คมอปฏบตงาน

เรอง

การตรวจวเคราะหปรมาณยนลกผสม BCR-ABL p210

ในผปวยโรคมะเรงเมดโลหตขาวมยอลอยดชนดเรอรง

ดวยวธ Real-time quantitative PCR (RQ-PCR)

โดย

นางสาวนตยา ลมสวรรณโชต

นกวทยาศาสตร

หองปฏบตการมนษยพนธศาสตร ภาควชาพยาธวทยา

คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด มหาวทยาลยมหดล

ป 2559

ข

ค าน า

คมอฉบบนจดท ำขนส ำหรบนกวทยำศำสตร นกวชำกำรวทยำศำสตรกำรแพทย หรอนกเทคนค

กำรแพทย เพอใชในกำรตรวจวเครำะหปรมำณยนลกผสม BCR-ABL p210 ในผปวยโรคมะเรงเมดโลหต

ขำวมยอลอยดชนดเรอรง ดวยวธ real-time quantitative PCR (RQ-PCR) ภำยในหองปฏบตกำรมนษยพนธ

ศำสตร ภำควชำพยำธวทยำ คณะแพทยศำสตรโรงพยำบำลรำมำธบด ส ำหรบหองปฏบตกำรอนๆ สำมำรถน ำ

คมอนไปประยกตใชในกำรพฒนำกำรตรวจวเครำะหปรมำณยนลกผสม BCR-ABL p210 ได เนองจำกกำร

ตรวจวเครำะหดงกลำว มบทบำทส ำคญในกำรตดตำม และกำรประเมนกำรรกษำโรคในผปวยทไดรบกำร

รกษำดวยยำกลม tyrosine kinase inhibitors (TKIs)

เนอหำในคมอฉบบนประกอบดวย ขนตอนกำรปฏบตงำนตงแต กำรรบสงสงตรวจของผปวย กำร

สกดสำรพนธกรรม RNA กำรท ำปฏกรยำ reverse transcription (RT), multiplex RT-PCR, real-time PCR

และ กำรแปลผลกำรตรวจวเครำะห นอกจำกนยงครอบคลมขอควรระวงในกำรปฏบตงำน ปญหำอปสรรค

พรอมทงแนวทำงในกำรแกไข และขอเสนอแนะในกำรปฏบตงำน

ผจดท ำขอขอบคณ รองศำสตรำจำรย ดร.บษบำ ฤกษอ ำนวยโชค หวหนำหองปฏบตกำรมนษยพนธ

ศำสตร และเจำหนำทหองปฏบตกำรฯ ทกทำน ทใหกำรสนบสนนและชวยชแนะแนวทำงในกำรจดท ำคมอ

ฉบบนใหส ำเรจลลวงไปไดดวยด ขอขอบคณภำควชำพยำธวทยำ คณะแพทยศำสตรโรงพยำบำลรำมำธบด

และ มหำวทยำลยมหดลทใหกำรสนบสนนกำรจดท ำผลงำนเพอพฒนำบคลำกรสำยสนบสนน มำ ณ ทน

นตยำ ลมสวรรณโชต

สงหำคม 2559

ค

สารบญ

หนา

บทท 1 บทน า

- ควำมเปนมำ 1 - วตถประสงค 1 - ประโยชนทคำดวำจะไดรบ 2 - ขอบเขตกำรศกษำของคมอ 2 - นยำมศพทเฉพำะ 2

บทท 2 บทบาทหนาทความรบผดชอบและการบรหารจดการ

- หนำทควำมรบผดชอบ 4 - โครงสรำงบรหำรจดกำร 6

บทท 3 หลกเกณฑ/ทฤษฎ/แนวคดทเกยวของ

- ปจจยเสยงตอกำรเกดโรค 10 - ลกษณะและอำกำรทำงคลนก 10 - ระยะของโรค 10 - กำรวนจฉยโรค 11 - กำรตอบสนองตอกำรรกษำ 12 - กำรตดตำมผลกำรรกษำ 14

บทท 4 ขนตอนการปฏบตงาน

- กำรลงทะเบยนรบตวอยำงผปวย 18 - กำรสกดสำรพนธกรรม RNA 18 - กำรวดปรมำณสำรพนธกรรม RNA 21 - กำรท ำปฏกรยำ reverse transcription (RT) 23 - กำรท ำ Multiplex RT-PCR for BCR-ABL fusion gene 24 - กำรเพมปรมำณสำรพนธกรรมในหลอดทดลองแบบ real-time 28 - กำรแปลผลกำรตรวจวเครำะห 32 - กำรค ำนวณ 33 - กำรรำยงำนผล 34

ง

สารบญ (ตอ)

หนา

บทท 4 ขนตอนการปฏบตงาน

- สงทควรค ำนงในกำรปฏบตงำน 35

บทท 5 ปญหาและอปสรรคในการปฏบตงาน

- ปญหำอปสรรค และแนวทำงแกไขในกำรปฏบตงำน 36 - ขอเสนอแนะ 38

บรรณานกรม 39

ประวตผเขยน 41

จ

สารบญรป

หนา

รปท 1 แผนผงขนตอนกำรตรวจวเครำะหปรมำณยนลกผสม BCR-ABL p210 5 ในผปวยโรคมะเรงเมดโลหตขำวมยอลอยดชนดเรอรงดวยวธ RQ-PCR

รปท 2 โครงสรำงบรหำรจดกำรของหองปฏบตกำรมนษยพนธศำสตร 6

รปท 3 โครงสรำงกลมงำนทตรวจวเครำะหปรมำณยนลกผสม BCR-ABL p210 7 ดวยวธ RQ-PCR

รปท 4 Karyotype ของผปวย CML ทม Ph chromosome 9

รปท 5 กำรเกด translocation ของยน BCR บนโครโมโซมแทงท 22 และ ยน ABL 9 บนโครมโมโซมแทงท 9

รปท 6 กำรจดท ำ karyotype ของโครโมโซมจำกตวอยำงผปวย CML 14

รปท 7 Ph chromosome ทตรวจดวยเทคนค FISH 15

รปท 8 หลกกำรท ำงำนของ Taqman probe 17

รปท 9 กำรแสดงผลจำกปฏกรยำ real-time PCR 17

รปท 10 น ำยำ Trizol® LS reagent 20

รปท 11 สำรละลำย RNA สวนใสทอยชนบนสด ภำยหลงจำกตกตะกอนดวย Chloroform 21

รปท 12 เครอง Nanodrop spectrophotometer 22

รปท 13 คำกำรดดกลนแสงของ RNA ทควำมยำวคลน 260 และ 280 นำโนเมตร มหนวยเปน ng/µl 22

รปท 14 ชดน ำยำ SuperScript® VILO™ cDNA Synthesis Kit 24

รปท 15 เครองวเครำะหขนำดสำรพนธกรรมอตโนมต QIAxcel Advanced System 27

รปท 16 ผลกำรตรวจวเครำะหยน BCR-ABL ดวยเครอง QIAxcel Advanced System 28

รปท 17 ชดน ำยำ TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix 31

รปท 18 เครอง 7500 Fast Real-Time PCR System 31

ฉ

สารบญรป (ตอ)

หนา

รปท 19 เครอง ViiA7 Real-Time PCR System 31

รปท 20 standard curve ทไดจำกยน ABL และ BCR-ABL ตงแต 106-102 copy number/µl 32

รปท 21 ตวอยำงกำรรำยงำนผลกำรตรวจวเครำะหยน BCR-ABL p210 ดวยวธ RQ-PCR 34

รปท 22 ตวอยำงกรำฟแสดงควำมสมพนธของคำ %IS 35

ช

สารบญตาราง

หนา

ตำรำงท 1 เกณฑกำรวนจฉยโรค CML ระยะ accelerated phase (CML-AP) 11 และ blast crisis (CML-BC) ตำมเกณฑของ WHO

ตำรำงท 2 ค ำจ ำกดควำมของกำรตอบสนองตอกำรรกษำโรค CML 12

ตำรำงท 3 เกณฑกำรตอบสนองของผปวย CML-CP ทไดรบกำรรกษำดวยยำ imatinib 13

ตำรำงท 4 กำรเตรยม master mix ในกำรท ำปฏกรยำ RT 23

ตำรำงท 5 ล ำดบเบสของ primer ของยน BCR-ABL ในกำรท ำปฏกรยำ Multiplex RT-PCR 25

ตำรำงท 6 กำรเตรยม master mix ในกำรท ำปฏกรยำ Multiplex RT-PCR 26

ตำรำงท 7 ขนำดของ PCR product ของยนลกผสม BCR-ABL 27

ตำรำงท 8 ล ำดบเบสของ primer และ Taqman probe ในกำรท ำปฏกรยำ RQ-PCR 29

ตำรำงท 9 กำรเตรยม master mix ในกำรท ำปฏกรยำ RQ-PCR 30

ตำรำงท 10 กำรวเครำะหยน BCR-ABL p210 33

ตำรำงท 11 กำรวเครำะหยน ABL 33