突变体 P53-Y200C 小分子激活剂的虚拟筛选和验证

报告人：丁吉勇导 师：刘夫锋 时 间： 2013.09.17

报告内容

• 研究背景及现状

• 研究内容

• 研究特色与创新之处

在正常的细胞内，当 p53 功能正常时，能够激活 DNA 修复机制并防止损伤的 DNA 分裂。当 DNA

损伤不能修复， P53 将诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡。所以P53 发生突变，不能行使其正常功能时，就会导致癌症的发生。

研究背景

Figure. 1 The function of P53:cell cycle arrestJoerger A C, Fersht A R. Rev. Biochem., 2008, 77: 557-582.

2 、突变导致稳定性下降

约有 50% 的人类癌症是由于肿瘤抑制物 P53 的突变而导致的失活引起的， P53 失活导致癌症的机理主要有两种：

1 、突变导致无法与 DNA 结合

Figure.2 Structure of the p53 core domain bound to consensus DNA . Cancer mutation sites are shown in orange. Joerger A C, Fersht A R. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-

2242.

研究背景

Figure.3 The relative frequency of cancer-associated mutations for each residue according to the TP53 mutation database of the International Agency for Research on Cancer (www-p53.iarc.fr).

由上图可知，大多数突变发生在 P53 的核心结构域（ 94-292 ）， Y220C 是除 DNA 结合表面之外频率最高的致癌错义突变，占 P53错义突变的 1.4 ％，每年全球由于 Y220C 突变产生的新的癌症病例约有 75000 个，因此，针对这个突变体设计药物是必要的。

Y220C 突变体由第 220 位的酪氨酸突变成了半胱氨酸，该突变是在热力学上是高度不稳定的。但 T-p53C-Y220C 的晶体结构显示， Y220C 突变体保持了核心结构域的结构完整性。

研究背景

Y220C 突变如何导致 P53 失活？

核心结构域降低了4kcal/mol 的稳定性

Tm 值由原先的 44℃ 降低到 43℃

Joerger A C, Ang H C, Veprintsev D B, et al. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(16): 16030-16037.

研究背景

Y220C 突变如何导致 P53 失活？

Figure.4 T-P53 core domain tetramer bound to DNA.

四个核心结构域以协同方式结合这些 DNA 反应元件，得到 P53 蛋白： DNA 反应元件为 4:1 的复合物，四聚体与单体之间存在一个可逆的平衡，四聚体单体，而Y220C 突变导致单体蛋白展开，使平衡向右移动，从而减少了四聚体的数量，导致P53 无法行使其正常功能。

Joerger A C, Fersht A R. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(6).

在 Y220C 突变体中的分子表面，具有一个由于突变引起的比较大的缝隙，这个缝隙连接了两个 p53C 中原本存在的小的缝隙，由于这个缝隙远离与 DNA 识别或蛋白相互作用表面的区域，使其成为小分子药物非常合适的靶位点。

Y220 C220

研究现状

Figure.5 Molecular surface of T-p53C around Tyr-220 and T-p53C-Y220C around Cys-220 , showing the mutation-induced crevice (PDB ID code 2J1X, molecule A).

Joerger A C, Fersht A R. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-2242.

Figure.6 Molecular surface of the p53 mutant Y220C bound to the carbazole derivative PhiKan083.

研究现状

通过分子对接筛选出一个结合到突变体 Y200C 表面缝隙的分子家族，挑选其中具有代表性的分子做核磁共振光谱分析，发现咔唑衍生物 PhiKan083 提高了突变体的热稳定性，实验显示与PhiKan083 结合后 Y200C的 Tm 值提高了 2℃ ，并且降低了热变性的速度。

Boeckler FM, Joerger AC, Jaggi G, Rutherford TJ, Veprintsev DB, Fersht AR. 2008. Proc Natl Acad Sci 105: 10360–10365.

Figure.7 Details interaction of Cys220 and Phikan083 with surrounding residues in Y220C-Tp53C-Phikan083 obtained from UA-QCMD calculation.

研究现状

通 过 分 子 动 力 学 模拟， 结 合 量 子化学 计算 ， 研 究 了 Tp53C-Y220C 的动力学和原子间的相互作用力。阐述了 Y220C 突变对结构稳定性的影响以及在原子水平 PhiKan083 恢复蛋白稳定性的机制。

Rauf S M A, Endou A, Takaba H, et al. The protein journal, 2013, 32(1): 68-74.

分子对接

分子动力学模拟

实验验证

从数据库中挑选其他类型的小分子

YN

选取数据库中其他小分子

分析小分子与蛋白之间的作

用力

N

选取类似结构的分子验证，总结结合效果好的分子间的共同特点

研究内容

研究内容

•小分子数据库： drugbank 、中草药小分子库 •小分子初筛条件：Drugbank ：分子量 <300 ， ClogP≤3 ， hydrogen bond donors

≤3 ， hydrogen bond acceptors ≤3

中草药小分子库：分子量 <600 ， ClogP≤5 ， hydrogen bond donors≤5 ， hydrogenbond acceptors ≤10

•受体蛋白： P53-Y220C （ PDB ID ： 2J1X ）•软件： autodock vina

1.利用分子对接筛选能与 Y220C 突变体结合的小分子

Knox C, Law V, Jewison T.Wishart DS. Nucleic Acids Res. 2011 Jan;39(Database issue):D1035-41. 

Trott O, Olson A J. Journal of computational chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

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Figure.8 Histogram of best docking scores for compounds from drugbank against P53-Y220C.

研究内容

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Figure.9 Histogram of best docking scores for herb small moleculars against P53C-Y220C.

研究内容

研究内容名称： Anagrelide化学式： C10H7Cl2N3O分子量： 256.008亲和力： -5.6 kcal/mol

名称： Proguanil化学式： C11H16ClN5

分子量： 253.731亲和力： -5.3 kcal/mol

分子对接结果 -drugbank

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Table1. Ranking order of the small molecules virtual screened.

Number Name Rank Affinity

4239 (9S)-9-(4-hydroxybenzyl)-9,10-dihydro-5H-[1,4]dioxino[2,3-j]phenanthridin-6-one

9 -7.3

1358 antheraxanthin 19 -7.2

1362 O-Glycoside 23 -7.1

993 alpinumisoflavone 32 -6.9

14193 (1S)-1-[(2S)-6-(2-hydroxyethyl)-5,7-dimethyl-1-oxo-indan-2-yl]-5-methyl-3,4,7,8-tetrahydro-1H-cyclop

32 -6.9

15855 Nuatigenin 43 -6.8

2536 (6R)-3,6,9,11-tetrahydroxy-10-methyl-6H-chromeno[2,3-c]chromen-12-one

61 -6.7

3592 Chrysanthemaxanthin 61 -6.7

2. 分子动力学模拟

用 GROMACS MD 模拟软件，对小分子与蛋白的结合过程进行模拟，评估筛选出的小分子结合到 p53-Y220C 后对其结构的影响，并分析结合作用力。

合成 P53 突变体基因，构建重组表达质粒，导入到大肠杆菌中进行表达。将表达后的突变体进行分离纯化。

3.P53 突变体的表达与纯化

4. 实验验证

利用等温滴定量热法（ ITC ）检测 P53-Y220C 与小分子化合物结合后的能量变化，获得结合过程中的完整热力学参数，验证小分子结合蛋白后对蛋白稳定性的影响。

研究特色与创新点

1. 本研究中使用的小分子数据库 Drugbank 是目前最大的药物数据库，其中收录的小分子药物是 FDA批准或者正在审批中的已知药物，不仅有很强的成药性，而且各种物理化学、药物、生理性质都很清楚，非常适合用于虚拟筛选。构建的中草药数据库在五规则的基础上计算了分子极性表面积，类药性参数较高。

2. 结合 ITC和分子动力学模拟分析小分子与突变体之间形成的作用力，以及这些作用力对蛋白稳定性的影响，指导进一步的研究。

[1]Joerger A C, Fersht A R. Structural biology of the tumor suppressor p53[J]. Annu. Rev. Biochem., 2008, 77: 557-582.

[2]Joerger A C, Fersht A R. Structure–function–rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants[J]. Oncogene, 2007, 26(15): 2226-2242.

[3]Joerger A C, Ang H C, Veprintsev D B, et al. Structures of p53 cancer mutants and mechanism of rescue by second-site suppressor mutations[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(16): 16030-16037.

[4]Joerger A C, Fersht A R. The tumor suppressor p53: from structures to drug discovery[J]. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(6).

[5]Boeckler FM, Joerger AC, Jaggi G, Rutherford TJ, VeprintsevDB, Fersht AR. 2008. Targeted rescue of a destabilized mutant of p53 by an in silico screened drug. Proc Natl Acad Sci 105: 10360–10365.

参考文献：

[6]Rauf S M A, Endou A, Takaba H, et al. Effect of Y220C Mutation on p53 and Its Rescue Mechanism: A Computer Chemistry Approach[J]. The protein journal, 2013, 32(1): 68-74.

[8] Knox C, Law V, Jewison T, Liu P, Ly S, Frolkis A, Pon A, Banco K, Mak C, Neveu V, Djoumbou Y, Eisner R, Guo AC, Wishart DS. DrugBank 3.0: a comprehensive resource for 'omics' research on drugs. Nucleic Acids Res. 2011 Jan;39(Database issue):D1035-41. 

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[9]Trott O, Olson A J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. Journal of computational chemistry, 2010, 31(2): 455-461.