[2]

Resumen

Se tiene conocimiento que las levaduras son capaces de degradar los azúcares

mediante el proceso de fermentación dando como resultado desechos como

etanol y CO2, sin embargo, en muchas ocasiones esto no logra ser evidente para

los estudiantes ya que el CO2 es un gas y es complicado observarlo. Tomando en

cuenta esto, el presente estudio tuvo como objetivo la evaluación, cuantificación y

observación de la producción de etanol y CO2 a partir de la metabolización de

diferentes sustratos naturales (azúcar morena, azúcar mascabado, miel de abeja,

jugo de naranja natural) y sintéticos (Splenda, Stevia, jugo de naranja sintético,

Coca-Cola, Coca-Cola zero azúcar)

Se utilizó 1gr de levadura seca granulada (Saccharomyces cerevisiae) en

presencia de los distintos medios de cultivo en proporción 10 a 1, agua/azúcares.

Disueltos el medio y la levadura de manera uniforme y estéril a una temperatura

de 35-40°C se llevó a cabo el proceso de fermentación durante los siguientes 30

minutos en una muestra de 1ml tomada con una jeringa realizando anotaciones de

la producción de CO2 cada 2 minutos con la ayuda de la graduación de ésta

colocada en una goma de migajón, todo este proceso por triplicado.

Los resultados obtenidos demuestran que S. cerevisiae metabolizó eficientemente

la mayoría de los azucares a los cuales fue expuesta y que todos los sustratos se

comportaron de manera similar en la producción de CO2 salvo el azúcar

mascabado y Stevia que en comparación con los otros seis sustratos presentaron

una producción mayor del doble que los demás azucares naturales y sintéticos, y

que efectivamente la Coca-Cola zero azúcar en realidad no contiene azúcar.

Se puede concluir que S. cerevisiae mostró una eficiente capacidad para producir

etanol y CO2 a partir del metabolismo de los azucares mencionados y que las

distintas cantidades de CO2 producidas fueron fácilmente cuantificables por el

desplazamiento del embolo de la jeringa que permitió observar de manera sencilla

la producción de este gas, sin la necesidad de recurrir a aparatos tecnológicos

muy sofisticados para observar este fenómeno.

[3]

Introducción

Marco teórico

Existen diversos procesos mediante los cuales los organismos pueden obtener

energía a partir de los alimentos que consumen (beta-oxidación, glucolisis, ciclo de

Krebs y respiración celular), a través de estos procesos tanto células procariontes

como eucariontes generan su energía en forma de ciertas moléculas, una de ellas

es el Adenosín Trifosfato (ATP) que servirá para la síntesis de otras

macromoléculas (De Martín, 2005).

Para obtener estas moléculas de energía, es necesario oxidar los nutrientes

consumidos, estos pueden ser ácidos grasos, compuestos cetónicos,

carbohidratos, entre otros compuestos orgánicos. En el caso particular de los

carbohidratos el proceso inicial se lleva a cabo en el citosol de la célula con la

degradación de la glucosa (glucólisis), esta degradación de la glucosa (un azúcar

de seis carbonos) consiste en una serie de reacciones enzimáticas en la cual se

generaran dos moléculas de piruvato (molécula de tres átomos de carbono). Este

proceso no requiere de oxígeno y por lo tanto se puede realizar en presencia de

oxígeno (condiciones aerobias) o en ausencia de éste (condiciones anaerobias)

(Audesirk et al., 2013).

El piruvato sintetizado en el citosol de la célula debe ser transportado a la matriz

de la mitocondria para que suceda la respiración celular con las enzimas que se

encuentran presentes en este sitio, por otro lado, en ausencia de oxígeno después

de la glucolisis se puede llevar a cabo la fermentación, este proceso tiene que

regenerar el NAD+ para que la glucolisis continúe y el organismo no muera. En

torno a la ruta metabólica con la cual el organismo haya evolucionado tiene dos

caminos para poder regenerar el NAD+: fermentación láctica o alcohólica, en el

primer caso se producirá acido láctico y para el segundo, etanol y CO2 ambos

casos a partir del piruvato.

[4]

Existen diversos organismos que son capaces de generar su propia energía

dependiendo de la situación y medio en el que se encuentren, es decir, en

presencia de oxígeno utilizaran la respiración aerobia, en el caso de que este

oxígeno se extinguiera pueden recurrir la respiración anaerobia y ser capaces de

fermentar, a estos organismos se les denomina anaerobios facultativos (Tortora et

al., 2013).

La levadura (hongo unicelular) posee las características mencionadas

anteriormente, puede realizar la fermentación alcohólica en condiciones

anaerobias. Desde hace siglos la humanidad ha aprovechado las características

de la levadura al fermentar el azúcar de distintos frutos para producir alcohol. Se

tiene conocimiento de que ya existía de manera comercial el vino y la cerveza

desde hace aproximadamente unos 5000 años. Pero, no es el único caso en que

la humanidad ha aprovechado las bondades de la levadura, el pan y el vino

espumoso también son producto de la fermentación (Audesirk et al., 2013).

Además de los beneficios que traen consigo las levaduras algunas especies del

género Saccharomyces han inspirado diversas obras de arte que exaltan al Dios

del vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Como modelo biológico han

contribuido de manera importante en diversas ramas de la biología, dentro del

género Saccharomyces, la especie cerevisiae es el organismo eucarionte mas

estudiado por poseer un genoma relativamente pequeño, tan solo un poco mayor

que Escherichia coli (bacteria anaerobia facultativa utilizada de manera frecuente

en experimentos de genética y biología molecular) y aproximadamente unas 200

veces menor que el de las células de mamífero (Martínez y Martínez, s/f).

Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular eucarionte de dimensiones

aproximadas entre 2.5 y 10 micras de ancho y 4.5 a 21 micras de largo, presentan

diversas formas desde cilíndricas y filamentosas hasta redondas, ovoides y

elipsoides con pared celular y núcleo verdadero. Posee mitocondrias, ribosomas y

en algunas ocasiones vacuolas, cuando se forman colonias suelen presentar un

color crema o blanco, de apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares, la

[5]

temperatura adecuada para su crecimiento oscila entre los 25-30 °C y llega a

producir ascosporas cuando los nutrimentos son óptimos. Es utilizada

comúnmente para la obtención de etanol a nivel industrial por su fácil

manipulación, cultivo y porque su fermentación produce subproductos casi

imperceptibles (Fajardo y Sarmiento, 2007).

Saccharomyces cerevisiae utiliza como fuente de carbono y energía diversos

azucares como glucosa, fructosa, manosa y galactosa (monosacáridos), maltosa e

isomaltosa (disacáridos), y en presencia de O2 puede metabolizar sustratos como

el glicerol, etanol y lactato (Fajardo y Sarmiento, 2007).

Objetivos

Evaluar la producción de CO2 a partir de la fermentación de Saccharomyces

cerevisiae empleando distintos sustratos naturales y sintéticos.

Cuantificar la producción de CO2 a partir de la fermentación de Saccharomyces

cerevisiae empleando distintos sustratos.

Observar cómo la fermentación de Saccharomyces cerevisiae metaboliza los

compuestos naturales y sintéticos hasta producir etanol y CO2.

Problema

Se tiene conocimiento que las levaduras son capaces de metabolizar una gran

cantidad de azúcares mediante el proceso de fermentación dando como resultado

desechos como etanol y CO2, sin embargo, en muchas ocasiones esto no logra

ser evidente para los estudiantes ya que el CO2 es un gas y es complicado

observarlo. En este sentido se pretende observar el desprendimiento de este gas y

realizar la cuantificación del mismo en un modelo que evidencie la producción de

este desecho.

[6]

Hipótesis

Se sabe que Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular utilizado para la

producción de etanol a partir de la fermentación de diferentes azucares, en el que

se obtiene como producto de desecho CO2, entonces si se emplean diversos

sustratos naturales (azúcar morena, azúcar mascabado, miel de abeja, jugo de

naranja natural) y sintéticos (Splenda, Stevia, Jugo de naranja sintético, Coca-

Cola, Coca-Cola zero azúcar) en un medio acuoso con presencia de

Saccharomyces cerevisiae y se utiliza un instrumento de medición de CO2, será

posible observar y cuantificar las distintas cantidades de CO2 producidas a partir

de los distintos sustratos naturales y sintéticos empleados.

Desarrollo

Cuando hay ausencia o suministro limitado de oxígeno puede ocurrir la

fermentación en las levaduras bajo la presencia de distintos azúcares, este

proceso se lleva a cabo en el citosol de la célula, repone los suministros de NAD+

al producir una pequeña cantidad de ATP y mediante este proceso se genera

alcohol etílico y dióxido de carbono, a partir de este hecho, se decidió observar

cuál de los distintos sustratos (azúcar morena, azúcar mascabado, miel de abeja,

jugo de naranja, splenda, stevia, jugo de naranja sintético, coca-cola, coca-cola

zero azúcar) produce una mayor cantidad de CO2. Para ello se utilizó 1g de

levadura seca granulada (Saccharomyces cerevisiae) pesada cuidadosamente

con ayuda de un vidrio de reloj y una balanza analítica en presencia de distintos

medios de cultivo en proporción 10 a 1, es decir, 10ml de agua (Bonafont) y un 1g

o 1ml de los distintos azúcares.

Cada uno de los sustratos fueron cuidadosamente pesados de la misma forma

que la levadura y la alícuota del jugo de naranja natural, sintético y la coca-cola

(tradicional y zero azúcar) tomada con una jeringa plastipak estéril de 3ml, estos

fueron depositados en un vaso de precipitado y agitados con una varilla de vidrio

también estéril para la disolución correcta, siempre cerca de la flama para evitar la

[7]

contaminación con algún organismo patógeno y tener certeza que el CO2

producido es por el sujeto experimental.

Una vez disueltos el medio y la levadura de manera uniforme y estéril se tuvo la

precaución con la ayuda de un termómetro de verificar que el medio de cultivo se

mantuviera entre 35-40 °C para comenzar el proceso de fermentación durante los

siguientes 30 minutos. Enseguida se tomó una muestra de un 1ml en una jeringa

plastipak estéril de 5ml y se colocó la aguja de la jeringa en una goma de migajón

con la finalidad de evitar que se escapara el CO2 y así poder observar la

producción del CO2 a partir del primer mililitro tomado, se realizaron las

anotaciones correspondientes obteniendo un registro de la producción cada 2

minutos con la ayuda de la graduación de la jeringa (figura 1). Todo el

procedimiento mencionado anteriormente se llevó a cabo por triplicado y para una

mayor certeza de los resultados se promediaron todos los registros.

Cabe señalar que de la misma forma se utilizó un testigo o muestra control el cual

consistió en todo el procedimiento anterior, sin embargo no contenía ningún

sustrato (azúcar).

Figura 1. Metodología y materiales utilizados en la fermentación de distintos azúcares por la levadura Saccharomyces cerevisiae.

[8]

Resultados

Con el propósito de evaluar, cuantificar y observar la producción de CO2 a partir

de 1ml tomado de cada una de las muestras de la fermentación de

Saccharomyces cerevisiae empleando los distintos sustratos naturales (azúcar

morena, azúcar mascabado, miel de abeja, jugo de naranja natural) y sintéticos

(Splenda, Stevia, jugo de naranja sintético, Coca-Cola, Coca-Cola zero azúcar)

fue colocado 1g de levaduras secas granuladas con los azucares mencionados y

agua en proporción 1/10. Se observó que Saccharomyces cerevisiae mostró

actividad metabólica inmediatamente después de entrar en contacto con los

distintos sustratos ya que al tomar la muestra de 1ml en el tiempo 0 se observó un

ligero movimiento en el embolo de las jeringas mostrando la presencia de CO2

generada por Saccharomyces cerevisiae metabolizando todo el sustrato a lo largo

de 30 minutos (figura 3 y 4), en comparación con la muestra control (figura 2).

Figura 2. 1 ml de la muestra Saccharomyces cerevisiae disuelta en agua a una temperatura entre 35-40 °C para tomar como referencia que la levadura necesita azúcar para poder producir CO2.

[9]

La siguiente grafica de barras muestra el registro promedio de la producción de

CO2 llevado a cabo por triplicado de la levadura en presencia del sustrato azúcar

morena, azúcar mascabado, miel de abeja y jugo de naranja (sustratos naturales)

mediante la fermentación (figura 3).

Figura 3. 1 ml de la muestra Saccharomyces cerevisiae en presencia de los sustratos naturales entre 35-40 °C produciendo CO2 en un lapso de 30 minutos.

Bajo las mismas condiciones se muestra en la figura 4 el registro promedio de la

producción de CO2 llevado a cabo por triplicado de la levadura en presencia de los

sustratos sintéticos.

[10]

Figura 4. Desprendimiento de CO2 de Saccharomyces cerevisiae mediante la fermentación en presencia de los sustratos sintéticos.

Finalmente podemos observar una grafica comparativa (figura 5) de los distintos

sustratos metabolizados por Saccharomyces cerevisiae por medio de la

fermentación alcohólica.

[11]

Figura 5. Saccharomyces cerevisiae mostró la producción de CO2 mediante el proceso de fermentación en presencia de los sustratos naturales y sintéticos.

Análisis e interpretación de resultados

El etanol y el dióxido de carbono generado por la levadura Saccharomyces

cerevisiae a partir de diversos azucares son productos de desecho para estos

organismos unicelulares, pero, resultan útiles para el ser humano. El etanol que se

ha producido por este microorganismo se puede encontrar en la cerveza, vino,

champaña y vinos espumosos (con gas). El dióxido de carbono es el responsable

de la subida de la masa para hacer pan, es decir, cuando la harina húmeda se

mezcla con la levadura el agua presente reanima el estado latente de las células

secas de levadura y al dejarlas en reposo estas se reproducen rápidamente, los

[12]

almidones presentes son degradados por algunas enzimas presentes en la harina

y estos producen suficiente azúcar que es rápidamente fermentada por

Saccharomyces cerevisiae, entonces, el CO2 queda atrapado en la masa

haciéndola esponjarse y el alcohol que se produjo se desprende en el proceso de

cocción (Tortora et al., 2013).

Este desprendimiento de CO2 da muestra clara de que Saccharomyces cerevisiae

está llevando a cabo la metabolización de los distintos azucares a través del

proceso de fermentación, de esta manera se puede observar en las graficas de los

resultados (figura 3) la cantidad de CO2 producido por cada uno de los diferentes

sustratos orgánicos.

La figura 2 muestra la ausencia de CO2, como era de esperarse, ya que al no

tener ningún sustrato no puede existir la fermentación, por ello era importante

tener un control para asegurar que el sujeto experimental (Saccharomyces

cerevisiae) esta metabolizando los distintos sustratos y por lo tanto produciendo

etanol y CO2.

Al realizar las fermentaciones con el azúcar morena y el azúcar mascabado

ambos “sacarosa” un disacárido conformado por glucosa y fructosa, se puede

apreciar una gran diferencia en la producción de CO2 (figura 3), 2.3 ml y 5ml

respectivamente durante 30 minutos. Desde los primeros minutos la producción de

CO2 fue de aproximadamente el doble a lo largo de todos los registros tomados,

demostrando que el azúcar mascabado es un sustrato muy eficaz para ser

metabolizado por Saccharomyces cerevisiae debido a que el mascabado es un

azúcar natural sin refinar, a diferencia del azúcar morena que ha llevado un

proceso de refinación (mecánico y químico) y mezclado con melaza dejándolo sin

nutrientes importantes (enzimas, antioxidantes, algunas vitaminas del complejo B

y minerales como el potasio, magnesio, hierro y calcio) [Ranilla, et al., 2008], los

cuales favorecen el metabolismo de los carbohidratos en la levadura.

En lo que respecta a la fermentación de la miel de abeja un azúcar conformado

por aproximadamente un 31% glucosa, 38% fructosa y un 7,5% maltosa, la

[13]

levadura Saccharomyces cerevisiae en un periodo de 30 minutos generó 2.5 ml de

CO2 (figura 3) ligeramente superior que el azúcar morena y aunque la miel de

abeja sí contiene componentes minoritarios como ácidos orgánicos (ácido cítrico y

ácido acético), flavonoides, enzimas, vitaminas, hormonas, minerales, cenizas,

proteínas, aminoácidos y residuos de polen (Gutiérrez, et al., 2008), no logró

hacerle frente a la producción de CO2 alcanzado por el azúcar mascabado. Esto

probablemente se deba a que aunque ambos poseen los nutrientes necesarios

para favorecer el metabolismo y los mismos azucares que se encuentran en el

azúcar mascabado, están presentes los enlaces O-glucosídicos propios de los

disacáridos y en la miel de abeja se encuentran la glucosa y fructosa pero de

manera individual en forma de monosacáridos, además de que el azúcar

mascabado por cada 10 gramos aporta 38 calorías y la miel de abeja por cada 10

gramos aporta 33 calorías y un buen porcentaje de agua (17%) conforma la

estructura de la miel de abeja y el azúcar mascabado tiene casi una humedad

nula.

Al utilizar el jugo de naranja como sustrato para la fermentación por

Saccharomyces cerevisiae se observó una producción de 1.8 ml de CO2 en el

lapso de 30 minutos (figura 3), este fue el sustrato natural que produjo una

cantidad menor de CO2 en el transcurso del tiempo mencionado con respecto a

los demás sustratos orgánicos ya que el jugo de naranja contiene alrededor de 9%

de azucares, estos son en porcentajes un 27% glucosa, 29% fructosa y 44%

sacarosa, el mismo caso que en la miel de abeja, la glucosa y fructosa se

encuentran de manera individual y aunque la sacarosa contiene los enlaces

glucosídicos y Saccharomyces cerevisiae la enzima invertasa para oxidar este

disacárido todos los elementos mencionados se encuentran en una cantidad muy

pequeña. En este sentido existen estudios que mencionan que para llevar a cabo

la fermentación del jugo de naranja o producir etanol a partir del jugo de esta fruta

es necesaria la adición de azúcar de mesa y condiciones sumamente controladas

por el contenido de acido cítrico que solo puede ser metabolizado por algunas

bacterias y dificulta a las levaduras llevar a cabo la fermentación alcohólica

[14]

(Ferreyra et al., 2009). Por esta razón es claro suponer que Saccharomyces

cerevisiae metabolizó de manera menos eficiente este sustrato.

En lo que respecta a los sustratos sintéticos (figura 4), Splenda y Coca-Cola

tradicional produjeron 2.3 y 2.2ml de CO2 respectivamente. Una cantidad y

comportamiento casi idéntico al azúcar morena, en el primer caso probablemente

debido a que en su estructura son muy similares, la diferencia radica en que los

grupos hidroxilos de la sacarosa son reemplazados por Cloro mediante

halogenación selectiva, es decir, la adición de átomos del grupo de los halógenos

a una molécula orgánica, dando como resultado la sucralosa (Cuellar y Funes,

2013), y esto no le afectó a Saccharomyces cerevisiae para poder metabolizar

este edulcorante de bajas calorías fabricado a partir del azúcar. En el segundo

caso, la Coca-Cola en sus ingredientes presenta agua carbonatada, azúcares y

concentrado de Coca-Cola, los azucares a los que hace referencia esta bebida es

el azúcar de caña con otros endulzantes (The Coca-Cola Company, 2011) por ello

la similitud en la producción de CO2 cuando fue metabolizada por la levadura.

Al evaluar la producción de CO2 por parte de Stevia (figura 4) se observó que su

comportamiento fue de manera similar al azúcar mascabado este sustrato produjo

5.3 ml de CO2 en el tiempo mencionado ya que este edulcorante es una mezcla de

sacarosa, sucralosa, y Estevia. De esta manera se puede determinar que estos

tres azucares en conjunto potencian el metabolismo por parte de la levadura lo

cual se vio reflejado con la mayor producción de CO2.

El jugo de naranja sintético y la Coca-Cola zero azúcar fueron los sustratos que

Saccharomyces cerevisiae metabolizó de manera menos eficiente (figura 4), en la

búsqueda de información sobre los azucares contenidos en el jugo de naranja

para tratar de explicar dicho comportamiento, no fue posible identificar la

particularidad de estos ya que la información nutrimental y los ingredientes en

etiquetas de estos productos solo indican que contienen azucares, es posible que

estos azucares no sean fuente importante de alimento para la levadura y por lo

[15]

tanto no se observa una alta producción de CO2. Sin embargo, la poca producción

de CO2 puede atribuirse al jugo de naranja natural que contienen estos jugos.

Por su parte la Coca-Cola zero enfatiza en su etiqueta que no contiene azucares,

pero si edulcorantes que le confieren ese sabor dulce, tales como el aspartame y

el acesulfame potásico. El primero de los edulcorantes deriva de dos aminoácidos

(ácido aspártico y fenilalanina), el segundo es un derivado del acetoacético y la sal

de potasio (Duran et al., 2013). De esta manera se puede explicar la

imperceptible producción de CO2 con este sustrato, ya que las levaduras

necesitan azucares para poder llevar a cabo el proceso de la fermentación

alcohólica y estos edulcorantes no poseen la características de los hidratos de

carbono, asimismo, se puede adjudicar la escasa producción de CO2 al agua

carbonatada que contiene la bebida en cuestión.

Finalmente se muestra una grafica comparativa de la muestra control y los

distintos sustratos metabolizados (figura 5), se puede observar que

Saccharomyces cerevisiae metabolizó eficientemente la mayoría de los azucares

a los cuales fue expuesta y que todos los sustratos se comportaron de manera

similar en la producción de CO2 salvo el azúcar mascabado y Stevia que en

comparación con los otros seis sustratos mostraron una producción mayor del

doble que los demás azucares naturales y sintéticos, y que efectivamente la Coca-

Cola zero azúcar en realidad no contiene azúcar.

Conclusiones

Saccharomyces cerevisiae mostró una eficiente capacidad para producir etanol y

CO2 a partir del metabolismo de los azucares naturales y sintéticos.

Saccharomyces cerevisiae produjo distintas cantidades de CO2 a partir de los

diferentes azucares a los cuales estuvo expuesta, esto se vio reflejado por el

desplazamiento del embolo de la jeringa que permitió cuantificar de manera

sencilla la producción de este gas.

[16]

Se observó de manera clara como Saccharomyces cerevisiae es capaz de

metabolizar azucares por medio de la fermentación ya que de manera inicial el

mililitro de muestra (liquida) con el paso de los minutos cambio a una fase

gaseosa y burbujeante produciendo en consecuencia etanol y dióxido de carbono.

Es importante mencionar que a veces no es necesario contar con aparatos

tecnológicos muy sofisticados para observar un determinado fenómeno, basta con

tener un poco de ingenio, materiales accesibles y de bajo costo para así

evidenciar lo que a veces es complicado mostrar.

[17]

Fuentes de información

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[18]

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