บทท 4

ผลการทดลอง

1. การเตรยมสารสกดดอกอญชน และการเตรยมตวอยางน าสมสายช

1.1 การเตรยมสารสกดดอกอญชน

การเตรยมสารสกดดอกอญชน เพอน าไปใชศกษาสมบต ความเปนอนดเคเตอร

กรด-เบส และการไทเทรตกรด-เบส ท าไดโดยใชดอกอญชนทผานการอบแหงแลว น ามาสกด

สารจากดอกอญชน โดยใชน ากลนเปนตวท าละลาย ในอตราสวนผงดอกอญชน 1 กรม ตอ

ตวท าละลาย 100 มลลลตร สกดนาน 30 นาท ผลทไดพบวา ลกษณะสของสารสกดดอกอญชน

ทไดมสน าเงนอมมวง เมอน าสารสกดทได ไปวดคา pH ดวย pH Meter สารสกดดอกอญชน

ทสกดไดจะมคา pH เทากบ 6

1.2 การเตรยมตวอยางน าสมสายช

การเตรยมตวอยางน าสมสายช ใชต วอยางน าสมสายชท งหมด 14 ต วอยาง

แบงเปน น าสมสายชหมก 8 ตวอยาง น าสมสายชกลน 5 ต วอยาง และน าสมสายชเทยม 1

ต วอยาง เ นองจ ากน าสมสายชหมกจะมสของพชทป นมาหลงจากกระบวนการหมก จ ง

จ าเปนตองท าการฟอกสออกเพอไมใหสงผลกระทบตอการวเคราะห โดยน าน าสมสา ยชหมกไป

ผานการกรองดวยผงถานกมมนต จะไดสารละลายทใสไมมส

ภาพ 20 ลกษณะการบรรจผงถานก ามนต และสของน าสมสายชหมกทผานการฟอกส

46

2. การวเคราะหปรมาณสารแอนโทไซยานนในตวอยางดอกอญชน โดยวธ

Estimation of Total Anthocyanin Method (Rangana, 1997)

การวเคราะหปรมาณสารแอนโทไซยานนทม อยในตวอยางดอกอญชน ใชวธ การ

ค านวณแบบ Estimation of Total Anthocyanin Method ผลการวเคราะหพบวา ตวอยาง

ดอกอญชนทน ามาใชสกดในงานวจยน มปรมาณสารแอนโทไซยานนเทากบ 223 มลลกร ม ตอ

ปรมาณของดอกอญชนแหงทน ามาทดสอบ 100 กรม

ตาราง 6 คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทความยาวคลน 535 นาโนเมตร

การค านวณปรมาณสารแอนโทไซยานน

Total Absorbance = Abs at 535 nm ×

× 100

Total anthocyanin content =

Total Absorbance = 2.21 ×

× 100 = 21881.21

Total anthocyanin content =

= 223 mg 100 g-1

ดงนน ตวอยาง ดอกอญชนทน ามาสกด เปนสารสก ดดอกอญชน มปร มาณสาร

แอนโทไซยานนเทากบ 223 มลลกรม ตอปรมาณของดอกอญชนแหงทน ามาทดสอบ 100 กรม

ครงท คาการดดกลนแสง

(535 nm)

ปรมาณสาร

แอนโทไซยานน (mg 100 g-1)

1 2.21 223

2 2.23 225

3 2.18 212

4 2.22 224

5 2.21 223

6 2.21 223

คาเฉลย ± SD 2.21 ± 0.02 222 ± 4

47

การวเคราะหปรมาณแอนโทไซยานน ใชต วอยางดอกอญชนสดทผานการอบแหง

แลวน ามาท าการวเคราะห ซงปรมาณสารแอนโทไซยานนในตวอยางดอกอญชนอาจมปร มาณ

สารทแตกตางกนออกไป ขนอยกบระยะเวลาและลกษณะในการเกบร กษา โดยทความคงตว

(Stability) ของสารแอนโทไซยานนในดอกอญชนจะลดลงเมอระยะเวลาในการเกบร กษาเพมขน

อนเปนผลมาจากปจจยตางๆ เชน โครงสร างโมเลกล (Structure) อณหภม และความเปน

กรด-ดาง (Temperature and pH) ซงไดมผทท าการศกษาวจยไวดงน เชน

Hiemori, M., et al. (2009) ศกษาองคประกอบและความคงตวของแอนโทไซยานนในขาวนล (Oryzasativa L. japonica var. SBR) โดยแอนโทไซยานน 6 ชนด ถกวเคราะหโดยเคร อง HPLC-PDA และ LC-(ESI)MS/MS พบวา แอนโทไซยานนทพบมากท สดค อ Cyanidin-3-Glucoside (572.47 ไมโครกรมตอกรม คดเปน 91.13% ของปรมาณแอนโทไซยานนทงหมด) และ peonidin-3-glucoside (29.78 ไมโครกรมตอกร ม ค ดเ ปน 4.74% ของปรมาณ แอนโทไซยานนท งหมด ) รองลงมาคอ Cyaniding-Dihexoside Isomer 3 ไอโซเมอร และ Cyaniding Hexoside อก 1 ชนด นอกจากน ความคงตวของแอนโทไซยานนททดสอบจากการหงขาวและความดน พบวา วธการทงหมดของกระบวนการหงขาวเปนสาเหตท าใหปร มาณสารแอนโทไซยานนลดลงอยางมนยส าคญ และความดน (Pressure) ทใชในการหงขาวเปนสาเหตส าคญสดทท าใหปรมาณของ Cyanidin-3-Glucoside ลดลง รองลงมาคอ หมอหงขาว (Rice Cooker) และปรมาณกาซทใชคดเปนรอยละ 79.8, 74.2 และ 65.4 ตามล าด บในขณะเดยวกนปรมาณของ Protocatechuic Acid มการเพมขน 2.7-3.4 เทา ในทกวธการของกระบวนการหงขาว ดงนนจงสรปไดวา ทางความรอนและความดนจากการหงขาว เปนสาเหตหลกใหเกดการสลายตวของ cyanidin-3-glucoside และการเกด Protocatechuic Acid ขนพรอมกน

Mori, K., et al. (2007) ศกษาการสญเสยแอนโทไซยานนในองนแดงท อณหภม 35°C และ 25°C พบวา ท อณหภม 25°C จะม 3-monoglucoside, 3-acetylglucoside และ 3-p-coumaroylglucoside ซง เ ปนอนพนธ ข อง Delphinidins, Cyanidins, Petunidins, Peonidins และ Maluidins อ ยในปรมาณมาก แตเมออณหภมเพมขนเปน 35°C พบว า แอนโทไซยานนแตละชนดมปรมาณลดลง ยกเวนอนพนธ ของ Maluidins ได แก 3-glucoside, 3-acetylglucoside และ 3-p-coumaroylglucoside สาเหตมาจากยนทได จากชวะสงเคราะห (Biosynthesis Genes) นน ไมสามารถตานการสลายตวท อณหภม 35°C ได ท ง นอณหภมยง มผลตอการเปลยนสของแอนโทไซนน เนองจากสดสวนของ cyaniding และ pelargonidin 3-glycoside ทม ในน าผลไม หลงจากการเกบร กษาท อณหภม 20°C นาน 3 เด อน พบวา แอนโทไซยานนมการเปลยนสอยางมนยส าค ญ ขณะทการเกบร กษาท อณหภม -20°C มการเปลยนแปลงเพยงเลกนอย

48

3. การศกษาสมบตความเปนอนดเคเตอรกรด-เบส ของสารสกดดอกอญชน

ผลการศกษาสมบตความเปนอนดเคเตอรกรด-เบส ของสารสกดดอกอญชน ทท า

การปรบคา pH ของสารสกดดอกอญชนดวยสารละลายกรดไฮไดรคลอร ก สารละลายกรด

อะซตก สารละลายแอมโมเนยมไฮดรอกไซด และสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด เพอปร บใหคา

pH ของสารสกดดอกอญชนอยในชวงคา pH 1 - 14 โดยใช pH Meter เปนตวตรวจวด แลว

สงเกตลกษณะทางกายภาพและการเปลยนแปลงเฉดสของสารสกดดอกอญชน

ภาพ 21 เฉดสของสารสกดดอกอญชนในชวงสารละลาย pH 1 - pH 14

สารแอนโทไซยานนมคณสมบต ในการเปนอนดเคเตอร กรด -เบส (Acid-Base Indicator) กลาวคอ เมอสารละลายในสภาวะทเปนกรดจะเกดสารสแดง ในสภาวะทสารละลายเปนกลางจะเกดสารสน าเงน และในสภาวะทเปนดางสารละลายจะไมมส การเปลยนแปลงสของ แอนโทไซยานนนเปนผลมาจากของการใหและรบอเลกตรอนของโมเลกล จ งท าใหโครงสร างหลกของโมเลกลซงเปนเกลอฟลาวลเลยม (Flavylium Cation) ทม ความวองไวตอการเกดปฏกรยา เกดการเปลยนแปลงของโครงสราง สงผลท าใหเกดการเปลยนแปลงสของสาร แอนโทไซยานน

ในสภาวะทสารละลายมความเปนกรด และเปนกลาง แอนโทไซยานนจะมโครงสร างอย 4 โครงสร างทอยในสภาวะสมดล ค อ Red Flavylium Cation (AH+), Blue Quinonoidal Base หรอ Red Quinonoidal Base (A), Colorless Carbinol Pseudo Base (B) และ Colorless Chalcone (C) ในสภาวะทเปนกรด (pH นอยกวา 2) จะม AH+ เปนโครงสร างหลก เมอคา pH เพมขน AH+ จะเกดการสญเสย โปรตอน เกดเปนสารละลาย Blue Quinonoidal Base หรอ Red Quinonoidal Base (A) ซงเปนโครงสรางทเกดเปนปกต แตการเกดปฏกร ยา ไฮเดรชน (Hydration) ของ AH+ จะท าใหเกด Colorless Carbinol Pseudo Base (B) สงผลท าใหเกดการเปลยนแปลงของคาพเอช (pH) และการเปลยนแปลงสของสารแอนโทไซยานน

49

ภาพ 22 การเปลยนรปโครงสราง (Structural Transformation) ของสารแอนโทไซยานน

ตาราง 7 เฉดสของสารสกดดอกอญชนในชวงคา pH 1 - pH 14

สารสกดดอกอญชน*

สารละลายทใชปรบคาพเอช pH สของสารละลาย

สารละลายกรดไฮไดรคลอรก

ความเขมขน 1.0 โมลาร

1 แดง

2 ชมพ

3 มวง

4 น าเงนอมมวง

สารละลายกรดอะซตก

ความเขมขน 0.5 โมลาร

5 น าเงนออน

6 น าเงน

7 น าเงน

8 น าเงนเขม

สารละลายแอมโมเนยมไฮดรอกไซด

ความเขมขน 0.5 โมลาร

9 น าตาลเขม

10 น าตาล

11 น าตาลออน

สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 1.0 โมลาร

12 เหลองออน

13 เหลองเขม

14 ใส

หมายเหต * สารสกดดอกอญชนความเขมขน 1.0% w/v

50

4. การไทเทรตกรด-เบส โดยใชสารสกดดอกอญชนเปนอนดเคเตอร

สารสกดดอกอญชนทน ามาประยกตใชเปนอนดเคเตอร ในการไทเทรตกรด -เบส

ทง 4 แบบ ไดแก การไทเทรตกรดแก -เบสแก กรดแก-เบสออน กรดออน-เบสออน และ

กรดออน-เบสแก โดยเปรยบเทยบกบอนดเคเตอร สงเคราะห 3 ชนด ไดแก ฟนอลฟทาลน

โบโมไทมอลบล และเมทลเรด

ตาราง 8 ผลการไทเทรตกรด-เบสโดยใชสารสกดดอกอญชนเปนอนดเคเตอร

การไทเทรตกรด-เบส อนดเคเตอร

ปรมาตร

สารละลาย

เบส (ml)

การ

เปลยนแปลง

เฉดส

pH

กรดแก – เบสแก (HCl และ NaOH)

โบโมไทมอลบล 30.50 เหลอง – ฟา 7.52

สารสกดดอกอญชน 31.50 ไมมส – ฟา 7.71

กรดออน – เบสแก

(CH3COOH และ NaOH)

ฟนอลฟทาลน 13.50 ไมมส – ชมพ 8.31

สารสกดดอกอญชน 14.50 ไมมส – ฟา 8.75

กรดออน – เบสออน

(CH3COOH และ NH4OH)

โบโมไทมอลบล 10.50 เหลอง – ฟา 7.26

สารสกดดอกอญชน 10.00 ไมมส – ฟา 7.02

กรดแก – เบสออน

(HCl และ NH4OH)

เมทลเรด 20.50 แดง – เหลอง 6.49

สารสกดดอกอญชน 22.50 ไมมส – ฟา 6.23

หมายเหต ความเขมขนของสารละลายท ใชในการไทเทรตกรด-เบส

สารสกดดอกอญชนความเขมขน 1.0% w/v

[HCl] = 1.0 M [CH3COOH] = 1.0 M

[NaOH] = 0.5 M [NH4OH] = 0.5 M

51

4.1 การไทเทรตกรดแก-เบสแก

ใชสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.5 โมลาร เปนไทแทรนต

(Titrant) และใชสารละลายกรดไฮโดรคลอรกความเขมขน 1.0 โมลาร เปนไทแทรนด (Titrand)

มจดสมมลทคา pH 7.71 ปรมาตรของสารละลายเบสทใชในการไทเทรตเทากบ 31.50 มลลลตร

สารละลายทไดมสฟาออน มสมการของปฏกรยาดงน

HCl + NaOH NaCl + H2O

ตาราง 9 ปรมาตรของสารละลายเบส และคาพเอช (pH) ของการไทเทรตกรดแก -เบสแก และ

การหาจดสมมล (Equivalence Point)

NaOH (ml) pH ± SD จดสมมล (Equivalence Point) 2.0 0.34 ± 0.09

4.0 0.36 ± 0.04 6.0 0.40 ± 0.07 8.0 0.45 ± 0.06 10.0 0.49 ± 0.03 12.0 0.58 ± 0.08 14.0 0.66 ± 0.09 16.0 0.73 ± 0.10 18.0 0.81 ± 0.06 20.0 0.92 ± 0.08 22.0 1.05 ± 0.08 24.0 1.21 ± 0.07 27.0 1.84 ± 0.11 30.0 7.31 ± 0.09 32.0 11.42 ± 0.10 34.0 12.26 ± 0.06 36.0 12.68 ± 0.08 38.0 12.83 ± 0.10 40.0 12.91 ± 0.07 42.0 13.02 ± 0.11

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

pH

Used alkaline solution volume (ml)

จดสมมล

52

4.2 การไทเทรตกรดออน-เบสแก

ใชสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.5 โมลาร เปนไทแทรนต

(Titrant) และใชสารละลายกรดกรดอะซตกความเขมขน 1.0 โมลาร เปนไทแทรนด (Titrand)

มจดสมมลทค า pH 8.75 ซง มปร มาตรของสารละลายเบสท ใชในการไท เทรต เทากบ

14.50 มลลลตร สารละลายทไดมสฟาออน มสมการของปฏกรยาดงน

CH3COOH + NaOH CH3COONa + H2O

ตาราง 10 ปรมาตรของสารละลายเบส และคาพเอช (pH) ของไทเทรตกรดออน-เบสแก และ

การหาจดสมมล (Equivalence Point)

NaOH (ml) pH ± SD จดสมมล (Equivalence Point) 1.0 3.09 ± 0.12

2.0 3.38 ± 0.09 3.0 3.69 ± 0.11 4.0 3.89 ± 0.13 5.0 4.02 ± 0.07 6.0 4.14 ± 0.08 7.0 4.25 ± 0.10 8.0 4.45 ± 0.07 9.0 4.65 ± 0.05 10.0 4.81 ± 0.10 11.0 4.97 ± 0.09 12.0 5.21 ± 0.07 13.0 5.44 ± 0.09 14.0 5.98 ± 0.11 15.0 8.84 ± 0.06 16.0 11.75 ± 0.07 17.0 12.10 ± 0.07 18.0 12.27 ± 0.08 19.0 12.53 ± 0.10 20.0 12.82 ± 0.06

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0 5 10 15 20 25

pH

Used alkaline solution volume (ml)

จดสมมล

53

4.3 การไทเทรตกรดออน-เบสออน

ใชสารละลายแอมโมเนยมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.5 โมลาร เปนไทแทรนต

(Titrant) และใชสารละลายกรดกรดอะซตกความเขมขน 1.0 โมลาร เปนไทแทรนด (Titrand)

มจดสมมลทค า pH 7.02 ซง มปร มาตรของสารละลายเบสท ใชในการไท เทรต เทากบ

10.00 มลลลตร สารละลายทไดมสฟาออน มสมการของปฏกรยาดงน

CH3COOH + NH4OH CH3COONH4 + H2O

ตาราง 11 ปรมาตรของสารละลายเบส และคาพเอช (pH) ของไทเทรตกรดออน-เบสออน และ

การหาจดสมมล (Equivalence Point)

NH4OH (ml) pH ± SD จดสมมล (Equivalence Point) 1.0 3.19 ± 0.07

2.0 3.63 ± 0.10 3.0 4.02 ± 0.09 4.0 4.31 ± 0.13 5.0 4.62 ± 0.11 6.0 4.83 ± 0.08 7.0 5.07 ± 0.07 8.0 5.28 ± 0.09 9.0 5.70 ± 0.01 10.0 7.02 ± 0.07 11.0 8.68 ± 0.12 12.0 9.45 ± 0.08 13.0 9.75 ± 0.09 14.0 10.07 ± 0.10 15.0 10.32 ± 0.10 16.0 10.54 ± 0.13 17.0 10.90 ± 0.9 18.0 11.21 ± 0.07 19.0 11.43 ± 0.10 20.0 11.59 ± 0.08

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0 5 10 15 20 25

pH

Used alkaline solution volume (ml)

จดสมมล

54

4.4 การไทเทรตกรดแก-เบสออน

ใชสารละลายแอมโมเนยมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.5 โมลาร เปนไทแทรนต

(Titrant) และใชสารละลายกรดไฮโดรคลอรกความเขมขน 1.0 โมลาร เปนไทแทรนด (Titrand)

มจดสมมลทค า pH 6.23 ซง มปร มาตรของสารละลายเบสท ใชในการไท เทรต เทากบ

22.85 มลลลตร สารละลายทไดมสฟาออน มสมการของปฏกรยาดงน

HCl + NH4OH NH4Cl + H2O

ตาราง 12 ปรมาตรของสารละลายเบส และคาพเอช (pH) ของไทเทรตกรดแก-เบสออน และ

การหาจดสมมล (Equivalence Point)

NH4OH (ml) pH ± SD จดสมมล (Equivalence Point) 2.0 0.32 ± 0.08

4.0 0.45 ± 0.10 6.0 0.63 ± 0.12 8.0 0.92 ± 0.09 10.0 1.21 ± 0.07 12.0 1.53 ± 0.10 14.0 1.80 ± 0.09 16.0 2.18 ± 0.07 18.0 2.57 ± 0.12 20.0 3.09 ± 0.10 22.0 6.34 ± 0.05 24.0 8.95 ± 0.12 26.0 9.52 ± 0.08 28.0 9.81 ± 0.10 30.0 10.06 ± 0.09 32.0 10.43 ± 0.11 34.0 10.70 ± 0.07 36.0 11.12 ± 0.06 38.0 11.53 ± 0.09 40.0 12.07 ± 0.11

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50

pH

Used alkaline solution volume (ml)

จดสมมล

55

5. การวเคราะหปร มาณกรดอะซต กในน าสมสายช โดยเทคนคโฟลอนเจคชน

อะนาลซส

5.1 การออกแบบระบบโฟลอนเจคชนอะนาลซส

การออกแบบระบบโฟลอนเจคชนอะนาลซส เพอใชวเคราะหปร มาณกรดอะซต ก

จ าเปนทตองศกษาคาการดดกลนแสงสงสด (λmax) ของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบ

สารละลายกรดอะซต ก ผ วจ ยไดท าการศกษาห าคาการดดกลนแสงสง สดของสารสก ด

ดอกอญชน และคาการดดกลนแสงสงสดของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก โดยใชเคร อง UV–Visible Spectrophotometer ไดดงตอไปน

คาการดดกลนแสงสงสดของสารสกดดอกอญชนความเขมขนร อยละ 1.0 โดย

น าหนกตอปรมาตร วเคราะหทความยาวคลน 400-800 นาโนเมตร สารสกดดอกอญชนมคาการ

ดดกลนแสงสงสดปรากฏทความยาวคลน 572 นาโนเมตร

ภาพ 23 สเปกตรมการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทความยาวคลน 400-800 nm

56

คาการดดกลนแสงสงสดของสารสกดดอกอญชนความเขมขนร อยละ 0.1, 0.5,

1.0 และ 1.5 โดยน าหนกตอปร มาตร ทท าปฏกร ยากบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐาน

ความเขมขนรอยละ 10.0 โดยน าหนกตอปรมาตร คาการดดกลนแสงสงสดจะปรากฏทความยาว

คลน 550 นาโนเมตร

ภาพ 24 สเปกตรมการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 0.1, 0.5, 1.0

และ 1.5 โดยน าหนกตอปรมาตร ทท าปฏกรยากบสารละลายมาตรฐานกรดอะซตก

ผลการศกษา การหาคาการดดกลนแสงสงสดของสารสกดดอกอญชน และคาการ

ดดกลนแสงสงสดของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซต ก โดยใชเคร อง

UV–Visible Spectrophotometer เปนตวตรวจวด พบวา สารสกดดอกอญชนมคาการดดกลน

แสงสงสดทความยาวคลน 572 นาโนเมตร และเมอน าสารสกดดอกอญชนทม ความเขมขน

รอยละ 0.1, 0.5, 1.0 และ 1.5 โดยน าหนกตอปรมาตร ท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซต ก

มาตรฐานความเขมขนรอยละ 10.0 โดยปรมาตรตอปรมาตร จะไดสารละลายทมสแดง มคาการ

ดดกลนแสงสงสดทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ซงคาการดดกลนแสงทความยาวคล น 550

นาโนเมตร น จะน าไปใชในการออกแบบระบบโฟลอนเจคชนอะนาลซส เพอใชในการวเคราะห

ปรมาณกรดอะซตกในน าสมสายช ในขนตอไป

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

400 450 500 550 600 650 700 750 800

Ab

s

Wavelength (nm)

0.1% w/v

0.5% w/v

1.0% w/v

1.5% w/v

550 nm

57

การออกแบบระบบโฟลอนเจคชนอะนาลซสเพอใชในการวเคราะหปร มาณ

กรดอะซตกทมอยในน าสมสายช ไดท าการออกแบบระบบทงหมด 3 ระบบ ดงน

ระบบท 1 ใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปรมาตร

เปนรเอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) และสารละลายกรดอะซต ก

มาตรฐานความเขมขนรอยละ 4.0 โดยปรมาตรตอปรมาตร ลงในต าแหนงของน ากลนทใชเปน

กระแสตวพา (Carrier) วเคราะหคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

ภาพ 25 FIA-Gram ของเทคนค FIA ในระบบท 1

ระบบท 2 ใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปรมาตร

เปนรเอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) และฉดสารละลายกรด

อะซตกมาตรฐานความเขมขนรอยละ 4.0 โดยปรมาตรตอปร มาตร ในต าแหนงของสารสกด

ดอกอญชนทใชเปนรเอเจนต วเคราะหคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

ภาพ 26 FIA-Gram ของเทคนค FIA ในระบบท 2

-0.01

0.01

0.03

0.0 200.0 400.0 600.0 800.0

Abs

Time (sec)

-0.11

-0.06

-0.01

0.0 200.0 400.0 600.0 800.0

Abs

Time (sec)

58

ระบบท 3 ใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปรมาตร

เปนร เอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) และฉดสารละลาย

กรดอะซต กมาตรฐานความเขมขนร อยละ 4.0 โดยปรมาตรตอปร มาตร ในต าแหนงของ

สารละลายทมการเขาท าปฏกรยากนแลวระหวางสารละลายทใชเปนกระแสตวพา (Carrier) และ

สารละลายทใชเปนร เอเจนต (Reagent) วเคราะหคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550

นาโนเมตร

ภาพ 27 FIA-Gram ของเทคนค FIA ในระบบท 3

ผลการศกษา การออกแบบระบบโฟลอนเจคชนอะนาลซส เพอใชในการวเคราะห

ปรมาณกรดอะซตกในน าสมสายช ทง 3 ระบบ พบวา ระบบทเลอกใชในการว เคราะหปร มาณ

กรดอะซตกในน าสมสายช เลอกใชระบบท 1 ทมการฉดสารละลายมาตรฐานกรดอะซต กลงไปใน

ต าแหนงของน ากลนทใชเปนกระแสตวพา (Carrier)

ในระบบท 2 ทมการฉดสารละลายมาตรฐานกรดอะซตกในต าแหนงของสารสกด

ดอกอญชนทใชเปนตวรเอเจนต (Reagent) และระบบท 3 ทม การฉดสารละลายกรดอะซต ก

มาตรฐาน ในต าแหนงของสารละลายทม การเขาท าปฏกร ยากนแลวระหวางสารละลายทใช

เปนกระแสตวพา (Carrier) และสารละลายทใชเปนร เอเจนต (Reagent) จะไดคาการดดกลน

แสงทเปนคาตดลบ เพราะเมอฉดสารละลายมาตรฐานกรดอะซต กลง ในต าแหนงของสารสกด

ดอกอญชนทใชเปนรเอเจนตจะไดสารละลายทมสแดง และสารละลายนจะเขาท าปฏกร ยากบน า

กลนทใชเปนกระแสตวพา ท าใหความเขมสของสารละลายลดลง

-0.06

-0.04

-0.02

0.000.0 200.0 400.0 600.0 800.0

Abs

Time (sec)

59

5.2 การศกษาสมบตทเหมาะสมของสารสกดดอกอญชน เพอใชเปนสารละลาย

อนดเคเตอรในการตรวจวด

การศกษา อณหภมของน าทใชเปนตวท าละลายในการสกดสารจากดอกอญชน

ระยะเ วลาทใชในการสกด และป รมาณดอกอญชนทใชในการสกด เพอใช เปนร เ อเจนต

(Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) น ามาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต ก

มาตรฐานความเขมขนร อยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตรตอปร มาตร ใชเทคนค

โฟลอนเจคชนอะนาลซสวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ไดผลดงน

5.2.1 อณหภมของน าทใชเปนตวท าละลาย

การสก ดสารจากดอกอญชน ใชน า เป นตวท าละลาย ทม อณหภม ณ

อณหภมหอง (Room Temperature) และอณหภม 80 องศาเซลเซยส แลวน าไปสกดสารจาก

ดอกอญชน โดยใชผงดอกอญชน 1.0 กรมตอตวท าละลาย 100 มลลลตร สกดนาน 30 นาท

จากนนน าสารละลายทสกดไดมาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐานความเขมขน

รอยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตรตอปร มาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส

วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

ตาราง 13 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตกมาตรฐาน ทใชน าเปนตวท าละลาย ณ อณหภมหอง และอณหภม 80°C

อณหภม (ºC) คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v

RT 0.0350 0.0452 0.0587 0.0691

80 0.0327 0.0367 0.0442 0.0510

หมายเหต RT = Room Temperature

60

ภาพ 28 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยากบสารละลาย

กรดอะซตกมาตรฐาน ทใชน าเปนตวท าละลาย ณ อณหภมหอง และอณหภม 80°C

ผลการศกษาอณหภมของน าทใชเปนตวท าละลายในการสกดสารละลายจาก

ดอกอญชน โดยใชผงดอกอญชน 1.0 กรมตอตวท าละลาย 100 มลลลตร สกดนาน 30 นาท

จากนนน าสารละลายทสกดไดมาทดสอบกบสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขนร อยละ

1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตรตอปรมาตร โดยใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซสวดคาการ

ดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร พบวา อณหภมทเหมาะสมของน าทใชเปนตวท า

ละลายจะอยท อณหภมหอง (Room Temperature) โดยสงเกตจากคาการดดกลนแสงของ

สารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก ในสวนของสารสกดดอกอญชนทใช

น าเปนตวท าละลายทมอณหภม 80 องศาเซลเซยส จะไดคาการดดกลนแสงทนอยกวา เพราะ

ความรอนของตวท าละลายจะท าใหปรมาณของแอนโทไซยานนในสารสกดดอกอญชนลดลง

5.2.2 ระยะเวลาทใชในการสกด

การศกษาระยะเวลาทใชในการสกดสารจากดอกอญชน ใชผงดอกอญชน

1.0 กรม ตอตวท าละลาย 100 มลลลตร สกดนาน 5, 10, 15, 30, 45 และ 60 นาท ณ

อณหภมหอง กรองสารละลายทสกดไดแลวน ามาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐาน

ความเขมขน รอยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตรตอปรมาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชน

อะนาลซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

0.03

0.04

0.04

0.05

0.05

0.06

0.06

0.07

0.07

0.08

1% 2% 3% 4% 5% 6% 7%

Ab

s

ความเขมขนของสารละลลายมาตรฐานกรดอะซตก (% v/v)

Room temp.

80°c

61

ตาราง 14 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ในระยะเวลาการสกดตางๆ

เวลา (min)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 5 0.0348 0.0405 0.0536 0.0648 10 0.0365 0.0454 0.0543 0.0654 15 0.0332 0.0422 0.0574 0.0679 30 0.0272 0.0350 0.0500 0.0552 45 0.0299 0.0358 0.0508 0.0555 60 0.0299 0.0310 0.0502 0.0591

ภาพ 29 คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยา

กบสารละลายกรดอะซตก 5.0% v/v ในระยะเวลาตางๆ

ผลการศกษาระย ะเวลาทใชในการสกดสารจากดอกอญชน โดยใชผ ง

ดอกอญชน 1.0 กรม ตอตวท าละลาย 100 มลลลตร ณ อณหภมหอง พบวา ระยะเวลาท

เหมาะสมในการสกดสารจากดอกอญชนจะอยท 15 นาท และเมอน าสารสกดดอกอญชนทได ไป

ท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานจะไดคาการดดกลนแสงมากทสด

5.2.3 ปรมาณดอกอญชนทใชในการสกด

การศกษาปรมาณของดอกอญชนทใชในการสกดสารจากดอกอญชน ใชผง

ดอกอญชนหนก 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 และ 3.0 กรม ตอตวท าละลาย 100 มลลลตร

ณ อณหภมหอง สกดนาน 15 นาท จากนนกรองสารละลายทสกดไดแลวน ามาทดสอบกบ

0.048

0.050

0.052

0.054

0.056

0.058

0 10 20 30 40 50 60

Ab

s

ระยะเวลาทใชในการสกด (min)

62

สารละลายกรดอะซต กมาตรฐานความเขมขนร อยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตร

ตอปรมาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550

นาโนเมตร

ตาราง 15 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ทใชปรมาณของดอกอญชนทใชในการสกดตางๆ

ปรมาณอญชน (% w/v)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 0.1 0.0088 0.0092 0.0104 0.0112 0.2 0.0164 0.0184 0.0221 0.0247 0.5 0.0272 0.0326 0.0408 0.0477 1.0 0.0330 0.0382 0.0624 0.0695 2.0 0.0089 0.0116 0.0144 0.0173 2.5 0.0044 0.0056 0.0092 0.0105 3.0 0.0023 0.0044 0.0079 0.0094

ภาพ 30 คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยา

กบสารละลายกรดอะซตก 5.0% v/v

ผลการศกษา ปรมาณดอกอญชนทใชในการสกดสารจากดอกอญชน โดยใช

น ากลนเปนตวท าละลายปรมาตร 100 มลลลตร สกดนาน 15 นาท ณ อณหภมหอง พบวา

ปร มาณดอกอญชนทใชในการสกดทเหมาะสม ใชปร มาณดอกอญชนแหง 1.0 กรม ต อ

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Ab

s

ปรมาณดอกอญชนทใชในการสกด (% w/v)

63

ตวท าละลาย 100 มลลลตร คดเปนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปรมาตร โดยสงเกต

จากคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

5.3 การศกษาหาสภาวะทเหมาะสมของเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส ในการ

วเคราะหปรมาณกรดอะซตก (Optimum Condition of FIA Method)

ศกษาถง อตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) ความยาวของทอ (Reaction

Coil) เสนผาศนยกลางของคอรย (Diameter of Coil) และปรมาณของตวอยางน าสมสายชทใช

ในการวเคราะห (Injection Volume) โดยใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนร อยละ 1.0 โดย

น าหนกตอปรมาตร เปนรเอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) น ามา

ทดสอบกบสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขนร อยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดย

ปรมาตรตอปรมาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

550 นาโนเมตร ไดผลการทดลองดงน

5.3.1 อตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate)

การศกษาอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) จะศกษาทอตราการ

ไหลของสารละลายทระดบ 0.2, 0.5, 1.0, 1.4, 2.2, 3.0, 4.0, 5.4 และ 9.0 มลลลตรตอนาท

ตาราง 16 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ทอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) ตางๆ

Flow Rate (ml min-1)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 0.2 0.0204 0.0295 0.0479 0.0544 0.5 0.0164 0.0295 0.0543 0.0630 1.0 0.0291 0.0403 0.0586 0.0636 1.4 0.0239 0.0332 0.0458 0.0526 2.2 0.0216 0.0283 0.0400 0.0430 3.0 0.0220 0.0291 0.0403 0.0458 4.0 0.0197 0.0272 0.0417 0.0469 5.4 0.0205 0.0289 0.0419 0.0483 9.0 0.0179 0.0245 0.0369 0.0422

64

ภาพ 31 คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน

ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก 5.0% v/v

ผลจากการศกษาอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) โดยใชสารสกด

ดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปร มาตร เปนร เอเจนต (Reagent) และใช

น ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) น ามาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐานความ

เขมขนรอยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยปรมาตรตอปรมาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาล

ซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร พบวา อตราการไหลของสารละลาย

ภายในระบบทเหมาะสม คอ 1.0 มลลลตรตอนาท

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

0.055

0.060

0.065

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Ab

s

Flow rate (ml/min)

65

5.3.2 ความยาวของทอ (Reaction Coil)

ศกษาความยาวของทอ (Reaction Coil) ทความยาว 50, 100, 150, 200,

250, 300 และ 350 เซนตเมตร โดยใชอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) ท 1.0

มลลลตรตอนาท

ตาราง 17 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ทความยาวของทอ (Reaction coil) ตางๆ

Reaction Coil (cm)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 50 0.0313 0.0611 0.1250 0.1195 100 0.0394 0.0616 0.1194 0.1432 150 0.0402 0.0594 0.1135 0.1423 200 0.038 0.0536 0.0913 0.1171 250 0.0305 0.0443 0.0836 0.0983 300 0.0568 0.0664 0.0727 0.1001 350 0.0461 0.0511 0.0698 0.0829

ภาพ 32 คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน

ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก 7.0% v/v

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

0.12

0.13

0.14

0.15

0.16

0 100 200 300 400

Ab

s

Tube long (cm)

66

ผลการศกษาความยาวของทอ (Reaction Coil) โดยใชสารสกดดอกอญชน

ความเขมขน 1.0% w/v เปนรเอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier)

น ามาทดสอบกบสารละลายมาตรฐานกรดอะซต กความเขมขนร อยละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0

โดยปรมาตรตอปร มาตร ใชเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซสวดคาการดดกลนแสงทความ

ยาวคลน 550 นาโนเมตร มอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) 1.0 มลลลตรตอนาท

พบวา ความยาวของทอ (Reaction Coil) ทเหมาะสม คอ 100 เซนตเมตร

5.3.3 เสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil)

การศกษาเสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) ทความยาว

เสนผาศนยกลาง 0.5, 1.5, 2.0 และ 2.5 เซนตเมตร โดยใชอตราการไหลของสารละลาย (Flow

Rate) ท 1.0 มลลลตร ตอนาท และความยาวของทอ (Reaction Coil) 100 เซนตเมตร

ตาราง 18 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ทความยาวเสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) ตางๆ

Diameter of Coil (cm)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 0.5 0.0492 0.0634 0.1028 0.1147 1.5 0.0580 0.0828 0.1355 0.1621 2.0 0.0562 0.0675 0.0902 0.1208 2.5 0.0658 0.0826 0.1218 0.1211

ภาพ 33 กราฟแสดงคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน

ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก 7.0% v/v

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.00 1.00 2.00 3.00

Ab

s

Diameter of Coil (cm)

67

ผลการศกษา ความยาวเสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) โดย

ใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปรมาตร เปนรเอเจนต (Reagent)

และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) น ามาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐาน

คว ามเข มขนร อย ละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยป รมาตรตอปร มาตร ใชเ ทค นค

โฟลอนเจคชนอะนาลซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร มอตราการไหล

ของสารละลาย (Flow Rate) 1.0 มลลลตร ตอนาท ความยาวของทอ (Reaction Coil) 100

เซนตเมตร พบวา เสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) ท เหมาะสม ค อ 1.5

เซนตเมตร

5.3.4 ปรมาตรของตวอยางทใชในการวเคราะห (Injection Volume)

การศกษาปรมาตรของตวอยางน าสมสายชทใชในการวเคราะห (Injection

Volume) ท าการศกษาทปรมาตร 20, 30, 40, 50 และ 60 ไมโครลตร โดยใชอตราการไหลของ

สารละลาย (Flow rate) ท 1.0 มลลลตรตอนาท ความยาวของทอ (Reaction Coil) 100

เซนตเมตร และเสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) 1.5 เซนตเมตร

ตาราง 19 เปรยบเทยบคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชนทท าปฏกร ยากบสารละลาย

กรดอะซตก ทปรมาตรของตวอยางน าสมสายชทใชในการวเคราะห (Injection volume) ตางๆ

Injection volume

(µl)

คาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก

1.0% v/v 2.0% v/v 5.0% v/v 7.0% v/v 20 0.0519 0.0709 0.1139 0.1326 30 0.0430 0.0551 0.0894 0.1096 40 0.0455 0.0589 0.0936 0.1488 50 0.0523 0.0768 0.1107 0.1335 60 0.0506 0.0828 0.1021 0.1278

68

ภาพ 34 กราฟแสดงคาการดดกลนแสงของสารสกดดอกอญชน

ทท าปฏกรยากบสารละลายกรดอะซตก 5.0% v/v

ผลการศกษาปรมาตรของตวอยางน าสมสายช (Injection Volume) โดยใช

สารสกดดอกอญชนความเขมขนรอยละ 1.0 โดยน าหนกตอปร มาตร เปนร เอเจนต (Reagent)

และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) น ามาทดสอบกบสารละลายกรดอะซต กมาตรฐาน

คว ามเข มขนร อย ละ 1.0, 2.0, 5.0 และ 7.0 โดยป รมาตรตอปร มาตร ใชเ ทค นค

โฟลอนเจคชนอะนาลซส วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร มอตราการไหล

ของสารละลาย (Flow Rate) 1.0 มลลลตรตอนาท ความยาวของทอ (Reaction Coil) 100

เซนตเมตร เสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter of Coil) 1.5 เซนตเมตร พบวา ปรมาตรของ

ตวอยางน าสมสายช (Injection Volume) ทเหมาะสม คอ 20 ไมโครลตร

5.4 การวเคราะหปรมาณกรดอะซตกในตวอยางน าสมสายช โดยเทคนค FIA

การวเคราะหปรมาณกรดอะซตกในตวอยางน าสมสายชโดยเทคนคโฟลอนเจคชน

อะนาลซส ตวอยางทน ามาท าการวเคราะห ไดแก ตวอยางน าสมสายชทงหมด 14 ตวอยาง โดย

ใชสารสกดดอกอญชนความเขมขนร อยละ 1.0 โดยน าหนกตอปร มาตร สกดนาน 15 นาท

ณ อณหภมหอง เปนรเอเจนต (Reagent) และใชน ากลนเปนกระแสตวพา (Carrier) วเคราะหท

ความยาวคลน 550 นาโนเมตร มอตราการไหลของสารละลาย (Flow Rate) 1.0 มลลลตรตอ

นาท ความยาวของทอ (Reaction Coil) 100 เซนตเมตร เสนผาศนยกลางของคอยล (Diameter

of Coil) 1.5 เซนตเมตร ใชปร มาตรของตวอยางน าสมสายช (Injection Volume) ในการ

วเคราะห 20 ไมโครลตร

0.07

0.08

0.08

0.09

0.09

0.10

0.10

0.11

0.11

0.12

0.12

0 20 40 60 80

Ab

s

Injection volume (µl)

69

ภาพ 35 FIA-Gram ของกรดอะซตกทมในน าสมสายชตวอยางท 1-7

ภาพ 36 FIA-Gram ของกรดอะซตกทมในน าสมสายชตวอยางท 8-14

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Ab

s

Time (sec)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Ab

s

Time (sec)

AC 1 AC 2

AC 4 AC 3 AC 5 AC 6 AC 7

AC 8 AC 9 AC 11 AC 10 AC 12 AC 13 AC 14

70

ตาราง 20 คาการดดกลนแสงทไดจากการวเคราะหหาปรมาณกรดอะซตกทม อยในน าสมสายช

โดยเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส ในการวเคราะหตวอยางน าสมสายชทงหมด 14 ตวอยาง

ตวอยาง

น าสมสายช

คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ความเขมขน

(% v/v) ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย ± SD

AC 1 0.0685 0.0668 0.0673 0.0675 ± 0.001 4.48

AC 2 0.0656 0.0663 0.0688 0.0669 ± 0.002 4.35

AC 3 0.0653 0.0663 0.0658 0.0658 ± 0.001 4.12

AC 4 0.0648 0.0658 0.0664 0.0657 ± 0.001 4.10

AC 5 0.0671 0.0686 0.0676 0.0678 ± 0.001 4.53

AC 6 0.0610 0.0627 0.0624 0.0620 ± 0.001 3.46

AC 7 0.0653 0.0663 0.0658 0.0658 ± 0.001 4.14

AC 8 0.0685 0.0713 0.0735 0.0711 ± 0.003 5.31

AC 9 0.0739 0.0758 0.0734 0.0744 ± 0.001 6.17

AC 10 0.0733 0.0703 0.0726 0.0721 ± 0.002 5.58

AC 11 0.0732 0.0723 0.0741 0.0732 ± 0.001 5.87

AC 12 0.0722 0.073 0.0713 0.0722 ± 0.001 5.58

AC 13 0.0686 0.0709 0.0713 0.0703 ± 0.001 5.10

AC 14 0.0714 0.0709 0.0733 0.0719 ± 0.001 5.53

71

ตาราง 21 ปรมาณกรดอะซตกทมในตวอยางน าสมสายช

ตวอยาง

น าสมสายช Abs ± SD

ความเขมขน

ทระบขางขวด (% v/v)

ความเขมขน

ทวดได (% v/v) % Found*

AC 1 0.0675 ± 0.001 5.0 4.48 89.6

AC 2 0.0669 ± 0.002 5.0 4.35 87.0

AC 3 0.0658 ± 0.001 5.0 4.12 82.4

AC 4 0.0657 ± 0.001 5.0 4.10 82.0

AC 5 0.0678 ± 0.001 5.0 4.53 90.6

AC 6 0.0620 ± 0.001 4.2 3.46 86.5

AC 7 0.0658 ± 0.001 5.0 4.14 82.8

AC 8 0.0711 ± 0.003 6.0 5.31 88.5

AC 9 0.0744 ± 0.001 6.0 6.17 102.8

AC 10 0.0721 ± 0.002 6.0 5.58 93.0

AC 11 0.0732 ± 0.001 6.0 5.87 97.8

AC 12 0.0722 ± 0.001 6.0 5.58 93.0

AC 13 0.0703 ± 0.001 6.0 5.10 85.0

AC 14 0.0719 ± 0.001 6.0 5.53 92.9

หมายเหต * คารอยละเมอเปรยบเทยบความเขมขนท ระบขางขวด

72

6. การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method Validation)

การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method Validation) เปนการศกษาทาง

หองปฏบตการเพอใหความมนใจวา วธการวเคราะหนนมความเหมาะสมตรงตามขอก าหนดหรอ

วตถประสงคของการน าวธวเคราะหนนไปใช ซงในงานวจยน ผท าวจยได ท าการตรวจสอบความ

ถกตองของกระบวนการวเคราะห (Method Validation) ไวดงน

6.1 ความสมพนธเชงเสนตรง (Linearity and Range)

การหาความสมพนธ เชงเสนตรง (Linearity and Range) เพอใชเปนกราฟ

มาตรฐานส าหรบวเคราะหปรมาณกรดอะซต กในตวอยางน าสมสายช ท าการฉดสารละลาย

กรดอะซตกมาตรฐานความเขมขนรอยละ 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, และ 10.0 โดยปรมาตร

ตอปรมาตร เขาสระบบทเลอก ท าการวเคราะหซ าความเขมขนละ 3 ซ า แลวค านวณหาคา

การดดกลนแสงเพอน าไปสรางกราฟมาตรฐาน ส าหรบการวเคราะหหาปรมาณกรดอะซต ก ใน

ตวอยางน าสมสายช พบวา กราฟมาตรฐานจะมความเป นเสนตรง ในชวงคว ามเขมข น

ของกรดอะซตกสองชวง คอ ในชวงความเขมขนของกรดอะซต ก ร อยละ 0.5-2.0 โดยปรมาตร

ตอปรมาตร จะไดสมการเสนตรงในรปของ y = 0.0167x + 0.016 มคาสมประสทธ สหสมพนธ

(R2) เทากบ 0.9987 และ ในชวงความเขมขนของกรดอะซต กร อยละ 4.0-10.0 โดยปรมาตร

ตอปรมาตร จะไดสมการเสนตรงในรปของ y = 0.0042x + 0.0502 มคาสมประสทธ สหสมพนธ

(R2) เทากบ 0.9391

73

ภาพ 37 FIA-Gram ของสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน

0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0% v/v

ตาราง 22 คาการดดกลนแสงสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขนร อยละ 0.5, 1.0,

2.0, 4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0% v/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Ab

s

Time (Sec)

สารละลายกรดอะซตก (% v/v) คาการดดกลนแสง

0.5 0.0240

1.0 0.0332

2.0 0.0492

4.0 0.0645

6.0 0.0781

8.0 0.0858

10.0 0.0899

1.0 0.5

2.0

4.0 6.0 8.0

10.0

74

ภาพ 38 กราฟมาตรฐานทใชในการวเคราะหปรมาณกรดอะซตก

ในน าสมสายช ในชวงความเขมขน 0.5-2.0% v/v

ภาพ 39 กราฟมาตรฐานทใชในการวเคราะหปรมาณกรดอะซตก

ในน าสมสายชในชวงความเขมขน 4.0-10.0% v/v

y = 0.0167x + 0.016 R² = 0.9987

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Ab

s

Concentration (% v/v)

y = 0.0042x + 0.0502 R² = 0.9391

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

3 5 7 9 11

Ab

s

Concentration (% v/v)

75

6.2 ความแมนย าของเทคนคทใชในการวเคราะห (Precision)

การศกษาความแมนย า (Precision) ของเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส ในการ

วเคราะหปรมาณกรดอะซตก โดยฉดสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขนร อยละ 1.0

โดยปรมาตรตอปรมาตร เขาสระบบ FIA จ านวน 12 คร ง ได คาสวนเบยงเบนมาตรฐาน

สมพทธ (%RSD) รอยละ 4.14

ภาพ 40 FIA-Gram ของสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน 1.0% v/v

-0.007

-0.002

0.003

0.008

0.013

0.018

0.023

0.028

0.033

0.0 500.0 1000.0 1500.0

Ab

s

Time (sce)

76

ตาราง 23 คาการดดกลนแสงสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน 1.0% v/v

ครงท สารละลายกรดอะซตกมาตรฐาน

คาการดดกลนแสง ความเขมขน (% v/v)

1 0.0308 0.925 2 0.0302 0.888 3 0.0315 0.969 4 0.0314 0.963 5 0.0301 0.881 6 0.0312 0.950 7 0.0321 1.006 8 0.0304 0.900 9 0.0315 0.969 10 0.0310 0.938 11 0.0309 0.931 12 0.0318 0.988

คาเฉลย 0.942 SD 0.039

%RSD 4.140

77

6.3 ขดจ ากดในการวเคราะห (Limit of Detection; LOD) และปรมาณต าสดท

สามารถท าการวเคราะหได (Limit of Quantitation; LOQ)

การศกษาขดจ ากดต าสดในการวเคราะห (Limit of Detection; LOD) ของเทคนค

โฟลอนเจคชนอะนาลซส ท าโดยการฉดสารละลายกรดอะซต ก มาตรฐานความเขมขนร อยละ

0.5 โดยปรมาตรตอปรมาตร เขาสระบบจ านวน 12 คร ง ซงเปนการเตมสารละลายมาตรฐาน

ความเขมขนต าเขาสระบบ ใชสมการในการค านวณหาคา LOD และคา LOQ ตามสมการ (1)

และ (2) ตามล าดบ (นนทนา กนยานวฒน, และคณะ. 2555)

ผลการศกษา พบวา คาสวนเบยงเบนมาตรฐาน (SD) เทากบ ± 0.05 มปร มาณ

ต าสดในการวเคราะห (LOD) ทระดบความเขมขนรอยละ 0.15 โดยปรมาตรตอปร มาตร และม

ปรมาณต าสดทเทคนคสามารถวเคราะหได(LOQ) รอยละ 0.50 โดยปรมาตรตอปรมาตร

การค านวณหาคา LOD และคา LOQ จากสมการ LOD = 3 × SD .......................................(1) และ SD = 0.05 (ตามตาราง 25) จะได LOD = 3 × 0.05

LOD = 0.15 ดงนน ขดจ ากดในการวเคราะห (Limit of Detection; LOD) ของเทคนค FIA มคาเทากบ 0.15% v/v จากสมการ LOQ = 10 × SD……………………………(2) และ SD = 0.05 (ตามตาราง 25) จะได LOQ = 10 × 0.05 LOQ = 0.50

ดงนน ปรมาณต าสดทสามารถท าการวเคราะหได (Limit of Quantitation; LOQ) ของ

เทคนค FIA มคาเทากบ 0.50% v/v

78

ภาพ 41 FIA-Gram ของสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน 0.5% v/v

ตาราง 24 คาการดดกลนแสงสารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน 0.5% v/v

ครงท สารละลายกรดอะซตกมาตรฐาน

คาการดดกลนแสง ความเขมขน (% v/v)

1 0.0250 0.563

2 0.0240 0.500

3 0.0253 0.581

4 0.0225 0.406

5 0.0232 0.450

6 0.0243 0.519

7 0.0243 0.519

8 0.0245 0.531

9 0.0235 0.469

10 0.0247 0.544

11 0.0234 0.463

12 0.0240 0.500

คาเฉล ย ( ) 0.504

SD 0.050

LOD 0.150

LOQ 0.500

-0.003

0.002

0.007

0.012

0.017

0.022

0.027

0 500 1000 1500

Ab

s

Time (sec)

79

6.4 การวเ ค ร าะห คณภาพของว ธ ก ารว เ คร าะห ( t-test) ข อง เทคนค FIA เปรยบเทยบกบเทคนคการไทเทรตกรด-เบส (Acid-Base Titration) ทใชในการวเคราะหปรมาณกรดอะซตกในน าสมสายช

การวเคราะหคณภาพของวธ การวเคราะห ( t-test) เปนการทดสอบทน ามาใชเปรยบเทยบผลการทดลองของวธการวเคราะหสองการวเคราะหทได จากการวเคราะหสารตวอยางเดยวกน โดยวธ การวเคราะหแบบแรกเปนวเคราะหวธ ทต องการทดสอบ (Test Method) และวธการวเคราะหทสองเปนการวเคราะห วธ มาตรฐานทเ ปนทยอมร บ (Accepted Method) โดยใชความรทางดานสถตค านวณหาคาท (t) จากวธการวเคราะหทงสอง แลวน าคาทไดมาเปรยบเทยบกบคาท t ถาคา t ทค านวณไดมคามากกวาคา t จากตาราง แสดงวาวธ การวเคราะหทงสองวธมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ แตถาคา t ทไดจากการค านวณมคานอยกวาคา t จากตาราง แสดงวาวธการวเคราะหทงสองวธไมมความแตกตางกนอยางมนยส าค ญ งานวจ ย นจะท าการวเคราะหคณภาพของวธ การวเคร าะห ( t-test) ระหวางเทคนค FIA เปรยบเทยบกบเทคนคการไทเทรตกรด-เบส (Acid-Base Titration) ทใชในการวเคราะหปรมาณกรดอะซตกในน าสมสายช สามารถค านวณคา t ไดจากสมการตอไปน

สมการค านวณคาท (t) ± t =

√

โดย = คาเฉลยผลการวเคราะหของวธการวเคราะหมาตรฐาน

= คาเฉลยผลการวเคราะหของวธการวเคราะหทตองการทดสอบ

= จ านวนครงทท าการวเคราะหของวธการวเคราะหมาตรฐาน

= จ านวนครงทท าการวเคราะหของวธการวเคราะหทตองการทดสอบ

= คาเบยงเบนมาตรฐานรวม (Pooled Standard Deviation) ซงหาไดจาก

= √∑ ∑ ∑

โดย = คาเฉลยแตละเซตของการวด (มทงหมด k เซต)

= คาทวดไดแตละคร งในแตละเซต

N = จ านวนครงของการวดทงหมดใน k เซตรวมกน

หาไดจาก N = N1+N2+N3+…NK

N – k = ระดบขนความเสร (Degree of Freedom) ของการวด

หาไดจาก N - k = (N1-1)+(N2-1)+(N3-1)+…(Nk-1)

80

ตาราง 25 การวเคราะหปรมาณกรดอะซตกในน าสมสายชโดยเทคนค FIA เปร ยบเทยบกบ

เทคนคการไทเทรตกรด-เบส (Acid-Base Titration)

Sample Proposed Method Compared Method

FIA Titration

AC 1 4.48 0.16 4.53 0.16

AC 2 4.35 0.28 4.21 0.52

AC 3 4.12 0.58 4.46 0.22

AC 4 4.10 0.61 4.38 0.30

AC 5 4.53 0.12 4.43 0.25

AC 6 3.46 2.02 3.96 0.94

AC 7 4.14 0.55 4.34 0.35

AC 8 5.31 0.18 5.29 0.13

AC 9 6.17 1.66 5.66 0.53

AC 10 5.58 0.49 5.57 0.41

AC 11 5.87 0.98 5.48 0.30

AC 12 5.58 0.49 5.61 0.46

AC 13 5.10 0.05 5.41 0.23

AC 14 5.53 0.42 5.64 0.50

4.88 0.61 4.93 0.38 SD 0.81 0.58 0.64 0.21 N 14 14

∑ 8.59 5.30

81

การค านวณคา t-test ระหวางเทคนค FIA และเทคนคการไทเทรต (Titration)

จาก = √∑ ∑

จะได = √

= √

= 0.36

และจาก ± t =

√

จะได ± t =

√

± t = 0.37

ผลการวเคราะหคณภาพของวธการวเคราะห (t-test) ของเทคนค FIA เปร ยบเทยบ

กบเทคนคการไทเทรตกรด-เบส (Acid-Base Titration) ทใชในการวเคราะหปรมาณกรดอะซต กในน าสมสายช พบวา เมอวเคราะหผลการวเคราะหในทางสถต ผลการวเคราะหท ง 2 วธ ใหผลการวเคราะหทไมมความแตกตางกนอยางมนยส าค ญทระด บความเช อมนร อยละ 90 เมอคา Critical Value (t) ทเ ปดจากตารางมคาเทากบ 1.77 และคา t-test ทได จากการค านวณ มคาเทากบ 0.37

82

9.5 อตราการวเคราะหตวอยาง (Sample per Hour)

การศกษาอตราการวเคราะหต วอยาง (Sample per Hour) ศกษาจากการฉด

สารละลายกรดอะซตกมาตรฐานความเขมขน 0.5, 1.0, 2.0 และ 4.0% v/v เขาสระบบทเลอก

ท าการวเคราะหซ าความเขมขนละ 3 ซ า แลวค านวณหาคาอตราการวเคราะห (Sample per

Hour) พบวา อตราการวเคราะหตวอยางของเทคนคโฟลอนเจคชนอะนาลซส สามารถวเคราะห

ไดในอตรา 24 ตวอยางตอชวโมง

ภาพ 42 FIA-Gram ของสารละลายกรดอะซตกมาตรฐาน

ความเขมขน 4.0, 2.0, 1.0 และ 0.5% v/v

การค านวณอตราการวเคราะหตวอยาง (Sample per Hour) เนองจาก FIA-Gram ของเทคนค FIA เปนคาความสมพนธ ของ คาการดดกลน

แสงกบระยะเวลาทใชในการวเคราะหมหนวยเปนวนาท และก าหนดใหหนงพคของผลการวเคราะห เทากบการวเคราะหตวอยาง 1 ตวอยาง

จาก FIA-Gram ของเทคนค FIA สามารถวเคราะหได 12 ตวอยางในเวลา 1,800 วนาท และถาในเวลา 1 ชวโมง มคาเทากบ 3,600 วนาท

จะได อตราการวเคราะหตวอยาง =

อตราการวเคราะหตวอยาง = 24

ดงนน เทคนค FIA สามารถวเคราะหได 24 ตวอยางในเวลา 3,600 วนาท หร อ 24 ตวอยางตอระยะเวลา 1 ชวโมง

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

-200 300 800 1300 1800

Ab

s

Time (sec)