BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS

VIÊM GAN B

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS

VIÊM GAN B

TS. Bạch Khánh Hoà

VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

Huế, 06-2006

2/29

Đặt vấn đềĐặt vấn đề

Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu• Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao

Sự xuất hiện các đột biến trong hệ gen virus gây

khó khăn cho việc chẩn đoán, dự phòng lây nhiễm &

điều trị• Các đột biến vùng gen S gây biến đổi kháng nguyên bề

mặt

3/29

Virus viêm gan B (HBV)Virus viêm gan B (HBV)

• Thuộc họ Hepadnaviridae

• Gây bệnh viêm gan B : o Cấp tínho Mạn tính (xơ gan, viêm gan, ung thư gan)

• Con đường lây truyền:o Từ mẹ sang cono Tiêm chícho Tình dục

4/29

Hình 1. Mô hình cấu trúc HBVHình 1. Mô hình cấu trúc HBV

Pre-S1

Pre-S2

HBsAg

HBcAg

ADN

5/29

Hình 2. Cấu trúc hệ gen virus viêm gan BHình 2. Cấu trúc hệ gen virus viêm gan B

6/29

Hình 3. Mô hình quyết định kháng nguyên “a” trên HBsAgHình 3. Mô hình quyết định kháng nguyên “a” trên HBsAg

124

137 139

142

145

147

Loop1

Loop2

Vị trí vùng quyết địnhkháng nguyên a:từ aa 110-160

7/29

Các kỹ thuật phát hiện virus viêm gan BCác kỹ thuật phát hiện virus viêm gan B

• Thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA)• Thử nghiệm miễn dịch gắn men (ELISA)• Phản ứng khuếch đại trình tự gen (PCR)• Phản ứng phát hiện axit nucleic (NAT)

8/29

Các dạng đột biến virus viêm gan BCác dạng đột biến virus viêm gan B

• Đột biến vùng gen S• Đột biến gen lõi (precore, core)• Đột biến gen polymerase• Đột biến gen X

9/29

Mục đích nghiên cứuMục đích nghiên cứu

• Tìm hiểu tần suất đột biến kháng nguyên bề mặt ở

nhóm đối tượng mang HBsAg chưa qua điều trị.• Khảo sát một số dạng đột biến hay gặp ở vùng gen

S virus viêm gan B.

10/29

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (1)Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (1)

• Đối tượng:o 75 bệnh nhân được chỉ định theo dõi viêm gan B

(1 - 12/2005) tại Viện Huyết học - Truyền máu TWo Độ tuổi: 18-43

11/29

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (2)Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (2)

Phương pháp nghiên cứu• Sàng lọc huyết thanh học

o Kit ELISA Monolisa HBsAg Plus: phát hiện kháng nguyên bề mặt bình thường

o Kit ELISA Monolisa HBsAg Ultra: phát hiện kháng nguyên bề mặt bình thường + các đột biến vùng gen S

12/29

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (3)Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (3)

Khuếch đại gen bằng PCR• Tách chiết ADN từ máu toàn phần sử dụng bộ kit

QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN, Mỹ)• Phản ứng PCR: Kit PCR Master mix (PROMEGA, Mỹ)• Cặp mồi sử dụng: theo nghiên cứu của Kobayashi &

Koike (4)

Sản phẩm phản ứng được điện di trên agarose

gel 1,5% và được phát hiện bằng tia UV.

13/29

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4)Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4)

Giải trình tự nucleotide & axit amin tương ứng:• Sử dụng kit sinh phẩm và máy của hãng

AppliedBioSystem (Mỹ).• Phần mềm xử lý số liệu: Sequencing analysis,

SeqSpace, DNA Star.

14/29

Quy trình nghiên cứu Quy trình nghiên cứu

Sàng lọc Monolisa HBsAg Plus

Sàng lọc Monolisa HBsAg Ultra

Mẫu bệnh phẩm(huyết thanh)

Phát hiện ADN và khuyếch đại vùng gen

S nhờ PCR

15/29

Tách ADN từ gel agarose

Điện di ADN trên gel agarose

Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của ADN

Giải trình tự gen S

Phân tích kết quả

16/29

Kết quả và bàn luận (1)Kết quả và bàn luận (1)

Sàng lọc huyết thanh học

Trong tổng số 75 bệnh nhân được tiến hành xét nghiệm

trên cả hai bộ kít, chúng tôi nhận thấy có 09 trường hợp

(12%) có tỷ số OD mẫu/ngưỡng (S/CO) chênh lệch khá

lớn. Những mẫu này nhiều khả năng chứa đột biến

HBsAg, vì vậy chúng tôi lựa chọn để tiếp tục tiến hành

phản ứng PCR.

17/29

Bảng 1. Danh sách mẫu có tỷ số S/CO chênh lệch lớn khi tiến hành xét nghiệm trên hai bộ kit

STT Mẫu S/CO (plus) S/CO (utral)

1 G7 0,12 17,42

2 G12 1,79 8,30

3 G27 34,43 48,21

4 G28 50,69 66,93

5 G41 50,50 68,50

6 G79 41,76 48,29

7 G88 49,85 68,05

8 G124 50,35 68,45

9 G130 8,20 34,48

18/29

Kết quả và bàn luận (2)Kết quả và bàn luận (2)

Phản ứng PCR– Trong số 9 mẫu được tiến hành tách chiết ADN, khuếch đại bằng

phản ứng PCR có 8 mẫu phát hiện được sản phẩm khuếch đại khi

điện di trên gel agarose 1,5%– 01 mẫu không phát hiện thấy sản phẩm điện di

19/29

Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%

20/29

Kết quả và bàn luận (3)Kết quả và bàn luận (3)

Giải trình tự nucleotide và axit amin tương ứng- 08 mẫu hiện băng sản phẩm PCR được sử dụng tiếp

cho việc giải trình tự nucleotide. Trình tự thu được sẽ

được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để xác

định trình tự axit amin tương ứng. - Trình tự axit amin của 8 mẫu trên được so sánh với

trình tự axit amin chuẩn (bình thường) AB031266 nhằm

tìm ra những đột biến nếu có.

21/29

Hình 5. Phần mềm giải trình tự nucleotide vùng gen S virus viêm gan B

Hình 5. Phần mềm giải trình tự nucleotide vùng gen S virus viêm gan B

22/29

So sánh trình tự axit amin của 8 mẫu HBV với mẫu chuẩn AB031266

So sánh trình tự axit amin của 8 mẫu HBV với mẫu chuẩn AB031266

Mẫu 108

118 128 138

AB031266

G12

G27

G28

G41

G79

G88

G124

G130

PLIPGSSTTS

- - - - - - - - --

- - - - - - - - G

- - - - - - - - --

- - - - - - - - --

- -D-E T- - - -

- - - - - - - - --

- -L- -T - - -R

- I - - - - - - --

TGPCRTCTTP- - - - - - - - - -

A- - - - - - - - -

- - - - -A - - - -

- - - - - - - R- -

- - - - K - -P - -

S- - - - - - - - -

- - - - K - - - --

- - - - - - - - - R

AQGTSMFPSC

- - - - F - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

CCTKPTDGNC

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

23/29

Mẫu 148

158 168 178

AB031266

G12

G27

G28

G41

G79

G88

G124

G130

 

 TCIPIPSSWA

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

FAKYLWEWAS

- -TF - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - F - - - - - -

- - - - -C - - - -

- - - F - - - - - -

- -TF - - - - - -

VRFSWLSLV

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - - - - - - -

F- - - - - I- - -

 PF

- -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

24/29

Bảng 2. Các đột biến phát hiện được sau khi giải trình tựBảng 2. Các đột biến phát hiện được sau khi giải trình tự

Mẫu Đột biến

sai nghĩa

Đột biến

im lặng

Tổng số

đột biến

G12 3 1 4

G27 2 1 3

G28 1 0 1

G41 1 1 2

G79 6 6 12

G88 2 2 4

G124 5 3 8

G130 6 1 7

Tổng số 26 15 41

25/29

Kết quả và bàn luận (4)Kết quả và bàn luận (4)

Tần số và phân bố ĐB điểm trên gen S: • Trong số 8 mẫu xác định được 41 ĐB (26 ĐB sai nghĩa +

15 ĐB im lặng) tại 27 vị trí, trung bình: 5 ĐB/mẫu.• Mỗi mẫu đều có ít nhất một đột biến sai nghĩa.

26/29

• Tần suất đột biến HBsAg ở nghiên cứu này là 10,7%, thấp hơn kết quả của TTT.Huy và cs (2003), LTT.Thuy & cs (2005), do:

o Chưa giải trình tự nucleotide cho tất cả các mẫuo Đối tượng nghiên cứu không thuộc nhóm có áp lực miễn

dịch cao

Kết quả và bàn luận (5)

27/29

• Dạng đột biến: 100% là đột biến thay thế nucleotide dẫn đến

thay thế axit amin tương ứng.• Vị trí đột biến: trong tổng số 26 đột biến có 4 đột biến xảy ra ở

loop 1, không có đột biến nào ở loop 2, còn lại 22 đột biến nằm

giữa vùng thuộc loop 1 – loop 2.

Kết quả và bàn luận (6)

28/29

Kết luậnKết luận

1- Tần suất đột biến vùng gen S ở bệnh nhân mang HBsAg

dương tính chưa qua điều trị là 10.7%.

2- Dạng đột biến phổ biến nhất là đột biến thay thế

nucleotide dẫn đến thay thế axit amin tương ứng.

29/29

- Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu TW, Labo trung tâm Y sinh - Đại học Y Hà Nội, công ty BioRad và những cán bộ, bệnh nhân đã giúp đỡ chúng tôi tiến hành nghiên cứu này;

- Xin cảm ơn sự theo dõi của quý vị đại biểu!

- Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu TW, Labo trung tâm Y sinh - Đại học Y Hà Nội, công ty BioRad và những cán bộ, bệnh nhân đã giúp đỡ chúng tôi tiến hành nghiên cứu này;

- Xin cảm ơn sự theo dõi của quý vị đại biểu!