ศูนย วิจัยและตรวจสอบค ุณภาพส ัตว น้ําและผล ิตภณฑั … · ผู ทบทวนเอกสาร

วิธีทดสอบเรือ่ง : Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli

หมายเลขเอกสาร : TM-06 ฉบับที่ : 1 แกไขครั้งที่ : 8 หนา 1 ใน 27 ผูทบทวน : ผูอนุมัติ : วันที่บังคับใช : 30 ส.ค.54

ศูนยวิจัยและตรวจสอบคุณภาพสัตวน้าํและผลิตภณัฑสัตวน้ํา สุราษฎรธาน ีกองตรวจสอบรับรองมาตรฐานคณุภาพสัตวน้ําและผลิตภัณฑสตัวน้ํา กรมประมง

ผูรับผิดชอบ ชื่อ-สกุล ตําแหนง ผูจัดทําเอกสาร 1. นางธีรยา สรรพวรพงษ

2. นางวิภาวรรณ บัวแกว 3. นางรุงทิพย บุษบรรณ

นักวชิาการผลติภัณฑอาหาร นักวชิาการผลติภัณฑอาหาร นักวชิาการผลติภัณฑอาหาร

ผูทบทวนเอกสาร นางธีรยา สรรพวรพงษ ผูจัดการวิชาการ (ฝายวิเคราะหทางจุลชีววทิยา) ผูอนุมัติเอกสาร นางสาวมณีย กรรณรงค ผูจัดการคุณภาพ

รายละเอียดผูครอบครองเอกสาร

ชุดเอกสาร หมายเลข ผูครอบครองเอกสาร ตนฉบับ - ผูจัดการคุณภาพ สําเนาควบคุม 1 ผูจัดการวิชาการ (ฝายวิเคราะหทางจุลชีววทิยา) สําเนาควบคุม 4 เจาหนาที่ฝายวิเคราะหทางจุลชีววทิยา สําเนาควบคุม 7 สํานักมาตรฐานหองปฏิบัติการ




ประวัติการแกไข

ฉบับที่ แกไขครั้งที่ รายละเอียดการแกไข วันที่บังคับใช 1 0 ประกาศใชเอกสารครั้งแรก 9 ต.ค. 49 1 1 -เพิ่ม นางอรสา เพชรสลับศรี นักวิชาการผลิตภัณฑอาหาร 4 เปนผูจัดทําเอกสาร

- แกไขชื่อผูทบทวน และผูอนุมัติ -แกไขขอความ ขอ 6.1 จากเดิม “1-10 CFU/ml” แกไขเปน “ที่มีระดับความเจือจาง 10-3 ถึง 10-4 (Inoculum ถูกเจือจาง 1,000-10,000 เทา)”

1 ส.ค. 50

1 2 -ขอ 6.1 เพิ่มขอความดังนี้ “ATCC 25922” หลังคําวา ”E.coli” 4 ธ.ค. 50 1 3 -ตัดชื่อผูจัดทํา “นางสาวมณีย กรรณรงค และนางอรสา เพชรสลับศรี” และเพิ่ม“นางธีรยา

สรรพวรพงษ” แทน, แกไข Flow Diagram -แกไขผูทบทวน เดิม “นางอรสา เพชรสลับศรี” เปน “นางธีรยา สรรพวรพงษ” -เพิ่มขอ 3.2.3 วิธีทดสอบเรื่อง เชื้อจุลินทรียที่มีชีวิตทั้งหมด (Total Viable Plate Count) (TM-04), ขอ 3.2.5 และ 5.4.4 แบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Coliform (โดยวิธีนับจํานวนโคโลนี) (F-TM-06-4), ขอ 5.2.4 Lauryl Tryptose Broth (Double Strength) (M 76a), ขอ 5.4.3.2 (กรณีตัวอยางที่มีการปนเปอนของเชื้อต่ํา ใหทําเพิ่มที่เนื้อหอย 10 g โดยปเปตสารละลายตัวอยางจากการตีปนกอนทํา dilution จํานวน 20 มิลลิลิตร ลงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ Lauryl Tryptose Broth (Double Strength) 10 มิลลิลิตร จํานวน 5 หลอด)

31 ส.ค.51

1 4 -แกไขขอ 3.1.2 จาก “2001” เปน “2006” -แกไขอุณหภูมิทีใ่ชบมจาก “35 ± 2 ºC “ เปน “35 ± 1 ºC” -ขอ 5.4.2.3 แกไขจาก “MPN ตัวอยาง” เปน “ MPN/g ตัวอยาง “ -ขอ 5.2.4 และขอ 5.4.3.2 แกไขจาก “ Double “ เปน “ Triple “ - ตัดขอความในขอ 6.2.3 ออก “โดยคิดเปนเปอรเซ็นตเทียบระหวางตัวอยางที่ทําซ้ํากับตัวอยางปกติ”

31 ต.ค.51

1 5 แกไขตําแหนงผูจัดทํา, ขอ 6.1 ตัดชื่อเชื้อออก แลวเพิ่ม “(ตามภาคผนวก ข ของวิธีปฏิบัติงาน เรื่อง การเก็บรักษาเชื้ออางอิง (W-M-509-04))”

3 ส.ค.52

1 6 -เพิ่มเอกสารอางอิงขอ 3.1.3, เพิ่มเอกสารที่เกี่ยวของ ขอ 3.2.7 F-TM-06-05, เพิ่มชื่ออาหารเลี้ยงเชื้อขอ 5.2.16 และ 5.2.17, เพิ่มวิธีทดสอบหา E.coli โดยวิธี ISO/TS 16649-3 พรอม Flow Diagram, แกไขหวัขอ 5.4.2, 5.4.4, 5.4.5, 6.1 และเพิ่มภาคผนวกตารางที่ 3 กับ 4

1 พ.ย.52




ฉบับที่ แกไขครั้งที่ รายละเอียดการแกไข วันที่บังคับใช 1 7 เพิ่มขอความหัวขอ การประมาณคาจากตาราง MPN กรณีที่ไมพบคาปรากฏในตาราง 1 เม.ย.53 1 8 -ตัดขอความ ในขอ 6.1 “และ Negative ไมตอง spike เชื้อ อีก 1 ถุงตัวอยาง”

-ตัดขอ 6.2, 6.2.1, 6.2.2, 6.2.3, 7.1, 7.2 -เปล่ียนชื่อผูจัดทําเอกสารจาก นางสาวนูรียะห มะสาแม็ง เปน นางวิภาวรรณ บัวแกว และเพิ่มชื่อ นางรุงทิพย บุษบรรณ -ขอ 8.5 เปล่ียนขอความ “หนวยงานระดับชาติหรือระดับนานาชาติ” เปน “หนวยงานภายนอก” -ขอ 3.1.2 เปล่ียน “2006” เปน “2010” และ “14pp.” เปน “13pp.” -แกหัวขอ เปน ขอ7 คุณสมบัติผูทดสอบ - แกไขการอานคา MPN การอานคา MPN การอานคาจากตาราง MPN โดยการตัด dilution สูงสุด (มีปริมาณตัวอยางต่ําสุด) หรือ dilution ถัดมา ในกรณีที่ dilution สูงสุดใหผลเปน negative ทุกหลอด ใหเลือก 3 dilution ที่เหลืออยูดังตัวอยางชุด A ถามี positive มากกวา 3 dilution ใหพิจารณาดังนี้

กรณีที่ 1 เมื่อพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด และเปน dilution ที่ตองเลือก ใหเลือก 3 dilution สูงสุด เชน ตัวอยาง ชุด B และตัวอยางชุด C

กรณีที่ 2 เมื่อพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด แตเปน dilution ที่ไมไดเลือก ใหเลือก dilution สูงสุดลําดับถัดไป ดังตัวอยางชุด D

กรณีที่3 ไมพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด ใหเลือก 2 dilution ต่ําสุดและใหรวมผล positive ที่เหลือเปน dilution ที่ 3 ดังตัวอยางชุด E

ถา 3 dilution ที่เลือกไมพบคาในตาราง แสดงวาผลเปนที่นาสงสัย ใหทําการทดสอบซ้ําหรือใหใช 3 dilution สูงสุดที่เหลืออยู ดังตัวอยางชุด F

30 ส.ค. 54




ฉบับที่ แกไขครั้งที่ รายละเอียดการแกไข วันที่บังคับใช

Example 1.0 g

0.1 g

0.01 g

0.001 g

0.0001 g

Combination of Positives

MPN/g

A 4 1 0 0 0 410XX 17

B 5 5 1 0 0 X510X 330

C 4 5 4 5 1 XX451 4,800

D 4 5 4 3 1 XX431 3,300

E 4 3 0 1 1 432XX 3

F 4 3 3 2 1 XX321 1,700 -แกไขคําวา “การประมาณคาจากตาราง MPN กรณีไมพบคาปรากฏในตาราง MPN” เปน “การคํานวณหาคา MPN กรณีไมมีตาราง MPN”




1. วัตถุประสงค เพื่อตรวจวิเคราะหเชื้อ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli ในสัตวน้ําและผลิตภณัฑสัตวน้าํ

2. ขอบขาย วิเคราะหหาเชือ้ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli ในสัตวน้าํและผลิตภัณฑสัตวน้าํ

3. เอกสารอางอิงและเอกสารที่เกีย่วของ

3.1 เอกสารอางอิง 3.1.1 Bacteriological Analytical Manual Online, 2002. Chapter 4 Enumeration of Escherichia

coli and the coliform bacteria. USFDA. 10 pp. (http://www.cfsan.fda.gov) 3.1.2 Bacteriological Analytical Manual Online, 2010. Blodgett R. Appendix 2 Most Probable

Number from serial dilution. USFDA. 13 pp. (http://www.cfsan.fda.gov) 3.1.3 ISO/TS 16649-3 : September 2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs-

Horizontal method for the enumeration of β-glucoronidase-positive Escherichia coli. 3.2 เอกสารที่เกี่ยวของ

3.2.1 วิธีปฏิบัติงานเรื่อง การจัดการตัวอยางฝายจุลชีววิทยา (W-M-508-01) 3.2.2 วิธีปฏิบัติงานเรื่อง การทดสอบประสิทธิภาพอาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมี (W-M-509-02) 3.2.3 วิธีทดสอบเรื่อง เชื้อจุลินทรยีที่มีชวีิตทัง้หมด (Total Viable Plate Count) (TM-04) 3.2.4 แบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Coliform, Fecal coliform และ Escherichia coli

(3:3:3) (F-TM-06-1) 3.2.5 แบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Fecal coliform และ Escherichia coli for bivalve

(F-TM-06-2) 3.2.6 แบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Coliform (โดยวิธนีบัจํานวนโคโลนี) (F-TM-06-4) 3.2.7 แบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Escherichia coli (3:3:3) / 5:5:5) (F-TM-06-5) 3.2.8 แบบฟอรมบันทึกการทาํซ้ําของตัวอยางทดสอบ ( F-M-509-05-1)




4. หลักการ นําตัวอยางทีต่องการวิเคราะหโดยการทาํใหเจือจางตามความเขมขนที่เหมาะสมกบัตัวอยางอาหาร โดยใช

ปริมาณตัวอยางที่เจือจางในระดับตางๆ ปริมาณ 1 มิลลิลิตร หรือตามสัดสวนที่วิเคราะห เพาะเชื้อลงในอาหารเหลวที่บรรจุในหลอดทดสอบระดับความเจือจางละ 3 หรือ 5 หลอด บันทกึจํานวนหลอดที่ใหผลบวกกับปฏิกิริยาที่ตองการทดสอบในแตละระดับความเจือจาง นาํผลที่ไดไปอานคาจากตาราง MPN

5. ขั้นตอนการทดสอบ

5.1 อุปกรณ 5.1.1 หมอนึง่ฆาเชื้อ ( ดูวิธีการใชเครื่องจาก เอกสาร W-M-505-10 ) 5.1.2 อางน้ําควบคมุอุณหภูมิ ( ดูวิธีการใชเครือ่งจาก เอกสาร W-M-505-09 ) 5.1.3 ตูอบฆาความรอนแหง ( ดูวธิีการใชเครื่องจาก เอกสาร W-M-505-11 ) 5.1.4 ตูบมเชื้อ (ดูวิธีการใชเครื่องจาก เอกสาร W-M-505-03 ) 5.1.5 เครื่องชั่ง 2 ตําแหนง ( ดูวิธีการใชเครื่องจาก เอกสาร W-M-505-02 ) 5.1.6 เครื่องตีตัวอยาง ( ดูวิธีการใชเครื่องจาก เอกสาร W-M-505-07 ) 5.1.7 จานเพาะเชื้อ 5.1.8 ปเปต 5.1.9 ตะเกียงแกส 5.1.10 แอลกอฮอล (70% v/v) 5.1.11 loop เขี่ยเชื้อ 5.1.12 ปากคีบ 5.1.13 ตะแกรงวางหลอดทดลอง (Rack) 5.1.14 หลอดทดลอง 5.1.15 หลอดดักแกส (Durham tube )

5.2 อาหารเลีย้งเชือ้และสารทดสอบ 5.2.1 Butterfield’s phosphate-buffered water (R 11) 5.2.2 Phosphate buffered dilution water 5.2.3 Lauryl Tryptose Broth (Single Strength) (M 76)




5.2.4 Lauryl Tryptose Broth (Triple Strength) (M 76a) 5.2.5 EC broth (M 49) 5.2.6 Levine’s Eosin-Methylene Blue (L-EMB) agar (M 80) 5.2.7 Tryptone (Tryptophane) broth (M 164) 5.2.8 MR-VP medium (M 104) 5.2.9 Kovac’s reagent (R 38) 5.2.10 Voges Proskauer (α -napthol solution 5%) (R 89) 5.2.11 Methyl red indicator (R 44) 5.2.12 VRBA ( Violet red bile agar ) (M 174) 5.2.13 Brilliant Green Lactose Bile Broth (M 25) 5.2.14 Koser’s citrate broth (M 72) 5.2.15 Nutrient agar slant (M 112) 5.2.16 Mineral-modified glutamate medium (MMG) 5.2.17 Tryptone bile glucuronide agar (TBX)

5.3 สภาวะทดสอบ 5.3.1 หองปฏิบัติการมีการระบายอากาศไดดี สะอาด ไมมีฝุนละออง 5.3.2 ใชเครื่องปรับอากาศเพื่อลดการปนเปอนและปรับอุณหภูมิใหเหมาะสม

5.4 ข้ันตอนและวธิีการทดสอบ 5.4.1 การเตรียมตัวอยาง

ชั่งตัวอยาง (ตัวอยางอาหารทั่วไป ยกเวนหอย) 50.0 ± 0.1 กรัม ลงในถงุปนตวัอยาง จากนั้นเติม 450 มิลลิลิตร ของ Butterfield’s phosphate-buffered water ปนตัวอยางนาน 2 นาท ีแลวนํามาเจือจางเพื่อใหไดความเขมขนที่ตองการ หมายเหต ุสําหรับอาหารแชแข็ง กอนชั่งน้ําหนักตัวอยางตองทําใหอาหารละลายในตูเย็นอุณหภูมิ 2 - 5 ๐C เปนเวลาไมเกิน 18 ชั่วโมง ไมควรปลอยทิง้ไวใหละลายที่อุณหภูมิหอง

5.4.2 วิธีทดสอบ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli โดยวธิี Most Probable Number (MPN Method) (อางอิงวธิ ีBAM, Chapter 4)




เจือจางตวัอยางใหมีระดับความเจือจาง 10-1, 10-2 และ 10-3 จากนัน้ใหทาํ 3-tube MPN โดยใช series 3:3:3 5.4.2.1 MPN - Presumptive test for coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli

ปเปตสารละลายตัวอยาง ในแตละระดับความเจือจางของ 3 tube MPN อยางละ 1 มิลลิลิตร ใสในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ LST ที่มีหลอดดกัแกสคว่ําอยู ความเจือจางละ 3 หลอด รวม 9 หลอด (ใหสังเกตดวยวาไมมีฟองอากาศอยูในหลอดดกัแกส) นําไปบมที่อุณหภูมิ 35± 1 ๐C เร่ิมคัดหลอดที่เกิดแกสที่เวลา 24± 2 ชั่วโมง สําหรับหลอดที่ไมเกิดแกสใหบมตอไปอีก ใหครบเวลา 48 ± 2 ชั่วโมง เลือกหลอดทีเ่กิดแกส และบันทึกผลลงในแบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Coliform, Fecal coliform และ Escherichia coli (3:3:3) (F-TM-06-1)

5.4.2.2 MPN - Confirmed test for coliforms ถายเชื้อจากหลอด LST ที่เกดิแกสลงใน BGLB หลอดละ 1 loop นําไปบมที่อุณหภมูิ 35± 1

OC เปนเวลา 48± 2 ชั่วโมง เลือกหลอดที่เกดิแกสนําไปอานคาจากตาราง MPN 3:3:3 ในภาคผนวก ก มีหนวยเปน MPN/g ตัวอยาง และบันทึกผลลงในแบบฟอรม (F-TM-06-1)

5.4.2.3 MPN - Confirmed test for fecal coliforms and Escherichia coli ถายเชื้อจากหลอด LST ที่เกดิแกสในหลอดดักแกส ลงใน EC broth ทีม่ีหลอดดักแกสคว่ําอยู หลอดละ 1 loop โดยถายเชือ้หลอดตอหลอด นาํ EC broth ไปบมใน Water bath ทีอุ่ณหภูมิ 45.5± 0.2 ๐ C เปนเวลา 48± 2 ชั่วโมง เร่ิมคัดหลอดที่เกิดแกสที่เวลา 24± 2 ชั่วโมง ถาใหผล negative (ไมเกิดแกส) ใหบมตอไปอีกจนครบเวลา 48± 2 ชั่วโมง คัดเลือกหลอด EC broth ที่เกิดแกสในหลอดดกัแกส นําไปอานคาจากตาราง MPN 3:3:3 ในภาคผนวก ก. คาที่อานไดเปนคาของ Fecal coliforms มีหนวยเปน MPN/g ตัวอยาง และบันทกึผลลงในแบบฟอรม (F-TM-06-1) หมายเหต ุ การวิเคราะหหา fecal coliform จะบมที่อุณหภูมิ 45.5 ± 0.2 OC ในทกุตัวอยางอาหารยกเวน การวิเคราะหน้ํา, หอย และน้ําจากการเลีย้งหอย ซึง่จะบมที่อุณหภูม ิ44.5± 0.2OC

5.4.2.4 MPN - Completed test for Escherichia coli




ใช loop ถายเชื้อจาก EC broth ที่เกิดแกสมา Streak บนผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อ L-EMB agar นําไปบมที่อุณหภูมิ 35 ± 1 ๐C เปนเวลา 18-24 ชั่วโมง ลักษณะโคโลนีของเชื้อ E. coli. บน L-EMB agar จะมีลักษณะสมีวงหรือดํา ตรงกลางโคโลนมีีสีดํา อาจมหีรือไมมีลักษณะมันวาวคลายโลหะ ( Metallic sheen ) เลือกโคโลนทีี่มีลักษณะดังกลาวมา Streak บน PCA Slant จํานวน 5 โคโลน ีนาํไปบมที่อุณหภมูิ 35± 1 ๐C เปนเวลา 18-24 ชั่วโมง เพื่อนาํไปทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีตอไป หมายเหต ุในขั้นตอนการทาํใหเชื้อบริสุทธิ์กอนนําไปทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคม ีสามารถเลือก 1 โคโลนี กเ็พียงพอแลวในการพิจารณาผล positive ในหลอด EC broth ดังนัน้ ไมจําเปนตองเลอืก 5 โคโลนี ในการทดสอบชีวเคมีก็ได

5.4.2.5 การทดสอบคณุสมบัติทางชวีเคม ีa) ทดสอบการสราง Indole ถายเชื้อจาก PCA Slant ใสในหลอด Tryptone broth นาํไปบมที่อุณหภูมิ 35± 1 ๐C เปนเวลา 24± 2 ชั่วโมง จากนัน้นาํมาทดสอบการสราง Indole โดยหยดสารทดสอบ Kovac ’ s reagent 0.2 - 0.3 มิลลิลิตร หากเชื้อสามารถสราง Indole ได จะเกิดวงแหวนสีแดงอานผลเปนบวก สวนผลลบจะไมเกิดวงแหวนสีแดง

b) การทดสอบ Voges-Proskaure (VP) ถายเชื้อจาก PCA Slant ใสในหลอด MR-VP medium นําไปบมที่อุณหภูม ิ35± 1 ๐C เปนเวลา 48± 2 ชั่วโมง ดูดมา 1 มลิลิลิตร ใสในหลอดเปลาขนาด 13 X 100 มิลลิเมตร ทีฆ่าเชื้อแลว จากนั้นนํามาหยดสาร α-naphtol 0.6 มิลลิลิตร, 40% KOH 0.2 มิลลิลิตร เขยาใหเขากนั และ เติมผง creatine เล็กนอย เขยาใหผสมกัน อานผลภายใน 2 ชั่วโมง หากเกิดสีชมพูแดงอานผลเปนบวก และไมเกดิการเปลี่ยนแปลงอานผลเปนลบ

c) การทดสอบ Methyl red (MR) หลังจากทดสอบ VP แลวใหบม MR-VP medium ตอไปอีกใหครบ 48± 2 ชม. ที่อุณหภูมิ 35± 1 OC จากนัน้นาํมาทดสอบ Methyl Red โดยคอย ๆ หยดสารทดสอบ Methyl red 5 หยด หากสีของอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเปนสีแดง อานผลเปนบวก แตถาเปลี่ยนเปนสีเหลืองอานผลเปนลบ

d) การทดสอบการใช Citrate




ถายเชื้อจาก PCA Slant ลงใน Koser’s citrate broth นาํไปบมที่อุณหภูมิ 35± 1๐C เปนเวลา 96± 2 ชั่วโมง หากอาหารเลี้ยงเชื้อขุน อานผลเปนบวก ถาอาหารเลี้ยงเชื้อไมเปลี่ยนแปลง อานผลเปนลบ E.coli จะใหผลลบเสมอ

e) การทดสอบการสรางแกสจากน้าํตาล Lactose ถายเชื้อจาก PCA Slant ลงในหลอด LST นาํไปบมที่อุณหภูมิ 35± 1๐C เปนเวลา 48± 2 ชั่วโมง ถาเกิดแกสในหลอดดักแกสอานผลเปนบวกคุณสมบัติทางชวีเคมีของเชื้อ E. coli ชนิดของ E. coli Indole MR VP Citrate E. coli Type I + + - - E. coli Type II - + - -

5.4.2.6 การรายงานผล นับจํานวนหลอดที่พบเชื้อ E . coli ของแตละความเจือจาง นาํไปอานคาจากตาราง MPN 3:3:3 ในภาคผนวก : ตารางที ่1 รายงานผลเปน MPN/g ตัวอยาง

5.4.3 วิธีทดสอบ Escherichia coli โดยวธิี Most Probable Number (MPN Method) (อางอิงวธิ ีISO/TS 16649-3) 5.4.3.1 เจือจางตวัอยางใหมีระดับความเจือจาง 10-1, 10-2 และ 10-3 หรือมากกวา กรณีที่ตัวอยางมี

การปนเปอนต่าํใหปเปตสารละลายตัวอยางที่มีความเขมขน 10-1 จํานวน 10 ml ใสในหลอดที่มี 2XMMG 10 ml จํานวน 3 หลอด จากนั้นปเปตสารละลายตัวอยางที่มีความเขมขน 10-1 10-2 , 10-3 หรือมากกวา จํานวน 1 ml ใสในหลอดที่ม ี1XMMG 10 ml จํานวนความเขมขนละ 3 หลอด นาํไปบมที่อุณหภมูิ 37± 1 oC เปนเวลา 24± 2 ชม. กรณีตัวอยางที่คาดวามีการปนเปอนในระดับสูง ใหเร่ิมตนที ่0.1 กรัมของตัวอยาง (ความเขมขนของตัวอยาง 10-1 จํานวน 1 ml ใสในหลอดที่ม ี1XMMG 10 ml จํานวน 3 หลอด) คัดเลือกหลอดที่เปลี่ยนเปนสีเหลืองและบันทกึผล (กรณีเปนตัวอยางหอยมีชีวติ ใหทาํระดับการเจือจางละ 5 หลอด)

5.4.3.2 MPN - Confirmed test for E. coli : Streak เชื้อจากหลอด MMG broth ลงบนเพลท TBX agar plate นําเพลทไปบมที่อุณหภูม ิ44± 1 oC เปนเวลา 20-24 ชม. ลักษณะโคโลนีของ E. coli บน TBX agar มีลักษณะ dark or light blue or blue-green นาํไปอานคาจากตาราง MPN ในภาคผนวก : ตารางที่ 3 (3:3:3) หรือตารางที่ 4 (5:5:5) จะไดคาของ E. coli




และลงผลในแบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Escherichia coli (3:3:3) / 5:5:5) (F-TM-06-5)

5.4.3.3 การรายงานผล รายงานปริมาณของ E. coli จากตาราง 3 tube MPN หรือ 5 tube MPN หรือกรณีที่ไมมีการเจริญของเชื้อ เมื่อใช 3 tube ใหรายงาน <30 MPN/100g หรือ ml, <3 MPN/g หรือ ml, < 0.3 MPN/g หรือ ml, Negative or nil ถาใช 5 tube ใหรายงาน <20 MPN/100g หรือ ml, < 2 MPN/g หรือ ml, <0.2 MPN/g หรือ ml, Negative or nil ข้ึนอยูกับการทดสอบและขอกําหนดของประเทศผูนําเขา หมายเหต ุ : กรณีที่มาตรฐานกําหนดใหหาคา Coliforms และ Fecal coliforms ในตัวอยาง ใหดําเนินการทดสอบตามขอ 5.4.2.1 - 5.4.2.3

5.4.4 วิธีทดสอบ Coliforms โดยวธิีนับจาํนวนโคโลนี (Coliforms count) (อางอิงวิธ ีBAM, Chapter 4) 5.4.4.1 เจือจางตวัอยางใหมีระดับความเจือจาง 10-1, 10-2 และ 10-3 หรือมากกวา ปเปตสารละลาย

ตัวอยางในแตระดับความเจอืจางละ 1 มิลลิลิตร ดวยวธิีการปลอดเชือ้ใสลงในจานเพาะเชื้อที่ผานการฆาเชื้อแลว ความเจือจางละ 2 เพลท pour plate ดวยอาหารเลี้ยงเชื้อ Violet Red Bile Agar (VRBA) ที่มีอุณหภูมิประมาณ 48 ๐C จํานวน 10 มิลลิลิตร ตอเพลท ต้ังไวใหอาหารเลีย้งเชือ้แข็งตัวที่อุณหภูมิหอง เททับหนาดวย VRBA อีก 5 มิลลิลิตร เพื่อปองกันเชื้อ spread บนผวิหนา ต้ังไวใหอาหารเลีย้งเชือ้แข็งตัวที่อุณหภูมิหองอีกครั้ง นาํไปบมในตูบมเชื้ออุณหภูมิ 35± 1 ๐C เปนเวลา 18-24 ชั่วโมง เมื่อบมครบตามเวลาทีก่าํหนด คัดเลือกเพลทที่มีโคโลนีสีมวงแดง ขนาดเสนผานศนูยกลางประมาณ 0.5 มิลลิเมตร หรือมากกวา อยูในชวง 25 -250 โคโลนี มานับจํานวน นาํไปคํานวณโดยใชสูตรเชนเดียวกับการคํานวณคา TVC (TM-04) จะไดคาของ Coliforms count ในหนวยของ CFU / g ตัวอยาง บันทกึลงในแบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Coliform (โดยวิธนีบัจํานวนโคโลนี) (F-TM-06-4) หมายเหต ุ : สามารถยืนยนั Coliforms ไดโดยเขี่ยเชื้อจาก VRBA อยางนอย 10 โคโลนี ๆ ละ 1 หลอด ถายลงใน BGLB แลวบมที ่35 ± 1๐C เปนเวลา 48±2 ชั่วโมง แบคทีเรียกลุม Coliforms จะสามารถสรางแกสใน BGLB ได




5.4.5 วิธีทดสอบตัวอยางหอย และเนื้อหอย โดยวิธ ีMost Probable Number (MPN Method) (อางองิวิธ ีBAM, Chapter 4) 5.4.3.1 การเตรียมตัวอยาง

ตัดเนื้อหอย 200.0± 0.1 กรัม เติม 200 มิลลิลิตร ของ Phosphate buffered dilution water (1:2 dilution of sample) ตีปนนาน 2 นาที การวิเคราะหใหเร่ิมทันทหีลังจากตีปน (ไมควรเกิน 2 นาทีหลงัจากปนตัวอยาง)

5.4.3.2 MPN - Presumptive and Confirmed Test for coliform ทํา serial dilution โดยใช phosphate buffered dilution water เปนตวั dilute เจือจางตัวอยางใหไดระดับความเจอืจาง 10-1,10-2,10-3 (0.1 g, 0.01 g และ 0.001 g ของเนือ้หอย) ใหทาํแบบ 5-tube dilution โดยใหแตละหลอดใส 10 มิลลิลิตร ของ lactose broth หรือ lauryl tryptose broth (แบบ single strength) จากนัน้ปเปตสารละลายตวัอยาง ดังตอไปนี ้a. ใน 5 หลอดที ่1 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยางจากการตีปนกอนทํา dilution (จะไดเนื้อ

หอย 1 g) b. ใน 5 หลอดที ่2 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยางที่ dilution 10-1 (จะไดเนื้อหอย 0.1 g) c. ใน 5 หลอดที ่3 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยางที่ dilution 10-2 (จะไดเนื้อหอย 0.01 g) d. ใน 5 หลอดที ่4 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยางที่ dilution 10-3 (จะไดเนื้อหอย 0.001 g) (กรณีตัวอยางที่มีการปนเปอนของเชื้อตํ่า ใหทาํเพิม่ที่เนื้อหอย 10 g โดยปเปตสารละลายตัวอยางจากการตีปนกอนทาํ dilution จํานวน 20 มิลลิลิตร ลงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ Lauryl Tryptose Broth (Triple Strength) 10 มิลลิลิตร จํานวน 5 หลอด) นําไปบมที่ 35± 1 ๐C เร่ิมคัดหลอดที่เกิดแกสที่เวลา 24± 2 ชั่วโมง ถาใหผล negative (ไมเกิดแกส) ใหบมตอไปอีกจนครบเวลา 48± 2 ชั่วโมง จากนั้นทําเหมือนการวิเคราะหหา coliforms, fecal coliforms และ E. coli ดังรายละเอียดขอ 5.4.2.2-ขอ 5.4.2.5 รายงานผลโดยเปดตาราง MPN 5:5:5 (0.1,0.01,0.001g) ในภาคผนวก ก : ตารางที ่2 โดยรายงานเปน MPN/100g ตัวอยาง และลงผลในแบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS : Fecal coliform และ Escherichia coli for bivalve (F-TM-06-2)




6. การควบคุมคุณภาพของการทดสอบ การทดสอบกระบวนการทดสอบ ใหดําเนนิการเมื่อมีการทดสอบ โดยการ spike เชื้อ Positive(ตาม

ภาคผนวก ข ของวิธีปฏิบัติงาน เร่ือง การเก็บรักษาเชื้ออางอิง (W-M-509-04)) ที่มีระดับความเจือจาง 10-3 ถงึ 10-4 (Inoculum ถูกเจือจาง 1,000-10,000 เทา) จํานวน 1 มิลลิลิตร ลงใน 1 ถุงตัวอยาง แลววิเคราะหตามขัน้ตอนการวิเคราะหปกต ิ หากผลการทดสอบสุดทาย ใหผลผิดปกตไิปจากวิธมีาตรฐาน ซึ่งระบุไวใน วิธทีดสอบเรื่อง : Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli (TM-06) และวิธปีฏิบัติงานเรื่อง การทดสอบประสิทธิภาพอาหารเลีย้งเชือ้และสารเคมี (W-M-509-02) ใหตรวจสอบวามาจากสาเหตุใด สวนผลการวิเคราะหในวนันั้น ใหรอสรุปผลการสบืหาสาเหต ุ หากจําเปนใหแจงลูกคา เพื่อทําการสุมซ้าํ หรือนําตวัอยาง confirm มาทําการทดสอบใหม หรือทําการยกเลิกตวัอยางในวันนัน้ทั้งหมด จากนัน้บนัทกึผลการทดสอบลงในแบบฟอรม BACTERIOLOGICAL ANALYSIS ตามขอ 3.2.4-3.2.7 โดยขึ้นอยูการเลือกวิธทีดสอบ

7. คุณสมบัติของผูทดสอบ

7.1 ผานการฝกอบรม การใชเครื่องมือพื้นฐานตามขั้นตอนการดําเนนิงานเรื่องบุคลากร (P-502-01) 7.2 ผานการฝกอบรม Aseptic technique ตามขั้นตอนการดําเนนิงานเรื่องบุคลากร (P-502-01) 7.3 ผานการฝกอบรม การจัดการตัวอยาง ตามวิธกีารวิเคราะหทางจุลชวีวิทยา (W-M-508-01) 7.4 ผานการฝกอบรม วธิีทดสอบเรื่อง Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli ตามวธิีการวิเคราะห

ทางจุลชีววิทยา (TM-06) 7.5 ผานการทดสอบความสามารถการวิเคราะหเชื้อ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli โดยการ

ทํา Proficiency test กับหนวยงานภายนอก




คัดเลือกหลอดที่เกิดแก็ส บันทกึผล นําไป อานคาจากตาราง MPN

คาที่ไดเปนคา Coliforms ในหนวย MPN/g

บมที่อุณหภูม ิ35 ± 1 ๐C เปนเวลา 48± 2 ชม.

Flow Diagram : วิธทีดสอบ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli โดยวิธ ีMost Probable Number (MPN Method) (อางอิงวิธ ีBAM, Chapter 4)

ตัวอยาง 50.0 ± 0.1 กรัม + Butterfield phosphate buffered dilution water 450 มล.

↓ ตีปนตัวอยางนาน 2 นาท ี(สารละลายที่ไดมีความเจือจาง 10-1 )

↓ เจือจางสารละลายตัวอยางใหมีความเจือจาง 10-2 และ 10-3

↓ ปเปตลงใน LST หลอดละ 1 มล. ความเจือจางละ 3 หลอด (รวม 9 หลอด )

↓ บมที่อุณหภูม ิ35 ±1 ๐ C นาน 24±2 ชม. และ 48±2 ชม.

↓ คัดเลือกหลอดที่เกิดแกส บันทกึผล

นําไปอานคาจากตาราง MPN คาที่ไดเปนคา Presumptive coliforms

ถายเชื้อหลอดที่เกิดแกสใน LST ลงใน EC broth

↓ บมใน Water bath อุณหภูมิ 45.5 ± 0.2 ๐C นาน 24±2 ชม. และ 48±2 ชม.

คัดเลือกหลอดที่เกิดแกส บันทึกผล นําไปอานคาจากตาราง MPN คาที่ไดเปนคาของ Fecal coliforms ในหนวย MPN/g

แลวถายเชื้อโดย Streak บนผิวหนา L-EMB agar ↓

บมที่อุณหภูม ิ35 ± 1 ๐C เปนเวลา 18 – 24 ชม. ↓

นําเพลทมาคดัเลือกโคโลน ีโดยโคโลนีของ E. coli บน L-EMB agar จะมีลักษณะโคโลนีสีมวงหรือดํา อาจเกิดหรือไมเกิด Metallic sheen

ถายเชื้อหลอดที่เกิดแกสลงใน BGLB




ผลลบ ไมมีสี ผลบวก สีชมพู หรือแดง

↓ นําโคโลนทีี่มีลักษณะดังกลาว Streak บน PCA slant

↓ บมที่อุณหภูม ิ35 ± 1 ๐C เปนเวลา 18-24 ชม.

↓ ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี

(IMViC Test)

ถายเชื้อลง Trytone Broth ถายเชื้อลง MR-VP 1 หลอด ถายเชื้อลง KCB ↓ ↓ ↓ บมที่อุณหภูม ิ35 ± 1 ๐C 24 + 2 ชม. บมที่อุณหภูมิ 35 ± 1 ๐C 48 ± 2 ชม. บมทีอุ่ณหภูมิ 35 ± 1 ๐C 96± 2 ชม. ↓ ↓ หยด Kovac ‘ reagent ↓ ↓ ผลลบอาหารเลี้ยงเชื้อไมเปลี่ยนแปลง ↓ บมที่อุณหภูมิ 35±1๐C ผลบวกอาหารเลี้ยงเชื้อขุน ผลลบ สีเหลือง นาน 48 ±2 ชม. ผลบวก สีชมพ ูหรือมวง หยด Methyl Red

↓ ผลลบ สีเหลือง ผลบวก สีแดง

ชนิดของ E. coli Indole MR VP Citrate E. coli Type I + + - - E. coli Type II - + - -

ถายเชื้อลง LST

บมที่ 35 + 1 ๐C 48 + 2 ชม

(Lactose Test)

ปเปตมา 1 มล. ใสหลอดเปลา หยด 5 % α-naphthol 0.6 มล. 40% KOH 0.2 มล. Creatine เล็กนอย อานผลภายใน 2 ชม.

↓




Flow Diagram : วิธทีดสอบ Escherichia coli โดยวิธ ีMost Probable Number (MPN Method) (อางอิงวิธ ีISO/TS 16649-3)

ตัวอยาง 50.0 ± 0.1 กรัม + Butterfield phosphate buffered dilution water 450 มล.

↓ ตีปนตัวอยางนาน 1-2 นาที (สารละลายที่ไดมีความเจอืจาง 10-1 )

↓ เจือจางสารละลายตัวอยางใหมีความเจือจาง 10-2 และ 10-3 หรือมากกวา

↓ ปเปตสารละลาย 10 มล. ลงใน 2XMMG ที่ความเจือจาง 10-1 จํานวน 3 หลอด / *5 หลอด ปเปตสารละลาย 1มล. ลงใน 1XMMG จํานวนความเจอืจางละ 3 หลอด / *5 หลอด

บมที่อุณหภูม ิ37 ±1 ๐ C นาน 24±2 ชม. ↓

คัดเลือกหลอด MMG broth ที่เปลี่ยนสีเปนสีเหลือง บันทกึผล และ Streak ลงบนเพลท TBX agar plate นําเพลทไปบมที่อุณหภูม ิ44± 1 oC เปนเวลา 20-24 ชม.

↓ เลือกลักษณะโคโลนีของ E. coli บน TBX agar มีลักษณะ dark or light blue or blue-green

นําไปอานคาจาก ตาราง MPNที่ 3 (3:3:3) หรือ 4 (5:5:5)

หมายเหต ุ* กรณีเปนตัวอยางหอยมีชีวิตใหทําระดับการเจือจางละ 5 หลอด




Flow Diagram : วิธทีดสอบ Coliforms โดยวิธนีับจาํนวนโคโลนี (Coliforms count) (อางอิงวิธ ีBAM, Chapter 4)

ตัวอยาง 50.0 ± 0.1 กรัม + BF 450 มล.

↓ ตีปนตัวอยางนาน 2 นาที (สารละลายตวัอยางที่ไดมีความเจือจาง 10-1 ) ↓

เจือจางสารละลายตัวอยางใหมีความเจือจาง 10-2 และ 10-3 ↓ ปเปตแตละความเจือจาง ใสเพลท ๆ ละ 1 มล. ความเจอืจางละ 2 เพลท ↓

เทเพลทดวย VRBA 10 มล. วนเพลทเพื่อใหตัวอยางกระจายตัง้ไวใหอาหารเลีย้งเชือ้แข็งตัวที่อุณหภูมิหอง เททับหนาดวย VRBA อีก 5 มล. ทิ้งใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัวที่อุณหภูมิหอง

↓ นําไปบมที่อุณหภูม ิ35 ±1 0C นาน 18-24 ชม. ↓

นับจํานวนโคโลนีสีมวงแดงที่อยูระหวาง 25 - 250 โคโลน ี ↓

นําไปยนืยนัโดยเขี่ยเชื้อลง BGLB แลวบมที่ 35±1 0C นาน 24±2 ชม. และ 48±2 ชม. ↓

คํานวณ และรายงานผล ในหนวย CFU / g ตัวอยาง




Flow Diagram : วิธทีดสอบตัวอยางหอย และเนื้อหอย โดยวิธ ีMost Probable Number (MPN Method) (อางอิงวิธ ีBAM, Chapter 4)

ตัวยาง 200.0±0.1 กรัม + Phosphate buttered dilution water 200 มล.

↓ ตีปนตัวอยางนาน 2 นาที (1:2 dilution of Sample)

↓ เจือจางสารละลายตัวอยางใหมีระดับความเจือจาง 100, 10-1,10-2,10-3 (1g, 0.1g, 0.01g และ 0.001g)

(5-tube dilution) ↓

a) ใน 5 หลอดที่ 1 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยางจากการตีปนกอนทาํ dilution (เนื้อหอย 1g) b) ใน 5 หลอดที่ 2 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยาง ที่ 10-1 dilution (เนื้อหอย 0.1g) c) ใน 5 หลอดที่ 3 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยาง ที่ 10-2 dilution (เนื้อหอย 0.01g) d) ใน 5 หลอดที่ 4 ปเปต 2 มิลลิลิตร ของตัวอยาง ที่ 10-3 dilution (เนื้อหอย 0.001g)

(กรณีตัวอยางที่มีการปนเปอนของเชื้อต่ํา ใหทําเพิ่มที่เนื้อหอย 10 g) ↓

บมที่อุณหภูม ิ 35±1oC นาน 24±2 ชม. และ48±2 ชม ↓

คัดเลือกหลอดที่เกิดแกส บันทกึผล นําไปอานคาจากตาราง MPN 5:5:5 คาที่ไดเปนคา Presumptive Coliforms

↓ ถายเชื้อหลอดที่เกิดแกสใน LST ลงใน EC broth

↓ บมใน Water bath 44.5±0.2 oC นาน 48±2 ชม.

↓ คัดเลือกหลอดที่เกิดแกส บันทกึผล นําไปอานคาจากตาราง MPN 5:5:5 คาที่ไดเปน คา Fecal Coliforms แลวตอเชื้อโดย Streak บนผวิหนา

L-EMB agar




↓ บมที่อุณหภูม ิ35±1 ๐ C เปนเวลา 18- 24 ชม.

↓ นําเพลทมาคดัเลือกโคโลน ีของ E. coli บน L-EMB agar

ที่มีลักษณะโคโลนีสีมวง หรือดํา อาจเกิดหรือไมเกิด Metallic sheen นาํมา streak บน PCA Slant ↓

บมที่อุณหภูม ิ35 ±1 ๐ C เปนเวลา 18 - 24 ชม. ↓

ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี *

หมายเหตุ* ทําเชนเดียวกับวธิีทดสอบ Coliforms, Fecal coliforms และ Escherichia coli โดยวิธ ีMost Probable Number (MPN Method) (อางอิงวธิ ีBAM, Chapter 4)




ภาคผนวก

ตารางที ่1 : For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per gram and 95 percent confidence intervals.

Pos. tubes MPN/g Conf. lim. Pos. tubes MPN/g Conf. lim.

0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High

0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000




2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

ตารางที ่2 : For 5 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs and 95 percent confidence intervals.

Pos. Tubes MPN/g

Conf. lim. Pos. tubes MPN/g

Conf.lim. 0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High 0 0 0 <1.8 -- 6.8 4 0 2 21 6.8 400 0 1 1.8 0.09 6.8 4 0 3 25 9.8 700 1 0 1.8 0.09 6.9 4 1 0 17 6 400 1 1 3.6 0.7 10 4 1 1 21 6.8 420 2 0 3.7 0.7 10 4 1 2 26 9.8 700 2 1 5.5 1.8 15 4 1 3 31 10 700 3 0 5.6 1.8 15 4 2 0 22 6.8 501 0 0 2 0.1 10 4 2 1 26 9.8 701 0 1 4 0.7 10 4 2 2 32 10 701 0 2 6 1.8 15 4 2 3 38 14 1001 1 0 4 0.7 12 4 3 0 27 9.9 701 1 1 6.1 1.8 15 4 3 1 33 10 701 1 2 8.1 3.4 22 4 3 2 39 14 1001 2 0 6.1 1.8 15 4 4 0 34 14 1001 2 1 8.2 3.4 22 4 4 1 40 14 100




1 3 0 8.3 3.4 22 4 4 2 47 15 1201 3 1 10 3.5 22 4 5 0 41 14 1001 4 0 11 3.5 22 4 5 1 48 15 1202 0 0 4.5 0.79 15 5 0 0 23 6.8 702 0 1 6.8 1.8 15 5 0 1 31 10 702 0 2 9.1 3.4 22 5 0 2 43 14 1002 1 0 6.8 1.8 17 5 0 3 58 22 1502 1 1 9.2 3.4 22 5 1 0 33 10 1002 1 2 12 4.1 26 5 1 1 46 14 1202 2 0 9.3 3.4 22 5 1 2 63 22 1502 2 1 12 4.1 26 5 1 3 84 34 2202 2 2 14 5.9 36 5 2 0 49 15 1502 3 0 12 4.1 26 5 2 1 70 22 1702 3 1 14 5.9 36 5 2 2 94 34 2302 4 0 15 5.9 36 5 2 3 120 36 2503 0 0 7.8 2.1 22 5 2 4 150 58 4003 0 1 11 3.5 23 5 3 0 79 22 2203 0 2 13 5.6 35 5 3 1 110 34 2503 1 0 11 3.5 26 5 3 2 140 52 4003 1 1 14 5.6 36 5 3 3 180 70 4003 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 4003 2 0 14 5.7 36 5 4 0 130 36 4003 2 1 17 6.8 40 5 4 1 170 58 400




3 2 2 20 6.8 40 5 4 2 220 70 4403 3 0 17 6.8 40 5 4 3 280 100 7103 3 1 21 6.8 40 5 4 4 350 100 7103 3 2 24 9.8 70 5 4 5 430 150 1,1003 4 0 21 6.8 40 5 5 0 240 70 7103 4 1 24 9.8 70 5 5 1 350 100 11003 5 0 25 9.8 70 5 5 2 540 150 17004 0 0 13 4.1 35 5 5 3 920 220 26004 0 1 17 5.9 36 5 5 4 1600 400 4600

5 5 5 >1600 700 -- การอานคา MPN การอานคาจากตาราง MPN โดยการตัด dilution สูงสุด (มีปริมาณตัวอยางต่าํสุด) หรือ dilution ถัดมาในกรณีที่ dilution สูงสุดใหผลเปน negative ทุกหลอด ใหเลือก 3 dilution ที่เหลืออยูดังตวัอยางชุด A ถาม ีpositive มากกวา 3 dilution ใหพิจารณาดงันี ้

กรณีที ่1 เมื่อพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด และเปน dilution ที่ตองเลือก ใหเลือก 3 dilution สูงสุด เชน ตัวอยาง ชุด B และตัวอยางชุด C

กรณีที ่2 เมื่อพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด แตเปน dilution ที่ไมไดเลือก ใหเลือก dilution สูงสุดลําดับถัดไป ดังตัวอยางชุด D

กรณีที่3 ไมพบ dilution ที่ใหผลเปนบวกทั้งหมด ใหเลอืก 2 dilution ตํ่าสุดและใหรวมผล positive ที่เหลือเปน dilution ที่ 3 ดังตัวอยางชุด E

ถา 3 dilution ที่เลือกไมพบคาในตาราง แสดงวาผลเปนทีน่าสงสัย ใหทาํการทดสอบซ้ําหรือใหใช 3 dilution สูงสุดที่เหลืออยู ดังตัวอยางชุด F




Example 1.0 g 0.1 g 0.01 g 0.001 g 0.0001 g Combination of Positives MPN/g

A 4 1 0 0 0 410XX 17

B 5 5 1 0 0 X510X 330

C 4 5 4 5 1 XX451 4,800

D 4 5 4 3 1 XX431 3,300

E 4 3 0 1 1 432XX 39

F 4 3 3 2 1 XX321 1,700 การคํานวณหาคา MPN กรณีไมมีตาราง MPN ใชการคํานวณจากสมการของ Thomas (1942) ดังนี ้MPN/g =

( ) ⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ × 21

TNP หรือ

TNP×

โดยที่ P คือ จํานวนหลอดที่ positive

N คือ น้าํหนักของตัวอยางในหลอดที่เปน negative T คือ น้ําหนักของตัวอยางทัง้หมดในระดับที่เลือก

เชน การอานผลการวิเคราะหได (5/5, 10/10, 4/10, 2/10, 0/5) ใชคาคํานวณเฉพาะ ( _ _, _ _, 4/10, 2/10, _ _ ) ไดวา T = 10x0.01+10x0.001 = 0.11 N = 6x0.01+8x0.001 = 0.068 P = 6

ดังนัน้ MPN/g = 0.110.068

6×

= 0.0866

= 70/g หมายเหต ุการเลือก dilution ใหเลือกเฉพาะ dilution ที่ใชอานผลแนนอนมาเปนตวัคํานวณ




ตารางที ่3 : MPN Table for 3x1g (ml), 3x0.1 g (ml) and 3x0.01 g(ml)




ตารางที ่4 : MPN Table for 5x1g (ml), 5x0.1 g (ml) and 5x0.01 g(ml)




ตารางที ่4 : MPN Table for 5x1g (ml), 5x0.1 g (ml) and 5x0.01 g(ml) (ตอ)

Documents

ศูนย วิจัยและตรวจสอบค ุณภาพส ัตว น้ําและผล ิตภณฑั … · ผู ทบทวนเอกสาร