 시 1,732건에 지나

지 않는다. 그 종류로는 장관면역활성증진 효과가 있는 밀가루 발효 조성물을 이용한 빵, 천연

원료 추출물을 포함하는 미백제 및 이를 포함하는 화장료 조성물, 폴리감마글루탐산을 함유하

는 면역증강용 조성물, 유산균을 함유하는 과채음료의 조성물 및 그 제조방법, 혼합 유산균을

포함하는 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 또는 식품 조성물 등

이 있다. PubMed 내 Lactic acid bacteria(LAB)와 면역(Immune) 연계어로 검색 시 총 510건에 대한

정보가 있지만, 1971년부터 1990년대까지 발표된 연구는 11건에 지나지 않지만, 계속적인 증가추세를

보이고 있다. 특히, 2013년 한 해 동안 발표된 자료만 64건으로 전에 5년 주기로 발표된 연구 논

문의 40%를 차지한다. 면역 활성 관련 건강식품의 상품화 현황으로는 몸의 기능을 활성화시키

고 신진대사나 면역력 회복에 도움을 주는 고려인삼, 스트레스에 강하고 면역기능을 높이는 오

갈피 과의 시베리아 인삼의 뿌리, 면역력과 호르몬 분비를 높이는 마늘, 면역력 활성화와 혈당

치를 저하시키는 프로폴리스 등이 있다. 유산균의 면역증강 또는 염증억제 활성은 이전부터 알

려져 있었지만, 유산균의 면역학적. 분자생물학적 작용기전은 최근에 와서야 연구가 진행되기

시작하였다. 최근에는 조력 T 세포의 분화를 조절하는 식물유래 천연물질 및 합성약물에 대한

- 12 -

연구가 진행되고 있으나, 프로바이오틱스에 의한 조력 T세포의 활성화와 분화에 대한 면역학

적.분자생물학적 작용기전 연구는 미흡한 상태이다. 최근 연구들은 면역조절능이 있는 특정 유

산균들이 NF-κB pathway를 증강 또는 억제하여 면역세포의 활성화와 분화를 조절한다고 밝

히고 있는데, 이러한 연구들은 macrophage cell line 또는 PBMC를 주로 사용하였으며 유산균

에 의한 조력T세포의 활성화와 분화를 조절하는 작용기작에 대해서는 잘 알려져 이씨 않아 좀

더 깊이 있는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 면역반응조절능이 있는 유산균을 선발하고 이들

이 어떠한 면역학적・분자생물학적 작용기작으로 감염성질환 또는 염증성질환에 대한 효능을

나타내는지 다양한 실험법을 사용하여 연구할 필요가 있다.

3. 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구(1협동과제)

정부는 ‘10년에 2조원인 기능성식품 시장을 ‘17년까지 4조원 시장으로 육성시키는 식품산업진흥계

획을 발표하였으며, 또한 ’15년까지 국가식품클러스터에 ‘식품기능성평가센터’를 설립할 예정이

다. 이 센터에서는 선진국 수준의 시설ㆍ장비ㆍ인력을 갖추고 식품기능성평가 과정을 원스톱 지

원하여, 기업 신제품 개발 촉진 및 국내 농수산물의 고부가가치화에 기여할 계획이다.

생명공학연구원 및 소속기관에서는 항비만 효과 검정, 항비만 및 항염증 효과 건강보조식품

개발, 노인성 치매예방, 간기능 개선 감자 육성, 항산화 resveratrol 고함유 감자 개발, 치매예

방 기능성 당근 개발, 양파를 이용한 기능성 건강 음료 개발, 난지식물을 이용한 암활성 기능

성 보조식품 개발, 토종 자원으로부터 항산화 활성 및 항암성 물질 개발 등 다양한 기능성 식

품소재를 활용한 개발 연구를 진행 중에 있다.

바이오그린 21사업에서는 동충하초류의 인공배양 및 신약소재 개발, 재래 발효식품을 이용한

성인병 예방 기능성 식품원료로 개발, 유용 미생물의 부산물을 이용한 성인병 예방 및 면역증

강 기능성 식품소재 개발, 약용 식물의 유효성분을 이용한 간 보호, 노인성 질병 면역증강 소

재 개발, 배추, 복숭아 등 주요 재배작물을 이용한 기능성 식품소재 개발, 배추, 복숭아 등 주

요 재배 작물을 이용한 기능성 식품 개발, Isoflavone 고 함유 콩 계통 선발 등 다양한 식물유

래물질을 건강식품 재료로 활용하는 응용연구과제가 수행되고 있다.

국내에서는 각종 시료로부터 유산균, 효모, 세균 등을 분리하여 가축, 가금류와 해양양식어

등의 생육에 미치는 생균제로서의 효능을 검토한 연구가 주종을 이루고 있으며, probiotics 제

품은 주로 유산균 단독 또는 유산균, 효모, 효소, 영양성분 등을 복합으로 첨가하여 제조한 것

을 사용하였다. 한편, 기능성 식품으로서 probiotics는 요구르트와 음료를 중심으로 발효유 제

품 회사들이 중심이 되어 응용 및 개발연구를 추진하고 있다.

4. 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구(2협동과제)

국내에서는 우수 유산균의 선발 및 효능검증에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔으며 최근

에는 국내분리 유산균이 면역반응을 증강 또는 억제하여 감염성 질환 또는 면역매개성 질환을

예방 또는 치료에 사용될 수 있음이 여러 연구를 통해 제시되었다. 김치유산균인

Lactobacillus sakei probio 65는 NC/Nga mice에서 아토피성 피부염을 억제하였으며 2-10살의

어린이 아토피환자를 대상으로 한 연구에서는 3개월의 투여가 아토피를 최대 238%까지 호전

되었다고 발표하였다 (Kim et al., 2013a, Woo et al., 2010). 장 등은 최근 발표된 논문을 통해

Lactobacillus rhamnosus가 비장내 Tregs의 분포를 증가시켜 천식을 예방할 수 있었다고 보고

- 13 -

하였다. 염증성 장질환에 대한 치료효과를 L. casei, L. plantarum HY115와 L. brevis

HY7401 투여한 마우스에서 확인되었다 (Lee et al., 2008, Yoon et al., 2008). 권 등은 복합 유

산균 프로바이오틱스가 regulatory dendritic cells과 regulatory T cells의 생성을 촉진하여 염

증성 장질환, 아토피성 피부염, 류마티스성 관절염등의 면역매개질환을 개선할 수 있음을 보고

하였다 (Kwon et al., 2010). 또한 유산균에 의한 면역증강효과로 감염성질병에 대한 저항성을

갖게 됨을 제시하는 연구들도 발표된 바 있다. 예를 들어 최 등은 오리에서 분리한

Enterococcus faecium JWS 833이 면역세포를 활성화 시켜 L.monocytogenes 감염을 억제함을

보여주었으며 Youn 등은 L. rhamnosus가 influenza 감염제어에 효능이 있음을 마우스실험을

통해 제시하였다 (Choi et al 2012, Youn et al 2012a, Youn et al 2012b). 김 등은

Lactobacillus acidophilus를 2주간 경구 투여한 랫드에서 살모넬라감염을 억제되었다고 발표하

였으며 이 등은 Lactobacillus 혼합액이 대장균요로감염을 예방하였다고 보고하였다 (Kim et

al., 2013b, Lee et al., 2013).

최근에는 유산균이 면역세포내 신호전달체계에 영향을 주어 면역반응을 증강 또는 약화시킨다

는 논문들이 발표되고 있다. 주 등은 Lactobacillus helveticus HY7801이 곰팡이균의 성장을

억제하고 NF-κB의 활성을 차단함으로서 마우스에서 칸디다 질염을 약화시키고

Lactobacillus johnsonii HY7042가 Gardnerella vaginalis를 죽이고 NF-κB를 억제함으로서

Gardnerella vaginalis에 의한 질염을 약화시킴을 증명하였다 (Joo et al., 2011, Joo et al.,

2012) 강 등은 exopolysaccharide를 과생산하는 Lactobacillus paracasei KB28가 마우스의 복

강 대식세포에서 NF-κB와 MAPKs의 활성을 조절함으로서 싸이토카인의 생성을 유도함을 보

여주었다 (Kang et al., 2011). 이 등은 생균제가 Helicobacter pylori 감염에서 SOCS 발현과

신호전달을 활성화시킴으로서 항염증활성을 보인다는 것을 보고하였다 (Lee et al., 2010).

5. 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발(3협동과제)

김치에서 분리된 유산균으로 부터 순수 분리한 신규 항균 펩타이드의 유해 미생물에 대한

항균력을 확인 하고 항균 펩타이드의 대량 생산을 위한 식물성 배지 개발을 통해 현재 국내뿐

아니라 국제적으로 문제가 되고 있는 항생제의 독성 및 내성의 문제를 자연적인 방법으로 대

체할 수 있는 치유방법을 개발이 기대 되고 있다. 또한 가바(GABA: 감마아미노부티르산,

Gamma-Amino butyic acid)는 항스트레스, 항불안, 혈압상승억제, 항경련, 시력증진 등 인체의

많은 생리적인 메카니즘의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있고, 성장호르몬의 분비 조절에도

관여하며 통증완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 주목 받는 물질로

김치 유래 유산균을 이용하여 가바가 풍부한 요구르트 제조법에 관한 연구가 진행 되었다 (Ku

et al. 2013, Bae et al. 2009, Kook and Cho 2013).

최종 생산에서 높은 생균수를 확보, 생산력 및 안정성 확보와 제품의 질적 향상을 위해 고가의

유산균 제품을 생산하기 위해 생균수 제조 발효기술이 발달되어야 한다. 현재 유산균 함유 제

품은 다양하게 출시되고 있으나 박테리오신을 함유하는 제품개발은 미미한 편이며 1950년대

영국에서 처음으로 유통되기 시작하였으며 유럽 에서는 박테리오신을 활용한 식품보존제등은

개발되어 유통되고 있다. 따라서 유산균의 효능을 이용한 기능성식품과 박테리오신을 이용한

의약품, 식품보존제, 기능성식품 등의 연구 및 기술개발은 필요한 실정이다.

- 14 -

2절 국외 연구 현황

1. 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구(1세부과제)

국외 연구 현황으로는 식물유래 다당에 의한 높은 면역증진 활성이 보고되어 있다. 비교적

낮은 독성과 넓은 spectrum의 치료 특성을 갖고 있어 의약품 내지 건강 유지 목적의 기능성식

품의 소재로 응용이 가능할 것으로 생각된다(Tzianabos et al., 2000; Paulsen BS. 2001;

Wasser SP. 2002). 식물 다당의 면역증진활성, 항암활성, 항균활성 및 기타 약리활성은 면역계

중 대식세포와 보체계의 활성화를 경유하여 일어나는 것으로 생각되고 있으며 결과적으로 선

천면역계의 활성화가 다양한 병원체에 대하여 신속하고 강력하게 대응하는 인체의 능력과 밀

접한 관련이 있다고 보고되고 있다(Chihara G. 1992; Wang SY et al. 1997; Beutler B. 2004).

고등식물 기원의 대부분의 다당류는 독성이 거의 없고, 다른 미생물 유래의 면역조절물질(예,

LPS)이나 합성의약품에서 문제가 되는 심각한 부작용을 야기시키지 않으므로 면역활성 작용

치료제 개발에 있어 이상적인 후보군이다. 지금까지 진행된 많은 연구에서 다양한 종류의 식물

에서 분리한 다당들은 대식세포를 공통적으로 활성화시키는 것으로 보고된다(Shin, 2012).

유산균을 기능성 소재로 한 다양한 연구가 진행 중인데 최근 Leuconostoc 균주를 이용한 발효를

통하여 난소화성 올리고당에 대한 연구는 프랑스 및 미국에서 활발하게 연구가 진행이 되어

프로바이오틱스로서 다양한 기능을 가진 것으로 발표되었다. Lactobacillus, Leuconostoc 등에서

장내 유해효소인 β-glucosidase와 β-glucuronidase의 감소로 유산균의 정장작용 효과가 알려져

있으며, 혈압상승 억제효과로 알려진 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)와 항비만 효능이 있는 오

르니틴(ornithine) 생산 유산균도 알려져 있고, 박테리오신 생성균, Pediococcus pentosaceus K23-2의

생균제개발및효능도입증되었다.

현재국내에서는각종시료로부터 유산균, 효모, 세균 등을 분리하여 가축, 가금류와 해양양식어

등의 생육에 미치는 생균제로서의 효능을 검토한 연구가 주종을 이루고 있으며, 프로바이오틱

스 제품은 주로 유산균 단독 또는 유산균, 효모, 효소, 영양성분 등을 복합으로 첨가하여 판매

되고 있으며 한편, 기능성 식품으로서 프로바이오틱스는 요구르트와 음료를 중심으로 발효유제

품 제조회사들 중심으로 응용 및 개발연구가 추진되고 있다. 또한 소비자 관심 증가로 인해 프

로바이오틱스와 프리바이오틱스를 혼합한 synbiotics 개념의 다양한 신제품(발효유제품, 기능성

음료, 기능성식품소재 및 동물용 생균제제 등) 개발을 위한 연구가 증가하고 있다. 새로운 기

능성 프로바이오틱스를 탐색하여 기능이 서로 다른 여러 종류의 미생물을 일정비로 혼합하고

여기에 올리고당, 키토산, 식이섬유 등 기능성 prebiotics를 첨가하여 새로운 형태의 기능성 식.

의약제품으로 개발이 가능하다. 이와 같은 기능성 식․의약품은 사람의 건강 증진뿐만 아니라

생균제로서 가축이나 어류양식의 생산성 증대에도 크게 기여할 것으로 보인다. 유산균 발효 기

술이 발달하면서 지금은 세계적으로 1011 cfu/g 이상의 유산균 원말이 생산되고 있다. 최종 생

산에서 높은 생균수를 확보, 생산력 및 안정성 확보와 제품의 질적 향상을 위해 고가의 유산균

제품을 생산하기 위한 생균수 제조 발효기술이 발달되어야 한다. 유산균 함유 제품은 다양하게

출시되고 있으나 박테리오신을 함유하는 제품개발은 미미한 편이며 1950년대 영국에서 처음으

로 유통되기 시작하였으며 유럽에서는 박테리오신을 활용한 식품보존제 등은 개발되어 유통되

고 있다. 따라서 유산균의 효능을 이용한 기능성식품과 박테리오신을 이용한 의약품, 식품보존

제, 기능성식품 등의 연구 및 기술개발은 필요한 실정이다.

- 15 -

2. 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및 원료표준화 연구

(2세부과제)

일본의 Tohoku 대학에서는 유산균의 장내 정착성과 면역조절작용을 밝혔는데, Lactobacillus

LGG 균주의 lipoteichoic acid는 LPS에 의한 IL-8 분비를 억제하고 쥐의 대식 세포에서 LPS

가 유도하는 TNF-α 분비를 억제하는 결과를 얻었다. 그리고 Lactobacillus casei Shirota는 생

쥐의 장간막 림프절에서 natural killer cell 활성을 증가 시켜서 선천 면역반응을 증진시킴을

밝혔다. 또한 사람에서 B. lactis HN019와 L. rhamnosus HN001은 대식세포를 활성화하고 중

성백혈구를 증가시킨다고 보고되었다. 덴마크의 코펜하겐대학에서는 바이러스에 대항하는 물질

인 인터페론의 생성을 촉진해 감기 등 바이러스성 호흡기 관련 질환에 유산균의 면역력 강화

를 보고하였다(Lactic Acid Bacteria & Intestinal Microbiota., 2011). 유산균이 면역계에서 병

원균이 감지하는 대식세포 활성화를 통한 세균과 바이러스의 신속한 감지, 임파구 분열 촉진으

로 인한 암 세포 증식 방지, 혈액 내의 항체인 IgA의 생산을 증가시키고 감마 인터페론 생성

으로 면역력을 증진하여 질병에 대항한다고 하였다(Hayashi et al. 2009). 또한 신생아나 유아

에 Lactobacillus rhamnosus GG 투여를 통하여 아토피성 습진의 예방과 치료에 효과적임이

밝혀졌고, 유아일 때 투여는 어린이 시기까지 영향을 미친다고 보고되었다. 그리고 임신 중의

생균제의 섭취는 아토피성 질환의 예방에 효과적이었는데, 출생 전후 생균제의 보충은 유아에

서 아토피성 피부염의 발생을 50% 감소 효과와 질병을 앓고 있는 환자에서 임상증세 완화효

과가 밝혀졌다.

면역 조절과 유산균 관련된 국외 논문 발표 현황으로는 Won 등(2011)은 gnotobiotic (Gn)

pig model에서 Lactobacillus acidophilus (LA) NCFM strain의 rotavirus vaccination에 대한

T cell 면역반응의 dose effect을 조사한 결과, Low dose LA는 모든 조직에서 IFN- γ

producing T cell을 promotion 시키고 Treg cell 면역반응과 TGF-ß 및 IL-10 production을 d

own regulation 시켰으며, High dose LA는 모든 조직에서 Treg cell 분포 증가를 확인하였다.

G. Malaguarnera 등(2012)은 발효유제품을 제공했을 때 probiotics strain의 면역저항력 (IgA,

CD4+, CD8+ T cell, NK cell 활성, 염증과 알러지 반응 하향조절)을 조절하는 효과가 있어 노

인의 건강유지에 도움이 됨을 보고하였으며, Kubota 등(2011)은 Lactobacillus GG (LGG)와 L.

gasseri TMC0356 (TMC0356) 박테리아를 포함한 발효유와 플라시보 요거트를 40명의

Japanese cedar pollinosis (JCP; 삼나무 화분증) 환자에게 10주 동안 섭취하게 하였을 때, 발효

유 안의 LGG는 IL-4와 IL-5생산을 유의하게 억제함을 보고하였다. Ohkouchi 등(2012)은 삼나

무 화분 allergen Cry J1 (Cry J1_LAB)을 발현하는 젖산균을 재조합체를 만들어 경구백신으로

삼나무 화분증을 가진 쥐모델을 이용하여 실험했을 때 Cry J1_LAB는 특이 IgE 반응을 하는

allergen을 억제시켰으며 specific IgE 반응인 코의 임상적 증상(재채기) 횟수가 감소하는 것을

확인하였다. Ouwehand 등(2009)은 노화로 인해 bifidobacteria가 감소함으로 lacitol과

L.acidophilus NCFM 혼합물을 섭취하면 intestinal microbiota 등의 marker를 상승시킴을 보고

하였으며, 칼피스 아지노모토 다농사의 프로바이오틱스 요구르트 “다농 BIO BE80균”은 세계12

개국 이상에서 판매되고 있으며 맛은 물론이고 소화관내에서 고농도의 비피더스균이 생존하는

것을 확인하여 “변비에 고민하는 소비자가 먹기 좋은 요구르트”로 인기 상품으로 선정되었다.

칼피스사는 L-92 유산균을 이용한 “인터밸런스 L-92” 계열의 3제품을 출시하였는데 L-92유산

균의 항allergy에 대한 면역기능을 계속 연구하고 있다. 모리나가유업은 probiotics와 prebiotics

- 16 -

를 합한 synbiotics를 기획하여, 대표적 제품은 비피더스균 BB536에 lacturose와 lactoferin을

첨가한 락토페린 요구르트 및 우유음료 ‘락토페린 플러스’를 개발하였으며, 기린맥주 그룹은 알

레르기 개선효과가 있는 유산균으로 가열처리 균체 KW 유산균 (Lactobacillus paracasei KW3110

주)을 이용한 각종 기능성 식품을 개발하였다. 유산균 원료 소재에서 비피더스에 사용되는 비피더스

균 분말(longum) BB536, breve, gasseri, faecium, acidophillus 등 여러 균종을 조합하여 프로바이

오틱스를 첨가하거나 lacturose를 조합한 상품을 개발하여 판매하고 있다. 메이지유업은 위산내성이

높은 비피더스균을 이용한 제품을 기획, 개발, 판매하고 있는데, 균분말 원료로 공급할 경우는 출하

시의 균수를 보증하기 위하여 800억/g이상의 제품을 공급하고 있고, 또한 캡슐, 과립품 등 OEM 공

급품 중에는 양적으로 배합 제한이 있는 제품을 위해서 1,500～2,000억/g의 고농도제품이 있다.

3. 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구(1협동과제)

2005년의 미국 기능성 식품 시장규모는 약 41억 달러로서 2000년에 비해 약 80%이상의 급

성장을 보이고 있다. 미국의 기능성 식품 시장을 이루고 있는 주 품목은 비타민, 미네랄, 유기

농식품, 다이어트 식품, 스포츠 드링크, 각종 영양보충제이다. 이중에서 비타민, 미네랄, 그 외

영양보충제 품목이 전체 시장의 38%인 약 16억 달러의 규모를 보이고 있다.

유럽 각국의 기능성 식품은 특정 질환을 대상으로 하는 제품이 주류를 이루고 있으며, 주로

우유 발효제품이나 시리얼 형태로 판매되고 있다. 2006년도 바이오식품에 대한 지출액은 2003

년 대비 10%가량 상승한 약 35억 유로에 달했지만, 식품 전체 매출액에서 차지하는 비중은 약

3%의 미미한 수준으로, 향후 발전가능성이 매우 높은 상황이다. 독일의 경우, 바이오식품 시장

이 새로운 소비자그룹을 형성하면서 호황을 맞고 있는데, 바이오 식품에 관심을 보이는 젊은

중산층들이 가격이 상대적으로 높음에도 불구하고 그 수요가 크게 늘고 있는 현황이다.

일본은 1969년부터 등장한 건강식품 산업이 급격하게 성장하였는데, 일본의 보건기능식품 시

장을 주도하는 품목은 유산균 음료 같은 유산균 관련제품으로 2003년에 전체 시장의 64%를

차지하고 있다. 나머지는 콜레스테롤 저하 관련 기능성 시장이 11.2%, 혈당 및 체지방 감소 관

련 다류(녹차) 시장이 10.3%의 시장 점유율을 나타내고 있다.

일본에서는 식품 중에 단일 품목으로 100억 엔 이상의 매출을 초과하는 품목도 나타나고 있

으며, 조건부 특정보건용 식품 제도의 시행으로 사실상 규제가 완화되는 효과를 가져오게 되어

기능성 식품시장은 더욱 급성장을 이루는 계기가 될 것으로 판단된다.

Probiotics 연구의 최첨단을 달리는 야쿠르트사는 예방의학, 건강장수라는 생각을 기본으로 하

여 probiotics 제품은 “모두 특보제품”이라고 하는 스탄스(stuns) 상품을 개발하고 있다. 작년에

“야쿠르트400”이 호황을 이루었고 probiotics 해외보급에 총력을 기울이고 있다. 구미(歐美)는

물론 아시아와 중남미에도 판매를 확대하고 있으며, “probiotics 건강법”을 해외에 보급하고 있다.

새로운 기능성 probiotics을 탐색하여 기능이 서로 다른 여러 종류의 미생물을 일정비로 혼

합하고 여기에 올리고당, 키토산, 식이섬유 등 기능성 prebiotics을 첨가하여 새로운 형태의 기

능성 식․의약제품을 개발할 수 있다. 이와 같은 기능성 식․의약품은 사람의 건강 증진뿐만

아니라 생균제로서 가축이나 어류양식의 생산성 증대에 크게 기여할 것이다. 따라서 probiotics

와 prebiotics를 혼합한 synbiotics 개념의 신제품(발효유제품, 기능성음료, 기능성식품소재 및

동물용 생균제제 등)의 종류는 다양해 질 것이 예상되며 그 수요 또한 크게 신장되어 세계적

시장은 막대할 것으로 예측된다.

- 17 -

4. 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구(2협동과제)

유산균에 의한 다양한 면역조절 기능 연구가 폭넓게 이루어져 왔다. 크게 유산균에 의한 장

점막 면역조절, 선천성면역반응 조절, 획득면역반응조절에 대해 다양한 유산균을 사용하여 질

환예방 및 치료효과 뿐만 아니라 면역학적/분자생물학적 작용기전 연구가 활발히 진행 중이다.

유산균은 병원체에 의해 유도된 염증매개성 물질들의 생성을 억제하여 장점막 면역반응을 조

절하고 장점막에서의 점액질 생산을 촉진하거나 병원체와 경쟁을 통해 장점막 환경을 개선하

는 것으로 알려졌다 (Zhang 2005, Perdigon 2002). 유산균은 또한 macrophages를 활성화시켜

병원체 탐식증을 증강시키고, NK cells의 세포독성 활성 증강, 장점막 또는 호흡기 점막에서의

IgA 생성 촉진, 면역세포의 사멸 유도 등을 통해 선천성면역반응을 적절히 조절하는 것으로

확인되었다. 이러한 면역조절활성은 유산균의 항암효과, 감염에 대한 저항성, 과민반응 억제등

과 연관된다고 볼 수 있다 (Ashraf et al., 2014). 또한 유산균이 직접적/간접적으로 Th cells의

활성조절하고 특정 Th cells의 분화를 유도 또는 억제하기도 한다. Inoue 등은

Bifidobacterium breve M-16V 와 prebiotic galacto-and fructo-oligosaccharides의 혼합투여가

Th1세포와 조절T세포의 분화가 증가시켜 알러지 증상을 완화시킨다고 보고하였으며 de

Roock는 장관유래 유산균 균주에 따라사람의 말초혈액단핵구에서 특정 CD4+ T cell의 분화를

유도한다고 보고하였다 (de Roock et al., 2010, Inoue et al., 2009). 또한 Lopez 등은

Bifidobacterium bifidum strains이 Treg과 Th17의 분화를 조절하는데 있어 다양한 능력을 보

유하고 있으며 수지상세포의 활성도 조절할 수 있음을 제시하였고 Ke Wen 등은 gnotobiotic

(Gn) pig model을 이용하여 probiotic strain이라도 dose의 차이에 따라 IFN-γ producing T

cell 또는 Treg cell 면역반응을 촉진 또는 억제할 수 있음을 보고하였다( Lopez et al., 2011,

Lopez et al., 2012a, Lopez et al., 2012b, Wen et al., 2011, Wen et al., 2012a, Wen et al.,

2012b) 이러한 유산균의 면역반응 조절능은 열처리를 통해 사멸시킨 균체를 사용하였을 때 더

욱 효과적으로 나타나는 것으로 보고되었다. (Hirose et al., 2006)

최근 연구들은 면역조절능이 있는 특정 유산균들이 NF-κB pathway를 증강 또는 억제하여

면역세포의 활성화와 분화를 조절한다고 밝혔다. Zakostelska 등에 의한 연구에서는

Lactobacillus casei lysate가 NF-κB 신호전달경로를 억제함으로써 LPS에 의해 유도된 TNF-

α 발현을 차단한다고 보고하였으며 Donato KA 등은 Lactobacillus rhamnosus GG가 NF-κB

의 subunit인 p65를 억제함으로서 IFN-γ, TNF-α, CXCL8과 CCL-11 발현양을 감소시켰음을

보고했다 (Donato et al., 2010, Zakostelska et al., 2011). Petrof EO 등은 유산균 배양액 (cell

free)이 NF-κB pathway와 proteosome 기능을 억제함 검증하여 유산균 대사산물이 직접적으

로 세포내신호전달 체계의 활성화를 조절할 수 있음을 제시하였다 (Petrof et al., 2004). Iyer

C 등은 Lactobacillus reuteri가 NF-κB와 MAPK 신호전달을 조절함으로써 TNF에 의한 세포

사멸을 억제한다고 보고하였다(Iyer et al, 2008). 하지만 이러한 연구들은 macrophage cell line

또는 PBMC를 주로 사용하였으며 유산균에 의한 조력T세포의 활성화와 분화를 조절하는 작

용기작에 대해서는 잘 알려져 있지 않아 좀 더 깊이 있는 연구가 필요하다.

5. 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발(3협동과제)

Probiotics 연구의 최첨단을 달리는 야쿠르트사는 예방의학, 건강장수라는 생각을 기본으로

하여 probiotics 제품은 “모두 특보제품”이라고 하는 스탄스(stuns) 상품을 개발하고 있다. 2012

- 18 -

년 “야쿠르트 400”이 호황을 이루었고 probiotics 해외보급에 총력을 기울이고 있으며 구미(歐

美)는 물론 아시아와 중남미에도 판매를 확대하 면서 “probiotics 건강법”을 해외에 보급하고

있다.

유산균들이 다양한 exopolysaccharides(EPS)을 생산하는데, 특히 dextran, mutan과 levan과

같은 homopolysaccharide들은 유산균들 중 Lactobacillus, Streptococcus와 Leuconostoc에 의해

생산된다. 그 밖에 L. lactis는 다양한 조성의 EPS를 생산한다 (Monoco et al. 2014, Valeria et

al. 1999). 유산균에 의해 생산된 다당류는 ‘food-grade’ 첨가제로 고안되고, 유제품에 조직과

미각의 특성을 부여하는 등의 용도로 인해 많은 관심을 받고 있다. Lactococcus EPS는 콜레스

테롤 저하효과, 면역조절능 그리고 항암효과를 보여 nutraceuticals로써 제조하는 연구가 수행

되었다 (Fan et al. 2005, Badel et al. 2010).

프리바이오틱은 “활성촉진제라고 부르기도 하며 장(colon)에 유익한 미생물의 대사와 성장을

선택적으로 활성화하여 인체에 유익하도록 영향을 미치는 식이섬유와 같은 난소화성 식품 성

분(non-digestible food ingredient)" 으로 정의하고 이러한 난소화성 올리고당은 프리바이오틱

로서 탁월한 기능성을 보이고 있어많은 연구자와 산업체에서 집중적으로 연구를 하여 다양한

종류의 기능성 식이섬유들이 생산되고 있다.

최근 Leuconostoc 균주를 이용한 발효를 통하여 난소화성 올리고당에 대한 연구는 프랑스

및 미국에서 활발하게 연구가 진행이 되어 프로바이오틱스로서 다양한 기능을 가진 것으로 발

표되어오고 있지만 피부 병원성 미생물 증식 억제를 위한 화장품 원료생산에 이용하고 기능성

식품으로 상업화에는 아직 미비한 실정이다 (Marguerite et al. 1999, Kim et al. 2007, Eom et

al. 2007). 국내에서는 각종 시료로부터 유산균, 효모, 세균 등을 분리하여 가축, 가금류와 해양

양식어 등의 생육에 미치는 생균제로서의 효능을 검토한 연구가 주종을 이루고 있으며,

probiotics 제품은 주로 유산균 단독 또는 유산균, 효모, 효소, 영양성분 등을 복합으로 첨가하

여 제조한 것을 사용하였다. 한편, 기능성 식품으로서 probiotics는 요구르트와 음료를 중심으

로 발효유 제품 회사들이 중심이 되어 응용 및 개발연구를 추진하고 있다. 새로운 기능성

probiotics을 탐색하여 기능이 서로 다른 여러 종류의 미생물을 일정비로 혼합하고 여기에 올

리고당, 키토산, 식이섬유 등 기능성 prebiotics을 첨가하여 새로운 형태의 기능성 식․의약제

품을 개발할 수 있다. 이와 같은 기능성 식․의약품은 사람의 건강 증진뿐만 아니라 생균제로

서 가축이나 어류양식의 생산성 증대에 크게 기여할 것이다. 따라서 probiotics와 prebiotics를

혼합한 synbiotics 개념의 신제품(발효유제품, 기능성음료, 기능성식품소재 및 동물용 생균제제

등)의 종류는 다양해 질 것이 예상되며 그 수요 또한 크게 신장되어 세계적 시장은 막대할 것

으로 예측된다. 유산균 발효 기술이 발달하면서 지금은 세계적으로 1011 cfu/g 이상의 유산균

원말이 생산되고 있다.

- 19 -

제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과

1절 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구(1세부과제)

1. 유산균 증식 촉진능을 보유한 식물 소재 스크리닝

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

(1) 식물 소재 선정

실험에 사용된 시료는 2010년 국민건강영양조사자료(Korea Centers for Disease Control and

Prevention, 2011) 내 30빈도 이상 식품 상위 42종이다(Table 1-1). 시료를 동결건조 과정을 거

친 후 분쇄하여 실험에 사용하였다. 시험 시료들은 곡류 8종, 두류 2종은 생시료를 마쇄한 후

사용하였고, 과일류 6종과 감자 및 전분류 2종, 채소류 24종은 동결건조 후 사용하였다. 모든

시료는 실험 시작 전에 고압멸균기를 이용하여 멸균한 후(121℃, 15분) 이용하였다. Table 1-2

에 동결건조 시료 목록과 건조수율을 제시하였다.

Table 1-1. 2010년 국민건강영양조사자료 내 30빈도이상 식품 목록 및 사용부위

순

번식품명(한글) 사용부위

순

번식품명(한글) 사용부위

1 마늘, 구근, 국내산, 생것 전체(탈피) 22 시금치, 하우스, 생것 전체

2 파, 대파, 생것 전체(탈피) 23 들깻잎, 생것 전체

3 쌀, 멥쌀, 논벼, 백미, 국내산, 일반형 전체 24 대두, 검정콩, 흑태, 마른것 전체

4 양파, 국내산, 생것 전체(탈피) 25 피망, 녹색과, 생것 전체(탈 씨)

5 당근, 생것 전체(탈피) 26 조, 차조, 생것 전체

6 고추, 풋고추, 녹광, 녹색, 생것 전체(꼭지제거) 27 부추, 재래종, 생것 전체

7 무, 조선무, 뿌리, 생것 전체(탈피) 28 배, 신고, 국내산, 생것 전체(탈피)

8 보리, 겉보리, 보리쌀(도정곡) 전체 29 감귤류, 밀감, 조생, 생것 전체(탈피)

9 대두, 검정콩, 서리태(녹색자엽콩), 마른것 전체 30 배추, 생것 전체(잎만)

10 오이, 개량종, 생것 전체 31 고구마, 생것 전체(탈피)

11 호박, 애호박, 생것 전체 32 쑥갓, 생것 전체

12 생강, 국내산, 생것 전체(탈피) 33 수박, 적육질, 생것 전체(탈피)

13 쌀, 멥쌀논벼, 백미, 국내산, 특수미, 흑미 전체 34 바나나, 생것 전체(탈피)

14 콩나물, 생것 전체 35 우엉, 생것 전체(탈피)

15 감자, 생것 전체(탈피) 36 고추, 꽈리고추, 생것 전체

16 쌀, 멥쌀, 논벼, 현미, 일반형 전체 37 숙주나물, 생것 전체

17 사과, 부사(후지), 생것 전체 38 수수, 도정곡 전체

18 쌀, 찹쌀, 현미 전체 39 미나리, 생것 전체

19 상추, 뚝섬적출면, 생것 전체 40 고추, 붉은고추, 생것 전체

20 쌀, 찹쌀, 백미 전체 41 고사리, 생것 전체

21 양배추, 생것 전체 42 포도, 캠벌얼리, 생것 전체(탈피,씨)

- 20 -

Table 1-2. 동결건조 시료 목록 및 건조수율(%)

(2) 유산균 시료 준비

본 연구에 사용된 균주는 충북대학교 수의학과에서 분양받아 실험에 사용하였다.

Lactobacillus rhamnosus GG 균주는 상업적으로 잘 알려진 유산균으로 실험의 대조군 균주로,

Lactobacillus plantarum 4-25와 Weissella cibaria JW15는 선행연구에서 면역 활성을 가진 균

주로 선발되어 본 연구에서 실험균주로 사용하였다.

(3) 조추출물 시료 제조

추출용매(물, 에탄올 및 산)로 동결건조시료들로부터 추출물을 제조하여 유산균 증식 촉진

실험을 수행하기 위하여 추출물을 다음과 같은 과정을 거쳐 제조하였다. 열수 추출물 제조 방

법으로는 시료의 20배에 해당하는 3차 증류수를 첨가하여 85℃, 3시간동안 열수추출한 후 여과

순번 품명 전처리전(kg) 전처리후(kg) 건조후(kg) 건조수율(%)

1 감자 19.94 15.02 2.40 16.0

2 고구마 9.5 8.14 2.58 31.7

3 당근 19.16 17.06 1.80 10.6

4 양배추 15.18 12.54 1.38 11.0

5 배추 17.44 11.88 1.02 8.6

6 피망 9.82 8.62 0.44 5.1

7 대파 18.8 16.82 1.58 9.4

8 애호박 12.3 12.26 0.82 6.7

9 오이 15.98 15.52 0.64 4.1

10 미나리 15.78 14.5 1.04 7.2

11 상추 19.36 19.36 1.26 6.5

12 숙주나물 19.78 17.16 0.88 5.1

13 콩나물 16.42 16.42 1.48 9.0

14 풋고추 18.24 16.94 1.42 8.4

15 꽈리고추 14.94 14.00 1.16 8.3

16 홍고추 8.9 8.52 1.32 15.5

17 깻잎 7.88 7.88 1.22 15.5

18 시금치 11.04 11.04 1.38 12.5

19 쑥갓 7.66 7.66 0.50 6.5

20 부추 11.16 11.0 0.92 8.4

21 깐마늘 14.82 14.82 5.36 36.2

22 깐우엉 9.16 9.16 1.60 17.5

23 수박 34.56 29.28 2.52 8.6

24 조선무 약 20kg 18.8(6%) 2.22 11.8

25 깐양파 약 20kg 20kg 1.58 7.9

26 깐생강 약 20kg 20kg 1.62 8.1

- 21 -

지(Advantec, No.6)로 여과 후 회전진공농축기(40℃)를 이용하여 용매를 제거하여 농축한 후

동결 건조하여 얻었다. 에탄올 추출물은 시료의 10배에 해당하는 94% 에탄올을 첨가한 후 2

5℃에서 24시간 동안 2회 교반 추출(170 rpm)을 하여 여과지(Advantec No.6)로 여과 후 회전

진공농축기(40℃)를 이용하여 용매 제거하여 동결건조 후 보관하였다. 산을 이용한 추출방법은

1% 농도(w/v)의 산(6N HCl)을 시료의 50배 첨가하여 autoclave에서 121℃, 5분 동안 반응시킨

후 여과지(Advantec No.2)로 여과 후 회전진공농축기(40℃)를 이용하여 용매 제거하여 동결건

조 후 제조하여 deep freezer에 보관하였다(Jeong et al., 2011).

나. 유산균 배양

시험 균주(Lactobacillus rhamnosus GG, Weissella cibaria JW15 및 Lactobacillus

plantarum 425)들은 4℃에서 냉장 보관하면서 유산균 증식용 배지인 MRS broth(Difco, USA)

로 2주마다 계대하여 사용하였으며, 장기보존을 위해 멸균된 50% glycerol에 배양액을 현탁하

여 실험하기 전까지 -70℃의 deep freezer에 보관하였다.

다. 천연배지 조성 및 배양 조건 확립

(1) 상용균주를 이용한 기본배지 선정 실험

본 실험에 사용한 균주는 실험 사용하기 전 3회 이상 계대 배양하여 활성화 시킨 후 사용하

였으며, 유산균주의 배양배지로 상업용 Lactobacilli MRS broth(Difco, USA)를 사용하였다. 시

험용 배지 선정 실험으로는 MMYG(Mineral medium+yeast extract(MMY)+Glucose)와 펩톤수

(Peptone water)의 2종류 배지에 사과와 흑태 분말 시료를 넣어 유산균 성장에 적합한 배지를

선정하기 위한 실험을 수행하였다(Table 1-3). 시험방법은 증균배양법으로 시료 1 g와 시험균

주(OD660nm=1.0, 1%)를 취하여 9 mL의 펩톤수에 가한 후 37℃에서 48시간 증균 배양(shaking

incubator)하였다. 배양액 0.1 mL를 취하여 적당량 희석하여 MRS agar에 접종하여 37℃

incubator에서 24, 48시간 배양 후 생성된 집락 계수를 확인하였다.

Table 1-3. 본 시험 사용 배지와 상업용 배지의 조성

Media Peptone 배지 Mineral 배지(MM) MRS 배지(상업용)

배지

조성

Peptone 10 g

NaCl 5 g

+ 추가(식물성분)

K2HPO4 3 g

FeSO4.4H2O 0.01 g

MnSO4.7H2O 0.01 g

NaCl 0.01 g

CaCO3 0.05 g

Ethylene diamine tetraacetic

acid(EDTA) 0.1 g

Yeast extract 5 g(MMY)

+ Glucose(MMYG)

+ 추가(식물성분)

Proteose Peptone No.3 10.0 g

Beef Extract 10.0 g

Yeast Extract 5.0 g

Dextrose 20.0 g

Polysorbate(Tween) 80 1.0 g

Ammonium Citrate 2.0 g

Sodium Acetate 5.0 g

Magnesium Sulfate 0.1 g

Manganese Sulfate 0.05 g

Dipotassium Phosphate 2.0 g

pH pH 7.2 pH 6.5 pH 6.5

- 22 -

(2) 배양 조성물 설정 실험

홍삼 전분의 배지 조성물로 적합성과 유산균 생육 촉진 여부를 확인하기 위하여 시료에 홍

삼 전분을 첨가하였을 때와 무 첨가 시 균주 성장에 미치는 영향을 알아보았다. 시험방법은 증

균배양법으로 시료 1 g와 시험균주(OD660nm=1.0, 1%)를 취하여 9 mL의 펩톤수에 가한 후 37℃

에서 48시간 증균 배양(shaking incubator)하였다. 배양액 0.1 mL를 취하여 적당량 희석하여

MRS agar에 접종하여 37℃ incubator에서 0, 24, 48시간 배양 후 생성된 집락 계수를 확인하

였다.

라. 다빈도식품 중 유산균 증식 촉진 소재 발굴

(1) 동결건조 시료 중 유산균 증식 촉진 소재 탐색

동결건조분말시료는 채소류 24종(마늘, 파, 양파, 당근, 풋고추, 무, 오이, 생강, 콩나물, 상추,

양배추, 시금치, 깻잎, 피망, 부추, 배추, 쑥갓, 우엉, 꽈리고추, 숙주나물, 미나리, 홍고추, 고사

리), 과일류 6종(사과, 배, 밀감, 수박, 바나나, 포도), 전분류군 2종(감자, 고구마), 곡류 8종(멥

쌀백미, 겉보리, 흑미, 멥쌀현미, 찹쌀현미, 찹쌀백미, 차조, 수수), 두류 2종(서리태, 흑태)으로

총 42종 시료와 상용균주(Lactobacillus rhamnosus GG) 1종과 면역활성균(Weissella cibaria

JW15, Lactobacillus plantarum 425) 2종을 증균배양법을 이용하여 유산균 증식을 측정하였다.

동결건조시료를 배지와 1:9 비율로 넣은 다음 시험균주(OD660nm=0.5, 1% v/v)를 접종하였다. 사

용한 최소배지는 펩톤수(Peptone water, 1L, pH 7.2) 배지로 펩톤 10 g에 Sodium Chloride 5

g을 넣어 제조하였다. 배양액 0.1 mL를 취하여 적당량 희석하여 MRS agar에 접종하여 37℃

에서 0, 24, 48시간 배양 후 생성된 집락 계수를 확인하였다.

(2) 조추출물 중 유산균 증식 촉진 소재 선발

앞선 실험을 통해 발굴된 8종 내외의 식품과 상용균주(Lactobacillus rhamnosus GG) 1종과

면역활성균(Weissella cibaria JW15, Lactobacillus plantarum 425) 2종을 이용하였다. 추출용매

별(물, 에탄올, 산)로 제조한 추출물들은 적당한 용매에 희석하여 실험에 사용하였다. 각각의

물, 에탄올, 그리고 산 가수분해 추출물은 펩톤배지에 5% 첨가하여 배지를 제조하였고 시험균

액(멸균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 OD660 nm=0.5에 맞춘 균액)을 총 volume의 1%

를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 spectrophotometer로 흡광도 파장 660 nm에서 0, 6,

12, 24, 48 시간별로 증식 정도를 측정하였다.

□ 연구 결과

가. 천연배지 조성 및 배양 조건 확립

(1) 상용균주를 이용한 기본배지 선정 실험(I)

Fig. 1-1에서처럼 흑미를 첨가한 MRS에서 Leuconostoc mesenteroides와 Lactobacillus

plantarum은 18시간 배양이후 현미에 비해 완만한 생육 감소를 보였다. 3가지 배지 중 합성배

지인 MRS의 경우에만 상용균주 2종 모두 배양되었고, MMY 배지에서도 흑미와 현미 2종을

첨가한 경우 모두 성장률이 높았지만, 비교 대상인 P 배지에서는 생육이 미비하여 본 실험에

사용하기 적합하지 않았다.

- 23 -

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 18 24 36 48

M-3-1-0

M-3-0-1

M-4-1-0

M-4-0-1

S-3-1-0

S-3-0-1

S-4-1-0

S-4-0-1

P-3-1-0

P-3-0-1

P-4-1-0

P-4-0-1

M-0-1-0

M-0-0-1

S-0-1-0

S-0-0-1

배지 시료명 상용균주 배양시간

MMS(M) 3. 흑미 1-0 = Lb. plantarum 접종 0 hr

MRS(S) 4. 현미 0-1 = Leu. mesenteroides 18 hr

Saline(P) 0-0 = 미접종 24 hr

36 hr

Fig. 1-1. Growth curve of LAB in different media containing 4 kinds of plant powder by

using spectrophotometer.

(2) 상용균주를 이용한 기본배지 선정 실험(II)

Fig. 1-2에 제시한 결과에서처럼 찰수수와 서리태를 첨가하여 각각의 배지에서 유산균 배양

정도를 비교한 결과 MRS 배지에서는 시료 무처리군에서 Lactobacillus와 Leuconostoc균 2종

모두 높은 생존율을 보였고, 실험군인 서리태를 첨가한 배지에서 Lactobacillus가 더 잘 자랐

다. MMY 미네랄 배지에서는 Leuconostoc의 경우 서리태에서 훨씬 높은 성장률을 보였고,

Lactobacillus의 경우 서리태에 의해 약간 증가하는 경향을 보였다.

(A) (B)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

17h 38h 60h

R-0-Lb

R-0-Leu

R-서-0

R-서-Lb

R-서-Leu

R-찰-0

R-찰-Lb

R-찰-Leu

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

17h 38h 60h

M-0-Lb

M-0-Leu

M-서-0

M-서-Lb

M-서-Leu

M-찰-0

M-찰-Lb

M-찰-Leu

- 24 -

배지 시료명 상용균주 배양시간

MMS(M) 1. 찰수수 1-0 = Lb. plantarum 접종 17 hr

MRS(S) 2. 서리태 0-1 = Leu. mesenteroides 38 hr

60 hr

Fig. 1-2. The growth curve of LAB in different media(A, MRS/B, MMY) added Seoritae

or millet powder by direct cell counting.

(3) 미네랄 배지와 펩톤 배지간의 증식율 비교 결과

Lactobacillus rhamnosus GG균과 Weissella cibaria JW 15균 간에는 증식에 있어 그다지 큰

차이를 보이지 않았지만, Lactobacillus plantarum 76균을 접종한 배 시료 MMYG 배지에서는

접종균들이 잘 자라지 않았다(Table 1-4). 모든 시료에 공통으로 적용가능하고 조성이 간단한

장점을 고려하여 MMYG보다 펩톤수가 더 적합한 배지라 판단하여 유산균 배양용 기본배지로

선정하였다.

Table 1-4. Comparison of the growth rate of LAB between MMYG and peptone media

(4) 홍삼 전분 첨가에 따른 증식율 비교 결과

차조, 찰수수, 흑태, 서리태, 및 사과 등 5종 시료와 0.5% 홍삼 전분을 펩톤배지에 첨가했을

때와 무 첨가 시 유산균주 성장에 미치는 영향을 비교한 결과는 Table 1-5에 나타내었다. 홍

삼 전분 첨가에 따른 증식율 상승 효과는 나타나지 않아 홍삼 전분을 배지 조성물로 선택하지

않았다.

Table 1-5. Comparison of the growth rate of Weissella cibaria JW 15

by adding red ginseng starch in peptone broth

No. Food name hr

Bacterial count(log CFU/mL)

L. rhamnosus LGG Isolate JW 15 Isolate LB 76

접종균 총균수 접종균 총균수 접종균 Total

1

Pear(MMYG)24 6.68 6.76 9.78 10.25 0.00 4.33

48 8.60 10.06 9.70 10.17 0.00 3.89

Pear(Peptone)24 5.15 6.37 9.85 10.24 3.56 4.19

48 8.78 9.68 9.51 9.88 2.30 3.98

2

Heuktae(MMYG)24 9.92 10.32 10.10 10.24 5.34 8.49

48 9.51 10.16 9.66 10.01 6.90 8.75

Heuktae(Peptone)24 9.26 10.28 10.08 10.26 5.00 6.55

48 9.66 10.21 9.15 9.94 6.78 8.05

No. Group Food name hr log CFU/mL

1

곡류

차조

0 4.20

24 7.68

48 6.00

2 차조+홍삼전분0 4.20

24 7.34

- 25 -

나. 동결건조 시료 중 유산균 증식 소재 탐색

(1) 생시료에 의한 유산균 증식 촉진능 비교 결과

곡류 8종, 두류 2종, 과일류 5종 생시료 15종에 시험균주(OD660nm=1.0, 1%)를 접종하여 증균

배양법으로 유산균 증식을 확인한 결과는 Table 1-6과 같다.

두 균주에 대한 증식 촉진 소재는 달랐지만 두류 중 흑태, 서리태와 곡류 중 겉보리쌀에서 2

종의 유산균주 모두 생육 촉진 효과를 보였다. 그러나 시료 수분함량이 다른 문제점을 고려하

여 동결건조 분말을 제조하여 동일한 조건에서 효과를 평가하였다.

Table 1-6. Comparison of the growth rate of LAB by adding plant raw meterials in

peptone broth(Bacterial inoculum : OD660nm=1.0, 1%)

48 6.60

3 찰수수

0 4.20

24 8.60

48 6.77

4 찰수수+홍삼전분

0 4.20

24 8.26

48 5.86

5

두류

흑태

0 4.00

24 9.00

48 7.78

6 흑태+홍삼전분

0 4.00

24 9.20

48 7.73

7 서리태

0 4.00

24 8.60

48 8.03

8 서리태+홍삼전분

0 4.00

24 9.00

48 7.70

9

과일류

사과

0 4.15

24 7.38

48 5.56

10 사과+홍삼전분

0 4.15

24 7.45

48 5.20

No. Food name hr

Strains

LGG Isolate JW 15

log CFU/mLpH

log CFU/mLpH

1st 2nd Mean 1st 2nd Mean

1 멥쌀백미

0 5.78 6.00 5.89±0.16 2.51 6.08 4.30±2.52

24 6.14 6.33 6.24±0.13 8.04 8.20 8.12±0.11

48 6.45 6.23 6.34±0.16 6.34 9.15 7.60 8.38±1.10 8.38

2 멥쌀현미0 5.78 6.00 5.89±0.16 3.04 6.08 4.56±2.15

24 7.08 6.60 6.84±0.34 8.97 6.15 7.56±1.99

- 26 -

No. Food name hr

Strains

LGG Isolate JW 15

log CFU/mLpH

log CFU/mLpH

1st 2nd Mean 1st 2nd Mean

48 6.18 6.78 6.48±0.42 6.48 4.01 8.08 6.05±2.88 6.05

3 찹쌀백미

0 6.08 6.00 6.04±0.06 2.64 6.08 4.36±2.43

24 5.97 6.60 6.29±0.45 7.86 8.00 7.93±0.10

48 5.90 6.60 6.25±0.49 6.25 7.08 7.07 7.08±0.01 7.08

4 찹쌀현미

0 6.08 6.00 6.04±0.06 2.64 6.08 4.36±2.43

24 7.15 7.00 7.08±0.11 8.28 6.83 7.56±1.03

48 7.00 6.90 6.95±0.07 6.95 5.62 5.90 5.76±0.20 5.76

5 겉보리쌀

0 5.23 6.15 5.69±0.65 2.92 6.08 4.50±2.23

24 8.04 8.15 8.10±0.08 8.34 8.34 8.34±0.00

48 7.41 7.19 7.30±0.16 7.30 7.08 6.68 6.88±0.28 6.88

6 흑미

0 6.08 6.20 6.14±0.08 2.51 6.08 4.30±2.52

24 6.26 6.90 6.58±0.45 8.25 8.53 8.39±0.20

48 6.78 5.94 6.36±0.59 6.36 7.53 6.96 7.25±0.40 7.25

7 찰수수

0 5.23 6.15 5.69±0.65 4.20 6.08 5.14±1.33

24 8.03 7.01 7.52±0.72 8.60 8.26 8.43±0.24

48 6.30 7.59 6.95±0.91 6.95 6.77 6.82 6.80±0.04 6.80

8 차조

0 5.78 6.20 5.99±0.30 4.20 6.08 5.14±1.33

24 6.56 7.26 6.91±0.49 7.68 6.66 7.17±0.72

48 7.30 6.78 7.04±0.37 7.04 6.00 5.60 5.80±0.28 5.80

9 흑태

0 3.90 6.30 5.10±1.70 4.00 6.62 5.31±1.85

24 8.59 8.81 8.70±0.16 9.00 8.95 8.98±0.04

48 8.32 8.70 8.51±0.27 8.51 7.78 8.51 8.15±0.52 8.15

10 서리태

0 3.90 6.30 5.10±1.70 4.00 6.56 5.28±1.81

24 8.57 8.85 8.71±0.20 8.60 8.78 8.69±0.13

48 8.36 8.48 8.42±0.08 8.42 8.03 6.00 7.02±1.44 7.02

11 밀감

0 6.00 5.78 5.89±0.16 2.70 6.15 4.43±2.44

24 6.63 6.30 6.47±0.23 6.30 6.56 6.43±0.18

48 5.19 6.78 5.99±1.12 5.99 5.66 6.08 5.87±0.30 5.87

12 사과

0 4.66 6.20 5.43±1.09 4.15 6.15 5.15±1.41

24 7.34 8.26 7.80±0.65 7.38 6.45 6.92±0.66

48 7.85 7.60 7.73±0.18 7.73 5.56 4.00 4.78±1.10 4.78

- 27 -

(2) 동결건조시료에 의한 유산균 증식 촉진능 비교 결과

동결건조분말시료의 유산균 촉진능을 비교해본 결과는 Table 1-7에 제시하였다. 유산균 3종

에 대한 각각의 상위 10순위를 선정 후 중복성을 검토하여 8종 우수 후보 소재를 선발하였다.

3균주 모두에 증식 촉진능을 보인 소재로는 서리태, 흑태, 우엉과 상추 4종이며, 2균주에 대한

증식 촉진 소재는 바나나, 배추, 미나리와 깻잎 4종이었다. 따라서 본 실험에 사용된 42종 식물

소재 중 동결건조시료를 첨가하여 유산균 증식 촉진능을 보인 것은 채소류 5종, 두류 2종, 과

일류 1종으로 총 8종이 후보소재로 선발되었다.

Table 1-7. Result of viable cell count of the lactic acid bacteria in peptone water media

added with 42 kinds of food ingredients.

No. Food name hr

Strains

LGG Isolate JW 15

log CFU/mLpH

log CFU/mLpH

1st 2nd Mean 1st 2nd Mean

13 포도

0 6.00 5.78 5.89±0.16 2.70 6.15 4.43±2.44

24 5.75 6.30 6.03±0.39 4.60 5.06 4.83±0.33

48 6.12 6.60 6.36±0.34 6.36 5.62 4.00 4.81±1.15 4.81

14 배

0 4.66 6.20 5.43±1.09 3.22 6.15 4.69±2.07

24 6.09 8.00 7.05±1.35 7.86 7.34 7.60±0.37

48 8.29 8.15 8.22±0.10 8.22 7.34 6.45 6.90±0.63 6.90

15 바나나

0 6.00 6.20 6.10±0.14 2.70 6.15 4.43±2.44

24 7.79 9.30 8.55±1.07 7.15 7.06 7.11±0.06

48 8.22 8.08 8.15±0.10 8.15 5.60 5.90 5.75±0.21 5.75

Foodgroup

Food andDescription

Viable cell count (log CFU/㎖)

Lactobacillus rhamnosus

GG

Lactobacillus plantarum4-25

Weissella cibariaJW15

0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h

Cereals

Blackrice 6.1±0.1 6.6±0.5 6.4±0.6 6.8±0.1 8.7±0.1 8.2±0.1 6.1±0.0 8.4±0.2 7.3±0.4

Brown glutinous rice 6.0±0.1 7.1±0.1 7.0±0.1 7.6±0.0 9.0±0.2* 8.4±0.2* 5.6±0.7 8.1±0.2* 6.1±0.2

Brown rice 5.9±0.2 6.8±0.3 6.5±0.4 6.6±0.0 8.4±0.1 8.2±0.3 5.6±0.7 8.4±0.8 4.4±0.5*

Glutinous millet 6.0±0.3 6.9±0.5 7.0±0.4 6.7±0.0 8.7±0.1 8.5±0.0 6.1±0.0 7.2±0.7 5.8±0.3*

Hulledbarley 5.7±0.7 8.1±0.1 7.3±0.2 6.7±0.1 8.6±0.1 8.6±0.1* 6.1±0.0 8.3±0.0 6.9±0.3

Sorghum 6.4±0.3 8.2±0.2 7.4±0.3 7.3±0.0 8.6±0.1 8.3±0.0 6.1±0.0 8.4±0.2 6.8±0.0

Well polishedglutinous rice

6.0±0.1 6.3±0.4 6.3±0.5 6.8±0.1 8.9±0.0 6.9±0.1 6.1±0.0 7.9±0.1 7.1±0.0

Well polished rice 5.9±0.2 6.2±0.1 6.3±0.2 7.5±0.0 9.1±0.0* 8.0±0.1* 5.6±0.7 8.3±0.1** 7.6±0.0

- 28 -

Foodgroup

Food andDescription

Viable cell count (log CFU/㎖)

Lactobacillus rhamnosus

GG

Lactobacillus plantarum4-25

Weissella cibariaJW15

0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h

Fruits

Apple 5.4±1.1 7.8±0.7 7.7±0.2 7.6±0.0 8.9±0.1 8.7±0.0 6.2±0.0 6.9±0.7 4.8±1.1

Banana1),2) 6.5±0.3 8.5±0.2 8.3±0.1 7.5±0.0 9.3±0.0 9.2±0.0* 6.2±0.0 7.1±0.1* 5.8±0.2

Grape 5.9±0.2 6.0±0.4 6.4±0.3 6.7±0.0 8.7±0.0 8.1±0.3 5.6±0.8 4.7±0.5 4.0±0.0

Mandarin orange 5.9±0.2 6.5±0.2 6.0±1.1 6.8±0.1 8.7±0.0* 8.4±0.1 6.2±0.0 6.4±0.2 5.9±0.3

Pear 5.4±1.1 7.1±1.4 8.2±0.1 7.6±0.0 9.3±0.0 8.6±0.1* 6.2±0.0 7.6±0.4 6.9±0.6

Watermelon 6.1±0.0 8.0±0.3 7.2±0.1 7.5±0.0 9.2±0.1 8.7±0.0 5.7±1.0 7.5±0.4 5.4±0.3

Potatoesandstarches

Potato 6.8±0.0 7.7±0.1 7.7±0.1 6.8±0.0 8.9±0.3 8.7±0.1** 6.8±0.4 8.2±0.0 6.8±0.7

Sweet potato 6.1±0.0 8.1±0.3 7.6±0.0 7.5±0.0 9.3±0.0 8.8±0.2 6.8±0.4 8.6±0.4 6.8±0.2

Pulses

Blacksoybean,

Heuktae1),2),3)5.1±1.7 8.7±0.2 8.5±0.3 6.6±0.0 9.5±0.0 9.0±0.1 6.6±0.0 9.0±0.0 8.2±0.5

Blacksoybean,

Seoritae1),2),3)5.1±1.7 8.7±0.2 8.4±0.1 7.6±0.0 9.3±0.0 9.0±0.0 5.8±1.0 8.7±0.1 8.0±0.0

Vegetab

les

Bracken 6.2±0.0 8.0±0.1 7.6±0.1 7.5±0.0 9.3±0.0* 8.4±0.0** 6.8±0.4 8.2±0.3 7.3±1.1

Burdock1),2),3) 6.1±0.0 8.3±0.1 9.0±0.0 7.5±0.0 9.6±0.1** 8.9±0.0 6.7±0.2 8.6±0.1 7.4±0.5

Cabbage 6.4±0.0 8.3±0.1 7.5±0.0 6.7±0.1 9.0±0.0 8.6±0.2 6.8±0.4 7.4±0.3 5.4±0.5

Carrot 6.2±0.0 8.3±0.2 8.5±0.0 7.6±0.0 9.2±0.1* 8.7±0.1 6.7±0.2 7.5±0.2 6.7±0.2*

Chinese cabbage1),2) 6.2±0.0 8.4±0.2 7.5±0.0 7.5±0.0 9.4±0.1 7.5±0.3 6.8±0.4 7.5±0.8 6.2±0.3

Chinese chive 6.3±0.2 8.0±0.1 7.6±0.0 7.6±0.0 9.2±0.0* 8.6±0.0** 6.8±0.1 8.0±0.6 7.5±0.3

Crown daisy 6.4±0.0 8.1±0.1 7.3±0.1 6.7±0.0 8.9±0.0 8.6±0.0* 6.8±0.4 8.2±0.3 7.7±0.0

Cucumber 6.2±0.0 8.2±0.2 7.7±0.0 7.5±0.1 9.4±0.0 8.1±0.5 6.8±0.4 7.2±0.1 5.9±0.2*

Garlic 6.5±0.0 7.5±0.1 7.1±0.1 7.4±0.0 9.0±0.0 8.6±0.0* 6.9±0.3 8.2±0.5 7.6±0.3

Ginger 6.1±0.0 4.4±0.1 4.1±0.1 7.6±0.0 9.2±0.0** 7.4±0.0* 6.7±0.2 5.1±0.6 0.0±0.0**

Green hot pepper 6.0±0.0 8.0±0.0 7.3±0.1 7.6±0.0 9.2±0.0** 8.6±0.1** 6.7±0.2 7.5±0.1 6.1±0.7

Green sweet pepper 6.0±0.0 7.8±0.0 7.4±0.2 7.3±0.0 8.7±0.1* 8.5±0.1 6.9±0.3 7.4±0.1 6.0±0.6

Green young hot pepper 6.6±0.0 7.8±0.1 7.6±0.0 7.5±0.0 9.4±0.1* 9.0±0.0** 6.7±0.2 7.8±0.3 7.0±0.9

Lettuce1),2),3) 6.5±0.0 8.4±0.0 8.6±0.1 7.5±0.0 9.2±0.0* 9.1±0.0 6.7±0.2 8.5±0.4 7.7±0.4

Mungbean sprouts 6.8±0.0 7.6±0.0 7.4±0.1 7.5±0.0 8.9±0.2 8.4±0.1 6.8±0.1 8.2±0.1 7.5±0.5

Onion 5.6±0.0 7.8±0.2 8.0±0.5 7.5±0.0 9.2±0.0 8.6±0.2 6.7±0.2 7.5±0.2* 5.7±0.5**

Perilla leaves2),3) 6.5±0.0 8.0±0.1 7.5±0.1 7.0±0.1 9.0±0.0* 8.9±0.1** 6.8±0.4 8.1±0.3 7.5±0.4

Radish 6.6±0.0 7.9±0.0 7.6±0.0 6.7±0.1 8.7±0.2 8.6±0.0* 6.9±0.3 6.6±0.3 4.2±0.3*

Red hot pepper 6.5±0.0 8.1±0.5 7.6±0.0 6.7±0.0 9.0±0.0 8.8±0.0** 6.7±0.2 7.4±0.1 6.7±0.3

Soybean sprouts 6.1±0.0 8.0±0.3 7.5±0.1 7.6±0.0 9.2±0.0 8.9±0.0* 6.8±0.1 8.2±0.0 7.2±0.7

Spinach 6.2±0.1 7.3±0.0 7.4±0.0 6.9±0.1 8.7±0.1* 8.5±0.0* 6.9±0.4 8.5±0.5 6.9±0.3

- 29 -

1) The first selected food ingredient from LGG2) The first selected food ingredient from Lb. plantarum 4-253) The first selected food ingredient from JW15§ Significant according to Student’s t-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

다. 조추출물 중 유산균 증식 촉진 소재 선발

(1) 열수추출물에 의한 유산균 증식능 비교 결과

열수추출물을 펩톤배지에 넣어 유산균 증식을 살펴본 결과는 Table 1-8에 제시하였다. 서리

태 열수추출물이 첨가된 배지의 경우 3균주 모두 증식을 촉진시켰다. 특히 합성배지인 MRS와

비교 시 서리태 추출물 첨가배지에서는 배양 6시간 만에 OD값이 1.0 이상 높아져 상대적으로

빠른 증식을 유도한다는 것을 알 수 있었다.

Table 1-8. The growth rate of LAB in water extract of 8 selected samples

Foodgroup

Food andDescription

Viable cell count (log CFU/㎖)

Lactobacillus rhamnosus

GG

Lactobacillus plantarum4-25

Weissella cibariaJW15

0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h

Water dropwort2),3) 6.2±0.0 8.3±0.1 7.7±0.1 7.6±0.0 9.3±0.1* 8.7±0.0 6.7±0.2 8.3±0.3 7.5±0.7

Welsh onion 5.9±0.0 8.2±0.1 8.0±0.6 6.5±0.2 8.5±0.0 8.6±0.0 6.7±0.2 7.8±0.1* 6.0±0.6

Young pumpkin 6.3±0.0 8.3±0.4 8.6±0.1 7.4±0.0 8.7±0.0 8.6±0.0 6.9±0.3 7.3±0.4* 5.4±0.2*

Different ingredientsof water extracts Time(hr)

Growth rate(Absorbance 660nm)

Lb. rhamnosus GG Lb. plantarum 4-25 W. cibaria JW15

MRS broth

(Control)

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0

12 0.7±0.0 0.8±0.0 0.8±0.0

24 1.3±0.0 1.4±0.0 1.4±0.0

48 1.3±0.0 1.3±0.0 1.3±0.0

Peptone water

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Heoktae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 1.0±0.0 1.0±0.0 0.5±0.0

12 1.0±0.0 1.0±0.0 0.7±0.0

24 1.0±0.0 1.1±0.0 0.6±0.0

48 1.0±0.0 1.1±0.0 0.6±0.0

Seoritae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 1.0±0.0 1.0±0.0 1.1±0.0

12 1.1±0.0 1.1±0.0 1.2±0.0

24 1.2±0.0 1.4±0.0 1.2±0.0

48 1.1±0.0 1.4±0.0 1.2±0.0

- 30 -

(2) 에탄올추출물에 의한 유산균 증식능 비교 결과

94% 에탄올추출물을 펩톤배지에 넣어 유산균 성장을 본 결과는 Table 1-9에 제시하였다.

Lb. rhamnosus GG 균주에서는 상추, 미나리, 깻잎 순으로 Lb. plantarum 4-25와 Weissella

cibaria JW15 두 균주에서는 깻잎 배지에서 MRS 배지에서만큼의 높은 증식율을 보였다. 따라

서 3균주 모두 높은 증식 효과를 보인 깻잎 에탄올추출물을 후보소재로 선발하였다.

Burdock

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.1±0.1 0.1±0.0

12 0.2±0.0 0.5±0.0 0.4±0.0

24 0.6±0.0 0.7±0.0 0.6±0.0

48 0.7±0.0 0.9±0.0 0.6±0.0

Lettuce

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.3±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0

12 0.4±0.0 0.5±0.0 0.5±0.0

24 0.6±0.0 0.9±0.0 1.0±0.0

48 0.7±0.0 0.9±0.0 0.9±0.0

Water dropwort

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0

12 0.1±0.0 0.5±0.0 0.3±0.0

24 0.5±0.0 1.0±0.0 0.9±0.0

48 0.7±0.0 1.1±0.0 1.1±0.0

Perilla leaves

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.1±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0

24 0.8±0.0 1.0±0.0 0.9±0.0

48 1.0±0.0 1.1±0.0 1.0±0.0

Chinese cabbage

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.1±0.0 0.0±0.0

12 0.1±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0

24 0.6±0.0 0.8±0.0 0.8±0.0

48 0.8±0.0 0.9±0.0 0.9±0.0

Banana

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0

12 0.1±0.0 0.5±0.0 0.3±0.0

24 0.3±0.0 0.7±0.0 0.6±0.0

48 0.6±0.0 0.8±0.0 0.7±0.0

- 31 -

Table 1-9. The growth rate of LAB in ethanol extract of 8 selected samples

Different ingredients

of 94% EtOH

extracts

Time(hr)

Growth rate(Absorbance 660nm)

Lb. rhamnosus GG Lb. plantarum 4-25 W. cibaria JW15

MRS broth

(Control)

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.6±0.0 0.7±0.0 0.5±0.0

12 1.2±0.0 1.1±0.0 1.0±0.0

24 1.2±0.0 1.3±0.0 1.2±0.0

48 1.2±0.0 1.2±0.0 0.9±0.0

Peptone water

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0

Heoktae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.2±0.0 0.3±0.0 0.1±0.0

12 0.2±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0

24 0.3±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0

48 0.2±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0

Seoritae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.3±0.0 0.3±0.0 0.1±0.0

12 0.6±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0

24 0.4±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.2±0.0

Burdock

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0

12 0.2±0.0 0.3±0.0 0.3±0.0

24 0.2±0.0 0.4±0.0 0.3±0.0

48 0.2±0.0 0.4±0.0 0.3±0.0

Lettuce

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.3±0.0 0.4±0.0 0.3±0.0

12 0.6±0.0 0.8±0.0 0.6±0.0

24 1.1±0.0 0.9±0.0 0.8±0.0

48 1.3±0.0 1.0±0.0 0.8±0.0

Water dropwort

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.3±0.0 0.4±0.0 0.2±0.0

12 0.6±0.0 0.6±0.0 0.7±0.0

24 1.1±0.0 0.8±0.0 0.8±0.0

48 1.0±0.0 0.9±0.0 1.0±0.0

Perilla leaves0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.4±0.0 0.1±0.0

- 32 -

(3) 산 가수분해 추출물에 의한 유산균 증식능 비교 결과

Table 1-10에 나타낸 바와 같이 산 가수분해 추출물을 넣은 펩톤 배지에서는 3균주 모두 증

식을 보이지 않았다. 이와 같은 결과가 초래한 것은 추출용매인 HCl이 잔류되어 유산균 증식

을 억제한 것으로 사료된다.

Table 1-10. The growth rate of LAB in acid hydrolyzed extract of 8 selected samples

Different ingredients

of 94% EtOH

extracts

Time(hr)

Growth rate(Absorbance 660nm)

Lb. rhamnosus GG Lb. plantarum 4-25 W. cibaria JW15

12 0.5±0.0 0.9±0.0 0.8±0.0

24 1.1±0.0 1.1±0.0 1.3±0.0

48 1.2±0.0 1.1±0.0 1.3±0.0

Chinese cabbage

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.1±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.1±0.0 0.1±0.0 0.2±0.0

24 0.2±0.0 0.1±0.0 0.0±0.0

48 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0

Banana

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.1±0.0 0.0±0.0

12 0.1±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0

24 0.2±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0

48 0.2±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0

Different ingredientsof HCl extracts Time(h)

Growth rate(Absorbance 660nm)

Lb. rhamnosus GG Lb. plantarum 4-25 W. cibaria JW15

MRS broth

(Control)

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.4±0.0 0.4±0.0 0.5±0.0

12 1.2±0.0 1.1±0.0 1.1±0.0

24 1.4±0.0 1.3±0.0 1.3±0.0

48 1.3±0.0 1.2±0.0 1.2±0.0

Peptone water

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Heoktae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

- 33 -

Different ingredientsof HCl extracts Time(h)

Growth rate(Absorbance 660nm)

Lb. rhamnosus GG Lb. plantarum 4-25 W. cibaria JW15

Seoritae

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Burdock

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Lettuce

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Water dropwort

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Perilla leaves

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Chinese cabbage

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

Banana

0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

6 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

12 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

24 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

48 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0

- 34 -

(4) 유산균 증식촉진능 보유 소재의 배양환경에 따른 증식율 비교

(가) 혐기와 호기 배양에 따른 비교 결과

Fig. 1-3에 3균주와 4종 식물 소재와의 혐기 또는 호기 배양에 따른 증식 효과를 확인한 결

과를 나타내었다. 앞선 실험을 통해 선정된 서리태 열수추출물, 상추 에탄올추출물, 미나리 에

탄올추출물, 깻잎 에탄올추출물 4종과 유산균주 3종(Weissella cibaria JW15, Lb. plantarum

4-25, Lb. rhamnosus GG)을 배양 조건에 따른 적정 환경을 설정하기 위해 혐기와 호기로 조

건을 달리하여 증식을 비교해 보았다.

Fig.에서 보는 것처럼 혐기/호기 배양 조건에 따른 유산균 증식율은 3균주 모두 배양환경에 따

른 성장률의 차이는 보이지 않았다.

(A)

(B)

(C)

- 35 -

Fig. 1-3. Comparison of growth rate of lactic acid bacteria in yeast extract media with

Seoritae extract under aerobic or anaerobic condition.

(A) Lactobacillus rhamnosus GG, (B) Weissella cibaria JW15, (C) Lactobacillus plantarum 4-25

(나) 효모추출물 첨가에 따른 증식율 비교 결과

Table 1-11에 질소원 peptone을 대신하여 효모추출물을 첨가하여 3균주의 증식 효과를 측정

하여 제시하였다. yeast extract를 첨가한 배지에서 서리태 열수추출물의 경우 배양 6시간 경과

후 합성배지만큼의 생육촉진을 보였고, 배양 24시간 경과 후에도 높은 생균수를 유지하였으므

로 유산균 증식 촉진 최종 소재로 서리태 열수추출물을 선정하였다. Weissella균과 같이 발효

초기에 출현하는 유산균은 아미노산의 요구성이 큰데 필요한 성분을 체외 합성하지 않고 직접

섭취할 수 있다면 성장이 촉진 가능한데, 서리태열수추출물의 경우 빠른 증식을 유도하였으므

로 합성배지에 비해 성장인자가 충분히 함유되어 있다고 판단된다.

이에 유산균 즉, 유익균 증식능이 우수한 배지 조성물 또는 프리바이오틱 소재로 ‘서리태열

수추출물’을 최종 소재로 선정하였다.

Table 1-11. The growth of LAB in yeast extract added plant extracts.

Extracts LABViable cell counts(log CFU/mL)

0h 6h 12h 24h 48h

MRS broth

(control)

Lb.rhamnosus GG 7.84±0.08 9.30±0.00 9.45±0.21 9.84±0.08 10.18±0.04

Lb.plantarum 4-25 7.43±0.01 9.36±0.01 10.14±0.08 9.28±0.01 8.59±0.01

W.cibaria JW15 7.34±0.06 9.33±0.03 10.25±0.07 9.95±0.07 9.13±0.04

Seoritae

(Water)

Lb.rhamnosus GG 8.18±0.04 8.83±0.01 8.92±0.05 9.60±0.00 10.04±0.06

Lb.plantarum 4-25 7.95±0.07 9.99±0.13 10.28±0.03 10.23±0.04 10.18±0.04

W.cibaria JW15 8.06±0.04 9.45±0.21 10.14±0.08 10.00±0.00 9.30±0.00

Lettuce

(EtOH)

Lb.rhamnosus GG 6.82±0.05 6.97±0.01 7.14±0.01 7.38±0.00 7.27±0.01

Lb.plantarum 4-25 7.47±0.05 7.45±0.21 8.30±0.06 8.76±0.01 7.60±0.00

- 36 -

2. 유산균 증식촉진능 보유 소재에 대한 원료 표준화 연구

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

1절에서 도출된 실험 결과를 토대로 유산균 증식촉진능 보유 소재로 서리태 열수추출물이

최종적으로 선정되었고, 이를 이용하여 원료의 표준화 연구를 수행하였다.

나. 최종 선발 소재 원료의 표준화 연구

(1) 원료 생산공정도 설계 및 지표성분 설정

서리태 추출물의 생산을 위한 단위공정 설계를 작성하기 위하여 추출용매에 따른 추출물 제

조 과정을 간략한 모식도로 나타내었다. 각각의 추출물로 유산균 증식 촉진능을 평가하기 위한

지표성분으로 W. cibaria, L. rhamnosus, L. plantarum의 균체량를 흡광도를 이용하거나 평판

배지 위에 형성된 집락을 계수하여 생균수를 측정하였다.

(2) 원재료 표준화

최종 선발 소재 표준화를 위해 품종에 따라 비교해 보았다. 각각의 추출물을 펩톤배지에 1%

첨가하여 배지 제조 후 시험균액(멸균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 OD660 nm=0.5가

되게 한 시험균액)을 총 volume의 1%를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양하여

spectrophotometer로 660 nm에서 0, 6, 12, 24, 48 시간별 측정하였다.

(3) 추출물 소재의 제조공정 표준화

추출물 소재의 제조공정을 추출온도를 상온인 25℃와 끓는 온도인 85℃로 달리하여 추출하

였고, 추출용매를 물, 70%에탄올, 94%에탄올로 각각 추출하였으며, 추출시간을 1, 3, 6시간으로

하여 각각 비교해 보았다. 각각의 추출물을 펩톤배지에 1% 첨가하여 배지 제조 후 시험균액(멸

균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 OD660 nm=0.5가 되게 한 시험균액)을 총 volume의

1%를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 spectrophotometer로 660 nm에서 0, 6, 12, 24, 48

시간별 측정하거나 배양액 0.1 mL를 취하여 적당량 희석하여 MRS agar에 접종하여 37℃에서

0, 24, 48시간 배양 후 생성된 집락 계수를 확인하였다.

W.cibaria JW15 7.34±0.02 7.34±0.05 8.42±0.05 8.84±0.04 7.54±0.01

Water dropwort

(EtOH)

Lb.rhamnosus GG 6.95±0.01 7.12±0.06 6.96±0.01 7.39±0.00 7.39±0.01

Lb.plantarum 4-25 7.36±0.04 7.69±0.13 8.45±0.09 9.11±0.00 7.88±0.01

W.cibaria JW15 7.33±0.05 8.12±0.05 8.28±0.03 7.43±0.01 7.64±0.01

Perilla leaves

(EtOH)

Lb.rhamnosus GG 6.92±0.01 3.30±0.00 3.30±0.00 4.04±0.06 4.04±0.06

Lb.plantarum 4-25 7.36±0.08 3.69±0.13 4.12±0.05 4.67±0.01 4.18±0.04

W.cibaria JW15 7.29±0.01 6.40±0.02 6.45±0.05 6.74±0.01 6.65±0.07

- 37 -

□ 연구 결과

가. 최종 선정 원료에 대한 생산공정도 설계 및 지표성분 설정

(1) 원료 생산을 위한 단위공정 설계

최종 선발된 소재인 서리태 열수추출물에 대한 원료 표준화 연구에 앞서 서리태 추출물 원

료를 제조하기 위한 생산 공정의 모식도를 Fig. 2-1에 나타내었다.

Fig. 2-1. Process schematic diagram for production of Seoritae extract

(2) 지표성분 설정

서리태 추출물로 유산균 증식 촉진능을 평가하기 위한 지표성분으로 W. cibaria, L.

rhamnosus, L. plantarum의 균체량를 흡광도를 이용하거나 평판배지 위에 형성된 집락을 계수

하여 생균수를 측정하였다.

나. 원재료 표준화

시험재료인 서리태 열수추출물의 제조함에 있어 생산시기가 다른 서리태를 이용하여 생산한

두 추출물 간에 3종 시험균주에 대한 균체량 변화를 비교하였다. Table 2-1에 제시한 것처럼

두 시료 간에 그다지 큰 차이는 보이지 않았고, 서리태 추출물을 첨가한 시험 배지는 합성배지

인 MRS보다도 배양 6시간 경과 후 급속한 성장률을 보였다.

- 38 -

Table 2-1. Comparison of the growth rate of LAB in different period of Seoritae.

다. 추출물 소재의 제조공정 표준화

(1) 추출온도의 영향

추출 조건(온도, 용매, 시간)을 달리하여 제조된 서리태 열수추출물에 의한 시험균주별 증식율

을 비교한 결과를 Table 2-2, Fig. 2-2, 2-3에 제시하였다.

먼저 서리태 열수추출물을 85℃와 상온 25℃의 추출온도에서 각각 추출한 추출물을 첨가한 후

증식율을 비교한 결과 85℃ 서리태 추출물을 첨가한 배지에서는 3균주 모두 높은 균체량을 보

였다. 따라서 상온 25℃에서 추출한 추출물보다는 85℃에서 추출하는 것이 유산균 증식 촉진에 도

움을 주는 물질 분리에 적합하다고 판단된다.

Table 2-2. Result of viable cell count of lactic acid bacteria in different extraction

temperatures of Seoritae.

Samples Time(h)Test strains (Absorbance, 660nm)

W.cibaria JW15 Lb.plantarum 4-25 Lb.rhamnosus GG

MRS

(Control)

0 0.07±0.00 0.07±0.00 0.08±0.00

6 0.16±0.02 0.29±0.00 0.27±0.01

12 0.90±0.02 0.92±0.00 1.00±0.01

24 1.46±0.01 1.48±0.00 1.39±0.00

48 1.41±0.01 1.45±0.00 1.36±0.01

Seoritae

(1)

0 0.06±0.00 0.06±0.00 0.05±0.00

6 1.03±0.01 1.27±0.00 1.00±0.01

12 1.21±0.00 1.47±0.01 1.27±0.01

24 1.47±0.01 1.46±0.01 1.30±0.01

48 1.46±0.00 1.45±0.00 1.35±0.00

Seoritae(2)

0 0.06±0.00 0.06±0.00 0.06±0.00

6 0.99±0.00 1.12±0.01 0.96±0.01

12 1.13±0.02 1.22±0.01 1.02±0.00

24 1.36±0.02 1.27±0.02 1.17±0.01

48 1.31±0.01 1.23±0.01 1.31±0.01

Seoritae(Average)

0 0.06±0.00 0.06±0.00 0.06±0.00

6 1.01±0.00 1.20±0.01 0.98±0.00

12 1.17±0.01 1.34±0.00 1.15±0.01

24 1.42±0.01 1.37±0.01 1.23±0.00

48 1.38±0.00 1.34±0.00 1.33±0.01

Samples Time(h)Test strains (Viable cell counts, log CFU/mL)

W. cibaria JW15 Lb. plantarum 4-25 Lb. rhamnosus GG

MRS

(Control)

0 6.71±0.06 6.71±0.06 7.01±0.03

6 8.81±0.09 8.80±0.02 8.34±0.04

12 9.10±0.02 9.21±0.02 8.91±0.04

- 39 -

(2) 추출용매의 영향 : 물, 에탄올 농도별(0, 70, 94%)

추출용매로 물과 에탄올(70%, 94%) 용매를 이용하여 서리태 열수추출물을 제조하고 이를

첨가한 증식배지를 이용하여 3종 시험균주에 대한 증식능을 비교하였다. Fig. 1-5에 제시한 바

와 같이 서리태 열수추출물의 경우 3종의 유산균에 대해 증식을 촉진시켰지만, 나머지 에탄올

추출물에서는 균주의 증식에 효과적이지 못하였다. 에탄올추출물보다는 열수추출물에서 높은

증식을 보이기에 열수추출물이 유산균의 증식에 적합한 소재라 판단된다.

Samples Time(h)Test strains (Viable cell counts, log CFU/mL)

W. cibaria JW15 Lb. plantarum 4-25 Lb. rhamnosus GG

24 9.15±0.01 9.26±0.01 9.12±0.03

48 8.08±0.08 7.82±0.07 9.02±0.02

25℃

0 6.74±0.04 7.04±0.04 7.01±0.02

6 7.02±0.02 7.26±0.01 6.99±0.02

12 6.80±0.02 7.40±0.17 7.32±0.02

24 6.42±0.05 7.40±0.17 6.77±0.13

48 6.52±0.04 7.39±0.02 6.20±0.06

85℃

0 6.70±0.04 6.47±0.15 6.98±0.04

6 8.99±0.03 8.93±0.03 8.79±0.08

12 9.07±0.04 9.00±0.01 8.93±0.03

24 9.13±0.02 9.03±0.01 8.82±0.04

48 8.69±0.09 8.47±0.15 8.82±0.04

- 40 -

Fig. 2-2. Comparison of the growth of lactic acid bacteria in different extraction solvents

of Seoritae.

(3) 추출시간의 영향

서리태 열수추출물을 추출시간 1, 3, 그리고 6시간에 거쳐 제조하여 각각의 추출물을 증식배

지에 첨가하여 추출시간에 따른 유산균 증식 정도를 비교하였다. Fig. 1-6에서처럼 3균주 모두

3시간 추출한 열수추출물에서 잘 자랐고, 특히 균주들의 초기 증식은 MRS 배지보다 열수추출

물이 첨가된 배지에서 더 효과적이었다.

최종적으로 서리태 열수추출물을 상온에서 3시간 추출하였을 때 유산균들의 증식에 가장 큰

도움을 주는 것으로 보인다.

- 41 -

Fig 2-3. Comparison of the growth of lactic acid bacteria in different extraction times of

Seoritae.

- 42 -

3. 유산균 증식촉진능 보유 추출물의 물질규명 연구

□ 재료 및 방법

가. 유산균 증식촉진 소재에 대한 주요 성분의 정성 및 정량 분석

유산균 증식촉진능을 보인 후보 추출물 8종(서리태, 상추, 깻잎, 미나리 각각 열수와 에탄올

추출물)에 대한 정성 및 정량 분석을 수행하였다. 각각의 추출물들은 BCA assay kit를 이용하

여 총단백질 함량을 측정하고, Phenol-Sulfuric acid를 이용한 총당측정법으로 총당 함량을 측

정하였다.

(1) 총당 및 총단백질 함량

(가) 총당 함량

각 추출물 중에 함유된 총당은 Phenol-Sulfuric acid법(Saha, 1994)을 토대로 변형하여 분석

하였다. 각각의 시료 0.5 mL에 5% phenol 0.5 mL과 sulfuric acid 2.5 mL을 첨가한 후 실온에

20분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Glucose를 표준물질로 하여 총당 함량

을 측정하였다.

(나) 총단백질 함량

추출물 내에 단백질 함량 분석은 Schoel(1995)의 방법을 변형한 Bicincchoninic acid protein

assay kit(BCA, Thermo, Rockford, IL, USA)를 이용하여 수행하였다. Bovine serum albumin

을 표준물질로 사용하여 각각의 시료 25 μL를 96 well plate에 분주하고 BCA assay regent

200 μL를 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도

를 측정하였다.

(2) 유리아미노산 함량

2차 선정된 4종 소재을 아미노산 분석기(L-8900, Hitachi Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 유

리아미노산을 분석하였다. 일정량의 추출물 시료에 물을 가한다음 100℃에서 10분간 가열 한

다음 다시 물을 첨가하여 일정량으로 맞춘 후 원심분리(4℃, 5,000×g, 10 min)하여 상등액만을

취하고 여기에 5% trichloroacetic acid을 동량 첨가한 후 원심분리(4℃, 12,000×g, 10 min)하였

다. 상등액을 회수하고 0.02N HCl로 2배(v/v) 희석한 다음 여과(0.2 μm, Millipore Co., Cork,

Ireland)한 것을 분석하였으며, 분석조건은 제조사의 매뉴얼을 따랐다(Choi et al. 2014).

나. 서리태 열수추출물의 배양 전후 주요 성분의 함량 변화 측정

추출물 소재의 제조공정을 추출온도를 상온인 25℃와 끓는 온도인 85℃로 달리하여 추출하

였고, 추출용매를 물, 70%에탄올, 94%에탄올로 각각 추출하였으며, 추출시간을 1, 3, 6시간으로

하여 각각 비교해 보았다. 각각의 추출물을 펩톤배지에 1% 첨가하여 배지 제조 후 시험균액(멸

균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 OD660 nm=0.5가 되게 한 시험균액)을 총 volume의

1%를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 접종직후 배양액(0 시간)과 48시간 배양한 균액간

에 주요 성분의 함량 변화를 살펴보았다. BCA assay kit를 이용하여 총단백질 함량을 측정하

- 43 -

고, Phenol-Sulfuric acid를 이용하여 총당 함량을 측정하였다. 그리고 아미노산 분석기를 이용

하여 유리아미노산을 분석하고 HPLC를 이용하여 유리당을 분석하였다.

□ 연구 결과

가. 유산균 증식촉진 소재에 대한 주요 성분의 함량 비교

(1) 총당 함량

각 추출물에 대한 총당 함량을 측정한 결과는 Fig. 3-1에 나타내었다. 대체적으로 열수추출

물보다는 94% 에탄올추출물의 당 함량이 더 높았고, 특히 바나나와 우엉 추출물 시료가 매우

높은 함량을 보였다. 하지만 바나나와 우엉 추출물을 배지에 첨가한 후 유산균 증식능을 비교

하였을 때 다른 시료들에 비해 그다지 높은 효과를 보이지 않아 본 실험에서는 당 함량이 높

은 추출물이 유산균의 증식에 큰 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.

Fig. 3-1. Total sugar contents of each extract.

(2) 총단백질 함량

각 추출물들의 총단백질 함량 분석 결과는 Fig. 3-2에 나타내었다. 열수추출물에서는 흑태와

서리태의 단백질 함량이 높았지만 94% 에탄올추출물에서는 깻잎과 상추의 함량이 더 높았다.

앞서 이들 추출물을 첨가한 배지에서 유산균들의 증식 정도를 비교한 결과에서 열수추출물의

서리태와 94% 에탄올추출물의 깻잎에서 유산균이 높은 증식을 보였으므로 단백질이 유산균주

증식에 영향을 미칠 것으로 판단된다.

- 44 -

Fig. 3-2. Total protein contents of each extract.

(3) 유리아미노산 함량

2차 선정된 4종 소재(서리태 열수추출물, 상추 에탄올추출물, 미나리 에탄올추출물, 깻잎 에

탄올추출물) 중에 함유된 유리아미노산을 분석하여 Table 3-1에 제시하였다.

깻잎, 미나리, 상추 에탄올추출물과 서리태 열수추출물 4종에 대한 유리아미노산 분석 결과,

총아미노산 함량은 채소류 3종 에탄올 추출물의 함량이 더 높았다. 그러나 채소류 에탄올 추출

물에서는 메티오닌(Met)이 불검출되었으나, 두류 열수추출물에서는 대략 4 μg/mL 함량이 나

타나 앞선 실험에서 서리태가 가장 유산균 증식율이 높았기에 메티오닌을 유산균 증식인자로

추정하였다.

Table 3-1. Free amino acid contents of extracts.

Amino acid(μg/mL) Perilla leaves Water dropwort Lettuce Seoritae

Tau 0.00 0.00 0.00 0.00

Asp 147.84 199.09 231.37 1.99

Thr 48.26 126.39 174.90 0.00

Ser 52.96 52.75 61.07 0.74

Glu 49.46 371.81 82.57 41.10

Gly 39.36 5.99 3.65 10.78

Ala 283.16 250.23 387.61 17.17

Val 116.33 235.05 207.83 70.51

Cys 69.69 223.31 170.33 9.13

Met 0.00 0.00 0.00 3.92

Ile 105.62 154.14 319.69 6.74

Leu 80.62 100.45 392.94 1.48

Tyr 47.72 48.95 152.90 20.75

Phe 35.24 94.26 243.33 20.88

Trp 0.00 151.22 0.00 9.69

- 45 -

나. 서리태 열수추출물의 배양 전후 주요 성분의 함량 변화

(1) 총단백질 함량

서리태 열수추출물을 추출조건을 달리하여 제조한 후 증식배지에 첨가하여 배양 전후 주요 성

분의 함량 변화를 측정하였는데, 먼저 Fig. 3-3에 제시한바와 같이 총단백질 함량의 변화를 살펴

보았다. (A)와 같이 원재료 간에 총단백질 함량 차이는 보이지 않았지만, 추출용매별 함량 변화

(C)를 비교한 결과 열수추출조건에서 큰 차이를 보였는데 48시간 배양 후 배지 내 단백질 함량

이 상당량 감소하였다. 동일 시료로 추출온도(B)와 추출시간(D)별 함량 변화를 비교한 결과 그다

지 큰 차이는 없었지만, 85℃에서 3시간 추출한 경우 배양 후 소비된 양이 큰 차이를 보였다.

총단백질의 함량은 배양 전(0 hr)과 후(48 hr) 차이를 보인 것은 85℃에서 3시간 열수추출한

시료에서만 큰 변화를 나타내었는데, 이는 각각 유산균 증식이 높았던 결과와 관련성이 있어

배양에 필요한 단백질원이 더 많이 포함되어 있는 것으로 판단된다.

(A) (B)

(C) (D)

Amino acid(μg/mL) Perilla leaves Water dropwort Lettuce Seoritae

Lys 7.72 17.29 38.23 5.20

His 0.88 11.73 7.35 10.32

Arg 23.96 564.71 132.84 97.83

Pro 31.08 100.50 519.70 4.18

Total 1139.9 2707.87 3126.31 332.41

- 46 -

Fig. 3-3. Analysis of the total protein contents in LAB culture broth according to

extraction condition of Seoritae.

(A) Raw material, (B) Extract temperature, (C) Extract solvent, (D) Extract time

(2) 총당 함량

서리태 열수추출물을 추출조건을 달리하여 제조한 후 증식배지에 첨가하여 배양 전후 총당 함

량의 변화를 측정하여 Fig. 3-4에 제시하였다.

Fig. 3-4(A)에서처럼 생산년도가 다른 원재료 간의 총당 함량은 약 2배정도 차이를 보였고,

추출온도별(B) 함량 변화를 비교한 결과 25℃와 85℃도 추출온도에 따른 차이는 없었다. 추출

용매(C)와 추출시간별(D) 함량 변화를 비교한 결과 각각 열수추출조건과 3시간 추출한 경우에

약간 높은 함량을 보였다. 그러나 48시간 배양 후 유산균 균체량의 증가와 연관하여 비교하면

원재료간 당함량 차이를 보였지만 균체량은 비슷하게 증가하였고, 다른 조건에서도 미비한 차

이를 보여 유산균 배양에 있어 당성분이 큰 영향을 미치지는 않는 것으로 판단된다.

(A) (B)

(C) (D)

Fig. 3-4. Analysis of the total sugar contents in LAB culture broth according to extraction

condition of Seoritae.

(A) Raw material, (B) Extract temperature, (C) Extract solvent, (D) Extract time

- 47 -

(3) 유리당 함량

Fig. 3-5에 유리당 분석 조건과 표준물질에 대한 Retention time을 나타내었다. 이와 같은

조건으로 유리당을 분석한 결과는 Table 3-2에 나타내었다. 추출온도와 추출시간에 따른 유산

균의 배양 전후 유리당 함량 변화를 살펴본 결과 모든 시료에서 sucrose와 maltose만이 검출

되었지만 배양 전후의 함량 차이는 보이지 않았다.

Analyzer Agilent 1100

․ Column

․ Solvent

․ Flow rate

․ Temp.

․ Injection vol.

Zorbax carbohydrate column (4.6um*150mm, 5um)

ACN 8 : Water 2

1.5mL/min

Column Temp. 35℃, RID detector 온도 30℃, thermosat 30℃

10ul

Fig. 3-5. Chromatography of standard sugars and analytic condition.

Table 3-2. Analysis of free sugar contents in LAB culture broth according to extraction

condition of Seoritae by HPLC.

Condition Strains

Free sugar contents(%)

Culture(0h) Culture(48h)

Sucrose Maltose Sucrose Maltose

Extract

time

1h

LGG 0.46±0.00 0.03±0.01 0.48±0.01 0.04±0.00

JW15 0.44±0.01 0.03±0.01 0.44±0.00 0.04±0.00

425 0.42±0.01 0.03±0.00 0.44±0.00 0.04±0.00

3h

LGG 0.46±0.01 0.04±0.00 0.48±0.01 0.04±0.00

JW15 0.43±0.01 0.04±0.00 0.44±0.01 0.03±0.00

425 0.44±0.00 0.04±0.00 0.44±0.00 0.03±0.00

6h

LGG 0.46±0.01 0.04±0.00 0.48±0.01 0.03±0.01

JW15 0.42±0.02 0.04±0.01 0.44±0.01 0.03±0.00

425 0.44±0.01 0.04±0.00 0.45±0.01 0.03±0.00

- 48 -

Condition Strains

Free sugar contents(%)

Culture(0h) Culture(48h)

Sucrose Maltose Sucrose Maltose

Extract

temp.

25℃

LGG 0.45±0.02 0.04±0.00 0.48±0.02 0.03±0.01

JW15 0.42±0.01 0.04±0.00 0.47±0.01 0.03±0.00

425 0.45±0.01 0.04±0.00 0.46±0.00 0.03±0.00

85℃

LGG 0.48±0.00 0.04±0.00 0.46±0.01 0.03±0.01

JW15 0.43±0.01 0.04±0.00 0.48±0.01 0.03±0.00

425 0.44±0.01 0.04±0.00 0.48±0.01 0.02±0.00

- 49 -

2절 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화

및 원료표준화 연구(2세부과제)

1. 식물 중 면역활성 보유 소재 탐색

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

(1) 식물 소재 선정

본 실험에 사용된 식물소재는 2010년 국민건강영양조사(Korea Centers for Disease Control

and Prevention, 2011)에서 보고된 30빈도 이상 식품 중 42 순위 내 식품들과 선행연구로 밝혀

진 면역 활성 소재로 산채류 5종을 포함하여 총 47종을 가지고 수행하였다. 모든 시료는 수원

지역의 대형마트에서 구입하였으며, Table 1-1 제시된 바와 같이 모두 생산지가 국내산이다.

Table 1-1. List of plant samples used for this study.

Group Food and Description Origin

Cereals

겉보리쌀 Hulled barley Korean

멥쌀백미 Well polished rice Gimpo

멥쌀현미 Brown rice Korean

차조 Glutinous millet Korean

찰수수 Glutinous sorghum Korean

찹쌀백미 Well polished glutinous rice Korean

찹쌀현미 Brown glutinous rice Korean

흑미 Black rice Chiak

Legumes서리태 Seoritae Korean

흑태 Heuktae Korean

Starches감자 Potato Gangwon

고구마 Sweet potato Dangjin

Fruits

밀감 Mandarin orange Jeju

바나나 Banana Philippines

배 Pear Jochiwon

사과 Apple Cheongsong

수박 Water melon Korean

포도 Grape Sangju

Vegetables

고사리 Bracken Yeoju

깻잎 Perilla leaves Daegu

꽈리고추 Green young hot pepper Jinju

당근 Carrot Jeju

대파 Welsh onion Yeoju

마늘 Garlic Seosan

무 Korean radish Jeju

미나리 Water dropwort Gijang

- 50 -

Table 1-1. Continued.

(2) 동결건조시료 및 에탄올추출물 시료 제조

수분함량이 10% 이하로 낮은 곡류 8종과 두류 2종은 생시료를 그대로 분쇄하여 사용하였고,

수분함량이 높은 과일류 6종, 전분류 2종, 채소류 24종 및 산채류 5종은 동결 건조기(Ilshin

Lab Co., Ltd, Korea)를 이용하여 동결 건조 과정(5-7 days, 20 torr, rack temp. -45℃, trap

temp. -70℃)을 거친 후 분쇄하여 사용하였다. 모든 시료는 실험 시작 전에 고압멸균기를 이용

하여 멸균한 후(121℃, 15분) 이용하였다.

시료로부터 추출물을 만드는 과정은 동결건조과정을 거쳐 분말형태가 된 시료를 일정량 칭

량한 후 그 중량의 10배에 해당하는 양만큼 70% 에탄올을 첨가하여 상온에서 24시간동안 170

rpm 속도로 교반추출기(Jeiotech, Shaker, SK-71)를 이용하여 추출하였다. 상층액은 모으고 잔

여물은 처음에 사용한 만큼의 70% 에탄올을 다시 첨가하여 처음 단계를 반복하는 과정을 거

쳐 2회 추출한 것을 모은 상층액은 여과지(Advantec No. 6)로 여과한 다음, 회전진공농축기

(EYELA, CCA-110, Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 제거하며 농축하였고, 다음의 조건(5-7

days, 20 torr, rack temp. -45℃, trap temp. -70℃)에서 동결 건조하였다. 이렇게 얻어진 에탄

올 추출물의 건조분말은 실험을 시작하기 전까지 -70℃ deep freezer에 보관하였다.

Group Food and Description Origin

Vegetables

배추 Chinese cabbage Haenam

부추 Chinese chive Hogyecheon

상추 Lettuce Yongin

생강 Ginger Seosan

숙주나물 Mungbean sprouts Icheon

시금치 Spinach Buyeo

쑥갓 Crown daisy Anseong

애호박 Young pumpkin Jinju

양배추 Cabbage Jeju

양파 Onion Muan

오이 Cucumber Osan

우엉 Burdock Changwon

콩나물 Soybean sprouts Hwaseong

풋고추 Green hot pepper Jinju

피망 Sweet pepper Jinju

홍고추 Red hot pepper Gwansan

Wild plant

가죽나무 Ailantias altissima Korean

꿀풀 P runella vulgaris L. Korean

다래 Actinidia arguta Korean

머위 Petasites japonicus Korean

참취 Aster scaber Korean

- 51 -

나. 세포 배양

본 연구에서 사용한 RAW-Blue™ 세포(InvivoGen, USA)는 NF-κB/AP-1 reporter cell line

으로 mouse Raw 264.7 macrophages에서 유래된 세포로 NF-κB/AP-1-inducible SEAP

reporter 유전자를 가지고 있어 면역반응에 의해 자극되면 활성화 되는 특징을 가지고 있다.

RAW-Blue™ 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco-Invitrogen)과 1%

penicillin-streptomycin(Gibco)을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM,

Gibco-Invitrogen) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 계대는 2일에 한 번

씩 시행하였으며, RAW-Blue™ 세포를 활성화시키기 위해 주 1회는 Zeocin™(InvivoGen, USA)

이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 양성대조군은 lipopolysaccharide(LPS,

Escherichia coli O11:B4, Sigma) 100 ng/㎖의 농도를 처리한 것으로 사용하였다. 시험 수행방

법은 면역반응 증강 또는 억제하는 식품소재 중 면역반응에서 중요한 역할을 하는 전사조절인

자 NF-κB 활성조절능을 평가하여 면역활성 소재를 선발하였다.

다. 대식세포의 활성화 측정

(1) NF-κB 전사인자 활성능 측정

in vitro상에서 대식세포가 활성화되어 나타나는 면역반응은 NF-κB/AP-1 pathway 전사인

자 활성화 측정을 통해 알아보았다. 본 실험에 사용된 대식세포는 NF-κB/AP-1 reporter cell

line(RAW-Blue™ cells, InvivoGen, USA)으로 mouse RAW 264.7 macrophages에서 유래된 세

포로 NF-κB/AP-1-inducible SEAP reporter 유전자를 가지고 있어 면역반응에 의해 자극되면

활성화되어 지시약(Quanti blue)에 의해 색변화(pink → blue/violet)가 일어나 활성화 여부를

판단할 수 있다(Fig. 1-1).

RAW-Blue™ 세포는 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였

고, 그 다음 100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물을 처리하여 다시 24시간 배양하였다. 그리고 나서

상층액 20 ㎕와 Quanti blue(InvivoGen, USA) 시약 200 ㎕를 혼합하여 암실에서 10분 반응시

킨 후 microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 650 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

Quanti-blue 양성 반응(LPS 처리) Quanti-blue 양성 반응(LPS 무처리)

* Blue box: 가죽나무 에탄올 추출물

Fig. 1-1. Production of NF-κB/AP-1-inducible SEAP reporter gene from RAW-Blue

cell by using Quanti-blue dye

- 52 -

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

식물 추출물에 의한 면역증강 기능성을 확인하기 위하여 RAW-Blue™ 세포의 배양 상층액을

취하여 NO의 생성량을 측정하였다. 먼저 RAW-Blue™ 세포를 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well

plate에 분주하여 24시간 배양 시킨 후 100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물을 처리하여 다시 24시간

동안 배양하여 상층액을 얻었다. 이 상층액 50 ㎕와 Griess reagent(Promega) Ⅰ(Sulfanilamide

solution)과 Ⅱ(NED solution)를 동량으로 섞어 제조한 시약 100 ㎕를 혼합하여 상온에서 10분

반응시킨 후 microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였

다. Nitric oxide의 농도는 Fig. 1-2와 같이 아질산나트륨의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

Fig. 1-2. The standard curve for nitrite level.

(3) 면역세포 활성물질(Cytokine) 생성량 측정

대식세포가 활성화되면 분비되는 세포활성물질(사이토카인, Cytokine)의 생성량을 알아보기

위하여 RAW-Blue™ 세포와 식물소재를 함께 처리한 후 얻은 배양액으로부터 사이토카인

(TNF-α와 IL-1β) 생성량을 측정하였다.

먼저 RAW-Blue™ 세포를 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양하였

고, 그 다음 100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물을 처리하여 다시 24시간 배양하였다. 그리고 나서

상층액만을 취하여 효소결합면역흡착검사(Enzymelinked immumosorbent assay, ELISA)를 이

용한 ELISA kit(ebioscience, San Diego, California, USA)로 사이토카인 함량을 측정하였다.

사이토카인(TNF-α와 IL-1β)의 항체가 코팅되어 있는 각각의 well plate에 상층액 시료 100

㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 PBS와 Tween 20(Sigma)을 섞어

만든 washing buffer로 5회 이상 세척하였다. Detection antibody 용액을 넣어 항체와 반응시

킨 후, Avidin과 결합된 Horseradish Peroxidase(HRP) 효소를 넣어 상온에서 15분 반응시켰다.

이 후, HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 확인하였다. 시료

에 사이토카인이 생성되어 존재하면 색상의 변화가 나타나므로, 이 변화를 통해 사이토카인

(TNF-α와 IL-1β) 생성량을 측정하였다. Stop solution(H2SO4)을 넣어 HRP 효소와 TMB 기질

- 53 -

의 반응을 종결시킨 후, microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를

측정하였다.

□ 연구 결과

가. 70% 에탄올 추출물 조제 및 수득률(%)

이번 실험에서 사용된 42종의 다빈도 식품과 5종의 산채류 시료들은 70% 에탄올로 2회 추

출하여 추출물을 제조하였다. Table 1-2에 제시한 바와 같이 바나나, 포도 등 과일류와 우엉,

무, 꽈리고추 등 일부 채소류에서 50% 이상의 수득률을 나타내었다. 대부분의 시료가 10% 이

상의 수득률을 보인 반면 겉보리, 백미, 현미 등 곡류는 5% 이하의 낮은 수득률을 보였다. 기

타로 사용된 산채류 시료는 선행연구에서 제조된 70% 에탄올 추출물을 그대로 제공받아 사용

하여 수득률을 표시하지 않았다.

Table 1-2. Yield(%) of ethanol extracts produced from plant samples used for this study.

순번분

류식품명

획득량(g)

수득률(%)

1

과일류

바나나 5.1 50.8

2 포도 5.2 52.1

3 수박 5.0 50.2

4 사과 5.0 50.3

5 배 5.1 51.3

6 밀감 5.0 50.0

7

곡류

겉보리 0.4 4.2

8 멥쌀, 백미 0.1 1.4

9 멥쌀, 현미 0.3 2.7

10 멥쌀, 흑미 0.3 3.0

11 찹쌀, 백미 0.1 1.3

12 찹쌀, 현미 0.3 2.8

13 수수 0.3 3.4

14 차조 0.3 3.0

15 두류

서리태 1.7 17.1

16 흑태 1.9 18.2

17 전분류

감자 1.6 16.2

18 고구마 1.9 18.4

19 채

소

류

들깻잎 1.7 34.4

20 미나리 3.3 32.8

21 우엉 5.5 54.6

순번분

류식품명

획득량(g)

수득률(%)

22

채

소

류

고사리 1.8 18.4

23 마늘 4.1 41.2

24 무 8.2 81.9

25 붉은고추 4.8 48.2

26 풋고추 3.2 31.8

27 꽈리고추 6.0 60.0

28 배추 3.1 31.1

29 부추 3.9 38.8

30 상추 3.0 30.4

31 생강 1.3 12.8

32 쑥갓 3.1 31.1

33 애호박 5.9 59.0

34 양배추 5.4 53.4

35 양파 5.8 57.8

36 당근 5.7 57.2

37 콩나물 2.2 22.3

38 대파 4.3 43.3

39 피망 4.4 44.0

40 숙주나물 3.3 32.9

41 시금치 2.2 22.0

42 오이 5.6 55.9

- 54 -

나. 대식세포의 활성화에 따른 면역증진 평가

(1) NF-κB 전사인자 활성능

47종의 추출물 시료와 대조군(LPS 처리와 비처리)을 RAW-Blue™ 세포에 처리하여 발현되

는 NF-κB/AP1 전사인자의 활성을 측정한 결과는 Table 1-3, Fig. 1-3와 Fig. 1-4에 나타내었

다. Table 1-3은 각각의 추출물을 1,000와 100 μg/mL 농도로 처리한 후 NF-κB 전사인자 활

성화 정도를 나타낸 것이고, Fig. 1-3과 Fig. 1-4는 각 시료들을 100 μg/mL 농도로만 처리한

실험군과 LPS를 100 ng/mL농도로 처리한 것과 처리하지 않은 대조군과 비교하여 제시하였다.

LPS를 처리한 경우 에탄올 추출물 시료에 의해 유도된 NF-κB/AP1 전사인자 활성화 정도

를 비교한 결과 곡류에서는 8종 시료 모두가 시료를 처리하지 않은 대조군보다 활성이 낮았고,

전분류 중 고구마 추출물은 감자에 비해 약간 높은 활성을 보였는데, 두류의 서리태와 함께 대

조군과 유사 활성을 나타냈다. 과일류에서는 바나나와 사과 추출물에서 대조군과 유사한 활성

을 보였고, 채소류에서는 콩나물 추출물을 LPS와 함께 처리하였을 때 대략 4배정도로 가장 활

성이 높았으며, 다음으로 양배추, 쑥갓, 그리고 마늘 추출물 순으로 높은 활성을 보였다. 5종의

산채류 중에서는 가죽나무 추출물 시료에서만 대조군보다 높은 활성을 나타내었다.

LPS를 처리하지 않은 경우에는 대부분 추출물 시료의 처리에 의해 대조군보다 활성이 약간

높아졌다. 곡류은 차조와 찰수수를 제외하고 나머지 6종은 높았는데, 멥쌀현미, 찹쌀현미, 검정

현미(흑미)가 높아 백미보다 현미가 활성을 높여줌을 알 수 있었다. 2종의 두류는 현미 추출물

들만큼의 활성을 보였고, 전분류에서는 고구마 추출물에 비해 감자 추출물이 활성을 2배로 높

여주었으나, 과일류는 그다지 큰 차이를 나타내지 않았다. 채소류의 경우 곡류만큼의 활성을

보여준 것은 콩나물이며 나머지 시료들은 LPS로 자극을 주지 않은 대조군에 비해 큰 활성을

나타내지 않았다. 산채류 중에는 꿀풀, 가죽나무, 머위, 다래, 참취 추출물 순으로 활성이 높았

지만, 곡류와 채소류에 비해 높지는 않았다.

NF-κB/AP1의 전사인자 활성능 비교를 통해 총 47종의 식물 추출물 중 대조군보다 높은 두

류군 1종, 전분류군 1종, 과일류군 2종, 채소류군 4종, 산채류군 1종을 면역 활성에 우수한 식

품소재로 발굴하였다.

Table 1-3. Effect of plant extracts on NF-kB production by RAW 264.7 cell.

Group Food nameNF-kB activity(OD650nm), Mean±SD

LPS stimulated LPS non-stimulated1,000㎍/㎖ 100㎍/㎖ 1,000㎍/㎖ 100㎍/㎖

대조군LPS(+) 0.41±0.00

LPS(-) 0.07±0.00

곡류군

차조 0.12±0.00 0.38±0.02 0.10±0.01 0.24±0.00

흑미 0.13±0.00 0.68±0.00 0.10±0.00 0.26±0.00

찰수수 0.14±0.00 0.70±0.00 0.12±0.00 0.26±0.00

겉보리쌀 0.13±0.00 0.38±0.02 0.11±0.00 0.18±0.00

멥쌀백미 0.09±0.00 0.34±0.01 0.10±0.00 0.12±0.01

멥쌀현미 0.10±0.00 0.31±0.01 0.10±0.00 0.17±0.00

찹쌀백미 0.10±0.01 0.39±0.01 0.10±0.00 0.12±0.00

찹쌀현미 0.10±0.00 0.30±0.01 0.09±0.00 0.26±0.00

두류군 서리태 0.15±0.00 0.43±0.02 0.10±0.00 0.25±0.01

- 55 -

Group Food nameNF-kB activity(OD650nm), Mean±SD

LPS stimulated LPS non-stimulated1,000㎍/㎖ 100㎍/㎖ 1,000㎍/㎖ 100㎍/㎖

흑태 0.10±0.00 0.71±0.02 0.09±0.00 0.26±0.00

전분류감자 0.11±0.00 0.33±0.01 0.10±0.01 0.15±0.00

고구마 0.11±0.01 0.42±0.00 0.10±0.01 0.09±0.00

과일군

밀감 0.09±0.01 0.32±0.01 0.09±0.00 0.09±0.00

사과 0.08±0.00 0.42±0.01 0.08±0.00 0.10±0.00

수박 0.07±0.00 0.38±0.01 0.09±0.00 0.11±0.00

포도 0.09±0.00 0.32±0.01 0.09±0.00 0.10±0.00

배 0.08±0.00 0.34±0.01 0.09±0.00 0.11±0.00

바나나 0.11±0.01 0.41±0.01 0.08±0.00 0.11±0.00

채소군

상추 0.06±0.00 0.25±0.01 0.06±0.00 0.10±0.00

애호박 0.08±0.00 0.29±0.02 0.11±0.00 0.11±0.00

숙주나물 0.10±0.00 0.29±0.02 0.09±0.00 0.15±0.00

풋고추 0.10±0.01 0.13±0.00 0.07±0.00 0.08±0.00

당근 0.10±0.01 0.22±0.02 0.08±0.01 0.07±0.00

마늘 0.06±0.00 0.44±0.00 0.09±0.00 0.08±0.00

배추 0.10±0.00 0.28±0.01 0.08±0.00 0.08±0.00

부추 0.08±0.00 0.26±0.01 0.09±0.00 0.08±0.00

오이 0.10±0.00 0.22±0.01 0.08±0.00 0.08±0.00

대파 0.07±0.00 0.20±0.00 0.09±0.00 0.08±0.00

콩나물 0.10±0.00 1.11±0.02 0.09±0.00 0.08±0.00

깻잎 0.06±0.00 0.32±0.01 0.06±0.00 0.07±0.00

무 0.07±0.01 0.15±0.00 0.06±0.00 0.11±0.00

우엉 0.09±0.00 0.35±0.00 0.08±0.00 0.08±0.00

미나리 0.08±0.00 0.37±0.00 0.06±0.00 0.08±0.00

꽈리고추 0.07±0.00 0.26±0.01 0.06±0.00 0.07±0.00

홍고추 0.09±0.00 0.14±0.00 0.09±0.00 0.07±0.00

생강 0.10±0.00 0.24±0.01 0.07±0.00 0.12±0.00

양파 0.06±0.00 0.27±0.00 0.09±0.00 0.08±0.00

피망 0.06±0.00 0.33±0.01 0.06±0.00 0.11±0.00

고사리 0.05±0.00 0.30±0.00 0.05±0.00 0.12±0.00

양배추 0.13±0.00 0.34±0.00 0.09±0.00 0.08±0.00

시금치 0.07±0.00 0.40±0.01 0.07±0.00 0.08±0.00

쑥갓 0.07±0.00 0.35±0.00 0.06±0.00 0.11±0.00

기타군

가죽나무 0.11±0.01 0.59±0.01 0.09±0.00 0.11±0.00

참취 0.10±0.01 0.22±0.00 0.10±0.00 0.07±0.00

머위 0.08±0.00 0.19±0.01 0.07±0.00 0.10±0.00

다래 0.12±0.00 0.29±0.00 0.08±0.00 0.09±0.00

꿀풀 0.07±0.00 0.35±0.00 0.07±0.00 0.13±0.00

- 56 -

Fig. 1-3. Comparison of NF-κB/AP1 gene activity of various plants(Cereals, legumes, and fruits) in

LPS-stimulated/-unstimulated RAW-Blue cells. Data are expressed as mean±SD(n=3).

- 57 -

Fig. 1-4. Comparison of NF-κB/AP1 gene activity of various plants(Vegetables and wild plants) in

LPS-stimulated/-unstimulated RAW-Blue cells. Data are expressed as mean± SD(n=3).

- 58 -

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

RAW-Blue™ 세포에 47종 에탄올추출물 시료와 대조군을 처리하여 곡류, 두류, 전분류와 과

일류의 NO 생성량을 측정한 결과는 Fig. 1-5에, 채소류와 산채류의 결과는 Fig. 1-6에 제시하

였다. 47종 시료의 단독 처리 또는 LPS와 함께 처리한 시험군은 LPS 자극만으로 유도된 대조

군과 비교하여 NO 생성량을 평가하였다.

LPS 처리 조건에서는 곡류, 두류, 전분류 및 과일류의 시료들 대부분이 대조군보다 LPS와

함께 처리하였을 때 NO 생성량이 모두 증가하였는데, 특히 검정 현미(흑미)와 바나나 추출물

이 각각 9.34±0.17 μM/㎖와 9.93±0.60 μM/㎖로 가장 높았고, 찰수수와 포도 추출물이 그다음으

로 높은 값을 나타내었다. 반면 LPS를 처리하지 않고 시료만 단독으로 처리하였을 때는 곡류

군의 찰수수(1.59±0.30 μM/㎖)와 흑미 에탄올추출물(1.75±0.10 μM/㎖), 두류군의 서리태

(1.52±0.32 μM/㎖)와 흑태 추출물(1.82±0.11 μM/㎖), 그리고 전분류의 고구마 추출물(2.51±0.25

μM/㎖)만이 대조군(1.46±0.10 μM/㎖)보다 NO 생성량이 높았다.

채소류와 산채류간에 NO 생성량을 비교하여 보면 에탄올추출물 시료만 단독 처리하였을 때

콩나물 추출물(5.59±0.17 μM/㎖)과 가죽나무(5.46±0.06 μM/㎖), 참취(4.81±0.00 μM/㎖) 순으로

가장 높은 NO 생성능을 보였다. 특히 콩나물과 가죽나무 추출물의 경우 LPS 처리 대조군

(5.73±0.06 μM/㎖)과 유사하게 높은 값을 나타내었다. 그 외에도 숙주나물, 시금치, 양파 추출

물 시료들에서 대조군보다 높은 NO 생성을 보였으며, 산채류군에서는 다래 추출물이 조금 높

았다. 반면 LPS와 동시에 추출물을 처리한 경우 채소류 24종 중 14종만이, 산채류는 5종 모두

대조군에 비해 높은 값을 나타내었다. 채소류 중에는 깻잎, 파, 양파, 그리고 우엉 추출물 순으

로 높았고, 산채류 중에는 가죽나무, 꿀풀, 참취 추출물 순으로 높은 NO 생성량을 보였다. 그

러나 에탄올추출물 단독처리로 생성능이 높았던 콩나물 추출물의 경우 LPS와 함께 처리하였

을 때는 그다지 높은 값을 보이지 않았고, 가죽나무 추출물만이 두 조건에서 모두 높은 NO 생

성량을 보였다.

위의 결과를 토대로 47종에서 대조군보다 NO 생성량이 높은 곡류군의 2종, 두류군의 2종,

전분류군과 과일류군의 각각 1종, 채소류군의 3종, 산채류군의 3종으로 총 12종을 면역 활성이

우수한 식품소재로 발굴하였다.

면역 활성 우수소재로 기대되는 후보소재를 선정하기 위하여 NF-κB/AP1 전사인자 활성능

과 NO 생성량 측정 결과를 토대로 두 실험에서 중복으로 선정된 서리태, 고구마, 사과 및 가

죽나무 추출물 시료들과 각각에서 높은 활성을 보인 시료를 포함하여 47종 중 17종 에탄올추

출물을 1차로 후보소재로 선정하였다(Table 1-4).

- 59 -

Fig. 1-5. Comparison of NO production of various plants(Cereals, legumes, and fruits) in LPS-stimulated/-unstimulated RAW-

Blue cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3).

- 60 -

Fig. 1-6. Comparison of NO production of various plants(Vegetables and wild plants) in LPS-stimulated/-unstimulated

RAW-Blue cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3).

- 61 -

Table 1-4. List of 1st selection samples with NF-kB/AP1 activity and nitric oxide

production among 47 kinds of plants.

Group Samples

NF-kB activity

(OD650nm)

Nitric oxide

(µM/㎖)

LPS(-) LPS(+) LPS(-) LPS(+)

ControlLPS(-) 0.07±0.00 1.19±0.04

LPS(+) 0.41±0.00 3.94±0.08

Cereals찰수수 Glutinous sorghum 0.37±0.02 0.07±0.00 8.35±0.26 1.59±0.30

흑미 Black rice 0.35±0.03 0.26±0.00 9.34±0.17 1.75±0.10

Legumes서리태 Seoritae 0.43±0.02 0.25±0.01 5.73±0.20 1.52±0.32

흑태 Heuktae 0.36±0.01 0.26±0.00 6.51±0.30 1.82±0.11

Starches 고구마 Sweet potato 0.42±0.00 0.08±0.00 7.70±0.20 2.51±0.25

Fruits바나나 Banana 0.41±0.01 0.11±0.00 9.93±0.60 0.83±0.23

사과 Apple 0.42±0.01 0.11±0.00 6.68±0.77 1.55±0.30

Vegetables

마늘 Garlic 0.44±0.01 0.09±.0.00 5.99±0.10 0.60±0.23

숙주나물 Mungbean sprouts 0.29±0.02 0.15±0.00 5.99±0.36 1.65±0.26

시금치 Spinach 0.40±0.01 0.08±0.00 6.25±0.21 1.78±0.11

쑥갓 Crown daisy 0.53±0.02 0.10±0.00 4.97±0.35 0.96±0.10

애호박 Young pumpkin 0.29±0.01 0.12±0.00 6.74±0.21 0.50±0.25

양배추 Cabbage 0.59±0.01 0.09±0.00 4.58±0.45 0.73±0.11

콩나물 Soybean sprouts 1.13±0.03 0.20±0.00 4.44±0.32 5.59±0.20

Wild plant

가죽나무 Ailantias altissima 0.57±0.01 0.11±0.00 10.16±0.63 5.46±0.06

다래 Actinidia arguta 0.24±0.01 0.09±0.00 6.38±0.17 1.88±0.15

참취 Aster scaber 0.22±0.01 0.07±0.00 8.75±0.52 4.81±0.00

(3) 세포활성물질(Cytokine) 측정

1차 스크리닝을 통해 선정된 17종의 시료 중 대식세포에 LPS와 함께 처리하면 생성되는 세

포활성물질 중 TNF-α와 IL-1β의 생성량을 측정하여 Fig. 1-7과 Table 1-5에 각각 제시하였

다. LPS 처리 유무로 대조군을 구분하여 LPS와 함께 처리한 시료와 시료만 단독으로 처리한

것을 각각 비교하였다.

(가) TNF-α 분비량 측정

먼저 TNF-α 생성량을 살펴본 결과 LPS와 함께 처리한 경우 콩나물 에탄올추출물이

- 62 -

1509.55±1.38 pg/㎖로 가장 높은 TNF-α 생성량을 보였으며, 시료 단독처리에서도 292.02±3.27

pg/㎖로 가장 높은 생성량을 보였다. 그 다음으로 사과, 고구마, 참취, 시금치, 가죽나무 추출물

순으로 높은 생성을 보였지만, 시료 단독처리에서는 매우 낮은 생성량을 나타내었다. 추출물

시료 단독으로 처리하였을 경우, 곡류군인 찰수수와 흑미, 그리고 두류군인 흑태 추출물에서는

높은 생성을 보였지만, LPS와 함께 처리 시 대조군에 비해 생성량이 감소하였다.

Fig. 1-7. Comparison of TNF-α production of plant in LPS-stimulated/-unstimulated

RAW-Blue cells. Data are expressed as mean±SD(n=3).

(나) IL-1β 분비량 측정

Table 1-5에 제시한 것처럼 IL-1β 생성량을 측정하였을 때 콩나물, 찰수수 및 가죽나무 에

탄올추출물 시료들에서만 IL-1β 사이토카인이 생성되었는데, LPS와 함께 처리하였을 때 각각

54.56±1.08, 34.10±1.08 및 26.10±0.81 pg/㎖의 생성량을 보였다. 하지만 나머지 시료에서는

IL-1β 사이토카인이 생성되지 않았다.

- 63 -

Table 1-5. Comparison of IL-1β production in RAW-Blue cells with samples.

Group Samples IL-1β production(pg/㎖)*

ControlLPS(-) 19.83±5.51

LPS(+) 1264.07±0.96

CerealsGlutinous sorghum 34.10±1.08

Black rice (N.D.)

LegumesSeoritae (N.D.)

Heuktae (N.D.)

Starches Sweet potato (N.D.)

FruitsBanana (N.D.)

Apple (N.D.)

Vegetables

Garlic (N.D.)

Mungbean sprouts (N.D.)

Spinach (N.D.)

Crown daisy (N.D.)

Cabbage (N.D.)

Onion (N.D.)

Soybean sprouts 54.56±1.08

Wild plants

Ailantias altissima 26.10±0.81

Actinidia arguta (N.D.)

Aster scaber (N.D.)

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** N.D., Not detected

이상의 in vitro상 기능성 평가 결과를 토대로 콩나물과 가죽나무 에탄올추출물 시료가 대

식세포를 증식시켜 면역 증강 사이토카인들의 생성량을 높일 뿐만 아니라, NF-κB/AP1 전사인

자 활성능과 NO 생성능도 뛰어나 유산균과의 혼합에 의한 면역 활성 평가를 위해 우수소재로

최종적으로 선정되었다.

- 64 -

2. 식물 소재와 유산균의 혼합에 따른 면역 활성 평가

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

(1) 식물 소재

앞 절에서 수행한 in vitro상 기능성 평가 결과를 토대로 콩나물과 가죽나무 에탄올추출물

시료를 유산균과의 혼합에 의한 면역 활성 평가를 위해 사용하였다.

(2) 유산균 시료

본 연구에 사용된 균주는 충북대학교 수의과대학에서 분양받아 실험에 사용하였다.

Weissella cibaria JW15(KACC 91811P)와 Lactobacillus plantarum 4-25(KACC 91936P) 분리

균주는 선행연구에서 프로바이오틱 기능과 면역활성을 가진 유산균으로 선발되었는데 이번 실

험의 비교균주로 사용하였다. Lactobacillus rhamnosus GG는 상업용 균주로서 면역 기능성을

보유한 균주로 잘 알려져 있어 이번 실험에 control 균주로 사용하였다. 이 균주들은 4℃에서

냉장 보관하면서 유산균 증식용 배지인 lactobacilli MRS broth(Difco, USA)에서 2주마다 계대

배양하였으며, 실험에 사용 전까지 멸균된 50% glycerol를 넣은 배지에 균체를 현탁하여 -70

℃의 deep freezer에 보관하였다.

Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus plantarum 4-25, 그리고 Weissella cibaria

JW15 세 균주는 MRS 액체배지로 37℃에서 24시간 배양한 후 각 균주들은 생균과 사균으로

구분하여 시료를 준비하였다. 생균은 배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리(Gyrogen,

Labogene, 1580R) 한 후 상층액을 제거하고 PBS로 희석하여 흡광도(OD660nm)를 측정하여 0.5

농도로 맞추어 균체 그대로 사용하였으며, 사균은 원심분리한 생균을 100℃에서 15분간 열처리

하여 상층액을 제거한 후 PBS로 희석하여 흡광도 0.5 농도로 맞추어 실험에 사용하였다.

나. 세포 배양

시험세포는 NF-κB/AP-1 reporter cell line(RAW-Blue cell)으로 mouse Raw 264.7 macrophages에

서 유래된 세포로 NF-κB/AP-1-inducible SEAP reporter 유전자를 가지고 있어 면역반응에 의해

자극되면 활성화 되는 특징을 가지고 있다. 배지는 1% penicillin-streptomycin(Gibco)을 포함한

Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco-Invitrogen)를 이용하였으며, 37℃, 5% CO2

조건에서 배양하였다. RAW-Blue™ 세포를 활성화시키기 위해 주 1회는 Zeocin™(InvivoGen, USA)이

첨가된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.

다. 대식세포의 활성화 측정

(1) NF-κB 전사인자 활성능 측정

RAW-Blue™ 세포를 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 시킨 후

100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물과 660 nm에서 OD값 0.5에 해당하는 유산균을 각각 단독으로

처리하거나 유산균과 시료 추출물을 1:1, 1:0.5, 1:0.25의 비율에 맞춰 복합으로 처리하여 24시간

다시 배양하였다. 배양한 상층액 20 ㎕와 Quanti blue(InvivoGen, USA) 시약 200 ㎕를 혼합하

- 65 -

여 암실에서 10분 반응시킨 후 microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 650 nm에서 흡

광도를 측정하였다.

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

RAW-Blue™ 세포를 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 시킨 후

양성대조군으로 LPS를 100 ng/㎖로 처리하였고, 음성대조군으로 PBS를 처리하였다. 시험군은

100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물과 660 nm에서 OD값 0.5에 해당하는 유산균을 각각 단독으로

처리하거나 시료 추출물과 유산균을 1:1, 1:0.5, 1:0.25의 비율에 맞춰 혼합하여 처리하여 24시간

동안 다시 배양하였다. 배양한 상층액 50 ㎕에 Griess reagent(Promega)Ⅰ(Sulfanilamide

solution)과 Ⅱ(NED solution)를 동량으로 섞어 제조한 시약 100 ㎕를 혼합하여 상온에서 10분

반응시킨 후 microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였

다. Nitric oxide의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

(3) 면역세포 활성물질(Cytokine) 생성량 측정

RAW-Blue™ 세포를 1×105 cell/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 시킨 후

100 ㎍/㎖ 농도의 시료 추출물과 660 nm에서 OD값 0.5에 해당하는 유산균을 각각 단독 처리

군과 시료 추출물과 유산균을 1:1, 1:0.5, 1:0.25의 비율에 맞춘 복합 처리군을 처리하여 다시 24

시간 배양하였다. 24시간 배양한 상층액을 가지고 효소결합면역흡착검사(Enzymelinked

immumosorbent assay, ELISA)를 이용한 ELISA kit(ebioscience, San Diego, California,

USA)로 사이토카인 함량을 측정하였다. 사이토카인(TNF-α와 IL-1β)의 항체가 코팅되어 있는

well plate에 상층액 시료 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 PBS

와 Tween 20(Sigma)을 섞어 만든 washing buffer로 5회 이상 세척하였다. Detection antibody

용액을 넣어 항체와 반응시킨 후, Avidin과 결합된 Horseradish Peroxidase(HRP) 효소를 넣어

상온에서 15분 반응시켰다. 이후, HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상

의 변화를 확인하였다. 이 변화를 통해 사이토카인(TNF-α와 IL-1β) 생성 유무를 판단하였다.

Stop solution(H2SO4)을 넣어 HRP 효소와 TMB 기질의 반응을 종결시킨 후, microplate

reader(SpectraMax M2)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

□ 연구 결과

가. Lactobacillus plantarum 4-25와 콩나물/가죽나무 추출물과의 혼합에 따른 면역활성 측정

(1) NF-κB 전사인자 활성능

Fig. 2-1(A, B)에 나타낸 것처럼 콩나물 추출물의 경우 L. plantarum 4-25 균주와 1:0.25 혼

합비율일 때 가장 높은 시너지 효과를 보였고, 사균과는 모든 비율에서 유의적으로 시너지 효

과를 보였다. 가죽나무 추출물의 경우 L. plantarum 4-25 균주 단독처리만큼 혼합에 의해 높아

지지는 않았다.

- 66 -

(A) (B)

Fig. 2-1. Relative NF-κB activity by mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and L. plantarum 4-25.

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

Lactobacillus plantarum 425 균주와 콩나물 또는 가죽나무 추출물 시료의 혼합에 의한 NO

생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-2에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 균주 단독과 혼합 그룹 모두 유사하여 혼합 효과는 보이지 않았다. 가

죽나무 추출물의 경우 단독처리만큼 NO 생성량이 높지는 않았다.

(A) (B)

Fig. 2-2. Nitric oxide production of mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

L. plantarum 4-25.

(3) 세포활성물질(Cytokine) 측정

(가) TNF-α 분비량 측정

Lactobacillus plantarum 425 균주와 콩나물 또는 가죽나무 추출물 시료의 혼합에 의한

TNF-α 생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-3에 제시하였다. 콩나물 추출물의 경우 TNF-α 생

성량은 생균과 1:0.25 혼합비율일 때 약간 높았지만, 통계적 유의성이 없었고, 가죽나무 추출물

은 사이토카인 생성량 증가에 있어 혼합에 의한 효과는 나타나지 않았다.

- 67 -

(A) (B)

Fig. 2-3. Comparison of TNF-α production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

L. plantarum 4-25 mixture.

(나) IL-1β 분비량 측정

Lactobacillus plantarum 425 균주와 콩나물 또는 가죽나무 추출물 시료의 혼합에 의한 IL-1β

생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-4에 제시하였다. 콩나물과 가죽나무 추출물 둘 다 IL-1β 생

성량에서는 혼합 효과가 나타나지 않았다.

(A) (B)

Fig. 2-4. Comparison of 1L-1β production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

L. plantarum 4-25 mixture.

나. Lactobacillus rhamnosus GG와 콩나물/가죽나무 추출물과의 혼합에 따른 면역활성 측정

(1) NF-κB 전사인자 활성능 측정

Lactobacillus rhamnosus GG 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 NF-

κB 전사인자 활성능의 변화를 본 결과를 Fig. 2-5에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 LGG 사균과 1:0.25 혼합비율일 때만 유의적인 시너지 효과를 나타냈지

만 가죽나무 추출물의 경우 LGG균과의 혼합 효과는 없었다.

- 68 -

(A) (B)

Fig. 2-5. Relative NF-κB activity by mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and L. rhamnosus LGG.

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

Lactobacillus rhamnosus GG 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 NO

생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-6에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 LGG사균과 1:0.25 비율일 때만 유의적으로 높은 시너지 효과를 보였

고, 가죽나무 추출물의 경우 단독처리만큼 높은 효과는 관찰되지 않았지만, LGG균과 추출물

혼합비가 1:0.25일 때 단독과 유사한 수준으로 생성되었다.

(A) (B)

Fig. 2-6. Nitric oxide production by mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and L. rhamnosus LGG.

(3) 세포활성물질(Cytokine) 측정

(가) TNF-α 분비량 측정

Lactobacillus rhamnosus GG 균주와 콩나물 또는 가죽나무 추출물 시료의 혼합에 의한

TNF-α 생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-7에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 TNF-α 생성량은 생균과 사균을 혼합한 효과는 없었지만, 가죽나무 추

출물의 경우 LGG생균과 1:0.5 혼합비율일 때 TNF-α 생성량이 유의적으로 높아지만, LGG 사균

단독처리만큼 높지는 않았다.

- 69 -

(A) (B)

Fig. 2-7. Comparison of TNF-α production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

L. rhamnosus LGG.

(나) IL-1β 분비량 측정

Lactobacillus rhamnosus GG 균주와 콩나물 또는 가죽나무 추출물 시료의 혼합에 의한

IL-1β 생성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-8에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 IL-1β 생성량은 생균과의 혼합 효과는 없었지만, LGG 사균과 1:0.25

혼합비에서 유의적으로 높은 시너지 효과를 보였다. 가죽나무 추출물의 경우는 LGG 사균과의 혼합

에서는 1:0.25 비에서 가장 IL-1β값이 높았지만, 이는 가죽나무 추출물 단독과 유사한 수준이었다.

(A) (B)

Fig. 2-8. Comparison of 1L-1β production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

L. rhamnosus LGG.

다. Weissella cibaria JW15와 콩나물/가죽나무 추출물과의 혼합에 따른 면역활성 측정

(1) NF-κB 전사인자 활성능 측정

Weissella cibaria JW15 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 NF-κB 전사인자 활성능의 변화를 본 결과를 Fig. 2-9에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 생균과 사균 모두 혼합에 의한 NF-κB 활성화 효과는 없었다. 하지만

가죽나무 추출물의 경우는 JW15 균주 단독처리에 비해 혼합에 의해 오히려 활성이 감소되었다.

- 70 -

(A) (B)

Fig. 2-9. Relative NF-κB activity by mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and Weissella cibaria JW15.

(2) Nitric oxide(NO) 생성량 측정

Weissella cibaria JW15 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 NO 생성

량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-10에 나타내었다.

콩나물 추출물의 경우 JW15 사균과 1:0.25 비율로 혼합했을 때 유의적으로 높은 시너지 효

과를 보였지만, 가죽나무 추출물의 경우 자체 활성은 높았지만, JW15균과의 혼합에 의한 차이

는 보이지 않았다.

(A) (B)

Fig. 2-10. Nitric oxide production by mixture of (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and Weissella cibaria JW15.

(3) 세포활성물질(Cytokine) 측정

(가) TNF-α 분비량 측정

Weissella cibaria JW15 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 TNF-α 생

성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-11에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 TNF-α 생성량은 균주 단독처리와 유사하여 생균과 사균을 혼합한 효과

는 없었다. 가죽나무 추출물을 처리한 경우도 역시 균주 단독으로 처리하였을 때만큼의 생성량 증

가는 관찰되지 않았다.

- 71 -

(A) (B)

Fig. 2-11. Comparison of TNF-α production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima

and Weissella cibaria JW15.

(나) IL-1β 분비량 측정

Weissella cibaria JW15 균주와 콩나물과 가죽나무 추출물 시료와의 혼합에 의한 IL-1β 생

성량의 변화를 본 결과를 Fig. 2-12에 제시하였다.

콩나물 추출물의 경우 IL-1β 생성량은 JW15 사균과 1:0.25 혼합비율일 때 유의적으로 가장 높

은 시너지 효과를 보였다. 가죽나무 추출물의 경우 단독으로 처리하였을 때 IL-1β 사이토카인 생성

량이 높았지만, 균주와의 혼합에 의해서는 IL-1β 사이토카인이 생성되지 않았다.

(A) (B)

Fig. 2-12. Comparison of 1L-1β production by (A)soybean sprout/(B)Ailantias altissima and

Weissella cibaria JW15.

이상의 in vitro상 면역활성 기능성 평가 결과를 토대로 양성대조군인 Lactobacillus

rhamnosus GG 균주만큼 Weissella cibaria JW15 사균과 콩나물 추출물 시료를 1:0.25 비율로

혼합한 복합물이 단독으로 처리하였을 때보다 대식세포를 증식시켜 면역 증강 사이토카인들의

생성량을 높일 뿐만 아니라, NO 생성능도 뛰어나 시너지 효과를 보였으므로 면역 증강 복합물

소재로 선정되었다.

- 72 -

3. 면역활성 우수 식물소재의 원료 표준화 연구

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

본 실험에서 사용한 식물소재는 앞선 실험 결과로 선정된 콩나물로 시중에 판매되는 것을

대형마트에서 구입하여 사용하였다. 시료는 동결 건조 과정(5-7 days, 20 torr, rack temp. -4

5℃, trap temp. -70℃)을 거친 후 실험 시작 전에 고압멸균기를 이용하여 멸균한 후(121℃, 15

분) 이용하였다.

나. 세포 배양

본 연구에서 사용한 RAW-Blue™ 세포(InvivoGen, USA)는 10% fetal bovine serum(FBS,

Gibco, Invitrogen)와 1% penicillin-streptomycin을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle

Medium(DMEM, Gibco-Invitrogen) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 계

대는 2일에 한 번씩 시행하였으며, RAW-Blue™ 세포를 활성화시키기 위해 1주일에 한번은

Zeocin™(InvivoGen)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. 양성대조군은 lipopolysaccharide

(LPS, Escherichia coli O11:B4) 100 ng/㎖의 농도를 처리한 것으로 사용하였다.

다. 최종 선발 소재 원료의 표준화 연구

(1) 원료 생산공정도 설계 및 지표성분 설정

콩나물 추출물의 생산을 위한 단위공정 설계를 작성하기 위하여 추출물 제조 과정을 간략한

모식도로 나타내었다. 제조공정 표준화 연구에서 생성된 각각의 추출물의 면역활성을 검증하기

위하여 NF-κB/AP-1 pathway 전사인자 활성화 측정하였고, 세포활성물질(Nitrogen oxide,

IL-1β, TNF-α cytokine)의 생성량을 알아보았다. 그리고 지표성분 설정을 위해 총폴리페놀을

분석하였다.

(2) 원재료 표준화

(가) 부위에 따른 면역활성 비교

콩나물 시료를 자엽(머리부위)과 배축으로 나누어 각각 동결 건조하여 실험에 사용하였다.

분말형태가 된 시료는 무게의 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 교반추출기로 상온(25℃)에서 24

시간동안 170 rpm으로 2회 추출하여 여과지(Advantec No. 6)로 여과한 다음, 회전진공농축기

를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 이렇게 얻어진 추출 건조분말은 -70℃ deep

freezer에 보관하였다.

각각의 추출물의 면역활성을 검증하기 위하여 NF-κB/AP-1 pathway 전사인자 활성화 측정

하였고, 세포활성물질(Nitrogen oxide(NO), IL-1β, TNF-α cytokine)의 생성량을 알아보았다.

그리고 지표성분 설정을 위해 총폴리페놀을 분석하였다.

(나) 지표성분 변화

총폴리페놀 함량 측정법은 Folin-Denis 방법을 변형한 것으로 시료 100 mg을 넣은 100 mL

- 73 -

둥근 플라스크에 증류수를 채우고 초음파로 추출하였다. 이 추출액 1 mL을 취하여 7 mL의 증

류수를 넣고 0.5 mL Folin-Ciocalteu's phenol reagent와 포화 Na2CO3 1 mL을 차례로 가하여

실온에서 60분간 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준물질로는 tannic acid를 사

용하였다.

(3) 콩나물 추출물 소재의 제조공정 표준화

(가) 추출온도의 영향

동결건조과정을 거쳐 분말형태가 된 시료를 무게의 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 교반추

출기로 상온(25℃) 혹은 70℃에서 24시간동안 170 rpm으로 2회 추출하여 여과지(Advantec

No. 6)로 여과한 다음, 회전진공농축기를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 이렇게

얻어진 추출 건조분말은 -70℃ deep freezer에 보관하면서 실험에 사용하였다.

(나) 추출용매의 영향

동결건조과정을 거쳐 분말형태가 된 시료는 무게의 10배의 70% 에탄올, 100% 에탄올 및 3

차 증류수를 첨가하여 교반추출기로 상온(25℃)에서 24시간동안 170 rpm으로 2회 추출하여 여

과지(Advantec No. 6)로 여과한 다음, 회전진공농축기를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조

하였다. 이렇게 얻어진 추출 건조분말은 -70℃ deep freezer에 보관하면서 실험에 사용하였다.

(다) 추출횟수에 영향

동결건조과정을 거쳐 분말형태가 된 시료를 무게의 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 교반추

출기로 상온(25℃)에서 24시간동안 170 rpm으로 1회, 2회, 3회별로 추출하여 여과지(Advantec

No. 6)로 여과한 다음, 회전진공농축기를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 이렇게

얻어진 추출 건조분말은 -70℃ deep freezer에 보관하면서 실험에 사용하였다.

□ 연구 결과

가. 최종 선정 원료에 대한 생산공정도 설계 및 지표성분 설정

(1) 원료 생산을 위한 단위공정 설계

최종 선발된 소재인 콩나물 에탄올추출물에 대한 원료 표준화 연구에 앞서 콩나물 추출물

원료를 제조하기 위한 생산 공정의 모식도를 Fig. 3-1에 나타내었다.

- 74 -

Sample(20 mesh)

↓

Addition of 10 vol. 70% EtOH

↓

Shaking(25℃, 170 rpm, 24h, duplicate)

↓

Vaccum filtration

(Filter paper, ADVANTEC No.6)

↓

Concentration

(EIELA CCA-110)

↓

Freeze drying

(5-7 days, 20 torr, rack: -45℃, trap:-70℃)

Fig. 3-1. Process schematic diagram for production of soybean sprout extract

(2) 지표성분 설정

콩나물 추출물을 제조하는 과정에서 면역활성 평가와 동시에 유용물질의 변화를 살펴보기

위하여 지표성분으로 총폴리페놀 함량을 측정하였다.

나. 원재료 표준화

(1) 부위에 따른 NF-κB/AP1 전사인자 활성능 비교

면역 활성 우수 소재로 선정된 콩나물 시료의 추출조건에 따른 면역 활성 차이를 비교하여

최적의 추출 조건을 확립하기 위하여 시료부위, 추출용매, 추출온도 그리고 추출횟수에 따라

시료를 제조하여 면역 활성을 비교 분석하였다.

먼저 콩나물 시료는 머리부위인 자엽부(Cotyledon)와 그 아래부위인 배축부(Hypocotyl)로 구

분하여 각각 에탄올 추출물을 제조하여 면역활성을 비교하였다. 각각의 시료 부위 추출물과 대

조군의 NF-κB/AP1 전사인자 활성능의 비교 결과는 Fig. 3-2에 제시하였다. 자엽부가 LPS의

비처리한 대조군보다 약 3.5배 활성이 높았고, 배축부는 약 2배정도로 높았으며, 두 부위 간에

는 자엽부가 유의적으로 높은 활성을 보였다.

Fig. 3-2. Comparison of NF-κB/AP1 gene activity of sample's parts in RAW- Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 75 -

(2) 부위에 따른 NO 생성능 비교

NO 생성능을 비교한 결과는 Fig. 3-3에 나타내었으며, LPS를 처리한 대조군이 가장 높은

NO 생성을 보였고, 시료 부위 간에 NO 생성능은 자엽부(2.23±0.02 uM/㎖)가 배축부(1.12±0.05

uM/㎖)보다 유의적으로 더 높은 NO를 생성하였고, 자엽부는 LPS를 처리하지 않은 대조군보

다는 더 높은 NO를 생성하였다.

Fig. 3-3. Comparison of NO production of sample's parts in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(3) 부위에 따른 TNF-α 생성량 비교

사이토카인 중 TNF-α의 생성량을 시료 부위별로 비교한 결과는 Fig. 3-4에 제시하였다. 콩

나물의 두 부위 모두 LPS를 처리하지 않은 대조군보다 높은 생성을 보였고, 앞선 결과들과 마

찬가지로 자엽부(3110.03±5.50 pg/㎖)가 배축부(2985.43±24.70 pg/㎖)보다 TNF-α의 생성이 유

의적으로 더 높았다.

Fig. 3-4. Comparison of TNF-α production of sample's parts in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(4) 부위에 따른 IL-1β 생성량 비교

IL-1β 생성량을 비교해 본 결과는 Table 3-1에 제시하였다. 콩나물 중 자엽부위의 추출물은

IL-1β 생성량이 12.46±3.95 pg/㎖로 배축부(1.06±1.00 pg/㎖)와 대조군(1.78±1.32 pg/㎖)보다 유

의적으로 훨씬 높았다.

- 76 -

Table. 3-1. Comparison of IL-1β production of sample's parts in RAW-Blue cells.

Sample 1L-1β production (pg/㎖)

Control N.D.c)

LPS 1.78±1.32c)

Whole 15.65±2.01a)

Cotyledon 12.46±3.95b)

Hypocotyl 1.06±1.00c)

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

시료부위별의 면역 활성능 평가 실험을 종합하였을 때 면역 활성에 가장 우수한 부위는 자

엽부였으며, 자엽부의 기능성 성분이 면역 활성 기능에 영향을 미치는 것으로 보인다. 전체 부

분과 자엽부를 비교해 보면 NF-κB/AP1 전사인자 활성능의 측정값이 각각 0.29, 0.25(OD

650nm)였고, NO 생성량은 1.40±0.04 uM/㎖와 2.23±0.02 uM/㎖로 자엽부가 더 높았다. 반면에

사이토카인 중 TNF-α의 생성량은 전체부분(3,800.88±558.33 pg/㎖)이 자엽부(3,110.03±5.50 pg/

㎖)보다 높았으며, IL-1β 생성량에서도 전체부분(16.36±0.37 pg/㎖)이 자엽부(12.46±3.95 pg/㎖)

보다 약간 높았다. 따라서 콩나물은 머리부위인 자엽부에 면역 활성과 관련된 성분이 함유되어

있는 것으로 사료된다.

다. 추출물 소재의 제조공정 표준화

최종으로 선정된 면역활성 우수 식물자원 소재를 추출물 소재의 제조 공정 표준화를 위해

추출조건을 달리하여 시험을 수행하였다. 콩나물 시료는 추출용매를 물, 70% 에탄올, 100% 에

탄올로 달리하였으며, 추출온도를 상온(25℃)과 끓는 온도(70℃)로 각각 다르게 하였다. 또한

추출횟수를 1회, 2회, 3회로 나누어 추출물을 제조한 후 대식세포의 활성화 및 총폴리페놀 함

량을 측정하였다.

(1) 추출조건에 따른 대식세포의 활성화 비교

(가) 추출온도의 영향

선정된 콩나물 시료를 상온(25℃)과 에탄올의 끓는점(70℃)으로 추출온도를 달리하여 추출한

추출물을 제조하여 대식세포에 처리하여 면역 활성능을 평가하였다.

먼저, NF-κB/AP1 전사인자 활성능의 결과는 Fig. 3-5에 제시하였다. LPS를 처리한 대조군

만큼의 활성능을 보이지는 않았지만, 25℃와 70℃ 추출물 모두 LPS 비처리 대조군보다는 활성

이 높았으며 25℃에서 추출한 추출물이 70℃ 추출물보다 유의적으로 활성이 더 높았다. 각 추

출물을 세포에 처리하여 생성된 NO의 양은 Fig. 3-6에 제시하였다. LPS를 처리한 대조군이

3.03±0.02 uM/㎖로 가장 높은 NO 생성을 보였으며, LPS를 처리하지 않은 대조군과 각각의 추

출물간의 유의적 차이는 없었다. 추출물간의 대식세포 활성을 알아보고자 사이토카인 생성량을

비교한 실험의 결과는 Fig. 3-7과 Table 3-2에 나타내었다. TNF-α의 생성량을 비교하였을 때

모든 추출물이 LPS를 처리한 대조군(3296.74±3.42 pg/㎖)보다 생성량이 더 많았으며, 특히 2

5℃에서 추출한 경우 3800.88±558.33 pg/㎖로 좀 더 높은 값을 나타내었으나 통계적 유의성은

없었다. 하지만 IL-1β는 25℃에서 추출한 추출물에서만 16.36±0.37 pg/㎖의 생성량을 보였는데,

- 77 -

대조군(1.78±1.32 pg/㎖)보다 훨씬 생성량이 높았다.

추출온도별의 면역 활성능 평가 실험을 종합하였을 때 면역 활성에 가장 우수한 추출온도는

25℃이었다.

Fig. 3-5. Comparison of NF-κB/AP1 activity of extraction temperatures in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Fig. 3-6. Comparison of NO production of extraction temperatures in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Fig. 3-7. Comparison of TNF-α production of extraction temperatures in RAW- Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 78 -

Table 3-2. Comparison of IL-1β production of extraction temperatures

in RAW- Blue cells.

Samples 1L-1β production(pg/㎖)*

Control N.D.

LPS 1.78±1.32b)

25℃ 16.36±0.37a)

70℃ N.D.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(나) 추출용매의 영향

콩나물 시료를 70% 에탄올, 100% 에탄올 및 3차 증류수 등 추출용매를 달리하여 각각 추출

하였으며 동결건조 과정을 거쳐 추출물을 제조하였고, RAW-Blue 세포에 처리하여 면역 활성

능을 평가하였다.

Fig. 3-8에 제시한 결과에서처럼 NF-κB/AP1 전사인자 활성능을 측정한 결과, 70% 에탄올

추출물과 3차 증류수 추출물이 100% 에탄올 추출물보다 활성이 더 높았지만, 두 용매 간에 유

의적 차이는 없었다. 각각의 추출물을 대조군과 비교한 NO 생성량의 결과는 Fig. 3-9과 같다.

70% 에탄올 추출물이 1.40±0.04 uM/㎖로 가장 높은 생성을 보였고, 100% 에탄올 추출물과 3

차 증류수 추출물은 각각 1.17±0.03 uM/㎖와 1.19±0.04 uM/㎖로 유의적 차이는 보이지 않았다.

사이토카인 중 TNF-α의 생성량을 비교해 본 결과는 Fig. 3-10에 제시하였다. 모든 추출물이

LPS를 처리한 대조군보다 더 높은 생성을 보였으며, 100% 에탄올 추출물과 3차 증류수가

70% 에탄올 추출물보다 생성량이 더 높았지만, 용매들 간의 유의적 차이는 없었다. IL-1β 생

성량을 비교해 본 결과는 Table 3-3에 제시하였다. 70% 에탄올 추출물에서는 IL-1β 생성량이

16.36±0.37 pg/㎖로 대조군(1.78±1.32 pg/㎖)보다 유의적으로 높은 값을 나타내었지만, 100% 에

탄올 추출물과 3차 증류수 추출물에서는 IL-1β가 생성되지 않았다.

추출용매별의 면역 활성능 평가 실험을 종합하였을 때 면역 활성에 가장 우수한 추출물은

70% 에탄올 추출물이었다.

Fig. 3-8. Comparison of NF-κB/AP1 gene activity of extraction solvents in RAW-Blue

cells. * Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 79 -

Fig. 3-9. Comparison of NO production of extraction solvents in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Fig. 3-10. Comparison of TNF-α production of extraction solvents in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Table 3-3. Comparison of IL-1β production of extraction

solvents in RAW-Blue cells.

Samples 1L-1β production(pg/㎖)*

Control N.D.

LPS 1.78±1.32b)

Distilled water N.D.

70% EtOH 16.36±0.37a)

100% EtOH N.D.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(다) 추출횟수에 영향

선정된 콩나물 시료는 추출횟수를 1회, 2회, 그리고 3회로 하여 추출하여 얻은 추출물간에

면역 활성능을 비교하였다.

- 80 -

추출물별로 NF-κB/AP1 전사인자 활성능을 비교한 결과는 Fig. 3-11에 제시하였다. LPS를

처리한 대조군이 가장 높은 활성을 보였으며, 추출물에서는 1회와 2회 추출물이 3회 추출물보

다 더 높은 활성을 보였으나 1회와 2회 추출물간의 유의적 차이는 없었다. 추출물간의 NO 생

성을 비교한 결과는 Fig. 3-12에 나타냈다. LPS를 처리한 대조군이 3.03±0.02 uM/㎖로 가장

높은 생성을 보였으며 1회, 2회 그리고 3회 추출물은 각각 1.40±0.11 uM/㎖, 1.40±0.04 uM/㎖,

그리고 1.55±0.15 uM/㎖의 생성량을 보였으나 시료간의 유의적 차이는 없었다. 사이토카인 생

성량을 비교한 실험의 결과는 Fig. 3-13과 Table 3-4에 나타냈다. TNF-α의 생성량을 비교한

결과, LPS를 처리한 대조군보다 추출횟수를 달리하여 제조한 추출물 시료들이 약간 높은 값을

나타내었으나 통계적 유의성은 없었다. 하지만 IL-1β 사이토카인 생성은 2회와 3회 추출물에

서 15.65±2.01 pg/㎖와 20.03±4.79 pg/㎖로 높게 검출되었는데, 특히 3회 추출물이 유의적으로

가장 생성량이 높았다.

추출횟수별의 면역 활성능 평가 실험을 종합하였을 때 면역 활성에 가장 우수한 횟수는 2회

나 3회였으며, 면역 활성에 영향을 주는 성분이 추출횟수가 많아질수록 추출되는 양이 증가되

는 것으로 보인다.

이상의 콩나물 시료에 대한 제조공정 표준화 연구결과를 토대로 높은 면역활성을 갖는 추출

조건은 콩나물의 자엽부를 사용하여 70% 에탄올로 상온에서 3회 추출할 때 높은 활성을 기대

할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3-11. Comparison of NF-κB/AP1 activity of extraction numbers in RAW- Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 81 -

Fig. 3-12. Comparison of NO production of extraction numbers in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Fig. 3-13. Comparison of TNF-α production of extraction numbers in RAW-Blue cells.

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Table 3-4. Comparison of IL-1β production of extraction

numbers in RAW-Blue cells.

Samples 1L-1β production(pg/㎖)*

Control N.D.

LPS 1.78±1.32c)

one time N.D.

two times 15.65±2.01b)

three times 20.03±4.79a)

* Data are expressed as mean ± SD(n=3).

** Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 82 -

(2) 추출조건에 따른 지표성분 변화

콩나물 추출물의 제조조건에 따라 총폴리페놀 함량을 비교한 결과는 Fig. 3-14에 나타내었

다. Fig. 3-14(A)에서처럼 추출온도에 따른 총폴리페놀 함량은 70℃와 상온인 25℃에서 각각

6.72± 0.77 μg/mL와 11.37±0.83 μg/mL로 저온에서 유의적으로 높은 값을 나타내었다. Lee 등

(2005)의 보고에 따르면 올리브 잎의 총폴리페놀 함량이 가장 높게 검출된 조건 역시 80% 에

탄올로 55와 85℃의 고온에서 추출할 때보다 25℃의 상온에서 더 높은 함량을 나타내어 이번

결과와 유사하였다. 그리고 추출용매에 따른 총폴리페놀 함량은 70% 에탄올, 열수, 94% 에탄

올 순으로 11.37±0.83, 9.40±0.92, 그리고 8.27±0.60 μg/mL로 70% 에탄올 추출물로 제조한 경우

가 가장 높았다. 마지막으로 추출횟수에 따른 총폴리페놀 함량은 1회 추출 시 9.24±0.55 μ

g/mL이었고, 2～3회 추출한 경우 11.37±0.83와 10.52±0.50 μg/mL로 그 함량이 높았으나 통계

적 유의성은 없었다.

이상의 결과를 토대로 콩나물 추출물은 제조 조건(추출온도, 용매, 횟수)에 따라 총폴리페놀

함량을 비교한 결과 25℃(상온), 70% EtOH로 2～3회 추출할 때 지표성분인 총폴리페놀 함량

이 높았고, 이는 앞서 수행한 대식세포 활성화에 따른 면역활성 평가와 일치한 결과를 나타내

어 상관성을 보여주었다.

(A) (B)

(C) (D)

Fig. 3-14. Comparison of total polyphenol content in different extraction conditions of

soybean sprouts. (A) tannic acid standard curve for total phenolic content assay, (B)

extract temperature, (C) extract time, and (D) extract solvent

- 83 -

4. 복합물 소재의 면역세포 증식 및 활성화 효능 시험

□ 재료 및 방법

가. 시료 준비

(1) 콩나물 시료

본 실험에서 사용한 식물소재는 앞선 실험 결과로 선정된 콩나물로 시중에 판매되는 것을

대형마트에서 구입하여 사용하였다. 시료는 동결 건조 과정(5-7 days, 20 torr, rack temp. -4

5℃, trap temp. -70℃)을 거친 후 실험 시작 전에 고압멸균기를 이용하여 멸균한 후(121℃, 15

분) 이용하였다.

(2) 유산균 시료

본 연구에 사용된 Weissella cibaria JW15(KACC 91811P) 분리균주는 충북대학교 수의과대

학에서 분양받아 실험에 사용하였다. 균주는 4℃에서 냉장 보관하면서 유산균 증식용 배지인

lactobacilli MRS broth(Difco, USA)에서 2주마다 계대 배양하였으며, 실험에 사용 전까지 멸균

된 50% glycerol를 넣은 배지에 균체를 현탁하여 -70 ℃의 deep freezer에 보관하였다.

나. 마우스 비장세포 분리 및 배양

마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였으며, RPMI 1640 용액으로 세척한 다음 분쇄하여

세포를 유리하였다. 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시킨 후 4℃,

1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 cell pellet을 ACK buffer 에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제

거하였다. 유출된 비장세포는 10% fetal bovine serum와 1% penicillin-streptomycin을 함유하

고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1×106 cell/㎖이 되도록 현탁하여 48 well plate에 각각

500 ㎕을 분주하였으며, 유산균과 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 콩나물 추출물을 각각 넣은 단독

처리군과 유산균과 식물추출물을 1:0.25, 1:0.5, 1:1로 혼합한 복합 처리군,

lipopolysaccharide(LPS)만을 처리한 양성대조군으로 시료를 구분하여 세포에 처리하였다.. 위

와 같이 처리된 세포군들은 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양하였고, 배양액의 상층액

은 -20℃에 보관하여 사이토카인 생성량 측정을 위해 사용하였다

다. 마우스 비장 면역세포의 활성화 기능 평가

비장세포는 FACS(Fluorescence-activated cell sort)를 이용하여 T cells, B cells 및

macrophage의 활성 정도를 분석하였다. FACS 분석은 다음과 같이 수행하였다. 배양한 비장세

포를 모아 trypan blue로 염색하여 살아있는 세포를 측정한 후, FACS medium으로 세척하여

표지하고자 하는 표식자에 대한 단일클론 항체를 각각 첨가하여 ice bath에서 60분간 처리하였

다. T cell는 활성화 바이오마커 분자인 CD25와 CD69의 발현양상을 비교하였고, B cell는 IgD

와 IgM의 발현량과 B220(CD45R) 및 MHC class II(항원전달분자)의 발현량을 분석하였으며,

macrophage의 경우 CD80, CD86(보조자극 분자) 및 MHC class II의 발현 여부를 FACS를 이

용하여 측정하였다.

- 84 -

라. Cytokine 생성량 측정

마우스 비장세포를 분리하여 적혈구를 제거한 후 세포배지에 well당 1×106 cell/㎖씩 첨가하

여 유산균과 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 콩나물 추출물을 각각 넣은 단독 처리군과 유산균과

식물추출물을 1:0.25, 1:0.5, 1:1로 혼합한 복합 처리군, lipopolysaccharide(LPS)만을 처리한 양

성대조군으로 시료를 구분하여 처리하였다. 각 plate는 72시간 후 세포배양액의 상층액으로 효

소결합면역흡착검사(Enzymelinked immumosorbent assay, ELISA)를 이용한 ELISA

kit(ebioscience, San Diego, California, USA)로 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL6, IL10, IL17,

IL12) 생성량을 측정하였다. 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL6, IL10, IL17, IL12)의 항체가 코팅

되어 있는 well plate에 상층액 시료 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층용액을

제거하고 PBS와 Tween 20(Sigma)을 섞어 만든 washing buffer로 5회 이상 세척하였다.

detection antibody 용액을 넣어 항체와 반응시킨 후, Avidin과 결합된 Horseradish

Peroxidase(HRP) 효소를 넣어 상온에서 15분 반응시킨다. 이후, HRP 효소에 대한 기질로

TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 확인한다. 시료에 cytokine(TNF-α, IFN-γ, IL6,

IL10, IL17, IL12)이 존재하면 색상의 변화가 나타나므로, 이 변화를 통해 cytokine(TNF-α,

IFN-γ, IL6, IL10, IL17, IL12)의 생성 유무를 알 수 있다. Stop solution(H2SO4)을 넣어 HRP

효소와 TMB 기질의 반응을 종결시킨 후, microplate reader(SpectraMax M2)를 이용하여 450

nm에서 흡광도를 측정하였다.

□ 연구 결과

가. 마우스 비장 면역세포의 증식능 측정 결과

(1) T 세포의 증식능

분리된 마우스 비장세포에 콩나물 에탄올추출물을 처리하여 72시간 후 CD4+ T cell 증식유도능

을 살펴본 결과는 Fig. 4-1에 제시하였다. Weissella cibaria JW15 사균은 생균에 비해 컸으며 LGG

사균에 비해서도 효능이 좋았다. 그러나 콩나물 추출물 첨가에 의한 상승작용은 관찰되지 않았다.

- 85 -

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

M10

M11

70% EtOH plant extract

JW15 Live cell(LC)

JW15 Dead cell(DC)

LGG Live cell

LGG Dead cell

JW15 LC + extract(1:0.25)

JW15 DC + extract(1:0.25)

LGG LC + extract(1:0.25)

LGG DC + extract(1:0.25)

Control (LPS-stimulated)

Control (Non-stimulated)

Fig. 4-1. Comparison of T-cell proliferation of mixture(LAB : soybean sprout

extract=1:0.25) by flowcytometry

(2) B 세포의 증식능

분리된 마우스 비장세포에 시료를 처리하여 72시간 후 B220+ cells 증식유도능을 살펴본 결과

는 Fig. 4-2에 나타내었다. Weissella cibaria JW15 사균은 생균에 비해 컸으며 LGG 사균에 비해

서도 효능이 좋았다. 그러나, 콩나물 추출물 첨가에 의한 상승작용은 관찰되지 않았다.

- 86 -

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

M10

M11

70% EtOH plant extract

JW15 Live cell(LC)

JW15 Dead cell(DC)

LGG Live cell

LGG Dead cell

JW15 LC + extract(1:0.25)

JW15 DC + extract(1:0.25)

LGG LC + extract(1:0.25)

LGG DC + extract(1:0.25)

Control (LPS-stimulated)

Control (Non-stimulated)

Fig. 4-2. Comparison of B-cell proliferation of mixture by flowcytometry

나. 마우스 비장 면역세포의 활성화 기능 평가

(1) T 세포의 활성능 비교

T 세포(Helper T cell; CD4+ T cell)의 활성능 평가를 위해 마커로서 관련된 표면분자인

CD25와 CD69의 발현량을 측정하였다. 먼저 CD4+ T 세포에서 초기 활성화 지표인 CD25는

활성화된 세포에서 발현되는 고친화성 IL-2 수용체로 CD25의 발현 정도를 조사한 결과는 Fig.

- 87 -

4-3과 같다. LPS를 처리한 대조군이 CD25 발현량이 가장 높았으며, 다음으로 높은 발현을 보

인 것은 Weissella cibaria JW15 생균과 콩나물 추출물 시료(400 ㎍/㎖)를 1:1 비율로 혼합하

여 처리한 복합물이었으나 통계적 유의성은 없었다. 생균의 경우 균주 또는 추출물의 단독물보

다 1:1 비율의 복합물에서 높은 발현을 보였지만, 1:0.5 비율(200 ㎍/㎖)과 1:0.25 비율(100 ㎍/

㎖)에서는 각각 발현이 감소함을 보였다. 반면에 사균의 경우 Weissella cibaria JW15균 단독

처리군과 콩나물 추출물과 1:0.5 비율로 혼합한 복합물에서 CD25의 발현량이 유사하게 높았고,

나머지 복합물에서는 발현량이 감소하였다. 콩나물 추출물 시료의 경우, 농도에 따른 유의적인

차이는 보이지 않았다. 또 다른 CD4+ T cell 활성화 마커인 CD69는 활성화된 세포에서 초기

에 발현되는 것으로 CD69 발현량의 결과는 Fig. 4-4와 같다. 가장 높은 CD69 발현을 보인 것

은 콩나물 추출물 시료만을 400 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우였으며, 콩나물 시료는 농도 의존적

으로 CD69의 발현량도 함께 증가함을 보였다. 또한 JW15 균주 역시 단독으로 처리하였을 때

보다 균주와 시료를 함께 처리하였을 경우 CD69 발현량이 증가하는 것으로 보아 콩나물 추출

물 시료와의 혼합에 의하여 T 세포의 활성화에 있어 상승효과를 나타내었다.

Fig. 4-3. Expression of CD25 in CD4+ T cells of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 88 -

Fig. 4-4. Expression of CD69 in CD4+ T cells of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(2) B 세포의 활성능 비교

B 세포의 활성능 평가는 성숙한 B 세포의 비율을 측정하고 MHC II의 발현량을 측정하여

알아보았다. 먼저 성숙한 B 세포의 비율을 측정한 결과는 Fig. 4-5에 나타내었다. 이 실험은

비장에 존재하는 미성숙한 B 세포(Immature B cell)가 세포활성물질들에 의해 활성화되면 성

숙한 B 세포(Mature B cell)로 분화됨을 측정하였다. 성숙한 B 세포의 비율이 가장 높은 것은

Weissella cibaria JW15 생균을 단독으로 처리한 것이며, 그 다음으로 비율이 높은 것은

Weissella cibaria JW15 사균 단독물로 다른 처리군에 비해 유의적인 차이를 보였다. 그러나

균주와 콩나물 추출물 시료를 혼합한 복합물은 단독물을 처리한 것보다 성숙한 B 세포의 비율

이 감소하였으며, 콩나물 추출물 시료 단독물 역시 농도가 높아짐에 따라 점차 B 세포의 비율

은 감소하였다. 이를 통해 JW15 균주 단독처리가 콩나물 추출물 시료와의 혼합처리보다 미성

숙한 B 세포를 더 활성화시키며, 복합물에 대한 시너지 효과는 볼 수 없었다.

또 다른 B 세포 활성화 마커인 MHC Ⅱ 발현량 측정 결과는 Fig. 4-6과 같다. 가장 높은

발현은 LPS를 처리한 대조군이며, 그 다음으로 콩나물 추출물 시료의 단독처리군으로 농도가

높아짐에 따라 발현량이 점차 증가함을 보였지만 통계적 유의성은 없었다. JW15 균만 처리한

경우는 균주 단독물보다 균주와 콩나물 추출물 시료를 혼합한 복합물에서 MHC Ⅱ 발현이 증

가하였는데, 사균과의 혼합물에서만 유의적으로 증가하는 경향을 보였지만 대조군과 비교 시

그다지 뚜렷한 활성을 나타내지는 않았다.

- 89 -

Fig. 4-5. Expression of B220+ IgM+ in B cells of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

Fig. 4-6. Expression of MHC Ⅱ+ in B cells of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

(3) Macrophage의 활성능 비교

CD11b+ macrophages의 활성능은 CD86과 MHC Ⅱ의 발현량을 측정하여 평가하였다. 먼저

대식세포 활성화 마커인 CD86 발현을 본 결과는 Fig. 4-7에 제시하였다. LPS를 처리한 대조

군에서만 유의적으로 가장 높은 발현을 보였고 Weissella cibaria JW15 사균과 콩나물 추출물

시료를 혼합한 복합물에서 약간 발현량이 증가하는 경향을 나타냈지만, 생균 또는 사균 단독물

- 90 -

과 균주와 시료를 혼합하여 처리한 복합물 간에 통계적 유의성은 없었다. 콩나물 추출물 시료

의 경우 농도가 높아져도 CD86의 발현량은 변화가 없었다.

대식세포가 활성화되면 MHC class Ⅱ 단백질의 발현량이 증가하는데 이 결과는 Fig. 4-8과

같다. 모든 군은 대조군과 유사하게 높은 발현량을 보였으나, 그 중에서 Weissella cibaria

JW15의 생균과 사균을 모두 단독으로 처리한 것과 사균과 콩나물 추출물 시료를 1:1로 혼합하

여 처리한 복합물에서 MHC classⅡ 발현량이 증가하였으나 통계적인 유의성이 낮아 시너지

효과는 없었다. 콩나물 추출물시료를 단독으로 처리한 결과는 농도가 높아짐에 따라 MHC

classⅡ 발현은 점점 낮아졌다.

위의 결과를 종합하여 보면, T 세포의 활성화 마커와 관련된 표면분자인 CD25와 CD69의

발현량의 경우, Weissella cibaria JW15 균주를 단독으로 처리한 단독물보다 균주와 콩나물 추

출물을 1:1로 혼합한 복합물에서 발현량이 더 증가함으로 시너지 효과를 볼 수 있었다. 반면에

B220+ B cell의 활성능의 평가의 결과는 Weissella cibaria JW15 사균 단독물이 가장 높은 비

율이었으므로, Weissella cibaria JW15 사균이 B 세포를 활성화하여 성숙한 B 세포로 많이 분

화시킨다는 것을 알 수 있었다. 또 다른 B 세포 활성화 마커인 MHC Ⅱ 발현량은 콩나물 추

출물 단독물이 균주와의 복합물에 비해 더 높아 혼합에 의한 시너지 효과는 관찰되지 않았다.

대식세포의 활성능 비교 결과, CD86 발현량은 균주 단독으로 처리한 것과 균주와 시료를 혼합

하여 처리한 복합물과의 유의적 차이는 보이지 않았으며 MHC class Ⅱ 단백질의 발현량은 복

합물보다 균주 단독물에서 더 높았다. 따라서 콩나물 추출물과 JW15 균주가 비장세포의 활성

화에 미치는 영향을 살펴보았을 때 JW15 균주는 생균과 사균 모두 면역세포를 활성화시켜 면

역 증강 효과를 보였으며, 고농도로 콩나물 추출물 시료를 혼합할 경우 T 세포를 활성화시켜

약간의 면역 증강 상승효과를 기대할 수 있었다.

Fig. 4-7. Expression of CD86 in CD11b+ cell of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

- 91 -

Fig. 4-8. Expression of MHC in CD11b+ cell of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Different letters at the top of the bars are significantly different(p<0.05).

다. 면역세포 활성물질(Cytokine) 생성량 측정

(1) IL-6 생성량 측정

IL-6는 면역 자극 시 T 세포와 대식세포에 의해 분비되는 사이토카인의 일종이다. 비장세포

에 Weissella cibaria JW15 균주와 콩나물 시료를 단독 또는 복합으로 처리하여 IL-6 생성량

을 측정한 결과는 Fig. 4-9에 제시하였다. LPS를 단독으로 처리한 대조군의 IL-6 생성량이 가

장 높았으며, 사균 JW15과 생균 JW15을 단독으로 처리 시 순차적으로 생성이 높았지만, 콩나

물 시료를 단독으로 처리한 경우에는 시료의 농도를 높여도 IL-6은 거의 생성되지 않았다. 균

과 시료를 혼합한 복합물을 처리하였을 경우 단독으로 처리한 것보다 오히려 IL-6 생성이 감

소하는 것으로 보아 복합물의 시너지 효과는 없었다.

- 92 -

Fig. 4-9. Comparison of 1L-6 production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

(2) TNF-α 생성량 측정

TNF-α는 대식세포가 활성화에 의해 생성되며, CD4+ T 세포나 NK 세포 등 다른 세포들에

의해서도 생성되기도 하며 주된 역할은 면역 세포를 조절하는 것이다. TNF-α 생성량을 측정

한 결과는 Fig. 4-10에 나타내었다. JW15 사균과 생균을 단독으로 처리하였을 때 가장 높은

생성을 보였으며, 대조군보다도 유의적으로 훨씬 높은 생성량을 나타내었다. 균과 시료를 혼합

한 복합물을 처리하였을 경우 단독물보다 TNF-α 생성량이 감소함을 보였으며, 시료를 단독으

로 처리하였을 때에는 시료의 농도가 증가하여도 TNF-α는 거의 생성되지 않았다. 결과적으로

균주를 단독으로 처리하는 것이 TNF-α 생성량을 높일 수 있었으며, 균주와 시료를 혼합한 복

합물의 시너지 효과는 없었다.

Fig. 4-10. Comparison of TNF-α production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

(3) IFNγ 생성량 측정

IFNγ는 T cell과 NK cell에서 분비되며 세포매개성 면역반응을 주도하는 사이토카인이면서

선천성 면역에 주로 관여하는 대식세포 활성화를 증강시키며, MHC Ⅱ를 발현을 유도한다.

IFNγ 생성량을 측정한 결과는 Fig. 4-11과 같다. JW15 사균을 단독으로 처리하였을 시 생성

량이 가장 높았고, JW15 생균도 높은 생성을 보였다. 균과 시료를 혼합한 복합물을 처리하였

을 경우 균 단독으로 처리하였을 때보다 IFNγ 생성량은 감소하였다. 반면에 시료를 단독으로

처리하였을 경우 시료의 농도가 증가하여도 IFNγ의 생성이 거의 되지 않았다. 결과적으로 균

주를 단독으로 처리하였을 시 IFNγ의 생성을 높일 수 있었다.

- 93 -

Fig. 4-11. Comparison of IFNγ production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

(4) IL-10 생성량 측정

IL-10은 면역 조절과 염증에 관여하는 사이토카인으로 항체 생성을 높여주고, NF-κB 활성

을 조절하며, JAT-STAT 신호 전달계를 조절한다. IL-10의 생성량은 Fig. 4-12에 제시하였다.

LPS를 처리한 대조군의 IL-10 생성량이 가장 높았으며, 균주를 단독으로 처리한 단독물과 균

주와 시료를 1:1 비율과 1:0.5 비율로 혼합하여 처리한 복합물간의 IL-10 생성량의 유의적인

차이는 나타나지 않았다. 콩나물 추출물을 단독으로 처리하였을 때에는 시료의 농도에 관계없

이 IL-10의 생성량이 거의 미비하였기 때문에 균주와 시료의 시너지 효과는 나타나지 않은 것

으로 보인다.

- 94 -

Fig. 4-12. Comparison of IL-10 production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

(5) IL-17 생성량 측정

IL-17은 염증성 사이토카인으로 외부에서 병원균이 침입하였을 경우 면역 시스템을 반응시

키는 역할을 하며, TNF와 IL-1과 함께 상승작용을 하는 것으로 알려져 있다. IL-17의 생성량

은 Fig. 4-13과 같다. JW15 생균을 단독으로 처리하였을 때보다 콩나물 추출물 시료를 1:1 비

율과 1:0.5 비율로 혼합한 복합물을 처리하였을 경우 IL-17의 생성량이 훨씬 높았지만, 사균의

경우 단독물과 혼합물의 생성량은 비슷하였다. 콩나물 추출물 단독물의 경우, 모든 농도에서

IL-17이 아예 생성되지 않았다. 따라서 JW15균주와 콩나물 농도를 100 ㎍/㎖로 혼합한 복합물

에서 단독물에서 나타나지 않은 IL-17이 생성된 것은 JW15 생균이 콩나물과 혼합되면서 T 세

포의 활성화를 촉진하여 더 많은 IL-17을 생성한 것으로 사료된다.

Fig. 4-13. Comparison of IL-17 production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

(6) IL-12 생성량 측정

IL-12는 T-cell stimulating factor로 T cell의 기능과 성장을 도와주며, IFNγ와 TNF-α의

생성을 활성화한다. IL-12의 생성량을 측정한 결과는 Fig. 4-14에 제시하였다. 가장 높은

IL-12의 생성을 보인 것은 JW15 생균을 처리한 것이며, JW15 생균과 콩나물 추출물 시료를

1:1 비율로 혼합한 복합물에서 단독물에 비해 조금 높았으나 단독물과 비교 시 통계적 유의성

은 없었다. 반면에 JW15 사균의 경우, 생균보다는 매우 낮은 생성량을 보였으나 사균 단독물

과 시료와의 복합물에서의 생성량은 비슷하였으며, 콩나물 시료는 농도에 상관없이 IL-12의 생

성은 나타나지 않았다. 결과적으로 JW15 균주를 생균으로 단독 처리하였을 때 IL-12의 높은

생성을 보였다.

- 95 -

Fig. 4-14. Comparison of IL-12 production of Weissella cibaria JW15 single/mixture in

spleen cells. Data are expressed as mean ± SD(n=3). Different letters at the top of the

bars are significantly different(p<0.05).

이상의 사이토카인 생성 측정 결과를 토대로 Weissella cibaria JW15 균주는 콩나물 추출물

시료와 혼합한 복합물보다 단독으로 처리하였을 경우 비장세포를 활성화 시켜 면역 증강 사이

토카인들의 생성량을 높였다.

- 96 -

3절 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구

(1협동과제)

1. 선발된 유산균주의 생리학적, 면역활성 특성조사

□ 재료 및 방법

가. 다양한 유산균 확보

기존에 확보한 유산균 외, 사람의 장관, 발효식품, 유제품 등에서 다양하게 분리하였고, LBS,

BS, TATAC(선택배지)와 BL(비선택배지)에서 37℃ 48시간 혐기배양하여 Lactobacillus,

Enterococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, Leuconostoc 등 유산균군을 선발하였다. 선발한

균주들은 carbohydrate fermentation test, MIS system, API kit를 통해 동정하였고 최종적으

로 16s rRNA sequence 분석을 통해 균종을 동정하였다.

나. 유산균주의 생리학적 특성조사 연구

(1) 내산성 및 내담즙성 검사

유산성의 내산성을 평가하기 위하여 분리된 균주들을 EGF broth (pH 7.0)에 접종하고, 48시

간 혐기배양하였다. Lactobacillus spp.와 Sterptococcus (Enterococcus)는 pH 2 ～ pH 2.5,Bifidobacterium, Pediococcus, Leuconostoc은 pH 2.5 ～ pH 3.5의 broth에 배양액 1%를 접종

하고 37℃에서 3시간 혐기배양한 후, 생존한 균주를 내산성 균주로 판정하였다.

0.15% ～ 2% Oxgall (pH 7.0)이 첨가된 배지에 유산균 배양액을 접종 하여 혐기배양 후 생

존한 균주를 내담즙성 균주로 판정하였다(Ryu et al., 2009).

(2) 내열성 검사

Lactobacillus, Streptococcus (Enterococcus)의 경우 60℃～80℃에서 15분간,

Bifidobacterium 균주는 60℃～70℃에서 5분간 노출 시킨 후, 배지에 도말한 후 혐기배양 하였

다. 배양 후 집락이 형성된 균주는 내열성 균주로 판정하였다(Ryu et al., 2009).

(3) 장내 정착성 검사

Caco-2 cell은 사람의 결장 선암종에서 유래되는 장관내피세포로서 한국생명공학연구원으로

부터 분양받았다. Cell은 20% inactivated fecal calf serum과 0.2% penicillin/streptomycin을 첨

가한 DMEM에서 CO2 incubator (95% air, 5% CO2)를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 부착능

시험을 위해 T75 flask에 cell을 분주하고 격일마다 배지를 교환하였다. 배양한 cell을 37℃에서10분동안 trpsin을 처리한 후 hemocytometer로 cell의 수를 세어 Caco-2 cell의 농도를 계산하

였다. cell의 농도가 1.0×105cell/ml가 되도록 분주하고 완전한 monolayer가 형성될때까지 배양

하였다. DMEM 0.5ml와 혼합한 유산균(0.5ml; 1.0×109 CFU/ml in PBS)을 Caco-2 cell에 접

종한 후 37℃에서 3시간 배양하였다. 배양 후 PBS로 5회 세척하고, methanol로 5분간 고정하

였다. Gram stain을 거친 cell을 광학현미경(× 1,000)으로 관찰 하여 50개의 Caco-2 cell에 부

- 97 -

착한 유산균의 수를 10개의 시야에서 계측 후, 5개의 Caco-2 cell당 부착한 유산균 수의 평균

값을 계산 하였다(Ryu et al., 2009).

(4) 병원균 억제능 검사

E. coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus 균주와 같은 병원성 세균을 사용하였

다. 유산균을 배지에 2μl 점적하고 spot이 형성되도록 30℃에서 24시간 혐기배양하였다. 그 후

유산균이 배양된 배지에 7ml의 Brain heart infusion agar(0.7%)와 혼합된 병원균을 pouring

하여 30℃에서 24시간 혐기적으로 배양한 후 억제환을 측정하였다. Spot 주위로 형성된 억제환의 직경을 mm단위로 측정함으로써 병원균 억제정도를 평가하였다(Ryu et al., 2009).

다. 유산균주의 면역활성 특성조사 연구

(1) 시험균주 준비

Bifidobacterium 속은 BL broth, 나머지 유산균은 MRS broth를 사용하였다.

(2) 세포 배양 및 RAW 264.7 activation

한국세포주은행으로부터 분양 받은 RAW 264.7 macrophage cell은 10% fetal bovine

serum(FBS; Gibco Laboratories)와 100unit/mL의 streptomycin과 penicillin(Gibco

Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; PAA, Austria) 배지를

사용하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다. 염증 반응 모델은 각 well 당 1㎍/mLlipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)를 처리하였으며, 대조군은 PBS(pH 7.2) 처리하였다

(Choi et al., 2012).

(3) Nitrite oxide (NO) 측정

RAW 264.7 cell을 5.0×105cell/ml로 접종하여 유산균과 양성대조군으로 처리한 LPS, 음성대

조군으로 처리한 PBS 배양액을 각각 회수하여 Griess reagent system (Promega, USA)을 사

용하여 NO를 측정하였고 산화질소 (NO) 농도는 아질산나트륨 표준곡선 (0-100μM)을 이용하

여 계산하였다(Choi et al., 2012).

(4) IL-1β와 TNF-α 측정RAW 264.7 cell을 5.0×105cell/ml로 접종한 후 세포가 안정되면 유산균과 LPS 처리 후 48

시간 후에 배양액을 회수한 후 IL-1β, TNF-α ELISA kit (eBioscience, San Diego)를 이용하

여 3회 반복 측정하였다(Choi et al., 2012).

(5) NF-κB 활성측정RAW BLUE cell은 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco Laboratories)와, 100unit/mL의

streptomycin과 penicillin (Gibco Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium

(DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하였고 Positive control은 well 당 100ng/mL의

lipopolysaccharide(LPS; Sigma)를 처리하였다(Ahn et al., 2013).

- 98 -

□ 연구결과

가. 다양한 유산균 확보

Probiotics용 우수균주로 실험실에서 확보된 유산균주 이외, 사람 장관, 김치 등의 발효식품,

유제품, 시판유산균, 시판생균제 등에서 생균제로서의 활성이 높은 유산균주를 분리, 배양하여

51균주 유산균주를 확보하였다. Lactobacillus 13, Enterococcus 12, Bifidobacterium 9,

Streptococcus 7, Leuconostoc 6, Pediococcus와 Weissella가 2균주씩 총 51균주를 확보하였

다.

나. 유산균주의 생리학적 특성조사 연구

확보된 우수유산균주의 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내정착능, 병원성세균 억제능 등과 같은

생리학적 특성조사를 실시한 연구 결과를 Table 1-1에 나타내었다.

본 실험에 사용한 대부분의 균주는 높은 내산성과 내담즙성을 나타내었으며, 내열성과

Caco-2 cell에 대한 장내정착성은 균주에 따른 특성이 뚜렷하게 나타났다. 병원성 세균에 대한

억제능 시험 또한 균주에 따른 다양한 특성을 나타내었으며, 균주별 특성조사의 결과는 Table

1-1과 1-2에 나타내었다.

- 99 -

Table 1-1. Characteristics of selected lactic acid bacteria used in this studies.

1) Acid tolerance test carried out into pH 2.0~2.5 (Lactobacillus and Streptococcus) or pH 2.5~3.5 (Bifidobacterium), Bile tolerance

test (0.3% oxgall), Heat resistance (60~80℃, 5~15 min)2) Not determined.

No Strain

Tolerance to1)

Adhesion

to Caco-2

Antimicrobial activity to

Acid Bile Heat E. coliSal.

enteritidis

Sta.

aureus

1 CUB30 ++ ++ - + - - -

2 CUB7 + ++ - ++ - + -

3 CUB26 + + - + - - -

4 CUB36 + + - - + - -

5 CUB26-S + + - - + - -

6 KBB5-22 + + - - + - ND2)

7 BIF-4 ++ + - + + + -

8 KBB1-26 + + - ++ ++ +++ +++

9 CUB40 + + - + ND ND ND

10 KSB3-5 + + - +++ +++ ++ +

11 CUL20-GB + + ++ + ND ND ND

12 Streptococcus5 + + + + ND ND ND

13 CUL10-GL + + ++ - - - -

14 CUB19-1 ++ + + + + - -

15 CUB23-1 ++ + + ++ - + ND

16 CUL10-GS + + + - - - -

17 CUL13-GB + + + + + + ND

18 CUL20-WL + + + + - - -

19 CUL21-GL + + + ++ - - -

20 CUL24-GL + + + - - - -

21 CUL24-WL + + + + - + -

22 CUL2-GB ++ + + ++ - - -

23 Lac37 ++ + + - - - -

- 100 -

Table 1-2. Characteristics of selected lactic acid bacteria used in this studies.

1) Acid tolerance test carried out into pH 2.0~2.5 (Lactobacillus and Streptococcus) or pH 2.5~3.5 (Bifidobacterium), Bile tolerance test (0.3%

oxgall), Heat resistance (60~80℃, 5~15 min)2) Not determined.

No Strain

Tolerance to1) Adhesion

to Caco-2

Antimicrobial activity to

Acid Bile Heat E. coliSal.

enteritidisSta. aureus

24 CUL39 + + + - ++ ++ +

25 KLB5-21 + + ++ - +++ +++ +++

26 KSB3-5 + + - +++ +++ ++

27 KLB5 27 + + - +++ ++ ++

28 L. M7558 + + + - - - -

29 L. 4-25 ++ + + + ND ND ND

30 L. 76 ++ + + + - - -

31 Lac ll + + + - + - -

32 CUL22-GB + + - - - - +

33 CUL26-WS + + + ++ - - +

34 LGG ++ ++ - ++ ND ND ND

35 DH33 ++ + - ND ND ND ND

36 WK18 ++ + - ND ND ND ND

37 GY17 ++ + - ND ND ND ND

38 Leuconostoc 5 + + - ND ND ND ND

39 DH34 ++ + - ND ND ND ND

40 SE34 ++ + - ND ND ND ND

41 K23-2 + ++ - ++ + + +

42 CUL20-GS ++ ++ + + - - -

43 ST KCTC 3778 + + + - ND ND ND

44 ST KCTC 3779 + + - + ND ND ND

45 ST KCTC 3780 + + + + ND ND ND

46 ST KCTC 3781 + + - - ND ND ND

47 ST KCTC 3782 + + - - ND ND ND

48 ST KCTC 3783 + + - - ND ND ND

49 ST-J-Japan ++ ++ + ++ - + -

50 JW15 + + + ND ND ND ND

51 GY11 + + + ND ND ND ND

- 101 -

Table 1-3. Characteristics of selected lactic acid bacteria used in this studies.

No Strain

Tolerance to1) Adhesio

n

to

Caco-2

Antimicrobial activity to

Aci

dBile Heat E. coli

Sal.enteritidis

Sta.aureus

L.mono-cytogenes

1 CUB362) + + + + - + + +

2 Bif4 - + - + + + + +

3 CUB7 + + + + + + + +

4 Lactobacillus 4-25 + + + - + + + +

5 KBB5-22 - + - - + + + +

6 Lactobacillus 76 + + + - + + + +

7 CUL20-WL + + - - + + + +

8 CUL20-GB + + - - + + + +

9 CUL22-GB + + + - + + + +

10 CUB23-1 + + + - + + + +

11 JW15 - + + + + + + +

1) Acid tolerance test carried out into pH 2.0, Bile tolerance test (0.3% oxgall), Heat resistance (70~80℃, 5~20 min)2) CUB36 (Meiji Co., Japan), CUB7 (Chr. Hansen, Denmark), CUL20-WL (Canada, Canada), CUL22-GB (Lifeplan, UK),

CUB23-1(Bifodan, Denmark)

다. 유산균주의 면역활성 특성조사 연구

51균주의 유산균주를 사용하여 면역활성을 스크리닝하기 위하여 Nitrogen oxide(NO), IL-1,

TNF-α와 같은 cytokine의 활성을 측정하였다. 아래의 Table 1-4～Table 1-9의 결과에서처럼

총 6차에 나누어 면역활성을 측정하였으며, 면역활성능력이 우수한 4균주와 면역억제활성이 우

수한 2균주를 선발하였다. 면역활성능력이 우수한 4균주는 유아 장관 분리 Bifidobacterium longum

(KBB1-26)과 Bifidobacterium breve (KBB5-22), 김치 분리 Lactobacillus plantarum (4-25)과 Weissella cibaria

(JW15)이 선발되었고 면역억제활성이 우수한 2균주는 성인의 장관에서 분리된 Bifidobacterium

longum (BIF-4)과 김치에서 분리된 Lactobacillus plantarum (76)이 선발되었다. 면역반응에서

중요한 역할을 하는 전사조절인자 NF-κB 활성조절능을 측정한 결과는 Fig. 1-1부터 Fig. 1-3

에 나타내었다.

- 102 -

Table. 1-4. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Strain IdentificationNO

production

IL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 1.07±0.12 70.00±2.29 382.22±23.02

PBS+L100 or

L1000Positive control 11.67±0.31 1162.67±15.28 1272.33±63.75

LGG Lac. rhamnosus GG 2.47±0.12 70.50±0.50 1371.50±86.93

WK18 Leuconostoc kimchii 4.67±0.64 532.33±8.81 1350.17±96.46

DH33 Leuconostoc citreum 1.13±0.23 69.50±4.77 1263.17±64.35

DH34 Leuconostoc mesenteroides 7.80±0.72 249.67±3.55 1327.33±75.80

JW15 Weissella cibaria 18.00±0.72 478.83±5.35 1171.83±52.25

SE34 Leuconostoc mesenteroides 1.40±0.40 49.33±2.75 1339.33±55.52

GY11 Weissella koreensis 2.53±0.23 430.50±22.77 1708.00±16.71

GY17 Leuconostoc mesenteroides 0.80±0.20 158.50±4.77 1232.67±62.26

- 103 -

Table. 1-5. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Strain Identification NO productionIL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 0.07±0.12 42.60±1.32 212.83±11.25

PBS+L100 or

L1000Positive control 18.22±0.12 89.00±6.00 1223.83±20.74

KBB5-22 Bifidobacterium breve 10.11±0.12 60.33±8.81 1184.23±78.36

BIF-4Bifidobacterium

longum-0.64 . .

KBB1-26Bifidobacterium

longum5.56±0.23 58.09±6.80 1196.10±112.14

Lac.4-25 Lac. plantarum 12.67±0.20 144.91±3.50 1192.12±104.61

Lac. 76 Lac. plantarum 0.33±0.35 . .

KLB5 27 Lactobacillus gasseri 1.44±0.12 44.00±1.00 1209.50±49.67

Lac37 Lactobacillus casei 0.11±0.12 . .

KLB5-21 Lac. fermentum 0.33±0.00 . .

Lac. ll Lac. plantarum 0.33±0.00 . .

KSB3-5 Lactobacillus gasseri 1.22±0.12 . .

Lac.M7558 Lactobacillus lactis 6.67±0.20 52.64±2.06 1475.90±85.47

Leuconostoc 5 Leu. mesenteroides 7.78±0.31 52.64±2.06 1459.97±98.58

K23-2 Ped. pentosaceus 2.89±0.12 48.51±1.27 1506.5±164.49

streptococcus5 Enterococcusfaecium 7.56±0.23 46.40±12.28 1174.67±45.08

KSB3-5 Enterococcusfaecalis 0.67±0.00 . .

- 104 -

Table. 1-6. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Table. 1-7. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Strain IdentificationNO

production

IL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 2.07±0.20 46.7±5.03 2.33±1.89

PBS+L100 or

L1000Positive control 29.13±0.12 228.3±44.81 1253.83±6.79

CUL39 Lactobacillusdelbrueckii 19.00±0.12 16.7±79.48 1253.65±9.10

CUL2-GBLactobacillus

acidophilus12.73±0.83 139.3±53.11 1248.32±18.91

CUL10-GL Enterococcus faecium 12.00±0.31 -98.0±12.17 1290.48±67.14

CUB7Bifidobacterium

animalis15.07±0.60 214.3±63.61 1284.82±25.82

CUB36Bifidobacterium

animalis32.80±1.21 301.3±64.81 1229.32±16.92

ST KCTC

3778

Streptococcus

thermophilus19.07±0.20 308.3±112.50 1201.15±79.00

ST KCTC

3779

Streptococcus

thermophilus12.33±0.12 238.0±20.07 1221.65±29.61

ST KCTC

3780

Streptococcus

thermophilus19.27±0.53 288.3±93.52 1236.65±25.34

Strain IdentificationNO

production

IL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 2.07±2.24 20.54±24.08 287.75±132.17

PBS+L100 or

L1000Positive control 34.34±1.64 75.04±20.16 1193.15±80.56

CUL26-WS Lactobacillus rhamnosus 5.82±0.16 -6.44±0.00 1228.90±52.67

CUB26 Bifidobacterium animalis 42.52±0.39 6.56±12.67 1209.70±68.29

CUB40 Bifidobacterium longum 16.61±0.32 8.69±24.62 1234.59±14.39

ST KCTC 3781 Streptococcus thermophilus 21.95±0.48 23.07±12.70 1253.72±83.88

ST KCTC 3782 Streptococcus thermophilus 22.64±1.45 27.20±4.45 1258.90±41.94

ST KCTC 3783 Streptococcus thermophilus 17.18±0.00 20.10±1.05 1222.86±55.35

ST-J-Japan Streptococcus thermophilus 21.95±0.48 16.77±6.15 -160.99±0.00

- 105 -

Table. 1-8. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Table. 1-9. Effect of Lactic acid bacteria on NO, IL-1β and TNF-α production in RAW

264.7 murine macrophage cell.

Strain Identification NO productionIL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 2.20±0.20 0.5 ±7.78 575.67± 65.05

PBS+L100 or

L1000Positive control 24.53±0.12 137.0±12.73 2508.70± 256.17

CUL10GS Enterococcus faecium 5.47±0.12 34.0±35.79 16927±416.17

CUL13GB Enterococcus faecium 3.33±0.42 39.7±11.50 16680.3± 190.09

CUL20WL Enterococcus faecium 11.73±0.61 108.0±2.83 19217.0± 785.45

CUL20GSPediococcus

pentosaceus11.20±0.53 35.5±19.9 22123.7± 1965.82

CUB19-1 Enterococcus faecium 9.33±0.31 49.7±31.56 19430.3± 1320.01

CUB30Bifidobacterium

animalis12.93±0.61 64.7±31.10 19520.3± 1342.40

Strain Identification NO productionIL-1β

production

TNF-α

production

PBS Negative control 3.61±0.42 17.5±0.71 220.73±16.60

PBS+L100 or

L1000Positive control 18.16±1.81 58±0.00 1230.24±73.54

CUL20 - GB Enterococcus faecium 2.24±0.00 -215.67±11.50 897.92±36.49

CUL21 - GL Enterococcus faecium 4.76±1.65 -221±4.36 634.9±86.00

CUL22 - GB Lactobacillus rhamnosus 8±0.62 -236.33±5.67 191.58±40.17

CUL24 - WL Enterococcus faecium 5.99±0.62 -211.33±19.73 683.21±29.69

CUL24 - GL Enterococcus faecium 5.17±0.12 154.66±89.44 729.64±68.17

CUB23 - 1 Enterococcus faecium 13.13±0.59 96±55.15 1115.2±126.01

CUB26- SBifidobacterium

animalis9.05±0.12 -74.67±29.19 1044.62±74.56

- 106 -

Fig. 1-1. Effect of Lactic acid bacteria on NF-κB production in RAW BLUE cell.

NC; Negative control, PC 100; Positive control (PC 100 means LPS at 100ng/mL). Data are

mean±SD values of triplicates.

Fig. 1-2. Effect of Lactic acid bacteria on NF-κB production in RAW BLUE cell.

NC;Negative control, PC 100; Positive control (PC 100 means LPS at 100ng/mL). Data are

mean±SD values of triplicates.

- 107 -

Fig. 1-3. Effect of Lactic acid bacteria on NF-κB production in RAW BLUE cell.

NC;Negative control, PC 100; Positive control (PC 100 means LPS at 100ng/mL). Data are

mean±SD values of triplicates.

2. 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 면역활성최적화 및 검증연구

□ 재료 및 방법

가. 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 면역활성 검증 연구

(1) 사용한 우수균주 및 배양 준비

우수균주와 식품유래 혼합배양물의 면역활성 검증 연구에 사용한 유산균은 screening을 통

해 면역활성이 우수하였던 Weissella cibaria JW15와 Lactobacillus plantarum 76을 검증연구

실험에 사용하였다.

우수균주의 배양법은 MRS broth 배지에 전 배양액의 1%를 접종한 후, 37℃에서 17시간 배

양하였다. 2회 계대 배양을 걸쳐 배양액 전체를 12,000 rpm에 10분간 원심 분리하여 균체를 회

수하였다. 회수한 균체를 멸균된 phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2)으로 2회 세척 후,

멸균된 PBS를 1㎖ 추가하여 voltexing 하고, 110℃에서 15분간 처리한 다음 1.0×108cfu/㎖로맞추어 활성 측정용 시료로 사용하였다.

(2) 식물유래물질 시료 준비

증식촉진능이 우수한 두류의 서리태와 곡류의 백미 농축액을 농도별로 준비하여, 면역활성이

우수한 Weissella cibaria JW15와 Lactobacillus plantarum 76을 혼합하여 시료로 사용하였다.

주관연구기관에서 제공 받은 열수추출 서리태, 흑태, 우엉을 면역활성이 우수한 Weissella

cibaria JW15와 혼합하여 면역활성을 검증하였다.

- 108 -

(3) 세포 배양

한국세포주은행으로부터 분양 받은 murine macrophage 세포인 RAW 264.7 cell을 10% fetal

bovine serum과, 100unit/㎖의 streptomycin과 penicillin이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 3

7℃, 5% CO2조건에서 배양하고 cytokine 및 nitric oxide (NO) 생성에 미치는 영향을 알아보기

위하여 사용하였다. Invivogen의 RAW BLUE cell은 NF-κB를 측정하기 위한 세포로 위의

RAW 264.7 cell과 동일한 조건에서 배양하였고 4~5회 계대 후 zeocin 항생제를 처리 후 사용

하였다(Ahn et al., 2013).

(4) Nitric oxide(NO) 측정

NO의 측정은 Promega사의 Griess reagent system을 사용하여 측정하였다. 96-well plate에

배양액 50㎕를 넣고 Griess reagentⅠ(NED solution)과 Griess reagentⅡ (Sulfanilamide solution)를 동량으로 섞어 넣고, 10분간 반응 후 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 540nm에서 측

정하였으며 산화질소 (NO)의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선 (0-100 μM)을 이용하여 계산하였다(Choi et al., 2012).

(5) IL-1β와 TNF-α 측정

RAW 264.7 cell을 5.0×105cell/㎖로 접종한 후 세포가 안정되면 1.0×107cfu/㎖ 농도로 맞춘

유산균과 식물유래 추출물을 혼합하여 LPS 처리 후 48시간 후에 배양액을 회수하였다. IL-1β와 TNF-α 생산량은 ELISA kit (eBioscience, San Diego)를 이용하여 Sandwich ELISA 방법

으로 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복으로 시행허여 450㎚ 파장에서사용하여 측정하였다(Choi et al., 2012).

(6) NF-κB 측정

NF-κB 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 96 well plate의 각 well당

5.0×104cell/㎖가 되도록 분주하여 2시간 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 후

1.0×107cfu/㎖ 농도로 맞춘 유산균과 식물유래 추출물을 혼합한 시료를 100㎕ 첨가해 최종

1.0×106cfu/㎖농도로 24시간 배양하였고 Positive control은 well 당 100ng/㎖의lipopolysaccharide (LPS)를 처리하였다(Ahn et al., 2013).

나. 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 최적화연구

(1) 실험균주

우수균주와 식품유래 혼합배양물의 최적화 연구에 사용한 우수유산균은 1차년도에서 확보한

면역활성이 우수한 Weissella cibaria JW15와 Lactobacillus plantarum 4-25 균주이었다.

(2) 사용한 식물유래 물질 및 추출 방법

혼합배양물의 최적화 연구를 위해 사용한 식물유래물질은 주관기관인 농촌 진흥청에서 제공

받은 백미와 서리태의 2종류 추출물을 사용하였고, 식물유래물질의 시료 추출방법은 에탄올추

출 시료와 열수 추출시료의 2가지를 사용하여 혼합배양물의 최적화 실험에 사용하였다.

- 109 -

(3) 식물유래 혼합배양물의 사용농도

우수균주와 식품유래 혼합배양물의 최적화 연구에 사용한 에탄올 추출시료와 열수 추출시료는 각

각 0.1%, 0.01%, 0.001% 농도로제조하여면역활성최적화실험에사용하였다.

다. 동물실험을 통한 면역활성 검증연구

(1) 면역활성 검증연구를 위한 Listeria monocytogenes 접종 농도 설정 연구

동물실험을 위한 L. monocytogenes의 접종농도를 설정하기 위해 5.0×104, 105, 106

cfu/mouse의 3가지의 접종농도로 Survival test를 실시하였다.

(2) 마우스 Listeria monocytogenes 감염 모델에서의 면역활성 검증 연구

(가) 사용한 우수 유산균주 및 준비

본 실험에 쓰인 유산균은 screening을 통해 면역활성이 우수하였던 Weissella cibaria JW15

균주를 동물접종실험에 사용하였다. MRS broth 배지에 전 배양액의 1%를 접종한 후, 37℃에서 17시간 배양하였다. 2회 계대 배양을 걸쳐 배양액 전체를 12,000rpm에 10분간 원심 분리하

여 회수한 균체를 멸균된 PBS(pH 7.2)으로 2회 세척 후, 10% skim milk가 첨가된 PBS로

1.0×1010 cfu/㎖로 맞추어 mouse에게 접종시료로 사용하였다(Choi et al., 2012).

(나) 식물유래물질 추출시료 준비

정맥주사 모델 동물실험에서는 성인(체중 60㎏)이 1일간 평균적으로 섭취하는 서리태, 흑태, 우엉의 평균 섭취량의 2배를 동물(체중 20g) 섭취량으로 환산하여 마우스 1마리당 서리태, 흑태는

11.14㎎/20g , 우엉은 51.20㎎/20g 로 준비하였다. 경구투여 모델 동물실험에서는 서리태, 흑태,

우엉의 평균섭취량의 3배를 동물(체중 20g) 섭취량으로 재설정해 서리태, 흑태는 16.65㎎/20g우엉은 76.80㎎/20g 농도로 준비하였다.

(다) Listeria monocytogenes Challenge test

실험동물로는 Female 7-9주령의 BALB/c mouse(나라바이오텍)를 사용하였다. 각 군별의 농

도에 맞게 제조한 PBS, JW15, JW15+서리태, JW15+흑태, JW15+우엉을 2주간 경구투여 하였

고, Listeria monocytogenes를 정맥주사법과 경구투여법으로 인공 감염시킨 2가지 동물 감염모델

을 사용하여(Table 2-1, Table 2-2), 식물유래추출물 (서리태, 흑태, 우엉)과 면역활성 우수 유산균

(Weissella cibaria JW15)과의 혼합효과를 검증하였다(Choi et al., 2012).

- 110 -

Table 2-1. List of groups used in Listeria monocytogenes intravenous infection model

Group 투여물질 투여농도Listeria

monocytogenes감염농도

NC PBS - -

PC PBS - 1.0×105 cfu/mouse

JW15 JW15 1.0×109 cfu/mouse 1.0×105 cfu/mouse

JW15+서리태 JW15, 서리태 1.0×109 cfu/mouse/11.14㎎/20g 1.0×105 cfu/mouse

JW15+흑태 JW15, 흑태 1.0×109 cfu/mouse/11.14㎎/20g 1.0×105 cfu/mouse

JW15+우엉 JW15, 우엉 1.0×109 cfu/mouse/51.20㎎/20g 1.0×105 cfu/mouse

Table 2-2. List of groups used in Listeria monocytogenes per oral infection model

Group 투여물질 투여농도Listeria

monocytogenes감염농도

NC PBS - -

PC PBS - 1.0×109 cfu/mouse

JW15 JW15 1.0×109 cfu/mouse 1.0×109 cfu/mouse

JW15+서리태 JW15, 서리태 1.0×109 cfu/mouse/16.65㎎/20g 1.0×109 cfu/mouse

JW15+흑태 JW15, 흑태 1.0×109 cfu/mouse/16.65㎎/20g 1.0×109 cfu/mouse

JW15+우엉 JW15, 우엉 1.0×109 cfu/mouse/76.80㎎/20g 1.0×109 cfu/mouse

농도에 맞게 제조한 PBS, JW15, JW15+서리태, JW15+흑태, JW15+우엉을 2주간 경구투여

후 NC군을 제외한 나머지 군에는 L. monocytogenes 접종액을 미정맥(tain vein) 투여 또는 경

구투여를 통하여 감염시켰다. 그 후 정맥투여군은 Listeria 접종 2일째(경구투여군은 접종 2일

째와 5일째)에 각 군의 체중(body weight)을 측정한 후, ether마취 후, 혈액을 채취하여 혈청을

분리하고, 간장(Liver)과 비장(Spleen) 무게를 측정하였다.

혈청을 분리하여 면역활성지표인 NO, NF-κB, IL-1β, TNF-α를 측정하였으며, 부검 후 간장

과 비장으로 전이된 L. monocytogenes 균수를 측정하였다.

부검 시 채취한 간과 비장을 10% 중성 포르말린에 고정한 후, 일반적인 조직처리 과정을 거

쳐 파라핀 포매 후 4㎛ 두께로 박절하여 슬라이드를 제작하였음. 제작한 슬라이드는

hematoxylin과 eosin으로 염색하였고, 광학현미경으로 조직병리학적 관찰을 실시하였다.

(라) Survival test

정맥주사 동물모델을 사용한 경우, 투여물질의 생존율(survival rate) 향상 여부를 확인하기

위하여, survival test를 실시하였다. 방법으로는 Female 7-9주령의 BALB/c mouse(나라바이오텍)

를 사용하여 NC, PC, JW15, 서리태, 흑태, 우엉투여군의 6군으로 나누어, 2주간 경구투여를 진행하

- 111 -

였고 그 후 NC군을 제외한 나머지 5군에게는 L. monocytogenes (1.0×105 cfu/mouse)를 미정

맥으로 주사하고, 모든 개체가 사망할 때 까지 3시간 간격으로 매일 관찰하며, 동물의 생존율

을 확인하였다(Choi et al., 2012).

□ 연구결과

가. 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 면역활성 검증 연구결과

(1) 예비실험을 통한 식물유래물질과 우수 유산균주의 혼합 면역 실험 조건 확립

예비실험을 통하여 식물유래물질과 우수 유산균주 혼합 면역 실험의 기초 조건을 확립하였

다. 예비 실험의 결과는 아래의 Fig. 2-1, Fig. 2-2에 나타내었다. 면역활성의 screening

method로 NO와 NF-κB를 우선적으로 측정하여, 면역활성의 Indicator로 활용하는 실험조건을

확립하였다.

(가) NO 측정

Fig. 2-1. Effect of Lactic acid bacteria on NO production in RAW 264.7 murine

macrophage cell. The cells (5×105/well)were cultured with probiotics + Plant-derived

extracts or PBS. Lactic acid bacteria concentrations were 1×107cfu/㎖. L 100 means LPS

at 100ng/㎖. After 48h of culture, the level NO production was measured by the Griess

reagent method. Results are mean± standard deviation of triplicates.

- 112 -

(나) NF-κB 측정

Fig. 2-2. Effect of Lactic acid bacteria on NF-κB production in RAW BLUE cell. The cells

(5×104/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS. Lactic acid

bacteria concentrations were 1×106cfu/㎖. L100 means LPS at 100ng/㎖. After 48h of

culture, the level NF-κB production was measured by QUNTI BLUE method. Results are

mean± standard deviation of triplicates.

(2) In vitro 상에서 식물유래물질과 우수 유산균주의 혼합을 통한 면역활성 특성 조사

연구결과

(가) JW15 + 식물유래추출물의 NO 측정결과

JW15균주와 서리태, 흑태, 우엉의 혼합을 통한 NO 활성을 측정한 결과는 아래 그림과 같았

다. 서리태 0.01%의 경우 JW15균주와의 혼합시너지 효과가 관찰되지 않았지만, 흑태와 우엉의

경우 JW15균주와의 혼합 시 통계학적으로 유의적인 NO생성량의 증가를 확인할 수 있었고, 특

히 3가지 식물추출물 중에서 우엉의 혼합증가 효과가 가장 높게 관찰되었다.

Fig. 2-3. Effect of mixture of JW15 and plant-derived extracts on NO production in RAW

264.7 murine macrophage cell. The cells (5×105/well)were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic

acid bacteria concentrations were 1×107 cfu/㎖. L 100 means LPS at 100ng/㎖. After 48h

of culture, the level of NO production was measured by the Griess reagent method. Results

are mean± standard deviation of triplicates.

- 113 -

(나) JW15 + 식물유래추출물의 NF-κB 측정 결과

NF-κB의 측정결과에서는 JW15균주와 흑태 0.01%를 혼합한 경우에서 흑태 단독 보다 약

3.6배 정도 높은 NF-κB의 증가 결과를 나타내었다. 또 서리태 0.01%와 JW15혼합군의 경우

JW15단독 투여군보다 유의적인 NF-κB의 증가결과를 나타내었으며, 이 결과는 LPS를 100ng/

㎖ 처리한 Positive control보다도 유의적인 증가결과를 나타내었다.

Fig. 2-4. Effect of JW15 and plant-derived extracts on NF-κB production in RAW BLUE

cell. The cells (5×104/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS.

Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic acid bacteria concentrations were

1×106 cfu/㎖. L100 means LPS at 100ng/㎖. After 48h of culture, the level of NF-κB

production was measured by QUNTI BLUE method. Results are mean± standard deviation

of triplicates.

(다) JW15 + 식물유래추출물의 IL-1β 측정 결과

IL-1β의 측정결과에서 서리태와 JW15 혼합군의 경우에 서리태 단독보다 약 2.1배 증가한

유의적인 IL-1β의 증가결과를 관찰할 수 있었다. 또 우엉의 경우에도 혼합군이 단독군보다 약

3.9배 정도 증가한 유의적인 IL-1β의 증가결과를 확인할 수 있었으나 흑태의 경우에는 혼합시

너지 결과를 확인할 수 없었다.

Fig. 2-5. Effect of JW15 and plant-derived extracts on IL-1β production in RAW 264.7

murine macrophage cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic

- 114 -

acid bacteria concentrations were 1×107cfu/㎖. L1000 means LPS at 1000ng/㎖. After 48h of

culture, IL-1β production was monitored by ELISA. Each value is expressed mean ±

standard deviation of triplicates.

(라) JW15 + 식물유래추출물의 TNF-α 측정 결과

TNF-α의 측정결과에서는 전반적으로 모든 처치군에서 TNF-α의 생성량이 높게 측정되었으

며, JW15, 서리태 단독, 우엉 단독, 서리태+JW15 혼합군의 경우 LPS를 1000ng/㎖ 처리한positive control과 동일한 수준으로 높은 TNF-α를 생성하는 특징을 나타내었다.

Fig. 2-6. Effect of JW15 and plant-derived extracts on TNF-α production in RAW 264.7

murine macrophage cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic

acid bacteria concentrations were 1×107 cfu/㎖. L1000 means LPS at 1000ng/㎖. After 48 h

of culture, TNF-α production was monitored by ELISA. Each value is expressed mean ±

standard deviation of triplicates.

나. 우수균주와 식물유래 혼합배양물의 면역활성 검증 연구 결과

(1) 예비 실험을 통해 식물유래물질(에탄올 추출)과 우수 유산균주의 적정 혼합농도 확립

백미와 서리태의 에탄올 추출 시료를 0.1%, 0.01%, 0.001%의 농도로 사용하여 NO, NF-κB,IL-1β, TNF-α를 측정하였으며, 식물유래물질과 우수 유산균주의 적정 혼합농도를 확립하였

다.(Fig. 2-7~10) 그 결과 서리태의 경우 0.01%의 농도에서 NF-κB, IL-1β가 서리태 단독보다

유산균을 함께 첨가 하였을 때 생산량이 증가하였고 유의적 차이가 있었으며, 백미의 경우

NO, TNF-α가 0.01%의 농도에서 백미 단독보다 유산균을 함께 첨가 하였을 때 생산량이 증가

하였고 유의적 차이가 있었다. 따라서 식물유래물질 백미와 서리태 모두 0.01%에서 뛰어난 혼

합면역효과를 나타내고 있으므로, 적정혼합농도를 식물유래물질 0.01%와 유산균주 1×107cfu/㎖로 설정하였다.

- 115 -

(가) 서리태(에탄올추출물) + 유산균의 NF-κB 측정

Fig. 2-7. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria and plant-derived extracts on NF-κB

production in RAW BLUE cell. The cells (5×104/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.1%, 0.01% and

0.001%. Lactic acid bacteria concentrations were 1×106cfu/㎖. L1000 means LPS at

1000ng/㎖. After 48h of culture, the level of NF-κB production was measured by QUNTI

BLUE method. Results are mean± standard deviation of triplicates.

(나) 서리태(에탄올추출물) + 유산균의 IL-1β 측정

Fig. 2-8. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria and plant-derived extracts on IL-1β

production in RAW 264.7 cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.1%, 0.01% and

0.001%. Lactic acid bacteria concentrations were 1×107cfu/㎖. L100means LPS at 100ng/㎖.

After 48h of culture, IL-1β production was monitored by ELISA. Each value is expressed

as mean ± standard deviation of triplicates.

- 116 -

(다) 백미(에탄올추출물) + 유산균의 NO 측정

Fig. 2-9. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria on NO production in RAW 264.7 cell.

The cells (5×105/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS.

Plant-derived extracts concentrations were 0.1%, 0.01% and 0.001%. Lactic acid bacteria

concentrations were 1×107cfu/㎖. L100 means LPS at 100ng/㎖. After 48h of culture, the

level of NO production was measured by the Griess reagent method. Results are

mean±standard deviation of triplicates.

(라) 백미(에탄올추출물) + 유산균의 TNF-α 측정

Fig. 2-10. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria on TNF-α production in RAW 264.7

cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS.

Plant-derived extracts concentrations were 0.1%, 0.01% and 0.001%. Lactic acid bacteria

concentrations were 1×107cfu/㎖. L1000 means LPS at 1000ng/㎖. After 48 h of culture,

TNF-α production was monitored by ELISA. Each value is expressed as mean ± standard

deviation of triplicates.

(2) 식물유래물질인 백미와 서리태의 에탄올 추출물과 열수 추출물의 최적화 비교 연구

백미와 서리태의 에탄올 추출물과 열수 추출물의 최적화 비교 연구를 위해, 0.01%의 농도에

서 NO, NF-κB, IL-1β, TNF-α를 측정하였다(Fig. 2-11~14). 열수추출물과 에탄올추출물을 비

교하였을 때, 열수추출물의 NO 생성량이 에탄올추출물보다 모든 혼합군에서 뛰어났으며, 백미와

- 117 -

서리태 0.01% 자체의 NO 생성능도 우수하였다. NF-κB도 마찬가지로 열수추출이 에탄올 추출보다 우수하였다. IL-1β의 경우 백미, 서리태 열수추출물 모두 우수 유산균 JW15 및

Lactobacillus 4-25와의 혼합 배양물에서 현저한 IL-1β의 증가치를 나타내어 우수한 면역활성

시너지 효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 2-13). 에탄올 추출 TNF-α 측정시의 TNF-α 값의 절대

값이 열수추출보다 전반적으로 높게 나왔지만 Negative control과 LPS 처리군, LGG 등의

Control과 비교하였을 때 열수추출의 TNF-α이 훨씬 많이 생산 된 것을 알 수 있었다. 따라서

이와 같은 백미와 서리태의 에탄올 추출물과 열수 추출물의 최적화 비교 연구를 통해 동

물실험에서의 식물유래물질은 열수추출물을 사용하기로 결정하였다.

(가) 서리태, 백미 0.01% (열수 추출 vs 에탄올 추출)+ 유산균 NO 측정

Fig. 2-11. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria on NO production in RAW 264.7 cell.

The cells (5×105/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS.

Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic acid bacteria concentrations were

1×107 cfu/㎖. L100 means LPS at 100ng/㎖. After 48h of culture, the level of NO production

was measured by the Griess reagent method. Results are mean±standard deviation of

triplicates.

(나) 서리태, 백미 0.01% (열수 추출 vs 에탄올 추출) + 유산균 NF-κB 측정

Fig. 2-12. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria and plant-derived extracts on NF-κB

production in RAW BLUE cell. The cells (5×104/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.01%.

Lactic acid bacteria concentrations were 1×106 cfu/㎖ . L100 means LPS at 100ng/㎖ .

After 48h of culture, the level of NF-κB production was measured by QUNTI

BLUE method. Results are mean±standard deviation of triplicates.

- 118 -

(다) 서리태, 백미 0.01% (열수 추출 vs 에탄올 추출)+ 유산균 IL-1β 측정

Fig. 2-13. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria and plant-derived extracts on IL-1β

production in RAW 264.7 cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics +

Plant-derived extracts or PBS. Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic acid

bacteria concentrations were 1×107 cfu/㎖. L1000means LPS at 1000ng/㎖. After 48h of culture,

IL-1β production was monitored by ELISA. Each value is expressed as mean ± standard deviation

of triplicates.

(라) 서리태, 백미 0.01% (열수 추출 vs 에탄올 추출)+ 유산균 TNF-α 측정

Fig. 2-14. Effect of a mixture of Lactic acid bacteria on TNF-α production in RAW 264.7

cell. The cells (5×105/well) were cultured with probiotics + Plant-derived extracts or PBS.

Plant-derived extracts concentrations were 0.01%. Lactic acid bacteria concentrations were

1×107cfu/㎖. L1000 means LPS at 1000ng/㎖. After 48 h of culture, TNF-α production was

monitored by ELISA. Each value is expressed as mean ± standard deviation of triplicates.

다. 동물실험을 통한 면역활성 검증연구 결과

(1) 면역활성 검증연구를 위한 Listeria monocytogenes 접종농도 설정 연구 결과

동물실험을 위한 L. monocytogenes의 접종농도를 설정하기 위해 5.0×104, 105, 106

cfu/mouse의 3가지의 접종농도로 Survival test를 실시한 결과를 Fig. 2-15에 제시하였다.

그 결과 제일 고농도인 5.0×106 cfu/mouse group에서는 2~3일 사이에 모두 100% 사망,

5.0×105 cfu/mouse group에서는 3~5일에 거쳐 80%가 사망하였다. 따라서 면역활성 검증 연

구를 위한 동물실험에서는 L. monocytogenes 접종농도를 3.0×105 cfu/mouse로 결정하는 것이

필요할 것으로 판단되었다.

- 119 -

Fig 2-15. Survival rate of BALB/c mice infected with 5.0×104, 5.0×105, and 5.0×106 Listeria

monocytogenes (n=5 per group).

(2) 마우스 Listeria monocytogenes 감염 모델에서의 면역활성 검증 연구 결과

(가) 정맥주사 모델 동물실험 결과

① 체중, 간장 및 비장의 무게 측정 결과

Table 2-3. Effect of Weissella cibaria JW15 on body weight and relative liver and spleenweights in mice 2 days after being infected with Listeria monocytogenes

Group(n=4) Body weight (g) Liver/BW (g/㎏) Spleen/BW (g/㎏)

NC 18.88±0.77b 42.028±2.004a 3.453±0.367a

PC 17.29±0.71a 63.973±4.012c 7.027±0.318d

JW15 17.57±0.62ab 63.308±0.862c 5.098±0.702bc

JW15+서리태 18.02±0.59ab 58.329±4.003b 4.996±0.402b

JW15+흑태 17.21±0.35a 60.947±0.905ab 5.831±0.629c

JW15+우엉 17.76±1.64ab 60.681±3.356ab 5.160±0.316bc

a,b,c,d The statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

L. monocytogenes 감염 동물모델 중에서 정맥주사법을 사용한 실험결과에서, 체중, 간장 및

비장의 상대적 무게를 측정한 결과는 Table 2-3에 나타내었다. L. monocytogenes 정맥주사

후 2일째의 체중결과는 NC군이 18.88±0.77g이었으며, 감염시킨 PC군은 17.29±0.71g으로 유의

적인 체중감소를 나타내었다그러나 모든 처치군에서 유의적인 체중증가는 관찰되지 않았다.

상대적인 간장무게측정 결과 PC군은 NC군에 비해 유의적인 무게증가를 나타내었다. 치군의

경우, 서리태, 흑태, 우엉혼합군에서 모두 PC군, JW15단독군에 비해 유의적인 무게감소를 나타

- 120 -

내어 리스테리아 감염을 방어하는 시너지효과를 확인할 수 있었다. 또한 중요한 면역관련 장기

인 비장의 상대적무게 측정 결과에서도 JW15단독군은 물론 서리태, 흑태, 우엉혼합군 모두 유

의적인 비장무게의 감소를 나타내었다.

② Liver에서의 Listeria monocytogenes 균수 측정결과

Table 2-4. Viable cell counts of Listeria monocytogenes in liver of BALB/c mice in the L.monocytogenes challenge model.

Group Listeria monocytogenes in liver (log cfu/g)

NC -

PC 8.54±0.45ab

JW15 8.94±0.46b

JW15+서리태 8.36±2.30a

JW15+흑태 8.32±0.40a

JW15+우엉 8.57±0.39ab

Data represent the log data of mean±SD in each groups.a,b The statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 2일째, 간장으로 전이된 리스테리아균의 생균수를 측

정한 결과, 모든 처치군과 PC군과의 유의적인 차이점은 관찰되지 않았다.

③ NO 측정결과

Fig. 2-16. Nitric oxide production in BALB/c mice sera in the L. monocytogenes challengemodel.

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 2일째에 부검 후 채혈한 혈청의 NO농도를 측정

한 결과, Fig. 2-16에서와 같이 처치군과 대조군 사이의 유의적인 농도변화를 확인할 수는 없

었다.

- 121 -

④ IL-1β 측정

Fig. 2-17. IL-1β production in BALB/c mice sera in the L. monocytogenes challengemodel.

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 2일째에 부검 후 채혈한 혈청의 IL-1β를 측정한결과, Fig. 2-17에서와 같이 모든 처치군에서 PC군에 비해 높은 IL-1β생성 결과를 보였지만,

통계학적인 유의성은 JW15+우엉 혼합군에서만 관찰할 수 있었다.

⑤ TNF-α 측정

Fig. 2-18. TNF-α production in BALB/c mice sera in the L. monocytogenes challengemodel.

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 측정한 혈청의 TNF-α 생성량은 JW15 단독 투여

군이 PC군에 비해 4-5배 이상의 매우 높은 결과를 나타내었다.(Fig. 2-18) 혼합투여군의 경우에

는 흑태, 우엉 혼합군에서 PC군보다 유의적인 증가결과를 나타내었지만, JW15단독투여군보다 유

의적인 증가는 관찰되지 않았다.

- 122 -

⑥ Survival test

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후, JW15균주와 식물유래물질(서리태, 흑태, 우엉)

의 생존율(survival rate)에 미치는 영향을 실험한 결과는 Fig. 2-19와 Table 2-5에 나타내었

다. 생존율 측정 결과 감염시키지 않은 NC군은 실험기간 동안 모두 생존하였지만, L.

monocytogenes를 감염시킨 PC군은 평균생존시간이 63.75±7.50 시간으로 가장 짧았다. JW15단

독군과 혼합투여군 모두 PC군에 비해 평균생존시간이 길게 관찰되었지만, 통계학적인 유의성

은 확인할 수 없었다.

Fig. 2-19. Survival rate of mice of infected with Listeria monocytogenes (n=4 per group).

Table 2-5. Mean survival time of mice fed probiotics or JW15 + plant-derived extracts and

infection to L. monocytogenes

Group Survival time (h)

NC -

PC 63.75±7.50a

JW15 79.50±2.65a

JW15+서리태 70.50±13.30a

JW15+흑태 70.25±8.96a

JW15+우엉 76.00±15.98a

- 123 -

(나) 정맥주사 모델 동물실험 결과

① 체중, 간장 및 비장의 무게 측정 결과

Table 2-6. Effect of Weissella cibaria JW15 on body weight and relative liver and spleenweights in mice 2 days after being infected with Listeria monocytogenes by oraladministration.

　2일차(n=4) Body weight Liver/BW(g/㎏) Spleen/BW(g/㎏)

NC 18.48±0.86a 39.560±2.42a 2.904±0.59a

PC 18.32±0.52a 44.710±2.89b 4.722±0.37b

JW15 18.55±0.31a 41.001±3.91ab 4.043±0.66b

JW15+서리태 18.32±0.71a 42.361±2.58ab 4.301±0.38b

JW15+흑태 19.63±1.50a 40.773±2.55ab 3.190±0.34a

JW15+우엉 18.50±1.16a 38.475±2.08a 3.321±0.23a

a,b The statistical differences as determined by ANOVA

Table 2-7. Effect of Weissella cibaria JW15 on body weight and relative liver and spleenweights in mice 5 days after being infected with Listeria monocytogenes by oraladministration.

　5일차(n=4) Body weight Liver/BW(g/㎏) Spleen/BW(g/㎏)

NC 19.34±0.66b 36.425±5.90a 3.527±0.74a

PC 17.26±0.41a 52.452±3.24b 7.653±1.47b

JW15 18.58±0.27b 52.600±3.34b 7.486±1.12b

JW15+서리태 19.11±0.88b 52.688±4.20b 6.814±0.76b

JW15+흑태 18.57±0.51b 47.287±2.60b 6.171±1.14b

JW15+우엉 19.00±0.99b 49.008±1.79b 6.915±0.60b

a,b The statistical differences as determined by ANOVA

L. monocytogenes 감염 경구투여 동물모델 실험의 체중, 간장 및 비장의 상대적 무게를 투

여 2일째와 5일째에 측정하여 나타낸 결과는 각각 Table 4과 Table 5에 나타내었다. 2일째의

체중 측정 결과는 모든 군에서 변화가 없었으며, 간장무게의 경우 PC군에 비해 JW15+우엉군

에서 유의적인 무게감소를 확인할 수 있었다. 또한 비장무게에서도 JW15+흑태, JW15+우엉군

이 유의적인 현저한 무게감소를 나타내어 Listeria 감염으로부터 감염방어효과가 뚜렷한 것으

로 판단되었다. 5일째의 실험결과 2일째의 결과와는 다르게 모든 처치군의 체중이 PC군에 비

해 유의성 있는 증가 결과를 보였지만, 상대적인 간장과 비장무게에는 변화를 관찰할 수 없었

다.

- 124 -

② 간장과 비장에서의 Listeria monocytogenes 균수 측정결과

Table 8. Viable cells of Listeria monocytogenes in liver and spleen of BALB/c mice 2 daysafter being infected with Listeria monocytogenes.

2 day

Group(n=4)

Listeria monocytogenes

in liver (log cfu/g)

Listeria monocytogenes

in spleen (log cfu/g)

NC - -

PC 6.44±0.98b 6.63±0.74b

JW15 4.28±2.44a 5.80±3.50a

JW15+서리태 6.15±3.04ab 5.54±2.74a

JW15+흑태 3.97±2.29a 6.15±3.53ab

JW15+우엉 2.97±1.79a 5.21±0.02a

Data represent the log data of mean±SD of four mice in each group.a,bThe statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

Table 9. Viable cells of Listeria monocytogenes in liver and spleen of BALB/c mice 5 daysafter being infected with Listeria monocytogenes.

5 day

Group(n=4)

Listeria monocytogenes

in liver (log cfu/g)

Listeria monocytogenes

in spleen (log cfu/g)

NC - -

PC 6.55±0.17b 7.34±0.19dc

JW15 5.44±2.76a 6.98±0.17bc

JW15+서리태 5.87±0.44a 6.70±0.21ab

JW15+흑태 5.34±2.71a 7.18±0.22cd

JW15+우엉 5.61±0.46a 6.40±0.31ab

Data represent the log data of mean±SD of four mice in each group.a,b,c,dThe statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

경구투여로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 2일째와 5일째에 간장과 비장으로 전이된 리

스테리아균의 생균수를 측정한 결과를 Table 6와 Table 7에 나타내었다. 경구투여 2일째의 경

우 JW15단독, 흑태, 우엉혼합군의 간장에서 PC군에 비해 유의성 있는 리스테리아균의 생균수

감소를 확인할 수 있었다. 비장의 경우 흑태를 제외한 모든 처치군에서 PC군보다 유의적인 생

균수 감소를 확인할 수 있었다. 따라서 JW15군 이외에도 혼합투여군에서는 우엉혼합군이 간장

과 비장 모두에서 리스테리아 감염균수를 유의적으로 감소시키는 면역활성의 효과를 보이고

있었다. 5일째의 경우 간장에서의 리스테리아균은 모든 처치군에서 유의적인 균수감소를 나타내었으며, 비

장의 경우에는 흑태군을 제외한 모든 처치군에서 유의적인 세균수 감소를 나타내었다.

- 125 -

③ NO 측정

Fig. 2-20. Nitric oxide production in BALB/c mice sera 2 days after being infected with Listeriamonocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

Fig. 2-21. Nitric oxide production in BALB/c mice sera 5 days after being infected withListeria monocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

경구투여로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 측정한 NO 생성량 결과 중, 2일째에는 Fig.

2- 20에서와 같이 JW15+흑태 혼합군에서 PC군에 비해 유의성 있는 NO생성량의 증가를 나타

내었다. 그러나 5일째에는 Fig. 2-21에서와 같이 모든 처치군에서 유의적인 NO 생성량 변화를

관찰할 수 없었다.

- 126 -

④ IL-1β 측정

Fig. 2-22. IL-1β production in BALB/c mice sera 2 days after being infected with Listeriamonocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

Fig. 2-23. IL-1β production in BALB/c mice sera 5 days after being infected with Listeriamonocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

정맥내로 L. monocytogenes를 감염시킨 후 측정한 IL-1β의 2일째 결과는 JW15+우엉 혼합

군에서만 PC군에 비해 유의적인 증가를 나타내었다. 그러나 JW15단독투여군과 비교하면 혼합

시너지효과는 관찰되지 않았다. 감염 5일째의 결과에서는 JW15단독군과 서리태, 우엉 혼합군

이 PC군에 비해 유의적인 IL-1β 생성량 증가를 나타내었다. 그러나 2일째에서와 같이 서리태,

우엉 모두 혼합 시너지효과는 관찰되지 않았다.

- 127 -

⑤ TNF-α 측정

Fig. 2-24. TNF-α production in BALB/c mice sera 2 days after being infected with

Listeria monocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

Fig. 2-25. TNF-α production in BALB/c mice sera 5 days after being infected with

Listeria monocytogenes. Data represent the mean ± SEM from four mice in each group.

경구투여 리스테리아 감염모델에서 측정한 TNF-α 생성량 결과는 Fig. 24와 Fig. 25에 나타

내었다. 그 결과 2일째와 5일째 모두 처치군과 대조군인 PC군 사이에 유의적인 생성량 변화를

관찰할 수는 없었다.

- 128 -

⑥ L. monocytogenes 경구투여 5일째 간장과 비장의 조직병리학적 관찰 결과

㉮ 간장의 조직병리학적 관찰 결과

Fig. 2-26. Histopathological findings of the liver in BALB/c mice 5 days after beinginfected with Listeria monocytogenes.

A: NC, B: PC, C: JW15, D: JW15+서리태, E: JW15+흑태, F: JW15+우엉

(A) Normal control, (B) Necrotic foci (Arrow) with infiltration of inflammatory cells consistedof neutrophils, lymphocytes and macrophages were observed in the liver of a mouse. (C, D, Eand F) Size of necrotic foci(Arrow) significantly decreased and infiltration of inflammatorycells consisted of lymphocytes and macrophages remarkably decreased. HE staining, Bar = 3㎛.

Listeria monocytogenes를 경구투여하고 5일째 관찰한 간장조직의 병리학적 관찰 결과는

Fig. 2-26에 나타내었다. 그 결과 정상군인 NC군(A)에 비해 Listeria 감염군인 PC군에서는 다

발성(multifocal)으로 중등도(moderate)의 간괴사(hepatic necrosis)가 관찰되었으며, 괴사 부위

와 그 주위로 호중구와 림프구 등 염증세포가 다수 침윤(infiltration)되어 있음을 알 수 있었다

(B). 그러나 JW15(C), JW15+서리태(D), JW15+흑태(E), JW15+우엉(F) 혼합군에서는 PC군과

다르게 간장의 괴사소(necrotic foci)의 숫자는 물론 침윤된 염증세포의 수도 현저하게 감소함

을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 JW15단독 또는 혼합투여군 모두에서 Listeria

monocytogenes 감염에 의한 염증과 조직괴사를 방어하는 면역활성 효과가 매우 우수함을 시

사한다.

- 129 -

㉯ 비장의 조직병리학적 관찰 결과

Fig. 2-27. Histopathological findings of the spleen in BALB/c mice 5 days after beinginfected with Listeria monocytogenes.

A: NC, B: PC, C: JW15, D: JW15+서리태, E: JW15+흑태, F: JW15+우엉

(A) Normal control. (B) Necrosis of a germinal center were observed in the spleen of amouse. (C, D and E) Necrotic region of a germinal center was reduced. (F) There was noinflammatory response and necrosis of germinal centers in the spleen. HE staining, Bar = 3 ㎛.

5일째 비장조직의 병리학적 관찰 결과는 Fig. 27에 설명하고 있다. 그 결과 정상군인 NC군

(A)과 비교하여 PC군(B)에서는 비장 조직 대다수의 백색속질(white pulp) follicle 내

germinal center에서 괴사 및 호중구의 침윤이 관찰되었다(B). JW15투여군(C)의 경우 PC군과

비교하면, 일부 germinal center에서 PC군과 유사하게 괴사 병변이 넓게 관찰되었지만, 괴사

가 관찰된 germinal center의 수는 PC군과 비교하여 감소하여 관찰되었으며, 크기 또한 작게

관찰됨을 알 수 있었다. 또 서리태(D), 흑태(E), 우엉(F) 혼합투여군의 경우, 비장 조직의 일

부 germinal center에서 괴사가 관찰되었으며, 괴사부의 크기 또한 감소하여 관찰되었으며, 특

히 우엉(F)투여군의 경우에는 germinal center에서의 괴사 및 염증세포의 침윤이 매우 적게 관

찰되어 가장 우수한 염증회복 결과를 나타내고 있었다.

- 130 -

3. 시제품 및 최종제품의 면역활성 검증연구

□ 재료 및 방법

가. 시제품의 in vitro 면역활성 검증

(1) Nitric oxide(NO) 측정

NO의 측정은 Promega사의 Griess reagent system을 사용하여 측정하였다. 96-well plate에

배양액 50㎕를 넣고 Griess reagentⅠ(NED solution)과 Griess reagentⅡ (Sulfanilamide solution)를 동량으로 섞어 넣고, 10분간 반응 후 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 540nm에서 측

정하였으며 산화질소 (NO)의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선 (0-100 μM)을 이용하여 계산하였다(Choi et al., 2012).

(2) IL-1β와 TNF-α 측정RAW 264.7 cell을 5.0×105cell/㎖로 접종한 후 세포가 안정되면 1.0×107cfu/㎖ 농도로 맞춘

유산균과 식물유래 추출물을 혼합하여 LPS 처리 후 48시간 후에 배양액을 회수하였다. IL-1β와 TNF-α 생산량은 ELISA kit (eBioscience, San Diego)를 이용하여 Sandwich ELISA 방법

으로 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복으로 시행허여 450㎚ 파장에서사용하여 측정하였다(Choi et al., 2012).

(3) NF-κB 측정NF-κB 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 96 well plate의 각 well당

5.0×104cell/㎖가 되도록 분주하여 2시간 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 후

1.0×107cfu/㎖ 농도로 맞춘 유산균과 식물유래 추출물을 혼합한 시료를 100㎕ 첨가해 최종

1.0×106cfu/㎖농도로 24시간 배양하였고 Positive control은 well 당 100ng/㎖의lipopolysaccharide (LPS)를 처리하였다(Choi et al., 2012).

나. 시제품의 in vivo 면역활성 검증

(1) Listeria monocytogenes Challenge test

실험동물로는 Female 7-9주령의 Balb/c mouse를 사용하였다. 실험군별 시료를 2주간 경구

투여 후, NC군을 제외한 나머지 군에는 L. monocytogenes 접종액을 미정맥(tain vein) 투여 또는

경구투여를 통하여 감염시켰다. 그 후 정맥투여군은 Listeria 접종 2일째(경구투여군은 접종 2일

째와 5일째)에 각 군의 체중(body weight)을 측정한 후, ether마취 후, 혈액을 채취하여 혈청

을 분리하고, 간장(Liver)과 비장(Spleen) 무게를 측정하였다. 분리된 혈청을 사용하여 면역활

성지표인 NO, NF-κB, IL-1β, TNF-α를 측정하고, 부검 후 간장과 비장으로 전이된 L.

monocytogenes 균수를 측정하였다. 부검 시 채취한 간과 비장을 10% 중성 포르말린에 고정

한 후, 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매 후 박절하여 슬라이드를 제작함. 제작한

슬라이드는 H&E 염색하고, 광학현미경으로 조직병리학적 관찰을 실시하였다.

- 131 -

(2) Survival test

시제품의 면역활성 효능을 리스테리아 감염모델에서의 생존율(survival rate) 향상 여부를 확

인하기 위하여, survival test를 실시하였다. 방법으로는 Female 7-9주령의 Balb/c mouse를 사

용하여 실험군별 시료를 나누어, 2주간 경구투여를 진행하였다. 그 후 NC군을 제외한 나머지

실험군에게는 Listeria monocytogenes(1.0×105 cfu/mouse)를 미정맥으로 주사하고, 모든 개체가

사망할 때 까지 3시간 간격으로 매일 관찰하여, 동물의 생존율을 확인하였다(Choi et al., 2012).

다. 최종제품에 대한 효능 연구

최종제품에 대하여 위의 (시험 1) 시제품의 in vitro 면역활성 검증과, (시험 2) 시제품의 in

vivo 면역활성 검증에서 실시한 실험방법에 따라서 최종제품의 면역활성을 측정함.

□ 연구결과

가. 시제품의 in vitro 면역활성 검증

(1) JW15 균주에 대한 시제품과 천연배지 배양환경에 따른 면역활성 검증

JW15 시제품 배양배지(MRS, 서리태배양액, 서리태)에서 검증한 결과, JW15(서리태)군과

JW15(MRS)군 모두 단독으로 면역활성효과를 보였다(Fig. 3-1).

(2) JW15 균주와 유산균증식소재(서리태 및 홍삼전분)와 혼합에 의한 면역활성 검증

서리태(0.01%)와 홍삼전분(0.01%) 단독군과 비교하여 JW15혼합서리태군과 JW15혼합홍삼

전분군에서 유의적으로 NF-κB, IL-6, TNF-α가 유의적으로 증가하였다(Fig. 3-2).

(3) 면역활성 우수소재(콩나물 에탄올추출물)와 JW15 혼합에 의한 면역활성 검증

콩나물 70% 에탄올추출물은 농도의존적으로 1,000ppm에서 유의적인 면역활성 증가

가 관찰되었으며, JW15와 콩나물추출물의 혼합비율을 검증한 결과 1: 0.25 혼합에서

유의적인 면역활성이 관찰되었다(Fig. 3-3).

(4) 천연배지에서 배양된 JW15(서리태, 상추)와 콩나물추출물 혼합에 의한 면역활성 검증

JW15(서리태)군보다 JW15(상추)군이 모든 면역지표에서 유의적으로 면역활성 능력

이 우수하였으며, JW15(상추)와 콩나물추출물 혼합실험에서는 콩나물추출물 100 ppm

이에서 유의적인 면역활성효과를 나타내었다(Fig. 3-4).

- 132 -

Fig. 3-1. Effect of different JW15 cultures and plant-derived extracts on NO, NF-κB, IL-6

and TNF-α production in RAW 264.7 murine macrophage cell or RAW BLUE cell. The

cells (5×105/well) were stimulated with different JW15 cultures, plant-derived extracts and

PBS. L100, LPS at 100ng/mL; L500, LPS at 500ng/mL; L1000, LPS at 1000ng/mL. Results

are mean± standard deviation of triplicates.

- 133 -

Fig. 3-2. Effect of JW15 and plant-derived extracts on NO, NF-κB, IL-6 and TNF-α

production in RAW 264.7 murine macrophage cell or RAW BLUE cell. The cells

(5×105/well) were stimulated with JW15, plant-derived extracts and PBS. L100, LPS at

100ng/mL; L500, LPS at 500ng/mL; L1000, LPS at 1000ng/mL. Results are mean± standard

deviation of triplicates. Each value is expressed mean ± standard deviation of triplicates.

- 134 -

Fig. 3-3. Effect of different JW15 cultures, LGG and plant-derived extracts on NO, NF-κB,

IL-6 and TNF-α production in RAW 264.7 murine macrophage cell or RAW BLUE cell.

The cells (5×105/well) were stimulated with different JW15 cultures, LGG, plant-derived

extracts and PBS. L100, LPS at 100ng/mL; L500, LPS at 500ng/mL; L1000, LPS at

1000ng/mL. Each value is expressed mean ± standard deviation of triplicates.

- 135 -

Fig. 3-4. Effect of different JW15 cultures, different LGG cultures and plant-derived

extracts on NO, NF-κB, IL-6 and TNF-α production in RAW 264.7 murine macrophage

cell or RAW BLUE cell. The cells (5×105/well) were stimulated with different JW15

cultures, different LGG cultures, plant-derived extracts and PBS. L100, LPS at 100ng/mL;

L500, LPS at 500ng/mL; L1000, LPS at 1000ng/mL Each value is expressed mean ±

standard deviation of triplicates.

- 136 -

나. 시제품의 in vivo 동물실험에서의 면역활성 검증

(1) 시제품의 동물장기 무게에 미치는 영향

JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 3일째 Liver 무게에서 양성대조

군에 비해 유의적인 무게감소를 나타내었으며, 5일째 면역관련장기인 Spleen에서 유의적인 감소를 나

타내어 면역활성에 의한 감염예방 효과를 보였다(Table 3-1).

Table 3-1. Effects of Weissella cibaria JW15 and plant-derived extract on relative liver

and spleen weights ratio to body weight in female BALB/c mice 3 days or 5 days after

being infected with Listeria monocytogenes

Group　3 day 5 day

Liver Spleen Liver Spleen

NC 38.26 ± 1.55a 3.92 ± 0.43a 38.43 ± 1.34a 3.94 ± 0.24a

PC 54.82 ± 3.77c 8.93 ± 0.68b 53.12 ± 2.01c 14.43 ± 1.61d

LGG 50.98 ± 1.35b 8.93 ± 0.65b 52.15 ± 5.26bc 13.50 ± 2.75cd

JW15 49.98 ± 2.46b 8.69 ± 0.68b 48.04 ± 3.68b 11.95 ± 2.17bc

콩나물 51.42 ± 2.40b 8.66 ± 0.71b 52.82 ± 3.68bc 10.51 ± 2.75b

JW15+콩나물 51.08 ± 1.86b 8.23 ± 0.79b 50.80 ± 2.88bc 11.25 ± 1.12b

(2) 시제품의 동물장기 Listeria균수에 미치는 영향

JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 3일째 Spleen으로 전

이된 세균수가 양성대조군 PC에 비해 유의적인 세균수 감소를 나타내어, 5일째 장기무게감소

와의 연관성을 시사하였다(Fig 3-5).

(3) 시제품의 동물혈청 내 Cytokine에 미치는 영향

JW15 단독투여군은 Listeria 감염 5일째에 혈청 내 사이토카인인 IL-6와 TNF-α 수치를 양

성대조군 PC에 비해 유의적으로 증가시켜, 동물실험에서도 면역활성 효과를 확인하였다(Fig

3-6).

- 137 -

Fig. 3-5. Viable cell counts of Listeria monocytogenes in liver and spleen of femaleBALB/c mice in the Listeria monocytogenes challenge model. Data represent the mean±SDfrom eight mice in each group.

- 138 -

Fig. 3-6. IL-6 and TNF-α production in female BALB/c mice sera in the Listeriamonocytogenes challenge model

- 139 -

다. 최종제품에 대한 효능 연구

(1) 최종제품

본 실험에 쓰인 최종제품으로는 서리태배지(리터당 서리태추출물 20g, 홍삼전분 10g, Yeast

extract 20g)에서 배양 동결건조시킨 W. cibaria JW15 (2.2×1010/ml)와 L. rhamnosusGG

(LGG)(1.7×1011/ml)을 사용하였다. 콩나물 분말은 70% EtOH추출 동결건조분말(최종수율 21%)

을 사용하였다.

(2) 최종제품 효능실험군 설정

Table 3-2. 최종제품의 효능확인을 위한 마우스 L. monocytogenes 감염모델 실험군 설정

Group 투여물질 투여농도Listeria

감염농도

NC PBS - -

PC PBS - 7.5×104 cfu/㎖

LGG LGG 1.0×109 cfu/㎖ 7.5×104 cfu/㎖

JW15 JW15 1.0×109 cfu/㎖ 7.5×104 cfu/㎖

콩나물 콩나물 11.14㎎/20g 7.5×104 cfu/㎖

JW15+콩나물 JW15, 콩나물 1.0×109 cfu/㎖/100㎎/20g 7.5×104 cfu/㎖

(3) 최종제품의 마우스 간장 및 비장 무게에 미치는 영향

최종제품 JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 3일째 및 5일째

Liver와 Spleen 무게에서 PC군에 비해 유의적인 무게감소를 나타내지 않았다(Table 3-3, Table 3-4).

그러나 대조군인 LGG군의 경우 3일째에서만 Liver에서 유의적인 장기무게감소를 나타내었다.

Table 3-3. Effect on relative liver and spleen weights in BALB/c mice 3 days after being

infected with Listeria monocytogenes.

Groups LIVER SPLEEN

NC 45.087 ± 2.787a 3.668 ± 0.446a

PC 60.022 ± 3.638c 9.214 ± 0.956b

LGG 50.867 ± 3.903b 8.660 ± 0.765b

JW15 58.170 ± 2.985c 8.932 ± 0.697b

콩나물 58.931 ± 2.111c 9.038 ± 0.263b

JW15+콩나물 61.356 ± 2.220c 9.134 ± 0.249b

a,b,c,d The statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

- 140 -

Table 3-4. Effect on relative liver and spleen weights in BALB/c mice 5 days after being

infected with Listeria monocytogenes.

Groups LIVER SPLEEN

NC 43.988 ± 0.886a 3.382 ± 0.289a

PC 63.990 ± 1.723b 13.573 ± 1.224b

LGG 64.943 ± 2.342b 11.955 ± 1.408b

JW15 66.380 ± 1.391b 12.111 ± 0.240b

콩나물 65.035 ± 2.108b 13.018 ± 0.712b

JW15+콩나물 66.510 ± 4.088b 12.735 ± 1.404b

a,b,c,d The statistical differences as determined by ANOVA (p<0.05)

(4) 최종제품의 마우스 간장 및 비장 Listeria 균수에 미치는 영향

최종제품 JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 3일째 Liver

와 Spleen에서 측정한 L. monocytogenes 균수가 양성대조군 PC에 비해 유의적인 세균수 감소

를 나타내었다(Fig 7). 감염 5일째에서는 Spleen에서 균수가 증가하는 추세를 보였지만 최종제

품 모두 유의적인 세균수 감소를 나타내었으며, 대조군인 LGG와도 동일한 유의적인 면역증강

효과를 나타내었다(Fig3-7).

- 141 -

Fig. 3-7. Viable cell counts of Listeria monocytogenes in liver and spleen of female

BALB/c mice in the Listeria monocytogenes challenge model. Data represent the mean±SD

from eight mice in each group.

- 142 -

(5) 최종제품의 마우스 혈청 내 NO 및 Cytokine에 미치는 영향

최종제품 JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 5일째 마우

스 혈청내 NO 생성량이 PC군에 비해 유의적인 증가결과를 보였으며, 이것은 LGG에서도 동일

한 결과를 나타내었다. 그러나 (JW15+콩나물)혼합군에서의 시너지 효과는 확인할 수 없었

다.(Fig 3-8)

Fig 3-8. Nitric oxide (N0) production in BALB/c mice sera 5 days after being infectedwith Listeria monocytogenes.

최종제품 JW15단독군, 콩나물단독군, (JW15+콩나물)혼합군 모두 Listeria 감염 3일째에 혈

청 내 사이토카인인 IL-6 생성량이 PC군에 비해 유의적 증가결과를 보여 면역증강 효과를 보

였으며, 5일째에서는 (JW15+콩나물)혼합군에서만 유의적 증가결과를 나타내었다.(Fig 3-9)

- 143 -

Fig 3-9. IL-6 production in BALB/c mice sera 3 days or 5 days after being infected withListeria monocytogenes.

혈청내 TNF-α 측정결과, Listeria 감염 3일째에 (JW15+콩나물)혼합군에서만 유의적인 증가

결과를 보여, JW15균주와 콩나물추출물 혼합 시너지 효과가 관찰되었지만(Fig 8), 감염 5일째

에서는 유의적인 차이를 확인할 수 없었다.(Fig 3-10)

- 144 -

Fig 3-10. TNF-αproduction in BALB/c mice sera 3 days or 5 days after being infectedwith Listeria monocytogenes.

(6) 최종제품의 마우스 Survival test(생존율)에 미치는 영향

Listeria 감염 후 240시간 동안 군별 마우스의 생존율을 확인한 결과 Fig 11에서와 같이 PC

군은 감염 120시간부터 급격히 사망하였지만, 최종제품군 모두 PC군에 비해 240시간까지 높은

생존율을 나타내어 최종제품의 Listeria 감염모델에 대한 높은 감염예방효과를 나타내었으며,

이것은 최종제품의 면역증강 효과에 의한 것으로 추측된다.

- 145 -

Time (hr)

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

Surv

ival

rate

(%)

40

50

60

70

80

90

100

110NC PCLGGJW15콩나물JW15+콩나물

Fig 3-11. Survival rate during 240 h after being infected with Listeria monocytogenes inBALB/c mice

- 146 -

4절 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구

(2협동과제)

1. 유산균에 의한 사람면역세포의 활성 조절의 면역학적 분자생물학적 작용기전 연구

□ 재료 및 방법

가. 유산균

본 실험에 사용된 유산균은 충북대학교 이완규 교수 실험실에 제공된 7종과 L. rhamnosus

GG이다. 유산균의 성장곡선을 알아보기 위해 Lactobacilli MRS broth (BD, Sparks, MD,

USA)에 37℃에서 혼탁배양 한 후 1시간 간격으로 1 ml씩 덜어내어 OD (600nm)값과 CFU

(colony forming unit) 값을 측정하였다. 각각의 균의 생장곡선을 측정하였고 이후 실험에 쓸

유산균은 대수기의 유산균을 사용하였다. 유산균 배양액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리하여

균체를 회수하고 세척하기 위해 PBS(phosphate-buffered saline)를 넣고 3,000 rpm에서 10분간

3회 세척해 주었다. 균을 재 부유시켜 100℃ 에서 15분간 끓여 주어 heat-killed 유산균을 준비

하여 실험에 사용하였다. Heat-killed 시킨 균의 수를 측정하기 위해 heat killing 전에 MRS

agar plate에 도말하여 균의 수를 측정하였다.

Table 1-1. List of lactic acid bacteria used in this study

나. 사람 말초혈액 단핵구 (PBMC) 분리 및 배양

건강한 donor로부터 제공받은 혈액에서 PBMC를 분리하여 실험에 사용하였다. 실온 상태에

서 15 ml tube 안에 Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 3 ml를 넣고 동량의 혈

액을 일정한 속도로 천천히 layering한 다음 24℃ 400 x g에서 30분간 원심분리를 하였다. 원

심분리가 끝나면 상층액을 파스퇴르 파이펫으로 조심스럽게 제거한다. 뿌옇게 보이는 단핵세포

층을 새로운 conical tube에 옮기고 10 ml의 차가운 식염수를 넣고 잘 섞어준다. 250 x g에서

10분간 원심분리하고 상층액은 버린다. 세척해 주기 위해 세포 펠렛을 5 ml의 식염수에 현탁

하여 250 x g로 원심분리 해주며 이 단계를 2회 더 반복한다. 식염수를 제거하고 세포 펠렛만

남긴 후 적혈구를 제거하기 위해 RBC lysis buffer (Sigma, St. louis, MO, USA) 1 ml로 현탁

Strain Identification by 16S rRNA sequence Origin

LP 4-25 Lactobacillus plantarum Kimchi

LP76 Lactobacillus plantarum Kimchi

CUL22-GB Lactobacillus rhamnosus Probiotic products

JW15 Weissella cibaria Kimchi

CUL20-GB Enterococcus faecium Probiotic products

CUB23-1 Enterococcus faecium Probiotic products

CUL20-WL Enterococcus faecium Commercial products

LGG Lactobacillus rhamnosus GG Commercial products

- 147 -

하여 적혈구를 제거 해주고, 다른 세포의 손상을 막기 위해 식염수를 9 ml를 넣고 섞어준 후,

250xg에 10분간 원심분리 한다. 세포 펠렛을 혈액공여자 혈장 10%와 penicillin/streptomycin

(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)가 1% 포함된 RPMI (Thermo, Scientific)배지에 현탁

한 후 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포를 48 well plate에 5 x 106/ml 농

도로 넣어주고, 37 ℃ CO2 (5 %) incubator에 넣어 키웠다.

PBMC를 CO2 (5%) incubator에 2시간 동안 배양한 후 Heat-killed 시킨 균을 세포: 유산균

의 비율이 1:0.1, 1:1, 1:5, 1:10, 또는 1:20이 되도록 처리해 준다. 또 유산균을 처리 안한

control군과 LPS (1㎍/ml)와 PHA (5 ㎍/ml)를 넣어준 positive control군을 만들어 준다. 또한

유산균을 처리하기 2시간 전에 LPS (1 ㎍/ml)을 처리한 후 유산균을 처리해주었다. 배양 후

상층액은 cytokine을 측정하기 위해 얼린 후 ELISA를 실시하였고, cell을 이용하여 RNA를 추

출하여 Real-time PCR, Western blot, flowcytometery를 진행 하였다.

다. 림프구 활성화 측정

PBMC에 유산균을 처리한 후 24-72시간 후 림프구의 활성화 정도를 측정하였다. PBMC를

96well plate에 원심분리하고 3%의 FBS (fetal bovine serum)(Thermo, Scientific)와 Sodium

azide를 200 ㎍/㎕의 농도로 넣어준 FACS buffer에 재 부유 시켜준 후 4℃ 2000 rpm에서 10

분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 형광이 결합된 anti-CD3, anti-CD4, anti-CD69와

anti-CD25 antibody로 30분간 얼음에서 염색하였다. 염색된 세포들은 FACS buffer로 2회 세

척한 후 Accuri C6을 이용하여 CD3+CD4+ T cell에서 CD25와 CD69의 세포표면 발현 정도를

측정하였다. 또한 세포배양 상층액에 존재하는 cytokine의 농도 측정은 Ebioscience사의

sandwich ELISA kit (eBioscience, USA)를 사용하였다. ELISA용 96well plate에 측정하고자

하는 cytokine의 primary항체인 coating antibody (250x)를 coating buffer에 넣고 희석하고

well plate에 넣어 코팅하였다 (4℃, overnight). ELISA washing buffer(0.25% tween 20 in

PBS)로 5회 세척한 후 1 x assay diluent를 200 ㎕씩 각 well에 넣고 실온에서 한 시간 동안

blocking 하였다. 그 후 washing buffer 5회 세척한 후 1xassay diluent로 희석한 cytokine

standard와 희석된 샘플을 100 ㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응을 시켜준다. 이어서

washing buffer로 5회 세척하고 detection antibody를 1x assay diluent 에 희석을 한 후 각

well당 100 ㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켜 준다. 이어서 washing buffer 5회 세척

한 후 avidin-HRP conjugate를 1x assay diluent 에 희석을 한 후 100 ㎕ 첨가하고 실온에서

30분간 반응을 시켜준 후 washing buffer로 5회 세척하고 TMB 용액을 넣었다. 5-15분간 효소

반응이 일어나면 stop solution 넣어 효소 활성을 중단시키고 450 nm에서 O.D 값을 측정하고

사이토카인 농도를 계산하였다.

라. 세포내 신호전달체계 활성화 측정

PBMC에 유산균을 일정 비율로 처리한 후 세포를 차가운 PBS로 세척한 후 RIPA buffer (

RIPA buffer containing 50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4 (all

other products from Sigma Aldrich), and Complete™ Mini-EDTA-free protease

inhibitococktail (Roche Diagnostics))에 넣어 10분간 얼음에서 방치한 후 원심분리 (15 min,

12000 x g, +4°C) 하여 cell lysate를 준비하였다. 단백질 농도는 bradford method (Peirce)를

- 148 -

사용하여 측정하였고 50 µg의 단백질을 western blotting에 사용하였다. 10% SDS-PAGE gel

에 전기영동한 후 PVDF membrane에 transfer하고 blocking 과정을 거친 후 일차항체로

overnight inculation하였다. 다음 날 horse radish peroxidase-conjugated immunoglobulin G

(IgG)로 1시간동안 실온에서 incubation하고 Pierce ECL Western blotting substrate (Thermo

Scientific, Rockford, IL)로 발색 한 후 LAS4000mini imaging system (Fuji photo film,

Japan)으로 분석하였다.

마. Real time PCR

세포 펠렛에 1ml의 RNAiso (Takara, Japan)을 넣고 파이펫팅하여 세포 펠렛을 완전히 풀

어주었다. 실온에서 5분간 방치 후 200 μL chloroform을 첨가하고 용액에 우윳빛이 돌때까지

섞어주었다. 실온에서 5분간 방치한 후 12,000xg로 4℃에서 5분간 원심분리한 후 투명한 상층

액을 500μL 덜어내어 새로운 tube에 옮기고 isopropanol 250μL를 첨가한 후 실온에서 10분간

방치하였다. 12,000 x g에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 제거하고

RNA 펠렛에 1 ml의 75% ethanol을 첨가한 후 vortexing 하고 750xg로 4C에서 5분간 원심

분리하였다. 상층액 제거하고 RNA 펠렛을 건조시킨 후 RNase free water로 녹여주었다. 추출

한 RNA는 농도를 측정한 후 1ug을 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (Takara,

Japan)를 이용하여 oligo-dT primer로 cDNA를 합성하였다. cDNA를 1:5로 희석하여 real

time PCR을 수행하였다. GAPDH를 house keeping gene으로 사용하여 결과를 normalize하고

deltadelta CT계산하였다.

Table 1-2. real time PCR primer list

바. 자연살생세포 활성화 측정

PBMC에 유산균을 처리하고 24시간 동안 37°C CO2 incubator에서 배양하였다. 표적 암세포

인 K562 세포주는 CFSE로 염색한 후 배지로 washing해서 PBMC culture에 1.0x105cells/well

Geneprimer sequences 5’-->3’

Forward Reverse

IFN-γATT CGG TAA CTG ACT TGA ATG

TCCCAC TCA TGG CTT TGT AGA TGC C

IL-17 AAT TCT GAG GAC AAG AAC TTC CCATA GTC TAA CTG CTT TGG GGA

GTG

Foxp3 CGG ACC ATC TTC TGG ATG AG TTG TCG GAT GAT GCC ACA G

IL-10CAA AAC CAA ACC ACA AGA CAG

ACT TGAG GAC CAG GCA ACA GAG CA

TNF-α AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT CCACCACGCTCTTCTGTCTAC

GAPDH TGG ACC TGA CCT GCC GTC TA CCC TGT TGC TGT AGC CAA ATT C

granzyme A AGC TGA CGG AAA AAG CAA AA TTT CAA GGC CAA AGG AAG TG

granzyme B AAG ACG ACT TCG TGC TGA CA TTC GCA CTT TCG ATC TTC CT

perforin GGT GAC CTT CAT CCA AGC AT CTG GCA TGA TAG CGG AAT TT

granulysin TGA CCA AAA CAC AGG AGC T GAT CTG CTG GCC AGT TTC TC

IL-12p35 ATC TCT ATG GTC AGC GTT CCA CTT CAG CAG GTT TCG GGA CT

- 149 -

이 되게 넣어주고 24시간 후에 propidium iodide (PI)로 염색하였다. 이어스 유세분석기로

K-562세포의 용해 비율을 측정하였다. NK cell에 의한 IFN-γ 생성을 보기위해 PBMC와 유

산균을 72시간동안 배양한 하였다. PMA, ION, BFA를 넣어 4시간동안 추가 배양하고 PBMC

를 FITC conjugated anti-CD3 antibody와 PE conjugated anti-CD56 antibody로 염색한 후

세포질내에 존해하는 IFN-γ를 APC conjuated anti-IFN-γantibody로 염색하여 유세포분석기

로 분석한다. NK cell의 cytotoxicity에 관여하는 유전자 발현은 각각 특이적인 프라이머를 이

용하여 real time PCR를 수행하여 측정하였다. 세포 내 IFN-γ를 측정을 위하여 단백질 수송

억제제가 포함된 cell stimulation cocktail (eBioscience)을 4시간 동안 처리하였다. 그 후 세포

는 4% paraformaldehyde solution으로 고정하고, 1×permeabilization solution (eBioscience)을

처리하였다. Fluorochrome이 결합된 사이토카인 특이적인 항체로 세포를 염색한 뒤, 유세포분

석기(Accuri, BD Biosciences)로 측정하였다.

□ 연구 결과

가. 유산균에 의한 사람면역세포의 사이토카인 분비

사람의 PBMC에 8종의 유산균을 세포:유산균 비율이 1: 0.1, 1:1, 1:5, 1:20 되도록 처리하였

을 때 염증성 사이토카인인 TNF-α생성이 용량의존적으로 증가하였다 (Fig.1-1). TNF-α는 대

식세포가 활성화에 의해 생성되며, CD4+ T 세포나 NK 세포에서 생성되기도 하며, 주된 역할

은 면역 세포를 조절하는 것이다. LGG는 면역세포조절 활성이 있는 양성대조군으로 사용하였

다. 7종의 유산균들 중에서 JW15는 가장 낮은 비율인 0.1:1에서도 LPS 또는 PHA를 처리한

경우보다 높은 수준의 TNF-α생성을 유도하였다. 20-GB와 23-1균주도 비슷한 결과를 보였다.

유산균을 2시간 동안 전처리한 후 LPS로 자극하였을 때 유산균에 의한 TNF-α이 증강되지

않고 오히려 감소하는 것으로 확인되었다 (Fig.1-1).

- 150 -

Fig. 1-1. TNF-α production by human PBMC upon stimulation with LAB. (A) PBMC

(5.0x105cells/well) were stimulated with LAB at the ratio of 1:0.1, 1:1, 1:5, 1:20 (cell :

LAB) or with LPS at 1 ㎍/ml. The level of TNF-α in the cell culture supernatant was

measured using ELISA kits in accordance with the manufacturer's instructions. (B) Cells

were pretreated with LAB for 2 hrs and then LPS was added into cell culture media at

the concentration of 1 ㎍/ml. After 48 hrs, the level of TNF-α in the cell culture

supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the manufacturer's

instructions. *: not detected.

IL-1β 유산균을 사람면역세포에 처리하였을 때 8균주 모두 IL-1β생성을 용량의존적으로 유도

하였으며 7균주 모두 비슷한 수준의 IL-1β 생성을 유도하였다. 모든 균주에서 LGG보다 높은

농도의 IL-1β가 생성되었다. 유산균 전처리 후 LPS 처리 시 IL-1β생성은 TNF-α와는 달리 유

산균만 처리한 경우에서 보다 증가하였다 (Fig. 1-2). 즉, 유산균과 LPS의 상호작용은

cytokines의 종류에 따라 증강 또는 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 1-2. IL-1β production by human PBMC upon stimulation with LAB.

(A) PBMC (5.0x105cells/well) were stimulated with LAB at the ratio of 1:0.1, 1:1, 1:5,

1:20 (cell : LAB) or with LPS at 1 ㎍/ml. The level of IL-1β in the cell culture

supernatant was measured using ELISA kits in accordance with the manufacturer's

instructions. (B) Cells were pretreated with LAB for two hours and then LPS was added

into cell culture media at the concentration of 1 ㎍/ml. After 48 hrs, the level of IL-1β-α

in the cell culture supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the

manufacturer's instructions. *: not detected.

- 151 -

IL-12는 T-cell stimulating factor로 T cell의 기능과 성장을 도와주며, IFNγ와 TNF-α의

생성을 활성화한다. IL-12 생성에 있어서는 유산균별 특성이 상이하게 나타났다. LP76 단독처리

는 IL-12생성을 유도하지 않았으며 LPS 처리 시 IL-12 생성이 미미한 수준으로 증가하였으나

JW15, LP4-25, 20WL, 20GB는 LPS 처리 시 유산균 단독 처리시보다 IL-12 생성이 증가하는

것으로 확인되었다. 22-GB와 23-1 유산균은 전처리 후 LPS를 처리한 경우 유산균 단독 처리

에 비해 IL-12 생성이 감소하는 것으로 나타났다 (Fig.1-3).

Fig. 1-3. IL-12 production by human PBMC upon stimulation with LAB.

(A) PBMC (5.0x105cells/well) were stimulated with LAB at the ratio of 1:0.1, 1:1, 1:5,

1:20 (cell : LAB) or with LPS at 1 ㎍/ml. The level of IL-12 in the cell culture

supernatant was measured using ELISA kits in accordance with the manufacturer's

instructions. (B) Cells were pretreated with LAB for two hours and then LPS was added

into cell culture media at the concentration of 1 ㎍/ml. After 48 hrs, the level of IL-12 in

the cell culture supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the

manufacturer's instructions. *: not detected.

나. 유산균에 의한 사람 Th cell 활성화

사람면역세포에 8종의 유산균을 처리하고 생성되는 사이토카인을 측정하고 Fig 1-4에 제

시하였다. 8종의 유산균 모두 사람면역세포에 처리 시 Th1 cytokine인 IFN-γ가 생성되었다.

IL-12에서와 마찬가지로 유산균 규주별 특성이 다르게 나타났다. JW15, 20WL , CUL20GB,

CUL22GB, CUB23-1은 IFN-γ 생성 유도능 다른 균주들에 비해 우수한 것으로 확인되었다.

LP76, LP4-25, LGG는 상대적으로 낮은 농도의 IFN-γ이 생성되었다. 사람면역세포에 유산균

전처리 후 OKT3 항체를 첨가하여 T cell을 활성화 시키면 IFN-γ의 생성이 급격히 증가하여

- 152 -

유산균 단독 또는 OKT3 항체 단독처리시 보다 최대 10000배 까지 높게 나타났다. 이는 유산

균 전처리로 인한 항원제시세포의 활성화가 Th cell에 강력한 costimulatory effects를 제공했

기 때문으로 사료된다. LP4-25 균주는 단독 처리 시 JW15보다 낮은 수준의 IFN-γ가 생성되

었으나 OKT3 항체 추가했을 때에는 JW15+OKT3와 유사한 수준으로 IFN-γ생성을 증강시켰

다. 반면에 LP76과 CUL20-GB는 OKT3 항체에 의한 IFN-γ생성 증강 효과가 다른 균주들

에 비해 약하게 나타났다.

Fig. 1-4. IFN-γ production by human PBMC upon stimulation with LAB.

(A) PBMC (5.0x105cells/well) were stimulated with LAB at the ratio of 1:0.1, 1:1, 1:5,

1:20 (cell : LAB) or with LPS at 1 ㎍/ml. The level of IFN-γ in the cell culture

supernatant was measured using ELISA kits in accordance with the manufacturer's

instructions. (B) Cells were pretreated with LAB for two hours and then LPS was added

into cell culture media at the concentration of 1 ㎍/ml. After 48 hrs, the level of IFN-γ in

the cell culture supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the

manufacturer's instructions. *: not detected.

사람면역세포에 유산균 처리 시 Th17 cytokine인 IL-17 생성 유도되지 않았으나 유산균 전처

리 후 OKT3 항체를 첨가하여 T cell을 활성화 시키면 IL-17 생성이 OKT3 항체 단독 처리

보다 약간 증가하였으나 (유산균: 세포 비율이 낮을 때) 세포당 유산균 비율이 증가할수록

OKT3 항체에 의한 IL-17 생성 감소하였다 (Fig. 1-5).

- 153 -

Fig. 1-5. IL-17 production by human PBMC upon stimulation with LAB.

PBMC (5.0x105cells/well) were pre-treated with LAB for two hours and then stimulated

with OKT3 antibody at 1 ㎍/ml. After 48 hrs, IL-17 were measured using ELISA kits in

accordance with the manufacturer's instructions.

다. 선발된 유산균에 의한 사람 Th cell 활성화 조절

LGG를 포함한 8종의 유산균이 모두 사람면역세포를 활성화시키는 것을 확인 할 수 있었으

며 이들 중에서 김치에서 유래된 우수 유산균인 JW15, LP4-25, LP76을 선발하여 추가적인 in

vitro 실험과 in vivo 실험에 사용하였다. LGG는 면역세포조절 활성이 있는 양성대조군으로 사

용하였다. 4가지 종류의 유산균에 의한 cytokine 생성을 비교한 결과 4종 모두

dose-dependent하게 cytokine의 생성을 유도하였다. 이들 중 JW15균주는 아주 낮은 용량

(0.1:1)에서도 TNF-α와 IL-1β의 생성을 유도하여 4종의 유산균들 중 TNF-α 생성을 가장 효

율적으로 유도하는 것으로 나타났다. 또한 세포내 감염되는 병원체의 제거에 필수적인 역할을

하는 IL-12와 IFN-γ의 생성도 JW15에 의해 가장 강하게 자극되었으며 면역반응을 억제시키는

IL-10과 면역반응을 촉진시키는 IL-12의 비율로 계산 시 4종류의 유산균들 중 JW15이 가장 우수

한 면역반응 활성능을 보유한 것으로 판단된다.

- 154 -

Fig. 1-6. Cytokine production by human PBMC upon stimulation with LAB isolated from

Kimchi.

PBMC (5.0x105cells/well) were isolated and stimulated with LAB for 48 hrs at the ratio of

1:0.1, 1:1, 1:5, 1:20 (cell : LAB) or LPS at 1 ㎍/ml.. Cytokine were measured using

ELISA kits(eBioscience) in accordance with the manufacturer's instructions. Data are

expressed as mean ± SEM.

사람면역세포에 유산균 처리 시 T cell 활성화가 유도됨을 CD69과 CD25 발현정도를 유세

포분석기로 분석하여 확인하였다 (Fig. 1-7). CD69은 T cell 활성화 초기에 세포표면 발현이

증가하며 CD25는 T cell의 성장인자인 IL-2의 high affinity receptor로 T cell 활성화 후기에

그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 유산균 4종 모두 T cell 표면에 CD69의 발현을 증가

시켰으면 이는 세포: 유산균의 비율이 증가함에 따라 함께 증가하는 양상을 보여주었다. CD25

를 발현하는 CD4+ T cell의 분포 또한 유산균 처리에 의해 dose-dependent하게 증가하였다.

위의 사이토카인 분비 결과와 유사하게 유산균 4종중에서 JW15가 가장 강력하게 T cell 활성

화 (CD69와 CD25발현 증가)를 유의성 있게 유도함을 확인하였다.

- 155 -

Fig. 1-7. Activation of human T cell by LAB isolated from Kimchi.

PBMC (5.0x105cells/well) were isolated and stimulated with LAB for 48 hrs at the ratio of

1:0.1, 1:1, 1:5, 1:20 (cell : LAB) or LPS at 1 ㎍/ml. The levels of CD4+ T cell activation

were evaluated using flowcytometry by analyzing the percentage of CD69+ or CD25+ cells

in CD4+ T cell. Data are expressed as mean ± SEM.

사람면역세포에 유산균을 처리하였을 때 과도한 면역반응을 억제하는 Tregs(조절 T cells)의

분포에 대한 영향을 평가한 결과 아래 그림에서와 같이 본 연구에서 사용된 4종의 유산균의

Tregs의 분포에 영향을 주지 않음을 확인하였다 (Fig. 1-8).

Fig. 1-8. Effects LAB isolated from Kimchi on the human regulatory T cells.

PBMC(5.0x105cells/well) were isolated and stimulated with LAB for 48 hrs at the ratio of

1:0.1, 1:1, 1:5, 1:20 (cell : LAB) or LPS at 1 ㎍/ml. Percentages of Tregs were analyzed

with flowcytometry. Data are expressed as mean ± SEM.

- 156 -

라. JW15와 LP4-25에 의한 세포내 신호전달경로 활성화

면역세포 활성화능이 가장 우수한 것으로 나타난 JW15균주에 의한 세포내 신호전달체계

활성화를 측정한 결과 세포내 여러 신호전달체계를 활성화시키는 것으로 확인되었다. JW15은

NF-κB, ERK, JNK pathway를 강하게 활성화시켰으며 p38 pathway의 활성화 또한 유도되었

으나 상대적으로 약한 반응을 보였다. LP 4-25도 JW15과 유사하게 NF-κB, ERK, JNK 뿐만

아니라 p38 pathway도 활성화시켰다. 그러므로 두 균주 모두 다양한 세포내 신호전달체계를

활성화시킴으로서 사람면역세포를 자극하여 면역반응을 유도한 것으로 사료된다.

Fig. 1-9. Intracellular signaling pathways activated by JW15 and LP 4-25.

PBMC(5.0x105cells/well) were stimulated JW15, LP4-25 and LGG strains at the ratio of

1:20 (cell: LAB) for 15, 30, and 60 min. Cell lysates were prepared and used to detect

protein levels by western blot. Representative results from three independent experiments

are shown.

1) 마. 유산균에 의한 사람 NK cell 활성 조절 측정

자연살생세포는 체내에 있는 비정상적인 세포 (종양세포)를 찾아 죽이는 면역세포로서 종양

발생의 예방 및 종양세포 제거를 위한 면역요법에 활용하기 위한 연구가 활발하게 이루어지고

있다. 유산균이 이러한 자연살생세포를 활성화시켜 종양세포에 대한 세포독성을 보이는지 측

정하였다. 본 실험에는 3종의 선발된 유산균과 LGG가 사용되었으며 이들 중 JW15과 LP4-25

가 종양세포에 대한 세포독성 활성이 우수한 것으로 확인되었다 (Fig. 1-10).

- 157 -

Fig. 1-10. Effect of LAB on the cytotoxic activity of NK cell. Human PBMC were isolated

from healthy donors and stimulated with or without heat-killed LAB strains, for 48 h at

0:1, 0.1:1, 1:1, 5:1, heat killed LAB to PBMC ratio. After incubation, cells were incubated

with CFSE-labeled K562 cells as target cells to measure cytolytic activity of PBLs (E:T

ratio; 10:1). After 1 h, cells were stained with propidium iodide (PI) and K562cells killed

were determined by CFSE (FL-1) and PI (FL-3) double positive staining. Data presented

are representative of three independent experiments

유산균 처리 후 종양세포에 대한 세포독성 증가의 작용기전을 연구하고자 사람 PBMC에 유

산균을 처리한 후 자연살생세포의 비율이 증가하였는지 확인하였다. Fig 11에서 보여주 바와

같이 유산균가 자연살생세포의 분포에는 영향주지 않았으며 이는 NK cell의 비율 증가가 종

양세포에 대한 cytotoxicity 증가의 원인이 아님을 시사한다 (Fig. 1-11).

Fig. 1-11. Effect of LAB on the proliferation of NK cell. Human PBMC were isolated from

healthy donors and stimulated with or without heat-killed LAB strains, for 48 h at 0:1,

0.1:1, 1:1, 5:1, heat killed LAB to PBMC ratio. After incubation, cells were stained for CD3

and CD56 expression on the surface of PBMC and analyzed by flowcytometer. NK cells

were identified by CD3- CD56+ cells. Data presented are representative of three independent

experiments. Data are expressed as mean ± SEM.

유산균이 K562세포에 직접적인 세포독성을 보이지를 K562세포에 유산균을 1:1, 10:1, 50:1로 처

리하고 propidium iodide로 염색하여 죽은 세포 분석하여 확인하였다. Fig 12에서 보는 바와

- 158 -

같이 유산균이 직접적으로 K562세포에 독성을 나타내지는 않았다. 그러므로 유산균에 의한

K562에 대한 세포독성 증가는 직접적인 세포독성에 의한 것이 아니라 자연살생세포의 증식을

유도하거나 세포독성 활성을 증가시킴에 의한 것으로 예상할 수 있다 (Fig. 1-12).

Fig. 1-12. Direct effect of LAB on K562 cell viability. Human PBMC were isolated from

healthy donors and stimulated with or without heat-killed LAB strains, for 48 hrs at 1:1,

10:1, 50:1, heat killed LAB to PBMC ratio. After incubation, cells were stained with PI and

analyzed by flowcytometer. PI positive cells were considered as dead cells. Data presented

are representative of three independent experiments. Data are expressed as mean ± SEM.

자연살생세포는 많은 양의 IFN-γ를 생성하며 병원체에 감염된 세포와 종양세포를 사멸시키는

데 IFN-γ가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 사람면역세포에 JW15와 LGG를 처리하고

CD3-CD56+인 자연살생세포의 IFN-γ을 flowctyometry 분석하였다. Fig. 1-13에서 볼 수 있듯이 LPS

나 PHA는 자연살생세포의 IFN-γ에 거의 영향을 주지 않았으나 JW15는 용량 의존적으로 IFN-γ를

생성하는 자연살생세포의 비율을 증가켰다. 본 연구에 양성대조군으로 사용된 LGG균의 경우엔 두

NK cell에 의한 IFN-γ 생성을 증가시키는 않았다 (Fig 1-13).

Fig. 1-13. Effect of LAB on IFN-γ production by NK cells.

Human PBMC were isolated from healthy donors and stimulated with or without

heat-killed LAB strains, for 48 h at 0.1:1, 1:1, 5:1, heat killed LAB to PBMC ratio. After

incubation, cells were stained with antibodies against CD3, CD56, and IFN-γ and then

analyzed by flowcytometer. Data presented are representative of three independent

experiments Data are expressed as mean ± SEM.

자연살생세포는 세포질내에 perforin과 granzyme과 같은 세포독성과립 (cytotoxic granules)을 포함

- 159 -

하고 있어 표적세포를 인식하게 되면 방출되어 표적세포표면에 pore를 형성한다. 이로 인해 표적세

포에 granzyme이 주입되고 표적세포는 apoptosis 또는 osmotic cell lysis에 의해 죽게 된다. 유산균

에 의한 종양세포 사멸이 이러한 세포독성인자의 증가에 의한 것인지를 확인하고자 사람 PBMC에

유산균 처리 후 granzyme A & B, perforin, gradulysin의 발현 정도를 real time PCR로 측정

하였다. Fig. 1-14에서 보여주는 것과 같이 JW15균주가 granzyme A, perorin, granulysin의

mRNA을 4배 이상 증가시켜 자연살생세포에 의한 종양세포 사멸을 유도하였을 것으로 사료된

다.

Fig. 1-14. Effect of LAB on the mRNA levels of granzyme A, granzyme B, perforin,

granulysin.

Human PBMC were isolated from healthy donors and stimulated with or without

heat-killed LAB strains, for 4 or 48 hrs at 5:1 heat killed LAB to PBMC ratio. After

incubation, total RNA was extracted from PBMC and then cDNA was synthesized. cDNA

were then used to measure the mRNA levels of cytolytic granules by using real time PCR.

- 160 -

2. Listeria monocytogenes 감염모델을 이용한 유산균효능의 면역학적 분자생물학적

기전연구

□ 재료 및 방법

가. 유산균

본 실험에 사용된 유산균은 충북대학교 이완규 교수 실험실에 제공된 7종과 L. rhamnosus

GG이다. 유산균의 성장곡선을 알아보기 위해 Lactobacilli MRS broth (BD, Sparks, MD,

USA)에 37℃에서 혼탁배양 한 후 1시간 간격으로 1 ml씩 덜어내어 OD (600nm)값과 CFU

(colony forming unit) 값을 측정하였다. 각각의 균의 생장곡선을 측정하였고 이후 실험에 쓸

유산균은 대수기의 유산균을 사용하였다. 유산균 배양액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리하여

균체를 회수하고 세척하기 위해 PBS(phosphate-buffered saline)를 넣고 3,000 rpm에서 10분간

3회 세척해 주었다. 균을 재 부유시켜 100℃ 에서 15분간 끓여 주어 heat-killed 유산균을 준비

하여 실험에 사용하였다. Heat-killed 시킨 균의 수를 측정하기 위해 heat killing 전에 MRS

agar plate에 도말하여 균의 수를 측정하였다.

Table 2-1. List of lactic acid bacteria used in this study

나. 마우스 비장세포 분리 및 배양

생후 8-10주령의 C57B/L6 마우스를 (주)샘타코(오산, 경기도)로부터 구입하여 시험에

사용하였다. 마우스는 환기 시설이 갖춰지고 실내온도 25±1oC,상대습도 40±5%, 명암조건 12

hrs/day가 유지되는 실험동물사에서 고형사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육되었다.

모든 실험동물은 동물보호법 13조 및 전북대학교 동물실험 윤리위원회 규정에 따라

관리하였다. 마우스를 이산화탄소로 안락사하여 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640

배양액으로 씻은 후 syringe plunger로 가볍게 분쇄하여 단일세포 현탁액을 준비하였다.

분리된 세포 현탁액을 70 μm cell strainer에 통과시켜 배양액으로 2번 세척하고, 1,200

rpm에서 10분간 원심분리하였다. 적혈구를 제거하기 위해 RBC lysis buffer (Sigma, St. louis,

MO, USA) 1 ml로 현탁 하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 10%의

FBS를 포함하는 RPMI medium 1640 용액에 현탁시켜, PBS로 희석한 후 trypan blue

solution으로 염색하고 hemocytometer를 이용하여 그 세포수를 측정하였다. 96-well plate에

세포농도 5.0×105 cell/well로 분주한 후 유산균을 다양한 비율로 첨가하여 실험을 수행하였다.

배양 후 상층액은 사이토카인을 측정하기 위해 얼린 후 ELISA를 실시하였고, cell을 이용하여

RNA를 추출하여 Real-time PCR, Western blot, flowcytometery를 진행 하였다.

Strain Identification by 16S rRNA sequence OriginLP 4-25 Lactobacillus plantarum KimchiLP76 Lactobacillus plantarum Kimchi

JW15 Weissella cibaria KimchiLGG Lactobacillus rhamnosus GG Commercial products

- 161 -

다. 사이토카인 측정 (Enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)

세포 외로 분비된 사이토카인 측정을 위하여 세포배양액에서의 IL-2, IL-4, IL-17, IFN-γ

(eBioscience)를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 사이토카인에 특이적으로 결합하는

capture antibody를 coating한 96 well plate에 assay diluent를 이용하여 blocking한다. 세포배

양액 시료를 처리한 후 실온에서 2시간 반응시킨다. 시료를 제거하고 well plate를 washing

buffer (0.05% Tween20 in PBS)로 세척해준다. Detection antibody를 처리한 후 실온에서 1시

간 반응시킨 후 세척한다. Peroxidase가 결합된 avidin이 detection antibody와 결합할 수 있게

30분간 암조건에서 반응시킨다. 세척 후 peroxidase의 기질용액인 TMB substrate를 넣어 암조

건에서 반응을 유도하였으며 1 N의 황산용액을 이용하여 반응을 정지시켰다. 반응액의 흡광도

는 microplate reader (Polarstar Optima plate reader, BMG Labtech, Melbourne, Austria)을

이용하여 450 ㎚에서 측정한 후 사이토카인의 농도를 kit 내 표준용액의 정량곡선을 기준으로

계산하였다.

라. 면역세포 활성화 측정

세포를 96well plate에 원심분리하고 FACS buffer에 재 부유 시켜준 후 4℃ 2000 rpm에서

10분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 형광이 결합된 anti-CD4, anti-CD69와 anti-

CD25 antibody 또는 anti-CD11c, anti-CD80와 anti-CD86 antibody를 첨가하여 30분간 얼음

에서 염색하였다. 염색된 세포들은 FACS buffer로 2회 세척한 후 Accuri C6을 이용하여

CD3+CD4+ T cell에서 CD25와 CD69의 세포표면 발현 정도를 측정하였다.

마. 세포내 신호전달체계 활성화 측정

PBMC에 유산균을 일정 비율로 처리한 후 세포를 차가운 PBS로 세척한 후 RIPA buffer (

RIPA buffer containing 50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4 (all

other products from Sigma Aldrich), and Complete™ Mini-EDTA-free protease

inhibitococktail (Roche Diagnostics))에 넣어 10분간 얼음에서 방치한 후 원심분리 (15 min,

12000 x g, +4°C) 하여 cell lysate를 준비하였다. 단백질 농도는 bradford method (Peirce)를

사용하여 측정하였고 50 µg의 단백질을 western blotting에 사용하였다. 10% SDS-PAGE gel

에 전기영동한 후 PVDF membrane에 transfer하고 blocking 과정을 거친 후 일차항체로

overnight inculation하였다. 다음 날 horse radish peroxidase-conjugated immunoglobulin G

(IgG)로 1시간동안 실온에서 incubation하고 Pierce ECL Western blotting substrate (Thermo

Scientific, Rockford, IL)로 발색 한 후 LAS4000mini imaging system (Fuji photo film,

Japan)으로 분석하였다.

바. Real time PCR

세포 펠렛에 1ml의 RNAiso (Takara, Japan)을 넣고 파이펫팅하여 세포 펠렛을 완전히 풀

어주었다. 실온에서 5분간 방치 후 200 μL chloroform을 첨가하고 용액에 우윳빛이 돌때까지

섞어주었다. 실온에서 5분간 방치한 후 12,000xg로 4C에서 5분간 원심분리한 후 투명한 상층

액을 500μL 덜어내어 새로운 tube에 옮기고 isopropanol 250μL를 첨가한 후 실온에서 10분간

방치하였다. 12,000xg에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 제거하고 RNA

- 162 -

펠렛에 1 ml의 75% ethanol을 첨가한 후 vortexing 하고 750xg로 4C에서 5분간 원심분리하

였다. 상층액 제거하고 RNA 펠렛을 건조시킨 후 RNase free water로 녹여주었다. 추출한

RNA는 농도를 측정한 후 1ug을 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (Takara, Japan)

를 이용하여 oligo-dT primer로 cDNA를 합성하였다. cDNA를 1:5로 희석하여 real time PCR

을 수행하였다. actin을 house keeping gene으로 사용하여 결과를 normalize하고 deltadelta

CT를 계산하였다.

Table 2-2. real time PCR primer list

사. 유산균 경구투여가 마우스 면역세포 활성화에 미치는 영향 측정

생후 6-8주령의 BALB/c 및 C57BL/6 마우스를 샘타코 (Seoul, Korea)에서 분양받아 전북대학

교 실험동물실에서 사육하였다. 마우스는 사육조에 각 군별로 5마리씩 넣어 정수된 물과 실험

동물용 펠렛사료(샘타코)를 자유 공급하였고, 온도 22oC, 습도 50%, 12시간 간격으로 자동 조

명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 사육하였다. 8주령의 마우스에 2x109 c.f.u

의 heat killed 유산균을 매일 2주간 경구투여하고 대조군은 PBS를 투여하였다. 마우스 비장세

포를 얻기 위하여 CO2 gas 처리하여 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였으며,

40μm cell strainer를 이용하여 single cell suspension을 준비하였다. 비장세포는 10% FBS를

함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 5×105 cells/well이 되도록 현탁하여 96 wells

tissue culture plate (Costar, Cambridge, MA. USA)에 분주하였다. 이어서 anti-CD3 antibody

또는 L. monocytogens으로 자극하고 48시간 후에 세포배양액에 존재하는 사이토카인의 농도

를 ELISA로 측정하였다.

아. Listeria monocytogens 감염모델

8주령의 C57BL/6 마우스에 2.0 x 109/100 ㎕의 유산균을 매일 2주간 경구 투여하고 대조군은

PBS를 투여하였다. 먼저 정맥을 통한 감염모델은 정맥에 L. monocytogenes을 1.0 x 106/100

Geneprimer sequences 5’-->3’

Forward Reverse

IFN-γGAT GCA TTC ATG AGT ATT GCC AAG

TGTG GAC CAC TCG GAT GAG CTC

IL-17 CCA GAA GAG CCG ACA GAG AC GAG CTG CGT TCT GTT TCT CC

Foxp3 GAA ACA GCA CAT TCC CAG AGT TC ATG GCC CAG CGG ATG AG

IL-10 AGT GGA GCA GGT GAA GAG TGA CGA GGT TTT CCA AGG AGT TG

TNF-α AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG AGA GAA CCT GGG AGT CAA GGT

IL-1β ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACTCAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT

TT

actin GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA G

IL-12p35 GCC AGG TGT CTT AGC CAG TC GCT CCC TCT TGT TGT GGA AG

- 163 -

㎕를 꼬리정맥에 투여 하여 감염시켰다. 경구 투여 감염모델은 유산균을 2주간 경구 투여한 후

L. monocytogenes을 경구 투여하기 30분전 10% sodium bicarbonate를 100 ㎕ 경구 투여를 한

후 L. monocytogenes을 1.0 x 109/100 ㎕를 경구 투여 하여 감염시켰다. 2-4일 후 마우스를

이산화탄소로 희생하여 혈액을 채취하고 간과 비장의 무게를 측정하였다. 간과 비장을

homogenization한 후 L. monocytogenes의 균수를 측정하였다. 혈청 내 cytokine의 농도를

ELISA로 측정하였다.

□ 연구결과

가. 유산균에 의한 마우스의 비장세포 활성조절

선발된 유산균이 균주 특이적으로 사람 면역세포의 활성을 조절하는 것으로 확인되었으나

마우스를 이용한 동물모델실험 전에 유산균에 의한 마우스 면역세포 활성조절을 연구하였다.

마우스에서 분리한 비장세포에 선발된 유산균을 처리하게 되면 JW15가 LP4-25 또는 LP76 보

다 강하게 수지상 세포의 활성화 유도함을 증가된 CD86발현으로 확인할 수 있었다 (Fig. 2-1).

수지상세포는 가장 효율적인 항원제시세포로서 JW15에 의한 수지상세포의 활성화는 JW15가

항원특이적인 면역반응을 증강시킬 수 있음을 간접적으로 보여주는 결과이다. 선발된 유산균

중 LP4-25와 LP76 균주는 수지상세포에서 CD86 발현을 유도하지 않은 것으로 보아 수지상세

포 활성화 유도능이 현저히 낮은 것으로 보여진다.

Fig. 2-1. Activation of mouse dendritic cells by LAB.

Splenocytes were isolated from seven weeks old C57B/L6 mice and treated with L.

monocytogenes or LAB as indicated in the graph. Activation of dendritic cells were

evaluated by analyzing expression of CD86 on the surface of CD11c+ cells flowcytometry.

Data are expressed as mean ± SEM. *LM : L. monocytogenes

이어서 선발된 유산균에 의한 마우스 비장세포의 사이토카인 생성을 측정한 결과 JW15가

TNF-α, IFN-γ, IL-17의 생성을 가장 강하게 유도하여 사람면역세포실험에서와 유사한 반응을

확인하였다 (Fig. 2-2).

- 164 -

Fig. 2-1. Cytokine production by mouse splenocytes upon LAB stimulation.

Splenocytes were isolated from seven weeks old C57B/L6 mice and treated with L.

monocytogenes or LAB as indicated in the graph. Cytokine were measured using ELISA

kits in accordance with the manufacturer's instructions. Data are expressed as mean ±

SEM. *LM : L. monocytogenes

마우스 비장세포에 유산균을 처리하고 T cell 활성화정도를 CD69 발현을 분석하여 평가하였으

며 사람 면역세포 실험결과와 유사하게 JW15에 의한 T cell 활성화가 가장 컸다. LP76균주는

사람 PBMC 실험결과와 유사하게 T cell 활성화 유도능이 다른 균주에 비해 현저치 낮게 나

타났다. 유산균을 마우스 비장세포에 처리하였을 때 조절 T 세포의 분포에는 변화가 없었다.

Fig. 2-3. Effect of LAB treatment on the CD4+ T cell activation in mouse splenocytes

culture. Splenocytes were isolated from seven weeks old C57B/L6 mice and treated with L.

monocytogenes or LAB as indicated in the graph. Activation of CD4+ T cell were

evaluated by analyzing CD69+ cells in CD4+ T cell using flowcytometry. Data are expressed

as mean±SEM.

나. 유산균 섭취가 마우스의 면역세포 활성에 미치는 영향

마우스 비장세포를 이용한 실험에서 선발된 유산균이 사람 PBMC실험결과와 유사하게

JW15균주가 면역세포 활성화 유도능이 가장 높은 것으로 확인되었다. 본 실험에서는 선발된

유산균 섭취가 면역세포의 활성을 조절할 수 있는지 알아보고자 7주령의 마우스에 1x109

CFU의 유산균을 매일 2주간 경구 투여하였다. 이 후 비장세포를 분리하여 anti-CD3 antibody

를 이용하여 T cells을 활성화 시켰다. Fig. 2-4는 JW15 경구투여가 anti-CD3 antibody에 의

한 T cell의 활성화를 증강시켜 TNF-α생성을 촉진시키고 Th1(IFN-γ)와 Th17 (IL-17)의 분

화를 유도한다는 것을 보여준다. LGG는 TNF-α생성은 증강시켰으나 IFN-γ와 IL-17에는 영향

- 165 -

을 주지 않았으며 LP4-25는 TNF-α와 IFN-γ의 생성을 증강시켰으나 IFN-γ의 경우 통계적

유의성은 없었다. in vitro 실험에서 면역세포 활성화능이 가장 약했던 LP76은 마우스에 경구

투여하여도 T cell의 활성화를 증강시키지 않는 것으로 나타났다. 종합해보면, JW15가 마우스

에 경구투여한 경우에도 가장 우수한 면역세포활성능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다. 반

면에 LP76은 JW15 또는 LP 4-25에 비해 면역세포 활성화 유도능이 현저히 낮았다.

Fig. 2-4. Effect of LAB administration on the cytokine production induced by TCR

stimulation

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with LAB for 2 weeks.

Splenocytes were isolated and stimulated with anti-CD3 antibodies. Cytokine in the cell

culture supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the

manufacturer's instructions. Data are expressed as mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, and

*** p<0.001 indicate significant differences in comparison with control stimulated with

anti-CD3 antibodies.

앞의 실험에서는 유산균 경구 투여가 항원 비특이적인 T cell활성화와 분화를 증강시킴을

보여주었으나 L. monocytogenes와 같은 세포내 기생세균에 대한 특이적인 면역반응에 대한

활성은 확인 할 수 없었다. 따라서 L. monocytogenes에 대한 면역반응에 어떠한 영향을 미치

는지 알아보기 위해 유산균을 2주간 경구 투여한 마우스로부터 분리한 비장세포를 L.

monocytogenes으로 자극하였다. 유산균을 투여한 모든 군에서 리스테리아에 대한 TNF-α의

생성이 증강되었으며 흥미롭게도 LP76균주가 가장 높은 활성을 보였다. 선발된 모든 균주가

IFN-γ의 생성을 증강시켰지만 IL-17의 경우엔 JW15균주만이 통계적으로 유의적인 증강효과

를 보였다. LGG는 다른 균주와 달리 IL-10의 생성을 증가시키는 것으로 나타났다. 본 실험을

- 166 -

통해 선발된 유산균들 중에서 JW15가 면역반응 증강 활성이 가장 우수한 것으로 최종 확인하

였으며 이 후 리스테리아 감염실험에 사용되었다.

Fig. 2-5. Effect of LAB administration on the cytokine production induced by L.

monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with LAB for 2 weeks.

Splenocytes were isolated and stimulated with heat killed L. monocytogenes, Cytokine in

the cell culture supernatant were measured using ELISA kits in accordance with the

manufacturer's instructions. Data are expressed as mean ± SEM.* p<0.05 indicate

significant differences in comparison with control group infected with LM. * p<0.05, **

p<0.01, and *** p<0.001 indicate significant differences in comparison with control

stimulated with LM.

유산균을 섭취하게 되면 대장내 면역세포의 활성화에 영향을 주게 되고 이것이 염증성 장

질환을 예방 치료하는데 중요한 작용기전으로 알려져 있다. 따라서 면역세포 활성화능이 가장

낮은 것으로 평가된 LP76의 염증성 장질환 예방 가능성을 확인하기 위해 2주일간 유산균을 경

구투여한 마우스의 대장조직에서 cytokine 유전자 발현을 조사하였다. Fig. 2-6에 제시된 것과

같이 JW15은 TNF-α와 IFN-γ 유전자의 발현을 증가시켰으며 LGG는 IL-1β와 IL-17 유전자

발현을 증가시켜 유산균주 특이적인 유전자 발현이 유도됨을 확인 할 수 있었다. LP76은

TNF-α, IFN-γ와 IL-1β의 발현에 크게 영향을 주지 않았으며 IL-17의 발현은 증가시켰다.

- 167 -

Fig. 2-6. Effect of LAB administration on the cytokine production of in colon.

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with LAB for 2 weeks. mRNA

levels of each cytokine were measured using real time PCR in accordance with the

manufacturer's instructions. Data are expressed as mean ± SEM. * p<0.05 indicate

significant differences in comparison with control.

다. 리스테리아 급성감염모델에서 JW15의 면역증강효과 연구 (리스테리아 정맥투여)

2주일간 유산균(JW15)을 경구 투여한 마우스를 L. monocytogens을 정맥주사한 후 생존율

비교 시 대조군과 큰 차이가 없었다. 이는 L. monocytogens 급성감염에 의한 패혈증으로 마우

스가 폐사하기 때문으로 JW15의 면역증강 효능을 평가하기엔 무리가 있었던 것으로 보여진다.

하지만 간과 비장에서 생균수를 측정한 결과 JW15를 투여한 마우스에서 낮은 수의 L.

monocytogens이 검출되었다 (Fig. 2-7).

0 20 40 60 800

50

100

150JW15Cont

Time

Perc

ent s

urvi

val

- 168 -

Fig. 2-7. Effect of LAB administration on mice survival, bacterial burdens in the spleen

and liver after intravenous infection with L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with JW15 for 2 weeks and

infected with L. monocytogenes via tail vein. Survival rate was evaluated very 8 hrs upto

80 hrs post infection. The number of live bacteria in the spleen and liver was counted 40

hours after infection. Data are expressed as mean ± SEM.

리스테리아 감염에 의한 체중감소에 대한 JW15의 효과는 나타나지 않았으며 비장과 간의 체

중대비 비율도 대조군과 JW15투여군 사이에 차이가 없었다 (Fig.2-8).

Fig. 2-8. Effect of LAB administration on body weights and organ weights after

intravenous infection with L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with JW15 for 2 weeks and

infected with L. monocytogenes via tail vein. Body weights and organ weights were

measured 40 hrs infection. Data are expressed as mean ± SEM.

- 169 -

JW15를 경구투여가 리스테리아 감염에 대한 면역반응을 증강시키는지 확인하기 위해 비장과

간에서 TNF-α과 IL-1β의 양을 측정하였다. JW15를 경구투여한 경우 비장에서 TNF-α의 생

성이 유의적으로 증가하였다. 하지만, 간에서는 증가하는 경향은 보였으나 통계적으로 유의한

차이를 보이지는 않았다. IL-1β는 비장과 간에서 모두 대조군과 JW15투여군에서 비슷한 수준

으로 검출되었다.

Fig. 2-9. Effect of LAB administration on cytokine levels in the serum after intravenous

infection with L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mice were orally administered with JW15 for 2 weeks and

infected with L. monocytogenes via tail vein. Cytokine levels in the serum were measured

using ELISA kits in accordance with the manufacturer's instructions. Data are expressed

as mean ± SEM. * p<0.05 indicates significant differences in comparison with control

group infected with LM.

- 170 -

라. 리스테리아 감염모델에서 JW15의 면역증강효과 연구 (리스테리아 경구투여)

2주일간 유산균(JW15, LGG)을 경구 투여한 마우스에 L. monocytogens을 경구투여

(1x10^9 CFU)하여 감염시켰다. 실험기간동안 체충 변화에는 그룹 간 큰 차이는 없었다. 간과

비장의 무게는 L. monocytogens 감염 후 증가하였으며 JW15 또는 LGG를 경구투여한 군에서

감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의차를 보이지는 않았다.

Fig. 2-10. Effect of LAB administration on the body weight and organ weights after oral

infection with L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mouse were orally administered with JW15 for 2 weeks and

orally innoculated with L. monocytogenes. Body weight were measured every day and

shown as percent weight changes compared to initial body weight. Two days after

infection, mice were euthanized and the weights of liver and spleen were measured. Data

are expressed as mean ± SEM.

마우스는 L. monocytogens 감염 2일 후 안락사하여 간과 비장에서의 생균수를 측정하였다. 아

래 Fig. 2-11에서 보여주듯이 유산균을 투여한 군의 간에서 L. monocytogens 균주가 낮은 경

향을 보였으며 비장의 경우 JW15를 투여한 마우스에서 현저히 낮은 수의 L. monocytogens가

검출되었다. 본 결과는 JW15 경구 투여가 L. monocytogens의 생체내 제거율을 향상시켰다

는 것을 제시하며 이는 JW15에 의한 면역증강효과로 사료된다.

- 171 -

Fig. 2-11. Effect of LAB administration on bacteria burden and TNF-α levels after oral

infection with L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mouse were orally administered with JW15 for 2 weeks and

orally innoculated with L. monocytogenes. The number of live bacteria in the spleen and

liver was counted and the level of TNF-α were measured in spleen and liver after 2 days.

Data are expressed as mean ± SEM.

간과 비장에서의 TNF-α 농도를 측정한 결과 간에서는 L. monocytogens 감염 그룹 간 차이가

없었으나 비장에서는 JW15를 경구 투여한 군에서 농도가 증가하는 경향을 보였다. 비장에서

면역세포를 분리하여 면역세포들의 활성화정도를 비교하였을 때 L. monocytogens를 투여하

지 않은 그룹들에서 JW15 경구 투여군은 증가된 macrophages (CD11b+) 비율을 보였으며 L.

monocytogens 감염군들 간의 차이는 없었다. 또한 macrophages의 활성화 정도를 CD80의 발

현으로 확인해본 결과 리스테리아 감염 후 모든 군에서 macrophages가 활성화되었으나 그룹

간 차이는 없었다. Macrophages의 활성화되면 세포표면에 CD86의 발현도 증가하는데 L.

monocytogens 감염 후 유산균 투여군 (JW15, LGG)에서 증가하는 경향을 보였다. CD4+ T

cells은 활성화되면 세포표면에 CD69의 발현이 증가하는데 L. monocytogens 감염 후 모든 군

에서 CD4+ T cell이 활성화되었음을 확인하였으며 특히 JW15를 경구 투여한 군에 PBS 대조

군에 비해 CD4+ T cells 활성화가 현저히 증가하였다.

- 172 -

Fig. 2-12. Effect of LAB administration on immune cell activation after oral infection with

L. monocytogens

Seven weeks old C57B/L6 mouse were orally administered with JW15 for 2 weeks and

innoculated with L. monocytogenes by orally administration. Immune cell activation was

evaluated by using flowcytometry. Data are expressed as mean ± SEM. ** p<0.01

indicates significant difference in comparison with control group infected with LM.

면역반응을 억제하는 것으로 잘 알려진 조절세포를 분석한 결과 유산균을 경구 투여하고 리스

테리아를 감염시킨 군에서 유의성 있게 감소하였으며 특히 JW15 경구 투여군에서 감소폭이

컸다. (Fig.2-13)

Fig. 2-13. Effect of LAB administration on Tregs after oral infection with L.

monocytogens. Seven weeks old C57B/L6 mouse were orally administered with JW15 for 2

weeks and innoculated with L. monocytogenes by orally administration. Percentage of

Tregs were evaluated using flowcytometry analysis. Data are expressed as mean ± SEM. *

p<0.05 indicates significant difference in comparison with control group infected with LM.

- 173 -

3. DSS의해 유도된 대장염증질환에 대한 유산균의 예방효과 연구

□ 재료 및 방법

가. 유산균

본 실험에 사용된 유산균은 충북대학교 이완규 교수 실험실에 제공된 7종과 L. rhamnosus

GG이다. 유산균의 성장곡선을 알아보기 위해 Lactobacilli MRS broth (BD, Sparks, MD,

USA)에 37℃에서 혼탁배양 한 후 1시간 간격으로 1 ml씩 덜어내어 OD (600 nm)값과 CFU

(colony forming unit) 값을 측정하였다. 각각의 균의 생장곡선을 측정하였고 이후 실험에 쓸

유산균은 대수기의 유산균을 사용하였다. 유산균 배양액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리하여

균체를 회수하고 세척하기 위해 PBS(phosphate-buffered saline)를 넣고 3,000 rpm에서 10분간

3회 세척해 주었다. 균을 재 부유시켜 100℃ 에서 15분간 끓여 주어 heat-killed 유산균을 준비

하여 실험에 사용하였다. Heat-killed 시킨 균의 수를 측정하기 위해 heat killing 전에 MRS

agar plate에 도말하여 균의 수를 측정하였다.

Table 3-1. List of lactic acid bacteria used in this study

나. DSS에 의한 염증성 대장질환 모델

8주령의 Balb/C 마우스에 2x109 c.f.u의 heat killed 유산균을 매일 경구투여하고 대조군은

PBS를 투여하였다. 3% DSS (destran sodium sulfate)를 포함하는 수용액을 5일 동안 마우스에

공급하여 대장염 유발하고 3일후에 안락사시켜 실험에 사용하였다. 실험기간동아 체중을 측정

하였으며 설사유뮤, 육안적 출혈 유무 등을 관찰하고 기록하였다. 안락사 시킨 마우스에서 대

장을 적출하여 길이를 측정하였고 대장을 절개하여 4% formaldehyde에 고정하여 조직절편을

준비한 후 H&E염색하여 염증 및 조직손상여부 확인였다. 대장의 일부분 (직장을 기준으로

1 cm)을 48시간동안 조직배양한 후 분비된 cytokine을 ELISA로 측정하였다. 또한 대장 조직

을 균질화 한 후 total RNA를 분리하여 cytokine mRNA 발현수준을 real time PCR로 측정였

다. 또한 대장 조직을 M-PER lysis에 넣고 균질화 후 단백질을 추출하여 NF-κB pathway의 활성화

정도를 western blotting으로 측정하였다.

다. 사이토카인 측정 (Enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)

세포 외로 분비된 사이토카인 측정을 위하여 세포배양액에서의 IL-2, IL-4, IL-17, IFN-γ

(eBioscience)를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 사이토카인에 특이적으로 결합하는

capture antibody를 coating한 96 well plate에 assay diluent를 이용하여 blocking한다. 세포배

양액 시료를 처리한 후 실온에서 2시간 반응시킨다. 시료를 제거하고 well plate를 washing

buffer (0.05% Tween20 in PBS)로 세척해준다. Detection antibody를 처리한 후 실온에서 1시

간 반응시킨 후 세척한다. Peroxidase가 결합된 avidin이 detection antibody와 결합할 수 있게

Strain Identification by 16S rRNA sequence OriginLP 4-25 Lactobacillus plantarum KimchiLP76 Lactobacillus plantarum Kimchi

- 174 -

30분간 암조건에서 반응시킨다. 세척 후 peroxidase의 기질용액인 TMB substrate를 넣어 암조

건에서 반응을 유도하였으며 1 N의 황산용액을 이용하여 반응을 정지시켰다. 반응액의 흡광도

는 microplate reader (Polarstar Optima plate reader, BMG Labtech, Melbourne, Austria)을

이용하여 450 ㎚에서 측정한 후 사이토카인의 농도를 kit 내 표준용액의 정량곡선을 기준으로

계산하였다.

라. 면역세포 활성화 측정

세포를 96well plate에 원심분리하고 FACS buffer에 재 부유 시켜준 후 4℃ 2000 rpm에서

10분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 형광이 결합된 anti-CD4, anti-CD69와 anti-

CD25 antibody 또는 anti-CD11c, anti-CD80와 anti-CD86 antibody를 첨가하여 30분간 얼음

에서 염색하였다. 염색된 세포들은 FACS buffer로 2회 세척한 후 Accuri C6을 이용하여

CD3+CD4+ T cell에서 CD25와 CD69의 세포표면 발현 정도를 측정하였다.

마. 세포내 신호전달체계 활성화 측정

PBMC에 유산균을 일정 비율로 처리한 후 세포를 차가운 PBS로 세척한 후 RIPA buffer (

RIPA buffer containing 50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4 (all

other products from Sigma Aldrich), and Complete™ Mini-EDTA-free protease

inhibitococktail (Roche Diagnostics))에 넣어 10분간 얼음에서 방치한 후 원심분리 (15 min,

12000xg, 4°C) 하여 cell lysate를 준비하였다. 단백질 농도는 bradford method (Peirce)를 사용

하여 측정하였고 50 µg의 단백질을 western blotting에 사용하였다. 10% SDS-PAGE gel에

전기영동한 후 PVDF membrane에 transfer하고 blocking 과정을 거친 후 일차항체로

overnight inculation하였다. 다음 날 horse radish peroxidase-conjugated immunoglobulin G

(IgG)로 1시간동안 실온에서 incubation하고 Pierce ECL Western blotting substrate (Thermo

Scientific, Rockford, IL)로 발색 한 후 LAS4000mini imaging system (Fuji photo film,

Japan)으로 분석하였다.

바. Real time PCR

세포 펠렛에 1ml의 RNAiso (Takara, Japan)을 넣고 파이펫팅하여 세포 펠렛을 완전히 풀

어주었다. 실온에서 5분간 방치 후 200 μL chloroform을 첨가하고 용액에 우윳빛이 돌때까지

섞어주었다. 실온에서 5분간 방치한 후 12,000xg로 4°C에서 5분간 원심분리한 후 투명한 상층

액을 500 μL 덜어내어 새로운 tube에 옮기고 isopropanol 250μL를 첨가한 후 실온에서 10분간

방치하였다. 12,000xg에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 제거하고 RNA

펠렛에 1ml의 75% ethanol을 첨가한 후 vortexing 하고 750xg로 4°C에서 5분간 원심분리하

였다. 상층액을 제거하고 RNA 펠렛을 건조시킨 후 RNase free water로 녹여주었다. 추출한

RNA는 농도를 측정한 후 1 ug을 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (Takara,

Japan)를 이용하여 oligo-dT primer로 cDNA를 합성하였다. cDNA를 1:5로 희석하여 real

time PCR을 수행하였다. actin을 house keeping gene으로 사용하여 결과를 normalize하고

deltadelta CT계산하였다.

- 175 -

Table 3-2. real time PCR primer list

사. 세포 내 사이토카인 (intracellular cytokine) 측정

세포를 anti-CD3 antibody와 anti-CD28 antibody가 있는 48-well plate에 1×106cells/well농

도로 48시간 동안 배양하고, 세포 내 사이토카인 측정을 위하여 단백질 수송 억제제가 포함된

cell stimulation cocktail (eBioscience)을 4시간 동안 처리하였다. 그 후 세포는 4%

paraformaldehyde solution으로 고정하고, 1×permeabilization solution (eBioscience)을 처리하

였다. Fluorochrome이 결합된 사이토카인 특이적인 항체로 세포를 염색한 뒤, 유세포분석기

(Accuri, BD Biosciences)로 측정하였다.

□ 연구결과

5일간 3% DSS 섭취에 의한 궤양성 대장염 유발군의 체중을 시간별로 관찰한 결과, 3%

DSS 단독 섭취군은 7일째 되는 날부터 정상군에 비해 유의성 있는 체중 감소를 보였다. 2주일

간 유산균(LP76, LP4-25)을 경구투여한 마우스에 3% DSS water를 급여하여 대장염을 유발하였을

때 대장염에 의한 체중감소가 LP76에 의해서 부분적으로 예방되었다.

Geneprimer sequences 5’-->3’

Forward Reverse

IFN-γGAT GCA TTC ATG AGT ATT GCC AAG

TGTG GAC CAC TCG GAT GAG CTC

IL-17 CCA GAA GAG CCG ACA GAG AC GAG CTG CGT TCT GTT TCT CC

Foxp3 GAA ACA GCA CAT TCC CAG AGT TC ATG GCC CAG CGG ATG AG

IL-10 AGT GGA GCA GGT GAA GAG TGA CGA GGT TTT CCA AGG AGT TG

TNF-α AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG AGA GAA CCT GGG AGT CAA GGT

IL-1β ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACTCAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT

TT

actin GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA G

IL-12p35 GCC AGG TGT CTT AGC CAG TC GCT CCC TCT TGT TGT GGA AG

- 176 -

Fig. 3-1. The effect of LP76 on the mice body weight (A) colon length (B), macroscopic

pictures of colons (C). colonic histology (D)

Mice administration of 3% DSS in drinking water for 5 days (from day14-19), followed by

regular drinking water for 3 days (from day19-22), were treated with PBS, LP76 or

LP4-25 as described. Changes of body weight were evaluated daily and weight loss was

shown as % of body weight changes relative to the initial body weight. Colon length was

measured from rectum to cecum. Serial sections of colon tissues were stained with

hematoxylin and eosin, and representative pictures are shown. Data are expressed as mean

± SEM. * p<0.05 indicates significant difference in comparison with DSS group.

사료섭취량은 모든 군에서 유의적인 차이가 보이지 않았다(data not shown). 궤양성 대장염 유

발군의 실험동물의 100 %가 혈변이 나타났으며 LP 76 유산균을 투여군의 경우는 혈변 증상이

25%의 마우스에서만 관찰되었다. LP 4-25 유산균 투여군은 50% 이상의 마우스에서 혈변증상

이 나타났다. 대장염에 의한 대장 길이 변화는 LP76과 LP4-25에 의해 유의성 있게 억제되었

다. 결장조직의 H&E 이중염색소견에서 DSS 투여군에서는 염증과 궤양이 관찰되었고, 점막하

조직에 침윤된 염증세포들이 관찰되었지만 유산균 투여군에서는 위의 병리소견들이 현저히 감

소하였다. 특히, DSS에 의해 유도된 대장융모손실과 염증세포 유입이 LP76에 의해 효과적으로

억제되었다. (대장조직 H&E 염색결과)

유산균투여가 대장에서 DSS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향을 보기위해 대장

조직을 48시간 배양 후 분비된 사이토카인 양을 ELISA로 측정하였다. 대장염 억제효과가 좋은

LP76은 TNFα, IL-1β, IFN-γ, IL-17과 같은 사이토카인의 생성을 모두 억제시켰으며

LP4-25는 TNFα를 제외한 IL-1β, IFN-γ, IL-17의 생성을 억제하였다.

- 177 -

Fig. 3-2. The effect of LP76 on cytokines production in the colon of mice with colitis.

The colon was cut into 1cm and cultured in RPMI with 10% FBS and 10 μg/ml

gentamycin for 24 hrs at 37℃. After that, the supernatant was collected and analyzed by

ELISA according to the manufacturer’s instructions. Data are expressed as mean ± SEM. *

p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 indicates significant difference in comparison with DSS

group.

real time PCR로 cytokines mRNA 수준을 비교한 결과 LP76과 LP4-25에 의해 TNF, IFN-γ, IL-17의

mRNA 전사가 감소되었음을 확인하였다. 특히 LP76에 의한 IFN-γ의 발현억제가 가장 현저하였다. 염

증반응을 억제지표인 Foxp3와 IL-10 mRNA의 발현은 유산균투여에 의해 유의성 있게 변화하지

않았다.

- 178 -

Fig. 3-3. The effect of LP76 on the gene expression of pro-inflammatory cytokines in DSS

induced mice colon.

The mRNA was extracted from the colon tissues and the RNA expression was measured

by realtime PCR. Data are expressed as mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001

indicate significant differences in comparison with DSS group.

장간막 림프절에서의 Th cells 분화를 확인해 본 결과 LP76 경구투여가 장간막 림프절에서 CD4+

Th cell의 Th1과 Th17 분화를 억제한 것으로 나타났다. 두 종류의 Th cell subset은 DSS에 의한

대장염 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있으므로 LP76에 의한 대장염 예방효과는

Th cell의 분화억제에 의해 일부 설명될 수 있다. CD4+ Th cell에 의한 TNF-α생성은 LP76

와 LP4-25 경구투여에 의해 감소하였다.

Fig. 3-4. The effect of LP76 or LP4-25 on the Th1 (CD4+ IFN-γ+), Th17 (CD4+IL-17+),

CD4+TNF-α+ cells in MLN.

Cells were prepared from spleen, and incubated at 37℃ for 4hr with PMA, ionomycin,

brefeldin A. After that, cells were collected and stained with fluorescence-conjugated

anti-CD4, anti-IFN-γ, anti-IL-17, or TNF-α. The cells were gated on CD4+ cells. The

expression of IL-17 and IFN-γ in CD4+ T cells was determined . Bar graph represented

the % of TNF-α, IL-17 and IFN-γ producing CD4+ T cells. Data are expressed as mean

± SEM. * p<0.05 indicates significant difference in comparison with DSS group.

장간막 림프절 결과와는 달리 비장에서의 Th1과 Th17 분화는 LP4-25에 의해 억제되었으며

비장에 있는 CD4+ Th cell에 의한 TNF-α생성은 LP76와 LP4-25에 의해 억제되었다.

- 179 -

Fig. 3-5. The effect of LP76 or LP4-25 on the Th1 (CD4+ IFN-γ+), Th17 (CD4+IL-17+),

CD4+TNF-α+ cells in spleen.

Cells were prepared from spleen, and incubated at 37℃ for 4hr with PMA, ionomycin,

brefeldin A. After that, cells were collected and stained with fluorescence-conjugated

anti-CD4, anti-IFN-γ, anti-IL-17, or TNF-α. The cells were gated on CD4+ cells. The

expression of IL-17 and IFN-γ in CD4+ T cells was determined. Bar graph represented the

% of TNF-α, IL-17 and IFN-γ producing CD4+ T cells. Data are expressed as mean ±

SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 indicate significant differences in comparison with

DSS group.

Fig. 3-6. Effect of LP76 and LP4-25 administration on the Tregs in the mice with colitis.

Cells were isolated and stained with CD25, foxp3. After that, cells were analyzed with flow

cytometry and gated on CD4+ cells. (A) spleen (B) mesenteric lymph node. Data are

expressed as mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 indicate significant

differences in comparison with DSS group.

- 180 -

DSS에 의한 대장염은 대장조직에서 NF-κB이 발현과 활성화를 증가시키는 것으로 알려졌다.

증강된 NF-κB 활성화는 다양한 종류의 유전자발현을 조절함으로써 염증반응에 필수적인 역할

을 한다. 그러므로 유산균 경구투여에 의한 대장염 예방효과가 대장조직에서의 NF-κB 신호전

달경로의 과도한 활성화를 억제시킨 결과인지를 확인해 보았다. 아래 그림에서와 같이 DSS는

대장조직에서 NF-κB를 활성화시켜 p65 subunit의 인산화를 증가시켰으며 LP76와 LP4-25 경

구투여에 의해 인산화된 p65의 양이 감소하였다. 대장염 관련 여러지표에 있어 개선효과가 좋

아던 LP76이 LP 4-25보다 NF-κB 신호전달경로를 강하게 억제하였다.

Fig. 3-7. The effect of LP76 on the NF-κB pathway. The colons were removed from mice

and homogenized in RIPA buffer containing 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 50 mM

NaF, 0.2 mM Na3VO4, and protease inhibitor tablets. Protein extraction from colons was

separated using SDS-PAGE gel. Primary antibodies against pp65, p65, pIκB-α, β-actin

were used.

- 181 -

5절 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발(3협동

과제)

1. 홍삼 전분을 활용한 유산균 배양 배지 개발

□ 재료 및 방법

가. 재료 및 균주

유산균 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides sub sp.는 농촌진흥청 농업유

전자원센터로부터 분양 받아 사용 하였다. 연구에 사용한 홍삼 전분은 홍삼 농축액을 만드는

공정중에 불용성 성분으로 분리되는 미이용 자원으로 홍삼 고유의 진세노사이드를 포함하고

있고 유리당 및 유기산을 포함하고 있어 미생물 증식에 유익한 원료로 사용 될 수 있는 조건

을 갖추고 있다. 본 연구에 사용한 홍삼 전분은 충남 금산군 소재 ㈜성신비에스티의 100% 홍

삼에서 분리된 홍삼전분을 연구용으로 기탁받아 사용하였으며 유산균 배양에 필요한 MRS

broth, proteose peptone, beef extract, yeast extract, agar등은 BD (Becton Dickinson and

company, New Jersey, USA)를 이용하였고, 그 외 사용된 용매 및 시약은 Sigma-Aldrich Co.

(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용 하였다.

나. 홍삼전분의 제조

실험에 사용한 홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생하는 홍삼 추출액에서 가라앉은

불용성 성분을 수거하여 원심분리 후 페이스트 상태로 제조되며, 제조 후 –20℃에서 냉동 보

관하면서 실험에 이용하였다.

다. 배지 제조

대조구의 배지로는 MRS 배지를 사용하였으며, 균주 증식 및 발효에 사용된 미네랄 배지

(mineral medium : MM)는 증류수 1L에 K2HPO4 3g, FeSO4.4H2O 0.01g, MnSO4.7H2O 0.01g,

NaCl 0.01g, CaCO3 0.05g, Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA) 0.1g을 용해하여 pH를 6.5로 보정하

여제조하였다. 미네랄배지에 0.5% Yeast extract를 포함하였을 때는 MMY로 표기 하였다. 각 배

지에 홍삼 전분 및 식물 추출물 10%를 첨가하여 본 실험에 사용하였다.

라. 유산균 배양

홍삼 전분 MMY 배지에서 전배양한 배지 10%을 본배양 배지에 접종하여 배양하였으며, 전

배양은 진탕 배양기 (Jssi-300CL, JSR, Korea)에서 30℃, 120 rpm 조건으로 24시 간 동안 진

탕 배양하였고, 본 배양을 위한 종균으로 사용하였다. 본 배양을 위한 홍삼 전분 MMY 배지의

조성은 MMY 에 홍삼 전분이 2, 5, 10, 20%(w/v), 그리고 효모추출물은 2, 5, 10%(w/v)로 첨

가하여 제조하였으며, 각각의 조건에서 유산균의 증식 상태를 관찰하였다. 본 배양은 working

volume 300 mL의 홍삼 전분 배지에 종균 10%를 무균적으로 공급을 하고, 30℃, 120 rpm 조

건으로 72시간동안 수행하면서 생균수를 측정하였다.

- 182 -

마. 유산균 생균수 측정

각각 배지로부터 유산균 균수을 채취 후 멸균 생리식염수(0.9%NaCl)를 사용하여 10진 희석

법에 따라 희석한 후, BCP첨가 평판측정용 한천배지 (peptone, yeast extract, dextrose, tween

80, cystein, bromocresol purple, agar) 를 배지로 사용하여 30℃에서 후, 생성된 집락을 3회

반복하여 측정 하였다.

바. 홍삼전분 성분 분석

홍삼전분의 진세노사이드 함량은 홍삼전분 분말 시료 0.5g을 농축용 플라스크에 평량해 넣

고 수포화부탄올 50 ㎖을 첨가하고 80℃ 환류냉각 추출기에서 1시간 추출하였으며, 10분간 방

냉 후 추출액을 여과하고 잔사에 다시 동량의 용매를 넣어 2회 반복 추출 하였다. 총 3회 추출

된 추출액은 분액 깔대기에 옮기고 150 ㎖ 증류수를 가하여 진탕한 후 부탄올 층과 물 층을

분리하고 물층을 제거하고 남은 부탄올 층을 농축 플라스크에 모아 45℃ 수조에서 rotary

evaporator를 이용하여 진공농축 하였다. 농축 후 잔류물을 50% MeOH 20 ㎖에 녹여

membrane filter로 여과 후 HPLC를 이용하여 측정 하였다. HPLC 분석은 μ-Bondapak C18

(3.9 mm × 150 mm, 5μm) column을 사용하여 203 nm에서 분석 하였다.

홍삼 전분의 유리당 분석은 홍삼전분 시료 10 g을 10 ㎖ 증류수에 현탁하고 80℃ water

bath에서 30분간 추출 후 원심분리하고 상등액을 membrane filter로 여과 후 carbohydrate

cartridge column (waters, USA)를 이용하여 HPLC로 분석 하였다.

사. 유산균에 대한 홍삼전분의 효과

홍삼전분의 동결건조 보호제로의 효과를 알아보기 위해 홍삼전분 MMY 배지에서 배양한 유

산균을 원심분리(Hanil Supra-25k, 10,000xg)를 10분간하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는

동결건조보호제(skim milk), 홍삼전분 그리고 동결건조보호제와 홍삼전분을 혼합하여 균질화한

후 –40℃로 동결시킨 다음 동결건조기(Il Shin Lab)에서 건조하였다. 건조된 균체는 분쇄하여

분말화시킨 다음 멸균 생리 식염수에 단계 희석하여 BCP 배지에 도말한 후 30℃에서 72시간

배양한 다음 생균수를 측정하여 동결건조 후의 생존수를 측정하였다. 이때 홍삼전분은 80℃에

서 6시간 열수 추출 후 filter 후 건조시켜 사용 하였다. 또한 동결건조 보호제에 따른 유산균

의 내산성을 시험하기 위해 인공위액 (Kobayashi et al. 1974)의 방법에 따라 HCl을 사용하여

pH를 3.0으로 조정한 홍삼전분 MMY 배지 (pepsin 1.0% 첨가) 30℃로 맞추어 30분간 방치 후

멸균 생리 식염수에 단계 희석하여 BCP배지에 도말하여 생균수를 측정 하였다.

- 183 -

□ 연구 결과

가. 홍삼전분 진세노사이드 및 유리당 분석

홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 부산물로 홍삼 추출액 중 침강되는 불용성 성분을

수거하여 원심분리 후 만들어 실험에 사용하였다. 홍삼 전분은 불용성 성분으로 아직 까지는

그 이용 가치 또는 활용 방법에 대한 연구가 거의 이루어지지 않았다. 홍삼 전분은 전분, 조단

백, 지방산 등 일반 성분뿐 아니라, 홍삼에 존재하는 진세노사이드를 포함하고 있어 기능성 소

재로 개발 가능성이 있는 물질이다. HPLC system를 이용하여 진세노사이드 함량을 측정한 결

과, Fig. 1-1과 같이 홍삼에서 발견되는 Rg3와 compound-K를 각각 0.52 mg/g과 0.1 mg/g을

포함하고 있는 전형적인 홍삼의 특징을 가지고 있었으며, 다양한 진세노사이드를 포함하고 있

어 (Fig. 1-1, 1-2) 홍삼의 기능을 이용할 수 있는 기능성 배지로 사용될 수 있을 뿐 아니라,

효능 면에서도 우수한 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

Fig. 1-1. Ginsenoside contents in red ginseng starch. Data represent the means of three

separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 184 -

Fig. 1-2. Chromatogram of ginsenosides in red ginseng starch

홍삼 전분의 유리당 함량을 분석한 결과는 Fig. 1-3과 같이 총 유리당 함량은 3.6 mg/g으로

sucrose 2.3 mg/g, glucose 0.6 mg/g, mannose 0.1 mg/g, 그리고 fructose 0.3 mg/g으로 측정

되었다. 홍삼 전분의 유리당은 유산균의 생장에 필요한 탄소원으로 사용될 수 있으며 기존에

미생물 배양에 필요한 유리당의 증식 효과와 같은 결과를 보여주었으나, 산도는 강하게 나타나

지 않아서 기존 유리당보다는 산미가 온화하여 식품개발 배지로 사용할 수 있는 가능성을 확

인하였다. 또한 주사형 전자현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM)을 통해 홍삼 전분의

입자 구조를 살펴 본 결과 (Fig. 1-4) 홍삼 전분의 형태는 저항전분 (resistant starch class 3)

의 특성을 가지고 있어 기능성 저항 전분으로서의 개발 가능성도 높을 것으로 생각 된다. 홍삼

전분은 홍삼 농축액 제조 시 발생하는 부산물 이지만 홍삼 고유의 진세노사이드 및 유리당을

함유하고 있어 저가의 소재 임에도 다양한 분야의 개발 가능성이 클 것으로 생각 되어 진다.

Fig. 1-3. Contents of free sugars in red ginseng starch. Data represent the means of

three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 185 -

Fig. 1-4. SEM image of red ginseng starch

나. 홍삼전분 배지에서 유산균 생육중 pH 및 총균수 변화

홍삼 전분 배지에서 유산균을 배양 시 유산균 발효에 의한 pH 및 총 균수 변화를 확인하기

위하여, L. plantarum 과 L. mesenteroides sub sp.을 MM 배지, 홍삼 전분 배지 그리고 질소

원(Yeast extract)을 첨가한 홍삼 전분 배지에서 배양하면서 pH 및 생균수를 측정 하여 Table

1-1, 1-2에 나타내었다. Table 1-1에서 MM 배지에서 배양한 유산균의 총 균수는 1.0×107

CFU/mL, pH는 7.47 이었으며, 홍삼 전분 10%로 배양한 유산균의 총 균수 및 pH는 L.

plantarum, L. mesenteroides sub sp.는 1.4×1010 CFU/mL, L. mesenteroides sub sp은

2.9×1010 CFU/mL 그리고 pH 는 각각 4.62와 4.17이었다. Table 1-2에서 홍삼 전분 배지 10%

에 질소원 5%을 첨가하여 유산균을 배양하였을 때, 유산균의 총 균수 및 pH는 L. plantarum

는 2.8×1010 CFU/mL, L. mesenteroides sub sp은 5.3×1010 CFU/mL 그리고 pH는 각각 4.51와

3.69로 측정되었다. 홍삼 전분 농도 0∼2%에서는 총 균수는 L. plantarum는 2.0×107∼4.6×108

CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp은 1.0×107∼3.6×109 CFU/mL 로 측정되었으며, 홍삼

전분의 농도가 증가할수록 총 균수는 증가하였다. 그러나 배양 시간이 증가할수록 pH는 감소

하였으나, 배양액의 산성화에 따른 유산균의 증식에는 영향을 미치지 않았다. MM 배지에서는

유산균 생장 총 균수가 1.0×107 CFU/mL까지 성장하였으나, pH는 감소하지 않았다. 이것은

MM 배지에 포함되어 있는 미네랄 성분에 의하여 산도가 변하지 않았으며, 유리당 같은 성장

에 필요한 영양분 부족으로 성장에는 한계가 있는 것으로 확인되었다. 또한 홍삼 전분의 함유

량이 증가할수록 미생물의 총 균수는 증가하였으며, pH도 감소하였다. 따라서 홍삼 전분에 포

함되어 있는 유리당 성분들이 유산균 성장에 영향을 미친 것으로 확인되었다.

- 186 -

Table 1-1. pH change of culture media of red ginseng starch according to the culture time

at 72hr of L. plantarum and L. mesenteriodes.

StrainsGinseng starch

(%)pH

Bacterial number

(cfu/㎖)1)

L. plantarum

0 7.47 1.0×107±0.5

2 6.74 1.9×109±0.4

5 5.25 7.1×1010±0.4

10 4.62 1.4×1010±0.6

20 4.43 8.5×1010±0.7

L. mesenteriodes

0 7.61 1.0×107±0.6

2 6.30 1.6×107±0.3

5 4.39 6.9×108±0.3

10 4.17 2.9×1010±0.7

20 4.11 9.9×1010±0.6

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

- 187 -

Table 1-2. pH change of culture media of red ginseng starch with yeast extract according

to the culture time at 72hr of L. plantarum and L. mesenteriodes

StrainsGinseng

starch(%)

Yeast

extract(%)pH

Bacterial

number(cfu/㎖)1)

L. mesenteriodes

0

2 7.81 2.3×107±0.6

5 7.96 4.2×107±0.7

10 6.85 3.1×107±0.3

2

2 6.45 1.5×107±0.3

5 4.52 4.6×108±0.2

10 4.57 3.2×108±0.3

5

2 4.63 3.6×108±0.5

5 4.83 5.7×109±0.4

10 4.19 9.8×108±0.3

10

2 5.17 1.3×1010±0.5

5 4.51 2.8×1010±0.7

10 4.97 5.9×1010±0.1

20

2 3.89 8.8×109±0.2

5 3.94 4.6×1010±0.7

10 4.55 8.1×1010±0.5

L. plantarum

0

2 7.78 3.1×107±0.4

5 7.90 1.2×107±0.3

10 6.90 2.1×107±0.7

2

2 4.35 1.8×107±0.7

5 4.28 3.7×109±0.7

10 4.36 3.6×109±0.1

5

2 3.75 6.3×1010±0.2

5 3.66 9.2×1010±0.6

10 3.64 8.6×1010±0.3

10

2 3.67 1.4×1010±0.8

5 3.69 5.3×1010±0.5

10 3.72 5.6×1010±0.7

20

2 4.10 7.1×1010±0.9

5 3.86 8.2×1010±0.8

10 3.82 8.0×1010±0.7

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

- 188 -

다. 홍삼전분의 동결건조 보호제로의 효과

본 연구에서는 유산균의 동결 건조 시 이미 알려진 동결 건조 보호제 (skim milk)와 본 연

구에서 사용하는 홍삼 전분 그리고 동결 건조 보호제와 홍삼 전분을 첨가하였을 때, 동결 건조

후 생균수의 변화에 미치는 영향을 관찰하였다. Fig. 1-5에서는 각각의 조건에서 유산균의 생

존율을 시험한 결과, skim milk를 2%와 10%를 첨가하였을 때, L. plantarum는 2.0×107

CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp.는 3.0×107 CFU/mL의 생존 효과를 보였고, 홍삼

전분 2%와 10%는 L. plantarum는 9.7×104 CFU/mL와 2.0×106 CFU/mL 그리고 L.

mesenteroides sub sp은 2.0×105~6 CFU/mL 또한 홍삼 전분 10%+skim milk 2%는 L.

plantarum는 5.2×109 CFU/mL 그리고 L. mesenteriodes sub sp은 5.3×109 CFU/mL로 측정되

었다. 홍삼 전분에 Skim milk를 혼합하여 동결 건조 보호 효과를 측정하였을 때, Skim milk

및 홍삼 전분 단독으로 처리한 효과보다는 생존균수가 높게 측정되었다. 홍삼 전분 단독 투여

시 농도가 증가할수록 보호 효과는 10배 정도가 증가하였으나, 기존 보호제인 skim milk와 비

교하였을 때는 그 효과가 100배 정도 낮게 측정되었다. 따라서 홍삼 전분의 효과와 기존 보호

제와의 효과를 이용하면 100∼1,000배 정도 향상 효과가 증가되었음을 확인하였다. 홍삼 전분

이 포함하고 있는 유리당 및 성분들과 기존 보호제의 단백 성분들과의 상승 보호 효과에 의해

서 단독 처리군보다는 생존 총 균수가 100∼1,000배 정도 높은 결과를 보여 유산균 생균제 제

형 제작에 저렴한 보호제로 사용 가능할 것이다.

Fig. 1-5. Effect of freeze-drying cryoprotectant agents for viable cell number.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 189 -

라. 동결건조 분말의 인공위액에서의 생존 효과

동결 건조 보호제로 건조된 홍삼 전분 분말로 실험한 결과를 Fig. 1-6과 같이 나타 났다. 인

공 소화전의 L. plantarum는 8.7×109 CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp.은 9.0×1010

CFU/mL이었으나, 소화 후, skim milk 10%에서는 L. plantarum는 5.4×107 CFU/mL 그리고 L.

mesenteroides sub sp.은 3.3×107 CFU/mL, RGS 10%에서는 L. plantarum CFU/mL는 2.9×107

CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp.은 3.5×107 CFU/mL 또한 SM 2%와 RGS 10% 에

서는 L. plantarum는 7.4×109 CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp.은 3.1×109 CFU/mL로

측정되었다. SM 2%와 RGS 10%를 혼합한 보호제의 유산균이 다른 조건보다는 인공 위액에서

의 생존 효과가 높게 측정되었다. 유산균 제품은 위산에서 견딜 수 있는 제형의 안정성이 중요

한 요소로 작용 하는데 (Ozlem et al 2011), 본 결과에 따르면 홍삼 전분은 이러한 조건을 충

족시킬 수 있는 보호제로 유산균 제품의 다양화를 위해 사용가능한 새로운 소재라 할 수 있겠

다.

Fig. 1-6. Effect of freeze-drying cryoprotectant agents by artificial gastric juice for viable

cell number.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 190 -

2. 식물 소재를 이용한 유산균 배지 개발

□ 재료 및 방법

가. 재료 및 균주

기능성 유산균 Weissella cibaria JW15는 협동 연구 기관인 충북대학교 수의과 대학으로부

터 분양 받아 사용하였으며 대조 균주로 Lactobacillus rhamnosus GG는 Vision biochem(주)

(Korea)에서 구매하여 사용 하였다. 본 연구에 사용한 배추, 상추, 흑태, 서리태등 농산물은 충

남 금산군 소재 재래시장 및 대형 마트에서 국내산 재료를 구매하여 사용하였다.

나. 농산물 시료 제조

배추, 상추, 깻잎은 동결건조기 (Ilshin Lab Co., Ltd, Korea)를 이용하여 동결건조 후 분쇄하

여 사용 하였고, 흑태, 서리태는 생시료를 분쇄하여 추출을 진행 하였다. 분말 시료 무게에 10

배에 달하는 70% 주정 또는 증류수를 가하여 상온 또는 70℃에서 24시간 동안 2회 추출하여

여과지를 이용하여 여과한 다음 회전진공농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한

후 동결건조 및 분쇄하여 시료를 제조 하였다.

다. 유산균 배양

홍삼 전분 MMY 배지에서 전배양한 배지 10%을 본배양 배지에 접종하여 배양하였으며, 전

배양은 진탕 배양기 (Jssi-300CL, JSR, Korea)에서 30℃, 120 rpm 조건으로 24시 간 동안 진

탕 배양하였고, 본 배양을 위한 종균으로 사용하였다. 본 배양을 위한 홍삼 전분 MMY 배지의

조성은 MMY 에 홍삼 전분이 2, 5, 10, 20%(w/v), 그리고 효모추출물은 2, 5, 10%(w/v)로 첨

가하여 제조하였으며, 각각의 조건에서 유산균의 증식 상태를 관찰하였다. 본 배양은 working

volume 300 mL의 홍삼 전분 배지에 종균 10%를 무균적으로 공급을 하고, 30℃, 120 rpm 조

건으로 72시간동안 수행하면서 생균수를 측정하였다.

라. 유산균 생균수 측정

각각 배지로부터 유산균 균수을 채취 후 멸균 생리식염수(0.9%NaCl)를 사용하여 10진 희석

법에 따라 희석한 후, BCP첨가 평판측정용 한천배지 (peptone, yeast extract, dextrose, tween

80, cystein, bromocresol purple, agar) 를 배지로 사용하여 30℃에서 후, 생성된 집락을 3회

반복하여 측정 하였다.

- 191 -

□ 연구 결과

가. 농산물을 이용한 유산균 배양

국내산 농산물 (배추, 흑태, 서리태) 추출물 2%와 10% yeast extract를 함유한 배지를 이용

하여 유산균 W. cibaria JW15와 L. rhamnosus GG를 배양한 결과 Table 2-1∼2-3와 같이 모

두 1×108 CFU/mL 이상 총균수를 확인하였다. W. cibaria JW15는 배추 추출물 보다 흑태 또

는 서리태 배지에서 좀더 빠른 성장 및 총균수를 나타내었고 이는 유산균 배지인 MRS 배지와

총균수를 비교 하였을 때 비슷한 정도를 나타내는 것으로 확인하였다. 또한 유산균 배양에 따

른 pH와 총산도 변화를 측정한 결과 배양 시간에 따라 pH는 다소 낮아져 약 pH 4.5정도로 되

었으나 총 산도는 배양 초기와 비교 시 큰 변화가 없는 것으로 확인 되었다 (Fig. 2-1∼2-3).

이는 배양 시간이 지날수록 pH는 감소하였으나 배양액의 산성화에 따른 유산균의 증식에는 영

향을 미치지 않는 것으로 판단된다. W. cibaria JW15 배양에 있어 배추, 흑태, 서리태 모두

MRS와 비슷한 균 성장을 보이지만 성장 속도에 있어 서리태가 우수한 것으로 확인하였다.

Table 2-1. Growth of LAB in chinese cabbage medium

배양시간 (h)총균수 (CFU/mL)

W. cibaria JW15 L. rhamnosus GG

0 0 1.5×109

6 0 2.7×109

12 0 1.9×1010

18 3.3×106 1.2×1010

24 8.3×107 1.3×1010

36 3.4×108 3.6×109

48 1.0×108 7.7×109

72 5.7×107 1.7×1010

Table 2-2. Growth of LAB in huktae (Black soybean) medium

배양시간 (h)총균수 (CFU/mL)

W. cibaria JW15 L. rhamnosus GG

0 8×107 5×108

6 0 1×109

12 0 2×109

18 3×108 2×109

24 2×109 5×109

36 2×108 7×109

48 3×107 3×109

72 1×107 5×109

- 192 -

Table 2-3. Growth of LAB in seoritae medium

배양시간 (h)총균수 (CFU/mL)

W. cibaria JW15 L. rhamnosus GG

0 0 1×1011

6 7×108 5×109

12 2×109 6×109

18 1×109 7×109

24 3×108 7×109

36 1×108 5×109

48 2×108 0

72 0 0

Fig. 2-1. Change of pH and total acidity in chinese cabbage medium

Fig. 2-2. Change of pH and total acidity in huktae medium

- 193 -

Fig. 2-3. Change of pH and total acidity in seoritae medium

나. 서리태 추출물을 이용한 유산균 대량 생산 연구

상기 시험을 통해 서리태 추출물을 이용하여 유산균을 배양 하는 것이 가장 좋은 결과를 타

나 낼 것으로 생각 되지만 우엉, 홍삼전분등 탄수화물이 풍부한 식물성 소재를 이용하여 W.

cibaria JW15의 배양 시험을 진행 하였다. Fig 2-4, Table 2-4과 같이 홍삼전분 보다는 서리태

와 우엉 추출물을 이용했을 경우 7×109 CFU/mL의 총균수를 나타 내어 좋은 것으로 확인 되

었고 질소원으로서 yeast extract와 peptone에 대한 차이는 크게 나타나지 않았다.

서리태 추출물과 홍삼전분 혼합 배지 제조를 위해 서리태 추출물과 홍삼전분의 혼합 비율 및

최적 농도를 확인한 결과 Table 2-5과 같이 서리태, 홍삼전분 비율 3:1인 혼합배지에서 5×109

CFU/mL의 총균수를 확인 하였고 최적 비율에서 서리태, 홍삼전분 혼합물의 최적 농도를 확인

한 결과 Table 2-6과 같이 30 g/L에서 2×1010 CFU/mL의 총균수를 확인 하였다. 위 결과를 종

합해 볼 때 W. cibaria JW15 배양에 있어 서리태와 홍삼전분의 최적 비율 및 질소원 설정 결

과 서리태 22.5 g/L, 홍삼전분 7.5 g/L, yeast extract 20 g/L를 최적 배지로 선정하였다.

(A) (B)

Fig. 2-4. Effect of C-source and N-source on W. cibaria JW15 growth

(A) Effect of C-source (B) Effect of N-source.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 194 -

Table 2-4. The optimum concentration of C-source and N-source on growth of LAB

(CFU/mL)

조성물 StrainConcentration (g/L)

1 5 10 20 30 50

C-source

서리태JW15 1×108 4×108 1.1×109 1.8×109 4×109 9×108

LGG 2×108 3×108 1.4×109 3.2×109 2.8×109 7×108

우엉JW15 1×108 1.7×109 1.8×109 1×109 1.2×109 1.5×109

LGG 3×108 1.1×109 2.1×109 1.8×109 1.5×109 8×108

N-source

Yeast

extract

JW15 5×108 3×108 9×108 3.3×109 2.3×109 2.2×109

LGG 3×108 3×108 1.2×109 2.4×109 2.8×109 1.9×109

peptoneJW15 1.1×109 1.3×109 1.6×109 1.2×109 1×109 9×108

LGG 5×108 3×108 9×108 8×108 7×108 9×108

Table 2-5. Optimum ratio of seoritae and red ginseng starch on growth of W. cibaria

JW15 (CFU/mL)

서리태 (g/L) 0 5 10 15 20

홍삼전분 (g/L) 20 15 10 5 0

총균수 (cfu/ml) 1.3 ± 8.1×108 2.8 ± 3.5×109 1.1 ± 3.4×109 5.3 ± 8.1×109 2.6 ± 5.1×109

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

Table 2-6. Optimum concentration of seoritae and red ginseng starch mixture on growth of

W. cibaria JW15

서리태 + 홍삼전분 농도 (g/L) 총균수(CFU/mL)

10 7.6 ± 1.2 ×108

20 5.3 ± 2.1 ×109

30 2.6 ± 1.5×1010

40 3.3 ± 1.5×1010

50 2.6 ± 1.2×1010

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

- 195 -

Fig. 2-5 Growth curve of W. cibaria JW15 in 30L fermenter using Seoritae medium

다. W. cibaria JW-15의 당 이용 능력 시험

기능성 유산균 W. cibaria JW-15 배지 탄소원으로 선정한 서리태의 유리당 함량을 분석한

결과 Fig. 2-6와 같이 sucrose의 함량이 72.3 mg/g으로 가장 높게 측정되었다. 당 이용능 평가

용 배지를 이용하여 유산균 생육을 확인한 결과 W. cibaria JW-15는 glucose와 fructose 이용

능이 가장 우수한 것으로 확인 되었고 sucrose 역시 높은 이용율을 나타내고 galactose에 대한

이용능은 낮은 것으로 확인되었다.

Fig. 2-6. Free sugar contents in seoritae.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 196 -

Fig. 2-7. Effects of carbon source (sugars) on growth of W. cibaria JW15.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

라. 다빈도 농산물을 이용한 W. cibaria JW-15 배양 배지 개발

상기 시험에서 확인된 서리태 뿐 아니라 국내에서 많이 소비되는 농산물인 상추, 깻잎을 이

용한 W. cibaria JW-15의 배양 배지 개발을 알아보기 위해 상추와 깻잎을 각각 열수 추출과

주정 추출을 진행 하고 이를 동결건조하여 배지에 탄소원으로 첨가하여 유산균 증식능을 확인

해 보았다. 그 결과 Table 2-7과 같이 대조군인 서리태 배지에는 미치지 못하지만 상추 열수

추출물을 첨가한 배지에서 MRS 배지와 유사한 1.5×108 CFU/mL의 유산균 성장을 나타내었다.

깻잎을 이용한 배지는 열수, 주정 추출 모두 유산균 성장에는 적합하지 않는 것으로 확인 되었

다. 상추의 일반 성분을 분석해본 결과 Fig. 2-8, 2-9과 같이 탄수화물 함량이 높고 유리당중

glucose 함량이 높아 유산균 배양에 적합 할 것으로 사료 된다.

상추 배지를 이용하여 유산균 배양시 유산균 총균수를 높이기 위해 보조 탄소원 및 질소원

첨가에 따른 유산균 성장을 확인한 결과 보조탄소원으로 glucose를 첨가하고 질소원으로 yeast

extract를 첨가한 경우 가장 높은 유산균 성장을 확인할 수 있었다 (Table 2-8). 또한 탄소원

인 상추 추출물과 보조 탄소원 glucose의 혼합 비율을 설정한 결과 Table 2-9와 같이 1:1 배

율에서 가장 좋은 유산균 성장을 타나 냈으며 탄소원과 질소원의 농도는 Table 2-10과 같이

탄소원 20 g/L, 질소원 15 g/L에서 가장 높은 유산균 총균수를 확인 할 수 있었다.

일반적인 유산균 성장에 있어 Mg, Mn, Na등의 미량 원소가 유산균 성장에 필수적으로 알려

져 있는데 상추 추출물을 이용한 유산균 배양 배지에서는 미량 원소의 첨가에 따른 영향이 없

는 것으로 확인되었다 (Table 2-11). 상기 결정된 배지를 이용하여 3.5 L scale의 fermenter에

서 W. cibaria JW-15를 배양한 결과 Fig. 2-10과 같이 상업용 배지인 MRS 배지와 유사한 결

과를 얻을 수 있었다. 따라서 국내에서 많이 생산되고 소비되는 상추의 경우 폐기되는 양 역시

많은 것으로 알려져 있는데 이렇게 폐기되는 상추를 이용하여 기능성 유산균 생산이 가능할

것으로 생각된다.

- 197 -

Table 2-7. Effects of plant extracts on growth of LAB (CFU/mL)

Fig. 2-8 Analysis of general component in lettuce.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

Fig. 2-9. Free sugar conetnts of lettuce.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

MRS 서리태 열수 상추 주정 상추 열수 깻잎 주정 깻잎 열수

W. JW15 1.4×108 5.4×109 1.2×107 1.5×108 2.3×103 2.6×107

L. rhamnosus GG 2.1×109 3.2×109 2.1×107 5.4×108 1.1×103 3.7×107

- 198 -

Table 2-8. Optimization of C-source and auxiliary C-source on growth of W. cibaria JW15

(CFU/mL)

C source

(5 g/L)

Auxiliary C

source (5 g/L)

N source (10 g/L)

Yeast

extractPeptone

Yeast extract

+ PeptoneNone

상추열수추출물Glucose 5×109 9×108 8×108 3×107

None 7×108 2×108 5×108 7×106

상추주정추출물Glucose 1×109 3×108 5×108 5×105

None 2×107 2×107 6×107 2×104

Table 2-9. Optimum ratio of C-source and auxiliary C-source on growth of W. cibaria

JW15 (CFU/mL)

상추 추출물(g/L) 0 5 10 15 20

Glucose (g/L) 20 15 10 5 0

총균수 (cfu/ml) 2.3±0.2 ×108 3.4±0.4 ×109 7.8±0.7 ×109 1.5±0.4 ×109 8.1±0.4×108

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

Table 2-10. Optimum concentration of C-source and N-source on growth of W. cibaria

JW15 (CFU/mL)

탄소원(g/L) 0 5 10 15 20 25 30

총균수(cfu/ml)

1.3±0.2

×1031.4±0.1 ×107 6.8±0.2 ×108 1.1±0.2 ×109 9.1±0.5×109 7.7±0.2×109 7.1±0.1×109

질소원(g/L) 0 5 10 15 20 25 30

총균수(cfu/ml) 3.7.±0.1 ×107 2.3±0.1 ×109 7.1±0.2 ×109 2.3±0.2 ×1010 9.5±0.3×109 8.6±0.1×109 8.1±0.2×109

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

Table 2-11. Effect of minerals on growth of LAB (CFU/mL)

Blank Mg Mn Na Mg+Mn+Na

LGG 5.3×109 4.8×109 6.2×109 6.2×109 5.1×109

JW 15 1.7×1010 2.5×1010 9.4×109 7.6×109 8.8×109

- 199 -

(A) (B)

Fig. 2-10. Growth curve of W. cibaria JW15 in 5L scale fermentor.

(A) Lettue medium, (B) MRS medium.

마. W. cibaria JW-15 동결건조 조건 확립

경제적인 동결건조 보호제를 개발하기 위하여 기존에 사용되던 skim milk와 더불어 홍삼전

분을 사용하여 시험을 실시하였다. 다만 유산균 동결건조 분말 제조 시 홍삼전분의 불용성 침

전물에 의한 영향을 최소와 하기 위해 초기 배양 및 동결건조 보호제로 사용되는 홍삼전분은

80℃에서 6시간 열수 추출한 후 filter후 건조시켜 사용 하였다. 전처리된 홍삼 전분을 사용하

여 기능성 유산균 배양시 총균수에 큰 변화 없이 1×109 CFU/mL이상 확인 하였고 동결 건조

보호제로 사용 하였을 경우 100배 이상 향상된 결과를 나타 내었다. 동결건조 보호제로 skim

milk와 홍삼전분을 단독 혹은 혼합 사용하였을 경우 Table 2-12.과 같이 2% skim milk와

10% 홍삼전분을 혼합 사용하였을 경우가 가장 좋은 결과를 나타 내었다. 기능성 유산균(W.

cibaria JW-15)의 경제적인 대량 배양 및 생산을 위해 식물 추출물등을 이용한 유산균 배양

배지를 개발하였다. 기능성 유산균(W. cibaria JW-15)의 배양을 위해 서리태 추출물과 홍삼전

분을 이용하여 유산균 배양 배지를 개발 하였고 이를 이용하여 30L fermentor에서 대량 배양

을 진행 하였다. 또한 동결건조 공정에 첨가되는 동결건조 보호제 개발을 위한 홍삼전분 전처

리 공정을 설정하고 이를 이용하여 1×1012 CFU/mL이상의 총균수가 확보된 동결건조 분말을 제

조 하였다. 식물 추출물 및 홍삼전분을 이용한 기능성 유산균 배지 제조 및 이를 이용한 동결건조

분말 소재 제조를 통해 면역 활성이 강화된 기능성 유산균에 대한 산업적 이용성을 높일 수 있을

것으로 사료된다.

- 200 -

Table 2-12. Effect of freeze-drying cryoprotectant agents for viable cell number

Cryoprotectant agent Viable cell number (CFU/mL)

Control 2.6 ± 5.2×105

S.M. 2% 2.7 ± 3.4×109

S.M. 10% 4.1 ± 1.7×1011

RGS 10% 1.8 ± 1.2×109

RGS 20% 2.1 ± 6.1×1010

S.M. 2% + RGS 10% 2.1 ± 1.1×1012

S.M. 2% + RGS 20% 1.7 ± 2.2×1012

§ Control, None treated sample ; SM, skim milk; RGS1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

3. W. cibaria JW-15 소재화 연구

□ 재료 및 방법

가. 항균활성 측정

W. cibaria JW-15의 항균 활성을 확인하기 위해 MRS 배지에 배양한 W. cibaria JW-15 배

양액을 원심분리 하여 상등액만 취한 후 paper disc method를 이용하여 수행 하였다. 실험에

사용한 공시 균주는 Escherichia coli와 streptococcus aureus를 사용 하였다. 전배양 한 공시

균주를 O.D (600nm) 0.4로 맞춘 후 한천배지에 1 ㎖을 가하여 도말 하고 W. cibaria JW-15

배양액을 paper disc에 흡수시켜 배지 위에 두고 clear zome을 확인 하는 방법으로 항균 활성

을 측정 하였다.

나. 유산균 배양액 분말 소재 제조

W. cibaria JW-15의 배양액의 소재화 연구를 위해 서리태 배지에서 24시간 배양한 W.

cibaria JW-15 배양액에 대해 동결건조, 분무건조, 진공건조등 건조 방법을 달리하여 분말화

하고 제조된 유산균 배양액 분말 1g을 멸균 생리 식염수에 단계 희석하여 BCP배지에 도말하

여 생균수를 측정 하였다.

다. W. cibaria JW-15 안정화 조건 설정

Alginate는 미역, 다시마등과 같은 갈색 해조류에서 추출하는 L-guluronate와

D-mannuronate가 결합된 해조 다당류의 일종으로 식품 소재의 캡슐 제조에 사용되는 소재로

유산균의 낮은 pH에서의 안정성을 높이기 위해 유산균 배양액을 원심분리 후 균체만 회수 하

여 1.5% sodium alginate 용액에 용해 후 1% CaCl2 용액을 이용하여 구형의 캡슐을 제작 하

- 201 -

였고 유산균 총균수 측정을 통해 4℃에서의 안정성에 대한 시험을 실시하였다.

또한 캡슐화된 유산균의 내산성을 시험하기 위해 인공위액 (Kobayashi et al. 1974)의 방법에

따라 HCl을 사용하여 pH를 3.0으로 조정한 홍삼전분 MMY 배지 (pepsin 1.0% 첨가) 30℃로

맞추어 30분간 방치 후 멸균 생리 식염수에 단계 희석하여 BCP배지에 도말하여 생균수를 측

정 하였다.

라. 항산화 활성 측정

DPPH radical 소거능은 Blois 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.2 mL에 에탄올에

녹인 0.5 mM 1,1-diphenyl-2 -picrylhydrazyl (DPPH) 용액 0.8 mL를 가하고 vortexing 한 후,

상온의 암실에서 30분간 반응시키고, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Reference는 시료 대

신 D.W.를 사용하였으며, DPPH radical 소거능은 시료 첨가구와 비첨가구(reference)의 흡광도

차이를 백분율(%)로 표시하였다.

DPPH radical scavenging activity (%)

= [1-(sample absorbance/reference absorbance)] ×100

□ 연구 결과

가. W. cibaria JW-15 배양액의 항균 활성

W. cibaria JW-15 의 항균 활성을 확인하기 위해 공시균주 (Escherichi coli,

Staphylococcus aureus)를 도말한 plate에 W. cibaria JW15 배양액을 원심분리 하여 상등액만

취한 후 paper disc에 점적하여 항균 활성을 확인한 결과 Fig. 3-1과 같이 clear zone을 확인할

수 있었다. 이는 기능성 유산균 W. cibaria JW15이 항균 물질인 bacteriocin을 생산 한다는 의

미로 향후 기능성 소재로 활용할 가능성이 있을 것으로 사료 된다.

Fig. 3-1. Antibacterial activity of W. cibaria JW15

가. W. cibaria JW-15 건조 방법에 따른 유산균 총균수 및 항산화 활성

서리태 배지를 이용하여 배양한 W. cibaria JW-15 배양액을 3가지 건조 방식(동결건조, 분

무건조, 진공건조)을 통해 분말화 시킨 후 W. cibaria JW-15 분말 소재에 대해 총 균수 및 항

- 202 -

산화 활성을 측정해 보았다. 그 결과 건조 과정에 고온의 열이 가해지는 분무 건조의 경우 생

균이 확인 되지 않았고 동결 건조 및 진공 건조의 경우 각각 8.4×107 과 5.2×106 cfu/ml의 총균

수를 확인할 수 있었다. 또한 각 건조된 유산균 분말의 DPPH radical scavening 활성을 측정

한 결과 건조 방법에 관계없이 56-61%의 활성을 나타 내어 배양액 건조 방법에 따른 총균수

의 차이는 있지만 항산화 활성은 큰 차이를 보이지 않아 유산균 배양액 및 사균으로의 소재

개발이 가능할 것으로 생각 된다.

Table 3-1. Cell viability and DPPH radical scavening activity of W. cibaria JW-15

according to drying methods

건조 방법 총균수 DPPH radical scavening (%)

동결 건조 1.8 ± 8.4×107 61.3 ± 2.1

분무 건조 N.D. 56.7 ± 1.5

진공 건조 2.3 ± 5.2×106 58.6 ± 3.1

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

나. 유산균 배양액 조성물 개발

유산균 소재와 약초 추출물의 시너지 효과를 알아보기 위해 서리태 배지를 이용하여 배양한

W. cibaria JW-15 배양액과 연잎, 산사자등 약초 추출물을 첨가하여 항산화 활성을 확인한 결

과 Table 3-2와 같이 연잎을 첨가한 경우 항산화 활성에서 시너지 효과가 나타 나는 것으로

확인 되었다. W. cibaria JW-15 배양액과 연잎 추출물의 DPPH radical scavening 활성은 각

각 72.1, 71.3%였으나 W. cibaria JW-15 배양액과 연잎 추출물을 1:1로 혼합한 혼합 소재의 경

우 83.5%로 높은 항산화 활성을 나타 내었다. 하지만 산사자 추출물의 경우 W. cibaria JW-15

배양액과 혼합에 의한 항산화 활성의 증가는 나타나지 않았다.

Table 3-2. DPPH radical scavening activity of W. cibaria JW-15 and herb mixture

DPPH radical scavening activity (%)

배양액 72.14 ± 3.11

연잎 71.34 ± 2.17

배양액+연잎 83.52 ± 2.07

산사자 69.14 ± 1.07

배양액+산사자 75.64 ± 3.16

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

다. W. cibaria JW-15 안정화 조건 설정

주로 유산균 제제는 단일 혹은 복합 형태의 생균제 제품이 주를 이루고 있다. 유산균은 각종

발효 식품의 제조에 전 세계적으로 응용되는 산업적으로 중요한 미생물이며, 장내 부패 억제,

장의 운동을 촉진하여 변비 방지, 면역력 증가, 발암 억제, 비타민 B군의 생산 등 여러 가지

- 203 -

생리적 기능을 가지고 있지만 이들을 유산균 제제로 사용하기 위해서는 위산에서 기인되는 낮

은 pH와 담즙산에서 견디어 장내에 도달할 수 있는 생존능력 및 균주의 안정성이 고려되어야

한다(Ozlem et al 2011). pH 2.5의 50 mM sodium phosphate 인공 위액에서의 W. cibaria

JW15의 생존율을 측정한 결과 인공 위액 처리 6시간 후 W. cibaria JW15는 74%의 생존율을

나타내 낮은 pH에서 비교적 안정한 것으로 나타 났으나 비교 균주인 L. rhamnosus GG에 비

해서는 다소 떨어지는 것으로 확인 하였다 (Table 3-3).

Table 3-3. Acid resistane of LAB in simulated gastric fluid

처리 시간생존율 (%)

2h 6h

LGG 96.3±1.7 89.2±3.8

JW15 85.3±3.6 74.3±2.6

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

기능성 유산균 W. cibaria JW15의 안정성을 높이고자 서리태 배지에서 배양한 W. cibaria

JW15를 원심분리를 통해 균체만 회수한 후 1.5% sodium alginate를 이용하여 캡슐화를 진행

하였다. 캡슐화된 유산균의 저장 기간별 안정성을 확인하기 위해 4℃에서 15일간 보관 하면서

날짜별로 유산균의 총균수를 확인한 결과 Fig. 3-2와 같이 4℃에서 안정성이 크게 증가 하는

것을 확인할 수 있었다. 또한 pH 2.5의 50 mM sodium phosphate 인공 위액에서의 생존율을

측정한 결과 6시간 처리후 캡슐화된 W. cibaria JW15의 생존율은 약 89%로 나타나 캡슐화된

W. cibaria JW15의 4℃에서의 생존율 및 내산성 모두 증가 하는 것을 확인하였다.

Fig. 3-2. Viability of capsulated W. cibaria JW15 at 4℃.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 204 -

Fig. 3-3. Acid resistane of W. cibaria JW15 in simulated gastric fluid.

Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

라. 포장재별 유산균 안정성 측정

현재 시중에 다양한 유산균 제품들이 출시되어져 있는데 발효유를 제외한 유산균 제품은 분

말, 캡슐, 타블렛 형태의 제품이 대부분을 차지하고 있다. 이에 유산균 제품 포장에 많이 사용

되는 연질, 경질 캡슐과 분말 제품 포장에 많이 사용되는 폴리에틸렌, 폴리레스터+폴리프로필

렌 재질에 대한 안정성 시험을 실시 하였다. 서리태 배지에서 배양한 W. cibaria JW15를 이용

하여 skim milk와 홍삼전분을 보호제로 사용하여 동결건조 분말을제조 하고 14일간 상온, 냉

장, 냉동 조건 하에서 유산균의 총균수, pH, 산도를 측정해 보았다. 그 결과 Table 3-4와 같이

포장재 재료와 상관 없이 14일 동안 총균수가 1×1010 CFU/g 이상 유지 되는 것을 확인 하였

고 pH 및 총산도의 변화도 없는 것으로 확인 되었다.

Table 3-4. Change of Viability, pH and total acidity of W. cibaria JW15 in packingmaterials.

균주 포장재저장조

건

총균수 (cfu/g) pH 산도 (ml)

1일 14 일 1일 14일 1일 14일

W. cibaria JW15

연질 캡슐

상온 0.5±3.2×1010 0.7±2.3×1010 5.1±0.2 5.1±0.3 0.41±0.03 0.43±0.02

냉장 0.5±3.2×1010 0.6±2.1×1010 5.1±0.2 5.0±0.1 0.41±0.03 0.37±0.01

냉동 0.5±3.2×1010 1.1±2.5×1010 5.1±0.2 5.2±0.1 0.41±0.03 0.41±0.05

경질 캡슐상온 0.5±3.2×1010 0.3±3.3×1010 5.1±0.2 4.9±0.1 0.41±0.03 0.43±0.03

냉장 0.5±3.2×1010 0.4±2.1×1010 5.1±0.2 5.0±0.2 0.41±0.03 0.49±0.04

- 205 -

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

마. 유산균 대량 생산

기능성 유산균 W. cibaria JW15의 산업적 이용을 위해서 유산균 대량 생산이 필요한데

batch culture를 통해서는 제한된 환경과 영양분 때문에 유산균 성장의 한계에 다다르게 된다.

이를 극복하기 위해서 유산균 배양의 진행중 영양 성분을 발효조에 서서히 첨가 하면서 배양

하는 방식인 fed-batch를 이용하여 유산균 생산량을 높이고자 하였다. 5L scace jar fermentor

에서 서리태 배지를 이용하여 W. cibaria JW15를 배양 하였고 feeding solution으로는 glucose

와 서리태 추출물을 사용하였고, 대조군으로는 MRS 배지에 glucose를 feeding 하였다. 그 결

과 glucose 및 서리태 추출물을 feeding한 경우 W. cibaria JW15는 각각 1.1×1010, 3.2×1011

CFU/mL의 총균수를 나타내었다. 서리태 추출물을 feeding한 경우는 batch culture와 비교하였

을 때 100배 이상 높은 유산균 총균수를 나타 내었다. 일반적으로 fed-batch의 경우 미생물의

균주 포장재저장조

건

총균수 (cfu/g) pH 산도 (ml)

1일 14 일 1일 14일 1일 14일

냉동 0.5±3.2×1010 0.2±2.1×1010 5.1±0.2 5.1±0.3 0.41±0.03 0.42±0.04

폴리에틸렌

상온 0.5±3.2×1010 0.5±2.0×1010 5.1±0.2 5.3±0.1 0.41±0.03 0.44±0.02

냉장 0.5±3.2×1010 0.2±2.5×1010 5.1±0.2 5.2±0.1 0.41±0.03 0.46±0.05

냉동 0.5±3.2×1010 0.6±3.3×1010 5.1±0.2 5.0±0.3 0.41±0.03 0.38±0.04

폴리에스터+

폴리프로필렌

상온 0.5±3.2×1010 1.0±2.0×1010 5.1±0.2 5.2±0.2 0.41±0.03 0.42±0.04

냉장 0.5±3.2×1010 0.6±2.2×1010 5.1±0.2 5.0±0.1 0.41±0.03 0.43±0.06

냉동 0.5±3.2×1010 0.4±2.1×1010 5.1±0.2 5.1±0.1 0.41±0.03 0.45±0.02

L. rhamnosus

GG

연질 캡슐

상온 0.7±2.7×1011 0.3±2.0×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.53±0.05

냉장 0.7±2.7×1011 0.5±2.1×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.48±0.03

냉동 0.7±2.7×1011 0.3±2.3×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.49±0.05

경질 캡슐

상온 0.7±2.7×1011 1.1±3.1×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.52±0.07

냉장 0.7±2.7×1011 0.5±2.2×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.51±0.04

냉동 0.7±2.7×1011 0.3±2.2×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.55±0.02

폴리에틸렌

상온 0.7±2.7×1011 0.2±2.0×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.53±0.03

냉장 0.7±2.7×1011 0.2±2.1×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.54±0.02

냉동 0.7±2.7×1011 0.3±2.1×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.52±0.03

폴리에스터+

폴리프로필렌

상온 0.7±2.7×1011 0.3±2.5×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.54±0.01

냉장 0.7±2.7×1011 0.2±2.3×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.52±0.03

냉동 0.7±2.7×1011 0.3±2.2×1011 4.6±0.1 4.6±0.1 0.54±0.02 0.51±0.07

- 206 -

대사산물 또는 미생물 유래 효소의 생산성을 높이는 목적으로 많이 사용되고 있지만 이번 실

험과 같이 미생물 균체량을 높이는 목적으로도 사용 된다. 이는 산업적 유산균 배양에 있어 경

제적으로 높은 수율의 유산균 생산에 응용 가능할 것으로 생각 된다.

Table 3-5. Viable cells of W. cibaria JW15 using Fed-batch culture

배지 Feeding solution 총균수 (CFU/mL)

MRS Glucose 1.1×1010

서리태 배지Glucose 6.5×1010

서리태 추출물 3.2×1011

(A) (B)

(C)

Fig. 3-4. Fed-batch culture of W. cibaria JW15 (A) Using MRS medium and glucosefeeding, (B) Seoritae medium and glucose feeding, (C) Seoritae medium and Soritae extract

feeding.Data represent the means of three separate experiments and error bars represent standard deviation.

- 207 -

4. W. cibaria JW-15를 이용한 시제품 개발

□ 재료 및 방법

가. W. cibaria JW-15 분말 소재 제조

서리태 배지를 이용하여 30℃, 120 rpm으로 24시간 진탕 배양한 W. cibaria JW-15를 원심

분리 하여 skim milk와 홍삼전분을 첨가한 후 동결건조 하여 W. cibaria JW-15 분말 소재를

제조 하였다. 제조된 분말 1 g을 취하여 멸균 생리식염수(0.9%NaCl)를 사용하여 10진 희석법

에 따라 희석한 후, BCP첨가 평판측정용 한천배지 (peptone, yeast extract, dextrose, tween

80, cystein, bromocresol purple, agar) 를 배지로 사용하여 30℃에서 후, 생성된 집락을 3회

반복하여 측정 하여 분말내 총균수를 측정 하였다.

나. 발효유 제조

W. cibaria JW-15 소재를 이용한 발효유를 제조하기 위해서 금산군 소재 목장에서 신선한

원유를 공금 받아 70℃에서 30분간 살균 후 filter 하여 L. casei, L. delbruekii등의 혼합 스타

터 균주를 접종하여 40℃에서 10시간 배양하여 발효유를 제조 하였다. 제조된 발효유에 기능성

유산균 W. cibaria JW-15 동결건조 분말 (1×1011 cfu/g 이상)을 1% 첨가하여 기능성 유산균

W. cibaria JW-15가 함유된 발효유 시제품을 제작 하였다.

다. W. cibaria JW-15 시제품 개발

서리태 배지를 이용하여 50L scale 발효기에서 배양한 W. cibaria JW-15를 연속식 원심분리

기를 이용하여 균체만 회수 후 동결건조 보호제로 skim milk를 첨가하여 동결건조 하여 유산

균 소재를 제조 하고 제조된 유산균 소재에 비타민C, 이산화규소, 요구르트 분말, 난소화성말

토덱스트린, 포도당, 초유분말등 부형제와 혼합하여 캡슐 및 스틱 형태의 시제품을 제작하였다.

□ 연구 결과

가. W. cibaria JW-15 분말 소재 제조

서리태 배지를 이용하여 배양한 W. cibaria JW-15를 원심분리 하여 skim milk와 홍삼전분

을 첨가한 후 동결건조 하여 Fig. 4-1과 같이 1×1012 cfu/g의 W. cibaria JW-15 분말 소재를 제

조 하였다. 면역 활성이 있는 홍삼전분을 이용하여 기능성 유산균(W. cibaria JW-15)을 동결건

조하여 분말 제품을 제조하고 3개월간 유산균의 안정성을 확인한 결과 동결건조 분말 제조 초

기에 기능성 유산균(W. cibaria JW-15) 1×1012 CFU/mL이상으로 확인 되었고 3개월 후에도

1×1012 CFU/mL의 총균수를 유지 하는 것으로 확인 하였다.

- 208 -

Fig. 4-1. The W. cibaria JW15 powder

Table 4-1. Cell viability of W. cibaria JW15 after freez-dry

Time (day) W. cibaria JW15 Viable cell number (CFU/mL)

0 3.1 ± 1.3×1012

15 2.2 ± 3.1×1012

30 4.1 ± 1.7×1012

45 3.5 ± 3.3×1012

60 2.9 ± 2.7×1012

75 2.8 ± 5.1×1012

90 2.6 ± 4.2×1012

1) Values were expressed as the mean±S.D. (n=3)

나. W. cibaria JW-15를 이용한 발효유 제조

원유를 이용하여 발효유 제조시 W. cibaria JW-15를 발효 균주로 사용하여 제조하였을 경

우 발효유의 맛과 향이 좋지 않아 발효유 제조용 유산균으로 W. cibaria JW-15는 적합하지

않는 것으로 확인 되었다. 따라서 본 시제품 제조에는 발효유 제조에 많이 사용되는

Lactobacillus casei, L. delbruekii등의 혼합 균주를 발효 스타터로 사용하여 발효유를 제조 하

였고 발효 후 L. casei등 발효에 사용된 유산균은 1×109 CFU/mL이상 이었다. 살균한 원유에

스타터 균주를 접종하고 40℃에서 10시간 발효를 통해 발효유를 제조 하고 여기 1×1011 CFU/g

이상의 W. cibaria JW-15 분말 소재를 혼합하여 W. cibaria JW-15가 첨가된 기능성 발효유를

제조 하였다. 이때 초기 기능성 유산균(W. cibaria JW-15)의 총균수는 3×109 CFU/mL이었고

20일 후 기능성 유산균(W. cibaria JW-15)의 총균수는 5×108 CFU/mL로 확인 되었다.

- 209 -

Fig. 4-2. Prototype of fermented milk using red ginseng and W. cibaria JW15 powder

다. W. cibaria JW-15 시제품개발

기능성 유산균 W. cibaria JW-15를 이용하여 복용이 간편한 형태의 시제품을 제작 하기 위

해 서리태 배지에서 배양한 W. cibaria JW-15를 동결건조 하여 1×1011 CFU/g 이상의 분말 소

재를 제조 하고 여기에 올리고당, 요구르트분말, 난소화성말토덱스트린, 포도당, 초유분말, 비타

민C, 이산화규소, 비타민B1염산염, 비타민B2, 니코틴산아미드등에 대한 혼합 비율을 설정하고

캡슐 형태와 스틱 형태의 시제품을 제작하였다. 또한 향후 산업적 활용도를 높이기 위해 Fig

4-3과 같이 유산균 제품에 대한 브랜드 및 패키지 디자인을 통해 기능성 유산균 제품에 대한

디자인을 개발 하고 이를 이용하여 Fig. 4-4와 같이 최종 시제품을 제작하였다.

Fig. 4-3. Packaging desigs for probiotics prototype products using W. cibaria JW-15

- 210 -

(A) (B)

Fig. 4-4. Probiotics products using W. cibaria JW15 (A)Capsule type (B) Stick type

- 211 -

제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도

1절 정성적 연구목표대비 달성도

연구개발 목표 연구개발내용달성도

(%)

□ 제1세부과제 : 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구

○ 유산균 배양을 위한 천연배지 제조 - 홍삼전분, 미네랄 성분 등과 비교하여

유산균 배양에 적합한 간단한 식용 가

능 펩톤 기본배지를 개발

100

○ 다빈도 농산물 시료 중 유산균 증식

소재 탐색 및 발굴

- 다빈도 농산물 42종 중 유산균 증식에

도움을 주는 4종 추출물(서리태, 상추,

미나리, 깻잎)을 발굴

100

○ 최종 선정 소재에 대한 원료 표준화

연구

- Weissella cibaria를 비롯하여 유산균 증

식을 촉진하는 소재로 서리태 열수추출

물을 최종 선정

- 최종 원료가 유산균 증식능이 뛰어난 추

출조건 등 원료 생산 표준공정 확립

100

○ 유산균 증식 촉진 물질 규명 - 기존에 알고 있는 당 성분 외에 단백질

원이 유산균 증식에 관여하고 그들 중

Met. 아미노산의 역할을 기대할 수 있음.

100

□ 제2세부과제 : 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화 및

원료표준화 연구

○ 면역활성 보유 소재 탐색 및 발굴 - 면역활성 보유 식물 소재로 47종 중

NF-kB 활성능과 NO 생성능 실험으로

20종을 선발함.

- IL-1B와 TNF-α 유도능 실험으로 2종

(콩나물, 가죽나무)을 우수 소재로 발굴

100

○ 면역활성 소재와 선발 유산균주의

혼합 조건 확립

- 유산균 단독과 유산균 사균과 콩나물 에

탄올 추출물 등 5종에 대한 혼합비율별

면역활성능을 확인

100

○ 면역활성 우수 식물소재(단독 또는

복합물) 최종 선정

- 유산균 사균과 콩나물 에탄올 추출물 혼

합비율 1:0.25에서 면역활성능을 확인

100

○ 면역활성 우수 식물소재의 원료

표준화 연구

- 콩나물 에탄올추출물 소재의 제조법 최

적화 및 표준 공정 확립(상온, 70%

EtOH, 3회 추출)

- 식물자원 소재의 추출조건에 따른 면역

활성 검증

100

○ 복합물 소재의 면역세포 증식 및

활성화 효능 시험(in vitro)

- 마우스 비장 면역세포의 증식 기능 평가를

통해 JW15와 LGG사균에 의한 T cell과

B cell 증식능을 확인함.

- 또한, 면역세포 B cell의 활성화 효능도

확인함.

100

- 212 -

연구개발 목표 연구개발내용달성도

(%)

□ 제1협동과제 : 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구

○ 다양한 유산균주 확보

○ 유산균주의 생리학적 특성조사 연구

○ 유산균주의 면역활성 특성조사 연구

- 다양한 분리원으로부터 면역활성분리용 균주

로 Lactobacillus, Bifidobacterium,

Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, Weisella등 51균주 확보

- 51균주에 대한 내산성, 내담즙성, 내열성, 장

내정착능, 병원성세균 억제능과 같은 생리학

적 특성조사를 실시하여 면역활성 스크리닝

균주로 사용

- Nitrogen oxide(NO), IL-1, TNF-α와 같

은 cytokine의 활성과, 전사조절인자

NF-κB 활성조절능을 측정하였으며, 그

결과 면역활성 우수균주 4균주, 면역억

제 우수균주 2균주를 선발하였음.

100

100

100

○ 우수균주와 식물유래 혼합배양물의

면역활성 검증 연구

○ 우수균주와 식물유래 혼합배양물의

최적화 연구

○ 동물실험을 통한 면역활성 검증연구

- 면역활성이 우수한 유산균주와 식물유래 혼

합배양물의 실험조건 확립 및 효능 검증을 완

료함.

- 백미와 서리태의 에탄올과 열수 추출물

의 최적화 비교 연구를 수행함.

- 동물실험을 위한 면역활성 검증용 L.

monocytogenes 접종농도 설정 및 정맥

주사 및 경구투여법을 사용한 동물실험

을 통한 면역활성 검증을 완료함.

100

100

100

○ 시제품의 in vitro 면역활성 검증

○ 시제품의 in vivo 면역활성 검증

○ 최종제품에 대한 효능 연구

- 시제품은 JW15 혼합서리태군에서

NF-kB, IL-6, TNF-α가 유의적으로 증

가함.

- JW15와 콩나물추출물의 1: 0.25 혼합에

서 유의적인 면역활성을 확인

- 시제품은 감염 3일째 Liver 무게에서 유

의적인 무게감소를 나타냄.

- 5일째 Spleen에서 유의적인 무게 감소를

나타내었고, 3일째 Spleen세균수의 유의

적인 감소를 나타냄.

- 최종제품은 Liver와 Spleen의 유의적 균

수감소 및 NO 생성량을 증가시킴.

- JW15+콩나물혼합군에서 유의적인 IL-6

및 TNF-α의 증가를 보여 시너지 효과

가 관찰됨.

- 최종제품군은 높은 생존율을 나타내어

감염예방 및 면역증강 효과를 나타냄.

100

100

100

- 213 -

연구개발 목표 연구개발내용달성도

(%)

□ 제2협동과제 : 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구

○ 유산균에 의한 사람 면역세포의 활성

조절의 면역학적· 분자생물학적

기전연구 (1차년도 연구의 계속)

- 유산균에 의해 사람면역세포가 활성화되

며 이는 NF-κB pathwasy를 포함한 여

러 신호전달경로가 활성화됨에 의한 것

임을 밝힘.

100

○ Listeria monocytogenes 감염모델을

이용한 유산균효능의 면역학적·

분자생학적 기전연구

- 유산균 경구투여가 마우스 면역세포의

활성을 조절함을 확인하였으며 Listeria

monocytogenes 감염시 균수가 감소하고

면역반응이 증강됨을 일부 확인함.

100

○ DSS에 의해 유도된 염증성 장질환

동물모델을 이용한 유산균효능의

면역학적· 분자생물학적 기전연구

- 본 연구에서 선발된 유산균에 의해 마우

스에서 유발된 염증성 장질환이 억제됨

을 확인하고 면역학적· 분자생물학적 작

용기전을 제시함.

100

□ 제3협동과제 : 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발

○ 홍삼전분을 첨가한 면역기능강화 유산균

배양배지 제조를 위한 물리화학적 조건

연구

- 홍삼전분 특성 조사 및 유산균 배지 조

건 설정 완료

100

○ 대량생산용 배지 제조, 기능성 유산균

최적 배양조건 및 공정 개발

- 서리태 및 홍삼전분을 이용한 유산균 배

지 개발 완료

100

○ 유산균 배양액에 열처리 조건 및

시간조건에 따라 생균수 여부를 확인하여

사균화 조건 연구 및 최종 사균수 및

생균 수 측정

- 건조 방법에 따른 유산균 배양액의 총균

수 및 항산화 활성 측정

100

○ 유산균 대량농축 공정에 필요한

보호제 개발

- 홍삼전분, skim milk를 이용한 유산균

보호제 조건 설정 완료

100

○ 동결건조 공정을 이용한 유산균 균체

가공 조건 확립 및 생산

- 동결건조 첨가제, 조건 설정 완료 100

○ 저온건조 공정을 이용한 유산균 균체

가공 조건 확립 및 생산

- 저온 진공건조를 이용한 유산균 배양액

분말화 조건 설정 완료

100

○ 유산균 증식능보유우수소재조추출물

제조

- 서리태, 상추, 홍삼전분, 우엉, 배추, 흑태,

깻잎등을 이용한 소재 개발 완료

100

○ 혼합배양물 첨가 식물소재의 원료 제조 - 연잎, 산사자등 약초 소재 첨가 조성물

개발 완료

100

○ 면역활성 증진 소재화 및 다양한 제품

개발

- 캡슐, 스틱 형태의 시제품 제작 진행중 100

- 214 -

2절 : 정량적 성과

구 분논문게재 산업재산권 학술발표

기술이전

정책건의

영농활용

품종개발 생물자원

등록기탁

인력양성지원

세미나발표건수출원 등록

SCI 비SCI출원 등록 국내 국제

당초목표(전체)

4 8 4 8 5 1 2 1 3

1년차(‘12) 1 3 2 3 1

2년차(‘13)

3 2 10 4 2 1 1 1

3년차(‘14)

1 4 1 2 4 4 1 1

소계 1 8 6 2 16 11 1 2 1 3 1

<연구성과 근거자료>

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

2013년

12월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

논문게재

(비SCI)

Analysis of components

according to different

collecting time and

production method in

sun-dried salt

김영섭 승인

2012년

11월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

학술발표(

국내)

Comparison of Major Sugar

Contents among Frequently

Consumed Foods in Korea

by International Food

Composition Database

김소영 승인

2013년

5월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

학술발표(

국내)

Screening of

growth-stimulatory plant on

Weissella cibaria JW15

김소영 승인

2013년

11월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

학술발표(

국내)

Screening of

Growth-stimulatory Plant on

Lactic acid bacteria

김가람 승인

2013년

11월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

학술발표(

국내)

Changes in Properties of

Fermented Platycodon

grandiflorum by Different

Steamed Repetition

이예진 승인

2013년

11월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

영농활용

기관제출

유산균주의 증식촉진 농산물

소재에 관한 정보제공김소영 승인

2013년

11월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

영농활용

채택

분리 유산균주의 증식촉진을

위한 농산물 소재 및 천연배

지 개발

김소영 승인

- 215 -

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

2014년

6월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영

산업재산

권 출원

식물 추출물을 포함하는 유

산균 배양용 배지 조성물 및

이의 제조방법

김소영 승인

2013년

10월

유산균 증식촉진 소재 탐

색 및 물질규명 연구김소영 홍보성과

인삼 속 사포닌 성분도 듬

뿍…힘이 불끈 ‘인디언 감자’김소영 승인

2014년

3월

면역활성 우수 식물자

원을 활용한 유산균 혼

합배양 조건 최적화 및

원료 표준화 연구

김소영논문게재(

비SCI)

열처리한 채소류의 이화학적

특성 및 항산화 활성 비교김소영 승인

2013년

10월

면역활성 우수 식물자

원을 활용한 유산균 혼

합배양 조건 최적화 및

원료 표준화 연구

김소영학술발표(

국내)

Screening of Extracts from

Immune-Activity plant on

LPS-stimulated Raw blue

264.7 Cells

김가람 승인

2013년

11월

면역활성 우수 식물자

원을 활용한 유산균 혼

합배양 조건 최적화 및

원료 표준화 연구

김소영영농활용

기관제출

식품 중 면역활성 보유 소재

에 관한 정보제공김소영 승인

2013년

11월

면역활성 우수 식물자

원을 활용한 유산균 혼

합배양 조건 최적화 및

원료 표준화 연구

김소영영농활용

채택

다빈도 식품 중 면역력 우수

순위에 관한 정보제공김소영 승인

2013년

6월

면역활성 우수 식물자

원을 활용한 유산균 혼

합배양 조건 최적화 및

원료 표준화 연구

김소영

세미나

등 발표

건수

발효식품 소재를 이용한 건

강기능성 식품 개발김소영 승인

2013년

04월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규논문게재(

SCI)

Screening of

B a c t e r i o c i n - p r o d u c i n g

Enterococcus faecalis Strains for

Antagonistic Activites against

Clostridium perfringens

이완규 승인

2012년12월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규논문게재(

비SCI)

Immune-enhancing Effects

of Leuconostoc Strains

Isolated from Kimchi.　

이완규 승인

2013년

11월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규논문게재(

비SCI)

Characteristics and

immuno-modulatory effects

of Weissella cibaria JW15

isolated from Kimchi, Korea

traditional fermented food,

for probiotic use

이완규 승인

2013년 면역활성 증진능 보유 이완규 논문게재( Characteristics and 이완규 승인

- 216 -

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

04월유산균및혼합배양액의

효능검증연구비SCI)

immuno-modulatory effects

of Enterococcus faecium

JS1-8 isolated from Kimchi

2013년

10월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규산업재산

권 출원

신규한 와이셀라 시바리아

JW15 균주 및 이의 용도

(출원번호10-2013-0111741)

이완규 승인

2012년

11월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국내)　

In vitro Immune-enhancing

Effects of Heat-killed

Leuconostoc Strains Isolated

from Kimchi.　

이완규 승인

2013년

04월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국내)

The Immune-enhancing

Effects of Bacteriocin

Producing Enterococcus

faecium JS1-8 for the

Potential Probiotics

이완규 승인

2013년

04월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국내)

The Immunomodulating

Activity and the

Characteristics of Weissella

cibaria JW15 Isolated from

Kimchi

이완규 승인

2013년

04월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국내)

Immunomodulating Activity of

Lactobacillus plantarum 4-25

Isolated from Kimchi,

Korean Fermented Food

이완규 승인

2013년

05월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국제)

Characteristics and

Immunomodulating Activity of

Weissella cibaria JW15 for

the Potential Probiotics

이완규 승인

2014년

05월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국제)

Probiotic Characteristics ans

Immuno-Modulatory Effects of

Weissella Cibaria JW15 strain

이완규 승인

2014년

05월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국제)

Comparative Effects of

Heat-killed and Viable Lactic

Acid Bacteria on

Immunomodulation in RAW

264.7 Macrophage

이완규 승인

2014년

10월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의이완규

학술발표(

국제)

C o m p a r a t i v e

Immunomodulating Effects of이완규 승인

- 217 -

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

효능검증연구

Heat-killed and Viable

Forms of Three Probiotic

Strains in RAW 264.7

Macrophage

2014년

10월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국제)

Enhancement of the

immune response against

Listeria monocytogenes

infection in BALB/c mice by

Weissella cibaria JW15

mixed with ethanol extract

of soybean sprout

이완규 승인

2014년

10월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규학술발표(

국제)

The Immunomodulating Activity

and Characteristics of

Bifidobacterium longum,

Bifidobacterium breve and

Bifidobacterium animalis for the

Probiotic Use in Humans and

Animals

이완규 승인

2013년

07월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규생물자원

등록·기탁

Weissella cibaria JW15

(KACC 91811P)이완규 승인

2012년

12월

면역활성 증진능 보유

유산균및혼합배양액의

효능검증연구

이완규우수인력

양성지원

대학원생 양성 후 취업 달

성이완규 승인

2014년

10월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명논문게재(

비SCI)

Resveratrol의 CD4+T세포

활성과 분화 억제 효과서동원 승인

2013년

10월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명학술발표(

국내)

Immunomodulatory effects

of Weissella cibaria isolated

from Kimchi in Human

peripheral blood

mononuclear cells

이상명 승인

2014년

9월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명학술발표(

국내)

Heat killed lactobacillusplantarum activateshuman PBMC via NF-kBand MAPK signaltransdcution pathways

고소나 승인

2013년 유산균 및 면역활성 이상명 학술발표( Lactobacillus plantarum 이상명 승인

- 218 -

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

11월

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

국제)

isolated from Kimchi

modulates immune

responses and alleviated

DSS-induced colitis

2014년

11월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명학술발표(

국제)

Weissella cibaria JW15

enhances natural killer cell

activity in vitro

강경원

2013년

11월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명우수인력

양성지원

면역조절 활성 유산균 소

재 개발 연구 동아리 인

증서

이현철 승인

2015년

2월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명우수인력

양성지원

면역조절 활성 유산균 소

재 개발 연구 석사학위취

득

최지현 승인

2015년2월

유산균 및 면역활성

물에 관한 면역과 분

자생물학적 작용기전

연구

이상명우수인력

양성지원석사학위 이현철 승인

2013년

12월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예논문게재(

비SCI)

프로바이오틱스 개발을 위한

홍삼전분 이용 유산균 배양

기술

김영수 승인

2014년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예논문게재(

비SCI)

Biotransformation of

ginsenoside Rb1 to

ginsneoside Rd by

beta-glucosidase from

Lactobacillu plantarum G1

김영수 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국내)

홍삼 농축액 첨가 배지의 미

생물 발효에 의한 항산화 활

성 및 Rg3전환

장영부 승인

2013년

6월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국내)

Effect of red ginseng starch

on the growth of

Enterococcus faecium and

cryoprotectant agent for

freeze drying

김영수 승인

2013년 유산균 대량생산공 손미예 학술발표 Effect of red ginseng starch 김영수 승인

- 219 -

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

8월

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

(국내)on the growth of Lactic acid

bacteria

2013년

8월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국내)

Manufacturing of red ginseng

makeolli김도연 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국제)

Fermentation and

P h y s i c o c h e m i c a l

Characteristics of Makgeoly

Used Red Ginseng Starch

서정화 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국제)

Medium Development of

Lactic Acid Bacteria Product

Using Red Ginseng Starch

장영부 승인

2013년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국제)

Bioconversion of minor

ginsenosides which can be

used as a functional food

ingredient

김영수 승인

2014년

10월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예학술발표

(국제)

Utilization of lettuce medium

for the cultivation of Weisella

cibaria JW15

김영수 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예산업재산권

출원

진세노사이드 Rg3를 증진하

고 항산화 기능을 촉진하기

위한 발효 홍삼 농축액 제조

방법

손미예 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예산업재산권

출원

홍삼전분과 유산균을 이용한

막걸리 및 제조방법손미예 승인

2012년

11월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예산업재산권

출원

홍삼전분을 이용한 미생물

배양 배지, 건조보호제, 및

미생물 배양 및 건조보호 방

법

손미예 승인

2013년

6월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

손미예산업재산권

출원

미량 진세노사이드의 함량을

증진시킨 홍삼전분의 제조

방법

손미예 승인

- 220 -

제 5 장 연구개발결과의 활용계획

1. 추가연구의 필요성 및 응용 분야

○ 사람면역세포를 활성화 시키는 Weissella cibaria JW15에 대한 면역학적·분자생물학

적 작용기전을 제시하여 김치에서 분리한 Weissella cibaria JW15의 probiotics로 우

수성 입증

성과적

용년월세부과제명

세부

과제

책임자

성과물

유형성과물명

성과물

주담당

자

성과물

승인

여부

발

2014년

3월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예산업재산권

등록

미량진세노사이드의 함량을

증진시킨 홍삼전분의 제조

방법

김영수 승인

2014년

6월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예산업재산권

등록

홍삼전분과 유산균을 이용한

막걸리 및 제조방법김영수 승인

2014년

6월

유산균 대량생산공

정 및 면역활성 증

진 기능성 식품 개

발

손미예 기술이전

“미량진세노사이드의 함량을

증진시킨 홍삼전분의 제조

방법“ 기술을 ㈜모드리나 화

장품에 기술이전 실시

김영수 승인

- 221 -

○ 향후 특정 면역세포를 분리하여 직접적인 활성화 연구 및 면역억제모델을 이용한 기

능성 검증이 필요한 것으로 사료됨.

○ Weissella cibaria JW15가 자연살생세포를 활성화시켜 종양세포에 대한 면역활성을 증

가시킴과 자연살생세포에서 종양세포를 죽이는데 필요한 perforin, granzyme,

granulysin과 같은 단백질의 발현을 유도함을 확인함으로써 Weissella cibaria JW15가

항종양 면역요법에 활용될 수 있는 가능성을 제시하는 중요한 연구결과이나 이를 뒷받

침 할 수 있는 후속연구(기전구명)가 필요함.

○ Lactobacillus plantarum 76과 4-25균주는 DSS에 의한 염증성대장질환 예방효능을 보

였으며, 이들 균주의 항염증활성과 면역반응조절 활성에 의한 것으로 향후 과도한 염증

반응에 의한 질환 예방 기능성 식품개발에 활용 가능성이 높음.

○ 특히, LP 76 균주의 항염증 활성에 미치는 영향을 과학적으로 입증하여 이들 균주들

의 활용가치를 더욱 높일 수 있을 것으로 기대됨.

○ 면역기능 및 면역관련 만성질환 예방의 관심이 급증하고 있는 시점에 미래 수요에 근거한

‘영양유전체학/영양유전자학 기술을 이용한 면역활성 조절 및 증진을 통한 면역질환 예방

및 개선을 위한 맞춤영양개발’ 연구에 응용가능할 것으로 기대됨.

○ 유산균 시장은 증가하고 있으나 다양한 제품군은 아직 없으며 유산균 제품의 안전성, 균

체량, 효능에 대한 검증 자료를 확보하여 신제품을 생산하면 유산균 시장에 큰 영향을 미

칠 것으로 예측됨.

○ 유산균 증식소재 및 면역활성 식물유래물질은 Weissella cibaria JW15균주와 다양한 형태

로 혼합되어 생균제, 발효식품, 기능성식품 등으로 제품화가 기대됨.

2. 현재 추진 중인 논문게재 계획

○ 비SCI 논문

- 유산균 증식 촉진능이 우수한 서리태 배지의 표준화 연구(한국미생물생명공학회)

- 면역활성 보유 콩나물 추출물에 대한 제조 공정 표준화 연구(한국식품영양과학회)

- 증숙 및 발효 도라지 제조 공정 표준화와 이화학적 특성 조사(한국식품영양과학회)

- Study on the physicochemical components in red ginseng Makgeoli (Korean journal of

food preservation)

- Effect of Antioxidant and Compound Analysis Activities in Black Ginseng Processe

(Korean Journal of Food and Nutrition)

○ SCI 논문

- Screening of Food Ingredients to promote the growth of Weissella cibaria,

Lactobacillus plantarum, and Lactobacillus rhamnosus GG(Journal of Microbiology and

Biotechnology)

- Immune enhancement effect of mixture of soybean sprout and lactic acid

bacteria(Journal of Medicinal Food)

- 222 -

- Activation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Lactobacillus plantarum

4-25 isolated from Kimchi

- Immunomodulatory effects of Weissella cibaria isolated from Kimchi in Human

peripheral blood mononuclear cells

- Heat-killed Weissella cibaria enhances NK cell cytotoxicity

- Lactobacillus plantarum 76 isolated from Kimchi ameliorates DSS-induced ulcerative

colitis via the anti-inflammatory and immunomodulatory activities.

- Physicochemical and antioxidant properties of red ginseng starch, a by-product of the

red ginseng industry, and its application to ginsenoside compound-K production

(World journal of microbiology and biotechnology)

- Fermentation enhances the antioxidant properties of Saengmaeksan extracts (Food

science and biotechnology)

3. 산업재산권 출원 사항

○ 식물 추출물을 포함하는 유산균 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법(농과원, 단독,

10-2014-0072825)

○ 신규한 와이셀라 시바리아 JW15 균주 및 이의 용도(충북대학교, 공동출원,

10-2013-0111741)

○ 진세노사이드 Rg3를 증진하고 항산화 기능을 촉진하기 위한 발효 홍삼 농축액 제조방

법(금산연, 단독)

○ 홍삼전분과 유산균을 이용한 막걸리 및 제조방법(금산연, 단독, 10-2012- 0105546)

○ 홍삼전분을 이용한 미생물 배양 배지, 건조보호제, 및 미생물 배양 및 건조보호 방법

(금산연, 단독, 10-2012-0130702)

○ 미량 진세노사이드의 함량을 증진시킨 홍삼전분의 제조 방법(금산연, 단독,

10-2013-0070993)

4. 연구 결과 활용 계획

○ 프로바이오틱스 제품의 기능성과 안전성에 대한 검증 및 규정이 강화되고 있으 며 이를

대비하는 것은 기업들이 직면한 과제임. 현재 유통되고 있는 대부분의 유산균 제품들이

특정 질환에 대한 개선 효능을 앞세우고 있기 때문에 매우 중요하다고 할 수 있음.

○ 최근 일본을 비롯한 유럽 시장에서는 식물성 유산균을 포함하는 제품들이 큰 인기를 끌

고 있음. 한국식품의 세계화를 위해서 한식 유래의 기능성이 우수한 유산균을 발굴하고

임상연구를 통해 효능입증을 하여 제품 개발을 해야 함.

○ 기능성 유산균 제품 개발은 그 가공품을 활용한 생산 부문의 고용 창출은 물론이고 기능

성 산업, 식품산업, 제약산업, 포장재산업, 등 연관 산업 부문의 고용이 창출되어 경제활

성화에 기여하여 신규 고용효과를 기대할 수 있음.

- 223 -

○ 기능성 유산균을 생산하여 새로운 가공 기술을 접목하여 다양한 기능성 유산균 제품을 생

산한다면 기존의 유산균의 기능과 면역활성 기능이 융합한 고기능성 신규 건강기능식품

소재 및 제품화로 유산균 시장에 기술경쟁력 강화가 기대됨.

○ 농산물, 폐 농산물을 활용한 유산균 배양 배지 개발 및 상용화를 통해 관련 농가에

새로운 수입원이 될 수 있음.

제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보

제 7 장 기타 중요 변동사항

항목 당초계획 변경사항 변경사유 근거문서

연구원 편성 김소영 노건민육아휴직에 따른

과제책임자 변경

기능성식품과-

712호(2014.7.2)

제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비

현황

제 9 장 참고문헌

제1세부연구과제 : 유산균 증식촉진 소재 탐색 및 물질규명 연구

Markets and Markets(2014). Probiotics Market by Products (Functional Foods, Dietary

Supplements, Specialty Nutrients, Animal Feed), Applications (Regular, Therapeutic,

Preventive Health Care) & Ingredients (Lactobacilli, Bifidobacteria, Yeast) - Global Trends

- 224 -

& Forecasts to 2019.

Metchnikoff, I.(1908). The prolongation of life: opti-mistic studies. 1st ed. New York, SP

Putmans Sons.

Bjorkroth, K. J., Schillinger, U., Geisen, R., Weiss, N., Hoste, B., Holzapfel, W. H.,

Korkeala, H. J., Vandamme, P.(2002). Taxonomic study of Weissella confusa and description

of Weissella cibaria sp. nov. detected in food and clinical samples. Int J Syst Evol

Microbiol, 52, 141-148.

Kang, M. S., Kim, B. G., Chung, J., Lee, H. C., Oh, J. S.(2006). Inhibitory effect of Weisella

cibaria isolated on the production of volatile sulfur compounds. J clin periodon, 33,

226-232.

Saarela, M., Mogensen, G., Fonden, R., Matto, J., Mattila-Sandholm T.(2000). Probiotic

bacteria : Safety, functional and technological properties. J Biotechnol. 85, 197-215.

Viljanen, M., Kuitunen, M., Haahtela, T., Juntunen-Backman, K., Korpela, R. and Savilahti,

E.(2005). Probiotic effects on faecal inflammatory markers and on faecal IgA in food

allergic atopic eczema/dermatitis syndrome infants. Pediatr. Allergy Immunol, 16, 65-71.

Kankainen, M., Paulin, L., Thnkkyen, S., von Ossowski, I., Reunanen, J., Partanen, P.,

Satokari, R., Vesterlund, S., Hendrickx, A., Lebeer, S., Keersmaecker, S., Vanderleyden, J.,

Hamalainen, T., Laukkanen, S., Salovuori, N., Ritari, J., Alatalo, E., Korpela, R.,

Mattila-Sandholm, T., Lassig, A., Hatakka, K., Kinnunen, K.T., Karjalainen, H., Saxelin, M.,

Laakso, K., Surakka, A., Palva, A., Salusjarvi, T., Auvinen, P. and de Vos, W. M.(2009).

Comparative genomic analysis of Lactobacillus rhamnosus GG reveals pili containing a

human mucus binding protein. Proc Natl Acad Sci, USA, 106, 17193-17198.

Cho, E. K., Cho, H. Y., Kim, B. C., Shin, H. H., Cho, S. C., Kook, M. C., Pyun, Y.

R.(2011). Development of Pretreatment and Mixed Culture Processes for Plant Originated

Lactic Acid to Produce a Functional Lactic acid Beverage. Korean J Food & Nutr, 24(1),

117-123.

Kumagai T.(2009). Application of plant origin lactic acid bacteria to food. Food Style,

21(13), 46-47.

Igarashi T.(2007). Development of beverage and food using plant origin lactic acid

bacterium. Bioindustry, 24, 32-39.

Huang C. J., Wang M. L., Kuo C. Y.(2008). Studies on the cholesterol removal ability of

- 225 -

plant origin lactic acid bacteria. J Taiwan Livestock Res, 41, 267-274.

Tzianabos A.O.(2000). Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural

aspects and biological function. Clin Microbiol Rev, 13, 523-533.

Paulsen B. S.(2001). Plant polysaccharides with immunostimulatory activities. Curr Org

Chem 5, 939-950.

Wasser S. P.(2002). Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating

polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol, 60, 258-274.

Chihara G.(1992). Recent progress in immunopharmacology and therapeutic effects of

polysaccharides. Dev Biol Stand, 77, 191-197.

Wang S. Y., Hsu M. L., Hsu H. C., Tzeng C. H., Lee S. S., Shiao M. S., Ho C. K.(1997).

The antitumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from

activated macrophages and T lymphocytes. Int. J . Cancer, 70, 699-705.

Beutler B.(2004). Innate immunity: an overview. Mol Immunol, 40, 845-859.

Shin, K. S.(2012). Immunostimulating Plant Polysaccharides: Macrophage Immunomodulation

and Its Possible Mechanism. Food Sci Industry, 45(1), 12-22.

Korea Centers for Disease Control and Prevention.(2011). The Fifth Korea National Health

and Nutrition Examination Survey (KNHANES V-2). Korea Centers for Disease Control

and Prevention

Jeong, H. M., Kim, Y. S., Ahn, S. J., Auh, M. S., Ahn, J. B., Kim, K. Y.(2011). Effects of

Zizyphus jujuba var. boeunesis Extracts on the Growth of Intestinal Microflora and Its

Antioxidant Activities. J Korean Soc Food Sci Nutr, 40(4), 500-508.

Saha S. K., Brewer C. F.(1994). Determination of the concentrations of oligosaccharides,

complex type carbohydrates, and glyco-proteins using the phenol-sulfuric acid method.

Carbohyd Res, 254, 157-167.

Schoel, B., Welzel, M., Kaufmann, H. E. S.(1995). Quantification of protein in dilute and

complex samples: modification of the bicinchoninic acid assay. J Biochemical Biophysical

Methods, 30, 199.

Choi, H. S.(2014). Quality improvement and commercialization for fermented grain drink

with Nuruk microorganisms. Rural Development Administration

- 226 -

제2세부연구과제 : 면역활성 우수 식물자원을 활용한 유산균 혼합배양 조건 최적화

및 원료표준화 연구

Lee, G. H., Kim, S. B.(2012). et al., Global trend of industry on Health functiona1 food.

KHIDI Brief, 36, 1-8.

Noverr, M. C., Huffnagle, G. B.(2004). Does the microbiota regulate immune responses

outside the gut?. Trends in Microb, 12(12), 562-568.

Lactic Acid Bacteria & Intestinal Microbiota.(2011). 16th International Symposium on Lactic

Acid Bacteria & Human Health.

Hayashi. A., Kimura, M., Nakamura, Y., Yasui, H.(2009). Anti-atopic dermatitis effects and

the mechanism of lactic acid bacteria isolated from Mongolian fermented milk. J Dairy

Res, 76(2), 158-164.

Wen, K., Li, G., Zhang, W., Azevedo, M.S., Saif, L.J., Liu, F., Bui, T., Yousef, A., Yuan, L.,

2011. Development of gammadelta T cell subset responses in gnotobiotic pigs infected with

human rotaviruses and colonized with probiotic lactobacilli. Veterinary immunology and

immunopathology 141, 267-275.

Malaguarnera G, Leggio F, Vacante M, Motta M, Giordano M, Biondi A, Basile F,

Mastrojeni S, Mistretta A, Malaguarnera M, Toscano MA, Salmeri M(2012). Probiotics in

the gastrointestinal diseases of the elderly. J Nutr Health Aging, 16, 402-410.

Kubota A., He F., Kawase M., Harata G., Hiramatsu M., Iino H.(2011). Diversity of

intestinal bifidobacteria in patients with Japanese cedar pollinosis and possible influence of

probiotic intervention. Curr Microbiol, 62(1), 71-77.

Ohkouchi K, Kawamoto S, Tatsugawa K, Yoshikawa N, Takaoka Y, Miyauchi S, Aki T,

Yamashita M, Murooka Y, Ono K.(2012). Prophylactic effect of Lactobacillus oral vaccine

expressing a Japanese cedar pollen allergen. J Biosci Bioeng., 113(4), 536-541.

Ouwehand AC1, Tiihonen K, Saarinen M, Putaala H, Rautonen N.(2009). Influence of a

combination of Lactobacillus acidophilus NCFM and lactitol on healthy elderly: intestinal

and immune parameters. Br J Nutr, 101(3), 367-375.

Korea Centers for Disease Control and Prevention.(2011). The Fifth Korea National Health

and Nutrition Examination Survey (KNHANES V-2). Korea Centers for Disease Control

and Prevention

- 227 -

Cannon, J. G.(2000). Inflammatory cytokine in non-pathological states. News Physiol Sci,

15, 298-303.

Arunachalam, K., Gill, H. S. and Chandra, R. K.(2000). Enhancement of natural immune

function by dietary consumption of Bifidobacterium lactis(NH019). Eur. J . Clin. Nutr, 54,

263-267.

Clerici, M. and Shearer, G. M.(1994). The Th1-Th2 hypothesis of HIV infection: new

insights. Immunol Today, 15, 575-581.

Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A. and Coffman, R. L.(2005).

Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine

activities and secreted proteins. J Immunol, 175, 5-14.

Martinez, F. O., Helming, L. and Gordon, S.(2009). Alternative activation of macrophage: an

immunologic functional perspective. Ann Rev Immunol, 27, 451-483.

Ryu, H. S.(2014). Effects of water extract from P latycodon grandiflorum on mouse immune

cell activation ex vivo by oral administration. Korean J . Food&Nutr, 27(1), 99-104.

Seo, M. J., Kang, B. W., Park, J. U., Kim, M. J., Lee, H. H., Ryu, E. J., Joo, W. H., Kim,

K. H. and Jeong, Y. K.(2013). Effect of black garlic extract on cytokine generation of

mouse spleen cells. Journal of life science, 23(1), 63-68.

Lee, Y. H.(2007). Effect of phellinus liteus grown in ferminated brown rice on atopic

dermatitis. J Kor Soc Cosm, 13, 514-519.

Leung, D. Y. M.(2000). Atopic dermatitis: new insights and opportunities for therapeutic

intervention. J Allergy Clin Immunol, 105, 860-876.

Seo, Y. S., Shin, K. S.(2012). Immune system-stimulating activities of mucilage

polysaccharides isolated from Opuntia humifusa. J Korean Soc Food Sci Nutr, 41(1),

95-102.

Gill, H. S., Shu, Q., Lin, H., Rutherfurd, K. J., Cross, M. L.(2001). Protection against

translocationg Salmonella typhimurium infection in mice by feeding the immuno-enhancing

probiotic Lactobacillus rhamnosus strain HN001. Med Microbiol Immunol, 190, 97-104.

Gilliland, S. E., Nelson, C. R., Maxwell, C.(1985). Assimilation of cholesterol by

Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol, 49, 377-381.

- 228 -

Salminen, S., Bouley, C., Boutron-Ruault, M. C., Cummings, J. H., Franck, A., Gibson, G.

R.(1998). Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr,

80, 147-171.

Tejada-Simon, M. V., Pestka, J. J.(1999). Proinflammatory cytokine and nitric oxide

induction in murine macrophages by cell wall and cytoplasmic extracts of lactic acid

bacteria. J Food Prot, 62(12), 1435-1444.

Okitsu-Negishi, S., Nakano, L., Suzuki, K., Hashira, S., Abe, T., Yoshino, K.(1996). The

induction of cardioangitis by Lactobacillus casei cell wall in mice. I. The cytokine

production from murine macrophages by Lactobacillus casei cell wall extract. Clin Immunol

Immunopathol, 78(1), 30-40.

Pessi, T., Sutas, Y., Hurme, M., Isolauri, E.(2000). Interleukin-10 generation in atopic

children following oral Lactobacillus rhamnosus GG. Clin Exp Allergy, 30, 1804-1808.

Park, S. H., Kim, Y. A., Lee, D. K., Kim, K. J., Ha, N. J.(2007). Antibacterial activity and

macrophage activation of lactic acid bacteria. J Environ Toxicol, 22(4), 287-297.

Lee, O. H., Lee, H. B., Lee, J. S., Lee, B. Y.(2005). Optimization of Extraction Condition

and Stability of Olive Leaf Extract. Kor J . Food Sci Technol, 37(2), 178-182.

Chae, S. W.(2005). Function and activation of NF-κB in immune system. Korean J

Otolaryngol, 48, 284-288.

Lee, B. G., Kim, S. H., Zee, O. P., Lee, K. R., Lee, H. Y., Han, J. W., Lee, H. W.(2000).

Suppression of inducible nitric oxide synthase expression in RAW 264.7 macrophages by

twocarboline alkaloids extracted from Melia azedarach. Eur J Pharmacol, 406, 301.

Seo, W. G., Pae, H. O., Oh, G. S., Chai, K. Y., Yun, Y. G., Kwon, T. O., Chung, H.

T.(2000). Inhibitory effect of ethyl acetate fraction from Cudrania tricuspidata on the

expression of nitric oxide synthase gene in RAW 264.7 macrophages stimulated with

interferon-and lipopolysaccharide. Gen Pharmacol. 35, 21.

Chiou, W. F., Chou, C. J., Chen, C. F.(2001). Camptothecin suppresses nitric oxide

biosynthesis in RAW 264.7 macrophages. Life Sci, 69, 625.

Seo, W. G., Pae, H. O., Oh, G. S., Kim, N. Y., Kwon, T. O., Shin, M. K., Chai, K. Y.,

Chung, H. T.(2001). The aqueous extract of Rhodiola sachalinensis root enhances the

expression of inducible nitric oxide synthase gene in RAW 264.7 macrophages. J

Ethnopharmacol, 76, 119.

- 229 -

Yoon, H. J., Moon, M. E., Park, H. S., Im, S. Y., Lee, J. H., Kim, Y. H.(2007). Effects of

Chitosanoligosaccharide on the C. albicans-induced inflammatory effect in mice and RAW

264.7 macrophage cells. J Chitin Chitosan, 12, 15.

Papayianni, A.(1996). Cytokines, growth factors, and other inflammatory mediators in

glomerulonephritis. Ren Fail, 18, 725.

So, M. S., Lee, J. S., Yi, S. Y.(2004). Induction of nitric oxide and cytokines in

macrophages by Codonopsis lanceolata. J Food Sci Technol. 36(6), 986-990.

Kim, C. H., Kwon, M. C., Kim, H. S., Bae, G. J., Ahn, J. H., Choi, G. P., Choi, Y. B., Ko,

J. R., Lee, H. Y.(2007). Enhancement of immune activities of Kadsura Japonica Dunal.

through conventional fermentation process. Korean J Medicinal Crop Sci, 15(3), 162-169.

Messina, M., Persky, V., Setchell, K. D. R., Barnes, S.(1994). Soy intake and cancer risk: A

review of in vitro and in vivo data. Nutrition and Cancer, 21, 113-131.

Messina, M.(1995). Modern applications for an ancient bean: soybeans and the prevention

and treatment of chronic disease. J Nutr, 125, 567-569.

Kim, C. H., Kwon, M. C., Kim, H. S., Bae, G. J., Ahn, J. H., Choi, G. P., Choi, Y. B., Ko,

J. R., Lee, H. Y.(2007). Enhancement of immune activities of Kadsura Japonica Dunal.

through conventional fermentation process. Korean J Medicinal Crop Sci, 15(3), 162-169.

Yang, B. W., Han, S. T., Ko, S. K.(2006). Quantitative analysis of ginsenosides in red

ginseng extracted under various temperature and time. Kor. J . Pharmacogn, 37(4), 217-220.

Park, B. D., Kim, H. J.(2012). Effects of soybean extracts fermented with Lactic acid bacteria

on immune system activity. Kor J Oriental preventive medical society, 16(3), 139-153.

Lee, C. W., Ko, E. J., Joo, H. G.(2012). Immumostimulatory effects of BCG-CWS on the

proliferation and viability of mouse spleen cells. Kor J Vet Res, 52(2), 89-97.

제1협동연구과제 : 면역활성 증진능 보유 유산균 및 혼합배양액의 효능 검증 연구

Ahn, S. B., Park, H. E., Lee, S. M., Kim, S. Y., Shon, M. Y., Lee, W. K.(2013).

Characteristics and immuno-modulatory effects of Weissella cibaria JW15 isolated from

Kimchi, Korea traditional fermented food, for probiotic use. J Biomed Res, 14, 206-211.

Björkroth, K. J., Schillinger, U., Geisen, R., Weiss, N., Hoste, B., Holzapfel, W. H.,

- 230 -

Vandamme, P.(2002). Taxonomic study of Weissella confusa and description of Weissella

cibaria sp. nov., detected in food and clinical samples. Int J Syst Evol Microbiol, 52,

141-148.

Chan, Y. S., Cheng, L. N., Wu, J. H., Chan, E., Kwan, Y. W., Lee, S. M., Chan, S.

W.(2011). A review of the pharmacological effects of Arctium lappa (burdock).

Inflammopharmacology, 19, 245-254.

Choi, H. J., Shin, M. S., Lee, S. M., Lee, W. K.(2012). Immunomodulatory properties of

Enterococcus faecium JWS 833 isolated from duck intestinal tract and suppression of

Listeria monocytogenes infection. Microbiol Immunol, 56, 613-620.

Fuller, R.(1989). Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol, 66, 365-378.

Gill, H. S.(2003). Prpobiotics to enhance anti-infective defence in the gastrointestinal tract.

Best Prac. Res. Clin. Gastroenterol, 17, 755-773

Isolauri. E., Sutas, Y., Kankaanpaa, P., Arvilommi, H., Salminen, S.(2001). Probiotics: effects

on immunity,. Am J Clin Nutr, 73, 444~450

Kang, M. S., Lim, H. S., Kim, S. M., Lee, H. C,. Oh, J. S.(2011). Effect of Weissella

cibaria on Fusobacterium nucleatum-induced Interleukin-6 and Interleukin-8 Production in

KB Cells. J Bacteriol Virol, 41, 9-18.

Kim, H. J., Moon, G. W.(2011). Affect of Fermentation diet on regulation of intestinal

microflora and autoimmunediseases J Complement. Altern. Med Sci1, 25-40.

Koide, T., Hashimoto, Y., Kamei, H., Kojima, T., Hasegawa, M., Terabe, K.(1997).

Antitumor effect of anthocyanin fractions extracted from red soybeans and red beans in

vitro and in vivo. Cancer Biother Radiopharm, 12, 277-280.

Lecssard, M., Brisson, G. J.(1987). Effect of a Lactobacillus fermentation product on growth,

immune response and fecal enzyme activity in weaned pigs. Can J Anim Sci, 67, 509-515.

Lee, Y. K., Salminen, S.(1995). The coming of age of probiotics. trends Food Sci Technol,

6, 241-245.

Marletta, M. A.(1993). Nitric oxide synthase structure and mechanism. J Biol Chem, 268,

12231-12234.

Matsuzaki, T.(1998). Immunomodulation by treatment with Lactobacillus casei strain

- 231 -

shirota. Int. J . Food. microbiol, 41, 133-140

Nomoto, K., Miake, S., Hashimoto, S., Yokokura, T., Mutai, M., Yoshikai, Y., Nomoto,

K.(1985). Augmentation of host resistance to Listeria monocytogenes infection by

Lactobacillus casei. J Clin Lab Immunol, 17, 91-97.

Nizamutdinova, I. T., Kim, Y. M., Chung, J. I., Shin, S. C., Jeong, Y. K., Seo, H. G., Kim,

H. J.(2009). Anthocyanins from black soybean seed coats stimulate wound healing in

fibroblasts and keratinocytes and prevent inflammation in endothelial cells. Food Chem

Toxicol, 47, 2806-2812.

Puertollano, E., Puertollano, M. A,. Cruz-Chamorro, L., Alvarez de Cienfuegos, G.,

Ruiz-Bravo, A., de Pablo, M. A.(2008). Orally administered Lactobacillus plantarum reduces

pro-inflammatory interleukin secretion in sera from Listeria monocytogenes infected mice.

Br J Nutr, 99, 819-825.

Rolfe, R. D.(2000). The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. J

NUTR, 130, 396-402.

Ryu, J. S., Han, S. K., Shin, M. S., Lee, W. K.(2009). In vitro selection of lactic acid

bacteria for probiotic use in pig, Korean J Vet Serv, 32, 33-41

제2협동연구과제 : 유산균 및 면역활성물에 관한 면역과 분자생물학적 작용기전 연구

Hirahara, K., Poholek, A., Vahedi, G., Laurence, A., Kanno, Y., Milner, J.D., O'Shea, J.J.,

2013. Mechanisms underlying helper T-cell plasticity: implications for immune-mediated

disease. The Journal of allergy and clinical immunology 131, 1276-1287.

Luckheeram, R.V., Zhou, R., Verma, A.D., Xia, B., 2012. CD4(+)T cells: differentiation and

functions. Clinical & developmental immunology 2012, 925135.

Josefowicz, S.Z., Lu, L.F., Rudensky, A.Y., 2012. Regulatory T cells: mechanisms of

differentiation and function. Annual review of immunology 30, 531-564.

Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K.S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons,

N., Levenez, F., Yamada, T., Mende, D.R., Li, J., Xu, J., Li, S., Li, D., Cao, J., Wang, B.,

Liang, H., Zheng, H., Xie, Y., Tap, J., Lepage, P., Bertalan, M., Batto, J.M., Hansen, T., Le

Paslier, D., Linneberg, A., Nielsen, H.B., Pelletier, E., Renault, P., Sicheritz-Ponten, T.,

Turner, K., Zhu, H., Yu, C., Li, S., Jian, M., Zhou, Y., Li, Y., Zhang, X., Li, S., Qin, N.,

Yang, H., Wang, J., Brunak, S., Dore, J., Guarner, F., Kristiansen, K., Pedersen, O., Parkhill,

J., Weissenbach, J., Meta, H.I.T.C., Bork, P., Ehrlich, S.D., Wang, J., 2010. A human gut

- 232 -

microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464, 59-65.

Frick, J.S., Autenrieth, I.B., 2013. The gut microflora and its variety of roles in health and

disease. Current topics in microbiology and immunology 358, 273-289.

Heselmans, M., Reid, G., Akkermans, L.M., Savelkoul, H., Timmerman, H., Rombouts, F.M.,

2005. Gut flora in health and disease: potential role of probiotics. Current issues in

intestinal microbiology 6, 1-7.

Knight, D.J., Girling, K.J., 2003. Gut flora in health and disease. Lancet 361, 1831.

Gill, H., Prasad, J., 2008. Probiotics, immunomodulation, and health benefits. Advances in

experimental medicine and biology 606, 423-454.

Ouwehand, A., Vesterlund, S., 2003. Health aspects of probiotics. IDrugs : the

investigational drugs journal 6, 573-580.

Santosa, S., Farnworth, E., Jones, P.J., 2006. Probiotics and their potential health claims.

Nutrition reviews 64, 265-274.

Koll, P., Mandar, R., Smidt, I., Hutt, P., Truusalu, K., Mikelsaar, R.H., Shchepetova, J.,

Krogh-Andersen, K., Marcotte, H., Hammarstrom, L., Mikelsaar, M., 2010. Screening and

evaluation of human intestinal lactobacilli for the development of novel gastrointestinal

probiotics. Current microbiology 61, 560-566.

Foligne, B., Daniel, C., Pot, B., 2013. Probiotics from research to market: the possibilities,

risks and challenges. Current opinion in microbiology 16, 284-292.

Klein, M., Sanders, M.E., Duong, T., Young, H.A., 2010. Probiotics: from bench to market.

Annals of the New York Academy of Sciences 1212 Suppl 1, E1-14.

Vogel, L., 2010. European probiotics industry fears regulations will scuttle market for

health-promoting or disease-preventing foods. CMAJ : Canadian Medical Association

journal = journal de l'Association medicale canadienne 182, E493-494.

Rescigno, M., 2009. Gut commensal flora: tolerance and homeostasis. F1000 biology reports 1, 9.

Kourelis, A., Kotzamanidis, C., Litopoulou-Tzanetaki, E., Papaconstantinou, J., Tzanetakis,

N., Yiangou, M., 2010. Immunostimulatory activity of potential probiotic yeast strains in the

dorsal air pouch system and the gut mucosa. Journal of applied microbiology 109, 260-271.

- 233 -

Delcenserie, V., Martel, D., Lamoureux, M., Amiot, J., Boutin, Y., Roy, D., 2008.

Immunomodulatory effects of probiotics in the intestinal tract. Current issues in molecular

biology 10, 37-54.

Kamdar, K., Nguyen, V., DePaolo, R.W., 2013. Toll-like receptor signaling and regulation of

intestinal immunity. Virulence 4, 207-212.

Napetschnig, J., Wu, H., 2013. Molecular basis of NF-kappaB signaling. Annual review of

biophysics 42, 443-468.

Kathariou, S., 2002. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety

perspective. Journal of food protection 65, 1811-1829.

Pamer, E.G., 2004. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nature reviews.

Immunology 4, 812-823.

Scaldaferri, F., Gerardi, V., Lopetuso, L.R., Del Zompo, F., Mangiola, F., Boskoski, I., Bruno,

G., Petito, V., Laterza, L., Cammarota, G., Gaetani, E., Sgambato, A., Gasbarrini, A., 2013.

Gut microbial flora, prebiotics, and probiotics in IBD: their current usage and utility.

BioMed research international 2013, 435268.

Arseneau, K.O., Tamagawa, H., Pizarro, T.T., Cominelli, F., 2007. Innate and

adaptive immune responses related to IBD pathogenesis. Current gastroenterology

reports 9, 508-512.

Goto, Y., Kiyono, H., 2012. Epithelial barrier: an interface for the cross-communication

between gut flora and immune system. Immunological reviews 245, 147-163.

Chen, Y.P., Hsiao, P.J., Hong, W.S., Dai, T.Y., Chen, M.J., 2012. Lactobacillus

kefiranofaciens M1 isolated from milk kefir grains ameliorates experimental colitis in vitro

and in vivo. Journal of dairy science 95, 63-74.

Chen, L.L., Zou, Y.Y., Lu, F.G., Li, F.J., Lian, G.H., 2013. Efficacy profiles for different

concentrations of Lactobacillus acidophilus in experimental colitis. World journal of

gastroenterology : WJG 19, 5347-5356.

Jang, S.E., Hyam, S.R., Han, M.J., Kim, S.Y., Lee, B.G., Kim, D.H., 2013. Lactobacillus

brevis G-101 ameliorates colitis in mice by inhibiting NF-kappaB, MAPK and AKT

pathways and by polarizing M1 macrophages to M2-like macrophages. Journal of applied

- 234 -

microbiology 115, 888-896.

Liu, Y.W., Su, Y.W., Ong, W.K., Cheng, T.H., Tsai, Y.C., 2011. Oral administration of

Lactobacillus plantarum K68 ameliorates DSS-induced ulcerative colitis in BALB/c mice via

the anti-inflammatory and immunomodulatory activities. International immunopharmacology

11, 2159-2166.

Yoda, K., Miyazawa, K., Hosoda, M., Hiramatsu, M., Yan, F., He, F., 2014. Lactobacillus

GG-fermented milk prevents DSS-induced colitis and regulates intestinal epithelial

homeostasis through activation of epidermal growth factor receptor. European journal of

nutrition 53, 105-115.

Wang, Q.Y., Chen, C.L., Wang, J.D., Lai, Z.S., Liu, R., Zhang, Y.L., 2002. Establishment of

dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis model in mice. Di 1 jun yi da xue xue

bao = Academic journal of the first medical college of PLA 22, 608-610.

Kim, J.Y., Park, B.K., Park, H.J., Park, Y.H., Kim, B.O., Pyo, S., 2013a. Atopic

dermatitis-mitigating effects of new Lactobacillus strain, Lactobacillus sakei probio 65

isolated from Kimchi. Journal of applied microbiology 115, 517-526.

Woo, S.I., Kim, J.Y., Lee, Y.J., Kim, N.S., Hahn, Y.S., 2010. Effect of Lactobacillus sakei

supplementation in children with atopic eczema-dermatitis syndrome. Annals of allergy,

asthma & immunology : official publication of the American College of Allergy, Asthma, &

Immunology 104, 343-348.

Lee, H.S., Han, S.Y., Bae, E.A., Huh, C.S., Ahn, Y.T., Lee, J.H., Kim, D.H., 2008. Lactic

acid bacteria inhibit proinflammatory cytokine expression and bacterial glycosaminoglycan

degradation activity in dextran sulfate sodium-induced colitic mice. International

immunopharmacology 8, 574-580.

Yoon, S.W., Lee, C.H., Kim, J.Y., Kim, J.Y., Sung, M.H., Poo, H., 2008. Lactobacillus casei

secreting alpha-MSH induces the therapeutic effect on DSS-induced acute colitis in Balb/c

Mice. Journal of microbiology and biotechnology 18, 1975-1983.

Kwon, H.K., Lee, C.G., So, J.S., Chae, C.S., Hwang, J.S., Sahoo, A., Nam, J.H., Rhee, J.H.,

Hwang, K.C., Im, S.H., 2010. Generation of regulatory dendritic cells and CD4+Foxp3+ T

cells by probiotics administration suppresses immune disorders. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America 107, 2159-2164.

- 235 -

Choi, H.J., Shin, M.S., Lee, S.M., Lee, W.K., 2012. Immunomodulatory properties of

Enterococcus faecium JWS 833 isolated from duck intestinal tract and suppression of

Listeria monocytogenes infection. Microbiology and immunology 56, 613-620.

Youn, H.N., Lee, D.H., Lee, Y.N., Park, J.K., Yuk, S.S., Yang, S.Y., Lee, H.J., Woo, S.H.,

Kim, H.M., Lee, J.B., Park, S.Y., Choi, I.S., Song, C.S., 2012a. Intranasal administration of

live Lactobacillus species facilitates protection against influenza virus infection in mice.

Antiviral research 93, 138-143.

Youn, H.N., Lee, Y.N., Lee, D.H., Park, J.K., Yuk, S.S., Lee, H.J., Yeo, J.M., Yang, S.Y.,

Lee, J.B., Park, S.Y., Choi, I.S., Song, C.S., 2012b. Effect of intranasal administration of

Lactobacillus fermentum CJL-112 on horizontal transmission of influenza virus in chickens.

Poultry science 91, 2517-2522.

Kim, M.S., Yoon, Y.S., Seo, J.G., Lee, H.G., Chung, M.J., Yum, D.Y., 2013b. A study on the

prevention of salmonella infection by using the aggregation characteristics of lactic Acid

bacteria. Toxicological research 29, 129-135.

Lee, J.W., Lee, J.H., Sung, S.H., Lee, S.J., 2013. Preventive effects of Lactobacillus mixture

on experimental E. coli urinary tract infection in infant rats. Yonsei medical journal 54,

489-493.

Joo, H.M., Hyun, Y.J., Myoung, K.S., Ahn, Y.T., Lee, J.H., Huh, C.S., Han, M.J., Kim, D.H.,

2011. Lactobacillus johnsonii HY7042 ameliorates Gardnerella vaginalis-induced vaginosis by

killing Gardnerella vaginalis and inhibiting NF-kappaB activation. International

immunopharmacology 11, 1758-1765.

Joo, H.M., Kim, K.A., Myoung, K.S., Ahn, Y.T., Lee, J.H., Huh, C.S., Han, M.J., Kim, D.H.,

2012. Lactobacillus helveticus HY7801 ameliorates vulvovaginal candidiasis in mice by

inhibiting fungal growth and NF-kappaB activation. International immunopharmacology 14,

39-46.

Kang, H., Choi, H.S., Kim, J.E., Han, N.S., 2011. Exopolysaccharide-overproducing

Lactobacillus paracasei KB28 induces cytokines in mouse peritoneal macrophages via

modulation of NF-kappabeta and MAPKs. Journal of microbiology and biotechnology 21,

1174-1178.

Lee, J.S., Paek, N.S., Kwon, O.S., Hahm, K.B., 2010. Anti-inflammatory actions of probiotics

through activating suppressor of cytokine signaling (SOCS) expression and signaling in

- 236 -

Helicobacter pylori infection: a novel mechanism. Journal of gastroenterology and

hepatology 25, 194-202.

Perdigon, G., Maldonado Galdeano, C., Valdez, J.C., Medici, M., 2002. Interaction of lactic

acid bacteria with the gut immune system. European journal of clinical nutrition 56 Suppl

4, S21-26.

Zhang, L., Li, N., Caicedo, R., Neu, J., 2005. Alive and dead Lactobacillus rhamnosus GG

decrease tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 production in Caco-2 cells. The

Journal of nutrition 135, 1752-1756.

Ashraf, R., Shah, N.P., 2014. Immune system stimulation by probiotic microorganisms.

Critical reviews in food science and nutrition 54, 938-956.

de Roock, S., van Elk, M., van Dijk, M.E., Timmerman, H.M., Rijkers, G.T., Prakken, B.J.,

Hoekstra, M.O., de Kleer, I.M., 2010. Lactic acid bacteria differ in their ability to induce

functional regulatory T cells in humans. Clinical and experimental allergy : journal of the

British Society for Allergy and Clinical Immunology 40, 103-110.

Inoue, Y., Iwabuchi, N., Xiao, J.Z., Yaeshima, T., Iwatsuki, K., 2009. Suppressive effects of

bifidobacterium breve strain M-16V on T-helper type 2 immune responses in a murine

model. Biological & pharmaceutical bulletin 32, 760-763.

Lopez, P., Gonzalez-Rodriguez, I., Gueimonde, M., Margolles, A., Suarez, A., 2011. Immune

response to Bifidobacterium bifidum strains support Treg/Th17 plasticity. PloS one 6,

e24776.

Lopez, P., Gonzalez-Rodriguez, I., Sanchez, B., Gueimonde, M., Margolles, A., Suarez, A.,

2012a. Treg-inducing membrane vesicles from Bifidobacterium bifidum LMG13195 as

potential adjuvants in immunotherapy. Vaccine 30, 825-829.

Lopez, P., Gonzalez-Rodriguez, I., Sanchez, B., Ruas-Madiedo, P., Suarez, A., Margolles, A.,

Gueimonde, M., 2012b. Interaction of Bifidobacterium bifidum LMG13195 with HT29 cells

influences regulatory-T-cell-associated chemokine receptor expression. Applied and

environmental microbiology 78, 2850-2857.

Wen, K., Li, G., Zhang, W., Azevedo, M.S., Saif, L.J., Liu, F., Bui, T., Yousef, A., Yuan, L.,

2011. Development of gammadelta T cell subset responses in gnotobiotic pigs infected with

human rotaviruses and colonized with probiotic lactobacilli. Veterinary immunology and

immunopathology 141, 267-275.

- 237 -

Wen, K., Bui, T., Li, G., Liu, F., Li, Y., Kocher, J., Yuan, L., 2012a. Characterization of

immune modulating functions of gammadelta T cell subsets in a gnotobiotic pig model of

human rotavirus infection. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases

35, 289-301.

Wen, K., Li, G., Bui, T., Liu, F., Li, Y., Kocher, J., Lin, L., Yang, X., Yuan, L., 2012b. High

dose and low dose Lactobacillus acidophilus exerted differential immune modulating effects

on T cell immune responses induced by an oral human rotavirus vaccine in gnotobiotic

pigs. Vaccine 30, 1198-1207.

Hirose, Y., Murosaki, S., Yamamoto, Y., Yoshikai, Y., Tsuru, T., 2006. Daily intake of

heat-killed Lactobacillus plantarum L-137 augments acquired immunity in healthy adults.

The Journal of nutrition 136, 3069-3073.

Donato, K.A., Gareau, M.G., Wang, Y.J., Sherman, P.M., 2010. Lactobacillus rhamnosus GG

attenuates interferon-{gamma} and tumour necrosis factor-alpha-induced barrier dysfunction

and pro-inflammatory signalling. Microbiology 156, 3288-3297.

Zakostelska, Z., Kverka, M., Klimesova, K., Rossmann, P., Mrazek, J., Kopecny, J., Hornova,

M., Srutkova, D., Hudcovic, T., Ridl, J., Tlaskalova-Hogenova, H., 2011. Lysate of probiotic

Lactobacillus casei DN-114 001 ameliorates colitis by strengthening the gut barrier function

and changing the gut microenvironment. PloS one 6, e27961.

Petrof, E.O., Kojima, K., Ropeleski, M.J., Musch, M.W., Tao, Y., De Simone, C., Chang,

E.B., 2004. Probiotics inhibit nuclear factor-kappaB and induce heat shock proteins in

colonic epithelial cells through proteasome inhibition. Gastroenterology 127, 1474-1487.

Iyer, C., Kosters, A., Sethi, G., Kunnumakkara, A.B., Aggarwal, B.B., Versalovic, J., 2008.

Probiotic Lactobacillus reuteri promotes TNF-induced apoptosis in human myeloid

leukemia-derived cells by modulation of NF-kappaB and MAPK signalling. Cellular

microbiology 10, 1442-1452.

제3협동연구과제 : 유산균 대량생산공정 및 면역활성 증진 기능성식품 개발

JI G.E. (1994). Composition and distribution of intestinal microbial flora in Korean. Kor J

Appl Microbiol Biotechnol, 22, 453-458.

Doron S., Snydman D.R., Gorbach S.L. (2005). Lactobacillus GG: Bacteriology and clinical

applications. Gastroenterol Clin N Am, 34, 483-498.

- 238 -

Muller D.M., Carrasco M.S., Tonarelli G.G., Simonetta A.C. (2009). Characterization and

purification of a new bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by

Lactobacillus plantarum Ip 31 strain isolated from dry-fermented sausage. J

Appl Microbiol 106: 2031-2040.

Chae D.J., Lee K.S., Jang K.H. (2010). Fermentation characteristics of flour sourdough

using mixed lactic acid bacteria and Bifidobacterium longum as starters. J East Asian Soc

Dietary Life, 20, 743-750.

Diep D.B., Godager L., Brede D., Nes I.F. (2006). Datamining and characterization of a

novel pediocin-like bacteriocin system from the genome of Pediococcus pentosaceus ATCC

25745. Microbiology, 152, 1649-1659.

Mathara J.M., Schillinger U., Guigas C., Franz C.M.A.P., Kutima P.M., Mbugua S., Shin

H.K., Holzapfel W.H. (2008). Functional characteristics of Lactobacillus sp. from traditional

maassai fermented milk products in Kenya. Int J Food Microbiol, 126, 57-64.

Park S.H., Yang S., Lee J.H., Kang M. (2013). Selection of phytate-degrading lactic acid

bacteria from Kimchi and reaction properties in brown rice. J Korean Soc Food Sci Nutr,

42, 627-632.

Ozlem O., fadime K., Ingolf F.N. (2011). A probiotic as biotherapeutic agents: present

knowledge and future prospects. Curr Pharm Des 8, 99-100.

Ryu B.H., Cho S.H., Ha S.W., Park K.M., Kang K.H. (1998). Changes of the intestinal

microflora and fecal properties by intake of yoghurt added capsulated or uncapsulated

bifidobacteria. Kor J Appl Microbial Biotechnol, 26, 221-225.

Kumagai T. (2009). Application of plant origin lactic acid bacteria to food. Food Style, 21,

13: 46-47.

Igarashi T. (2007). Development of beverage and food using plant origin lactic acid

bacterium. Bioindustry, 24, 32-39.

Huang C.J., Wang M.L., Kuo C.Y. (2008). Studies on the cholesterol removal ability of

plant origin lactic acid bacteria. J Taiwan Livestock Res, 41, 267-274.

Yoon S., Kwak H.K., Kim Y.K., Kim H.K., Park M.S., Yeom K.J., Oh H.S., Lee M.J., Lee

J.H., Ji K.E. (2006). Functional food. Lifescience Publisher, Seoul, Korea. p 268-273.

- 239 -

Ku B.S., Mamuad L.L., Kim S.H., Jeong C.D., Soriano A.P., Lee H.I., Nam K.C., Ha J.K.,

Lee S.S., (2013). Effect of γ-Aminobutyric Acid (GABA) Producing bacteria on in vitro

rumen fermentation, biogenic amine production and anti-oxidation using corn meal as

substrate, Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 26, 804-811.

Bae M.O., Kim H.J., Cha Y.S., Lee M.K., Oh S.H., (2009). Effects of Kimchi lactic acid

bacteria Lactobacillus sp. OPK2-59 with high GABA producing capacity on liver function

improvement. J Korean Soc Food Sci Nutr, 38, 1499-1505.

Koo M.C., Cho S.C., (2013). Production of GABA (gamma amino butyric acid) by lactic

acid bacteria. Korean J . Food Sci 33, 377-389.

Monaco R.D., Torrieri E., Pepe O., Masi P., Cavella S. (2014). Effect of sourdough with

exopolysaccharide (EPS)-producing lactic acid bacteria (LAB) on sensory quality of bread

during shelf life. Food and Bioprocess Technology 8, 691-701.

Valerie M.M. (1999). Effects of exopolysaccharide‐producing strains of thermophilic lactic

acid bacteria on the texture of stirred yoghurt. International Journal of Food Science and

Technology 34, 137-143.

Badel S., Bernardi T., Michaud P. (2010). New perspectives for Lactobacilli

exopolysaccharides. Biotechnology Advances 29, 54-66.

Marguerite D., Magali R.S., René‐M.W., Bernd D., Hans‐J.J., Klaus B., Pierre M. (1999).

Kinetic modeling of oligosaccharide synthesis catalyzed by Leuconostoc mesenteroides

NRRL B‐1299 dextransucrase. Biotechnology and Bioengineering, 63, 308-315.

Misook Kim, Donal F.D. (2007). Optimization of oligosaccharide synthesis from cellobiose

by dextransucrase. Applied Biochemistry and Biotechnology 148, 189-198.

Eom H.J., Seo D.M., Han N.S. (2007). Selection of psychrotrophic Leuconostoc spp.

producing highly active dextransucrase from lactate fermented vegetables. International

Journal of Food Microbiology 117, 61-67.

Wee Y.J., Kim H.O., Yun J.S., Ryu H.W. (2006). Pilot-scale lactic acid production via batch

culturing of Lactobacillus sp. RKY2 using corn steep liquor as a nitrogen source. Food

Technol Biotechnol, 44,293-298.

Kim W.Y., Kim J.M., Han S.B., Lee S.K., Kim N.D., Park M.K., Kim C.K., Park J.H.

(2000). Steaming of ginseng at high temperature enhances biological activity. J Nat Prod,

63, 1702-1704.

- 240 -

Leong K.H., Chen Y.S., Lin Y.H., Pan S.F., Yu B., Wu H.C., Yanagida F. (2012)

Weissellicin L, a nowel bacteriocin from sian-sianzih-isolated Weissella hellencia 4-7. J

Applied Micro, 115, 70-76.

Srionnual, S., Yanagida, F., Lin, L.H., Hsiao, K.N. and Chen, Y.S. (2007). Weissellicin 110, a

newly discovered bacteriocin from Weissella cibaria 110, isolated from plaa-som, a

fermented fish product from Thailand. Appl Environ Microbiol 73, 2247–2250.

Kobayashi Y., Tohyama K., Terashima T. (1974). Tolerance of the multiple antibiotic

resistant strain, L. casei PSR 3002, to artificial digestive fluids. Jpn J Microbiol, 29,

691-697.

Papagianni, M. and Papamichael, E.M. (2011). Purification, amino acid sequence and

characterization of the class IIa bacteriocin weissellin A, produced by Weissella

paramesenteroides DX. Bioresour Technol, 102, 6730–6734.

Keum Y.S., Park K.K., Lee J.M., Chun K.S., Park J.H., Lee S.K., Kwon H., Surh Y.J.

(2000). Antioxidants and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of

heat-processed ginseng. Cancer Letters, 150, 41-48.

Kim Y.S., Lee H., Kim D.Y., Kim S.Y., Lee W.K., Lee S.M., Park J.D., and Shon M.Y.

(2013) Cultivation of lactic acid bacteira for the Development of probiotic products using

red ginseng starch. J East Asian Soc Dietary Life, 23, 818～826

Muller D.M., Carrasco M.S., Tonarelli G.G., Simonetta A.C. (2009). Characterization and

purification of a new bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by

Lactobacillus plantarum Ip 31 strain isolated from dry-fermented sausage. J Appl

Microbiol, 106, 2031-2040.

Diep D.B., Godager L., Brede D., Nes I.F. (2006). Datamining and characterization of a

novel pediocin-like bacteriocin system from the genome of Pediococcus pentosaceus ATCC

25745. Microbiology, 152, 1649-1659.

Park J.W., Lee J.C., Ann S., Seo D.W., Choi W.S., Yoo Y.H., Park S.K., Choi J.Y., Um

S.H., Ahn S.H., Han J.W. (2011). A fermented ginseng extract, BST204, inhibits

proliferation and motility of human colon cancer cells. Biomol Ther, 19, 211-217.

- 241 -

- 242 -

주 의

1. 이 보고서는 농촌진흥청에서 시행한 「농업현장실용화기술개발 」의

연구보고서입니다.

2. 이 보고서의 내용을 인용․발표할 때는 반드시 농촌진흥청에서

시행한 「농업현장실용화기술개발」의 결과임을 밝혀야 합니다.

3. 국가과학기술 기밀유지에 필요한 내용은 대외적으로 발표 또는

공개하여서는 아니 됩니다.