đ

n đ

.

-

– ELISA),

nucleic acid lai (NAH),

.

,

tra

,

.

.

:

i) )

ii)

iii)

iv)

, a

- -

A.

1.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ngụ ý rằng có một loại enzyme dựa trên

phản ứng khuếch đại trong khảo nghiệm. các

'phản ứng dây chuyền' là thuật ngữ chỉ một số chu kỳ sao chép một đoạn quy

định của DNA, trong trường hợp này từ bộ gen

của một tác nhân gây bệnh. Khu vực để được khuếch đại được xác định bởi hai

(hoặc hơn) các chuỗi nucleotide ngắn, gọi là

sơn lót các trang web sườn chuỗi mục tiêu. Mồi, ngắn oligonucleotide bổ sung

của lớp sơn lót

các trang web, liên kết với các sợi DNA được sao chép. Sử dụng một

polymerase, đó không phải là denatured trong quá trình đi xe đạp nhiệt, nó là

có thể sao chép chuỗi mục tiêu bằng cách tham gia các nucleotide miễn phí để

mồi. Bằng cách lặp lại nhiệt đi thời gianchế độ20-40, số lượngsao

chépDNAmục tiêutăngtheo cấp số nhân, sản xuất đủđể tiếp tục

hoạt động, chẳng hạn nhưnhân bản,pháthiệnhoặctrình tự. Độ

nhạychẩnđoáncủaPCRlà rất caobởivì

vài triệubảnsaocủamục tiêuđượclựachọnđược sản xuất.Độ đặc hiệucũng có thể

làrất cao,được xác định bởi

các trình tựnucleotidecụ thểcủamục tiêuđượclựachọn, cũng như thiếtkếmồi.

Mồicóthểđược thiết kế để

phát hiệnrất cụ thểtrình tự nucleotidetrong bộ gencủamục tiêu lựa chọncác đại

lýtruyền nhiễm, hoặc có thể được

được thiếtkếđểbổ sung chocácvùng bảo tồnhơn, dođóchophéppháthiệncủa các

thành viêntrongmột gia đình hoặc

chi của tác nhân gây bệnh. Một tổng quanchi tiết hơn vềcáckỹ thuật phân tửđã

được xuất bản(17)

a)

b) )

.

c)

2.

'PCR thông thường (hoặc đơn giản là PCR) sử dụng một cặp mồi

oligonucleotide để khuếch đại một phần nhỏ của bộ gen của

các tác nhân gây bệnh.

Southern blotting ,

3.

. Tuy nhiê

4.

Real-time PCR khác vớitiêu chuẩnPCR, ởđâycácsản phẩm PCRkhuếch đạiđược

phát hiệntrựctiếptrong

khuếch đại chu kỳ, bằng cách sử dụng cácthiết bị thăm dòlai, trong đó tăng

cườngđặckhảo nghiệm. Phươngphápthời gianthực khác nhau, chẳng hạn

TaqMan, Scorpion sơn lót,chuyển giaonăng lượngcộng hưởnghuỳnh

quang(FRET), chuyển giao năng lượngPrimer-Probe(PriProET), SybrGreen, Light-

Upon-eXtension (LUX)vàcácxét nghiệmBeaconcácphân tửđãtrở nên phổ biến

công cụ để pháthiệncáctác nhân lây nhiễm. Real-time PCR đã được sử

dụngchoviệc phát hiện cácvi khuẩn, virushoặc

ký sinh trùng từmột loạt cácloài động vật(2-4, 14, 17). Nhữngxét

nghiệmnàycónhiều lợi thế hơn'cổ điển'

thông thường hay phương phápPCRlồng nhau. Nói chung,chỉ có mộtcặp mồiđược

sử dụng,cungcấpđộ nhạy cảmthườnggần hoặc

bằng truyền thốnglồng nhauPCRnhưngvới nguy cơô nhiễmthấp hơn nhiều. Huỳnh

quang,cho thấy

sự hiện diện của sản phẩmkhuếch đại, được đo thông quanắpbên củabình phản

ứng, do đó không có nhu cầu

-PCR xử lýDNAkhuếch đại. Những thủ tục nàyít hơn đáng kểthời gianso

với truyền thốngkhuếch đạisauphát hiện sản phẩmPCRtrongagarose geltiếp

theoethidiumbromidehoặc

DNA phát hiệntươngđươngvết bẩn vàmột lần nữa,nguy cơ ô nhiễmgiảm.Việc sử

dụngmộtmicrotitre96-giếng

tấm định dạng,màkhôngcósự cần thiết choPCRlồng nhau, chophépcác thủ tục

đểđược tự độngvà phù hợp vớiquy mô lớn

thử nghiệm (10,17). Chẩn đoáncó thểđược tiếp tụctựđộngbằng cách sử

dụngrobotchoDNA /RNAnhổvàpipetting.

So với các phương phápkhuếch đạicổ điển, mộtlợi thế hơn nữacủaPCRthời gian

thựclà nócó thể

thực hiệncácxét nghiệmđịnh lượng(6,7). Sửdụngthời gian thựcPCR, thời

gianchẩnđoáncóthểđược rút ngắntừ vài giờ đến

phút. Real-time PCR cũng có thểđược sử dụngchophiên

mãngượcPCRbằngcáchsửdụnggiaothứcmột bước, vì thế cho phép

bước RT-PCR sẽ diễn ratrongcùngmộtốngPCRtrongcùngmộtgiao thức(17).

5. PCR

PCR sử dụng các mồi nhiều hướng vào các mục tiêu khác nhau trong một thử

nghiệm duy nhất được gọi là xét nghiệm PCR .

TrongPCR , các truyền nhiễm khác nhau có thể được phát

hiện và phân biệt trong một bình phản ứng duy nhất tạicùng một thời gian. Các

chỉ tiêu PCR khác nhautrong một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn được

xác định dựa trên sản phẩm PCR

kích thước. Việc sử dụng các phương pháp cổ điển PCR lồng nhau để xây dựng

một nghiệm phức tạp bởicần cho mục của các kích cỡ khác

nhau, cũng như mồi có thể "cạnh tranh" với nhau trong cùng một hỗn hợp phản

ứng,cả hai đều có thể tác động tiêu cực hiệu quả PCR. Ngược lại, các khái

niệm về PCR (cặp mồi duy nhất)cung cấp khả năng tuyệt vời cho

việc xây dựng các hệ thống ghép kênh có độ nhạy cao (4, 9) dựa trên nhiều

Kích thước thống nhất mục tiêu, điều kiện khuếch đại thống nhất, và phát hiện

khác biệt giữa các mục tiêu sử dụng cụ thể

đầu dò lai dán nhãn với fluorophore khác nhau. Nó cũng cần được lưu ý rằng

mồi thông thường có thể được sử dụng

để khuếch đại các vùng cụ thể của bộ gen của một nhóm các tác nhân gây bệnh

và thăm dò fluorogenic (TaqMan) sau đó có thể được

sử dụng để phân biệt đối xử giữa các thành viên của nhóm. Đây không phải là

nghiêm multiplex PCR mặc dù nó có thể

nhầm lẫn được mô tả như vậy.

6.

,

-

B.

. D

1.1.4

C. Hợp thức xét nghiệm

Xác nhận khảo nghiệm - GIỚI Thiệu

1. Lựa chọn phù hợp của khảo nghiệm đối với mục đích của nó

Sự thích hợp của những xét nghiệm PCR cho các mục đích khác nhau rất rộng. Nơi

nào có nhu cầu cho phát hiện trực tiếp của một tác nhân gây bệnh, nói chung có thể

sử dụng PCR. Trong những năm đầu tiên của phát triển chuẩn đoán PCR, nhiều

phòng thí nghiệm đã có vấn đề với ô nhiễm và sự sử dụng, do đó PCR đã có danh

tiếng khiêm tốn như là một kỹ thuật thích hợp để sử dụng chẩn đoán. Thành tựu

trong những năm gần đây đã đảo ngược quan điểm đó. Công nghệ mới (tức là real-

time PCR) đã thực hiện các kỹ thuật ít tạo ra các kết quả sai gây ra do ô nhiễm và

dễ dàng hơn để sử dụng. Hơn nữa, tự động hoá việc khai thác và pipet thủ tục sử

dụng robot đã có những giảm chi phí, nâng cao khả năng lặp lại và giảm tải công

việc yêu cầu. Trong nhiều năm đầu thử nghiệm trong nhà được phát triển hài hòa,

và xác nhận người nghèo hoặc không tồn tại. OIE, National Laboratories và Cộng

đồng châu Âu Reference Laboratories (ECRLs) có một vai trò quan trọng trong

việc thúc đẩy các công việc xác nhận và hài hòa về phía trước. Nó là công bằng để

nói rằng PCR, nó được thực hiện ngày hôm nay, là an toàn (thấp hơn đáng kể nguy

cơ kết quả dương tính giả), thường được xác nhận trong một số hình thức và phù

hợp cho các mục đích dự định của nó. Một số ví dụ cụ thể về tầm quan trọng của

PCR được đưa ra dưới đây, định nghĩa của mục đích (s) có thể được tìm thấy trong

Chương 1.1.4.

• Để chẩn đoán nhiễm trùng khi mức độ kháng thể như vậy là thấp rằng việc tiếp

xúc trước không thể được khẳng định bằng xét nghiệm kháng thể (ví dụ như

enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA] lặp đi lặp lại trong "vùng xám"

trong các chương trình xoá bò bệnh bạch cầu).

• Để phân biệt giữa nhiễm trùng và khả năng miễn dịch mẹ ở động vật trẻ (ví dụ

như bê trẻ trong chương trình xóa).

• Để phát hiện virus hoặc vi khuẩn acid nucleic khi mẫu chẩn đoán không phải là

thích hợp cho việc phân lập virus do độc tính (ví dụ như tinh dịch, kỳ thi xác ướp

của thai nhi).

• Trong giai đoạn cuối của chương trình xoá, khi điều tra kỹ lưỡng các trường hợp

duy nhất là cần thiết (ví dụ như herpesvirus độ trễ và động vật lò phản ứng duy

nhất trong các chương trình diệt trừ bệnh Aujeszky).

• Để phân biệt chủng vaccine từ virus thực địa (DIVA [phân biệt nhiễm từ động vật

chủng ngừa]

phương pháp tiếp cận).

• Để xác định mối quan hệ phát sinh loài của virus và sử dụng thông tin này cho

epizootiology phân tử.

• Để kích hoạt tính năng chẩn đoán nhanh chóng và an toàn đầu tiên trong các tình

huống bùng nổ (ví dụ như năm 2006 dịch cúm gia cầm gây bệnh cao).

• Để xác định tải lượng virus (ví dụ như trong các loại Circovirus lợn 2 nhiễm

trùng).

• Nhanh chóng giám sát động vật chủng ngừa xuất hiện có dấu hiệu lâm sàng.

• Phát hiện đột biến kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh, vv

• Để chứng minh quyền tự do nhiễm trùng ở động vật sống hoặc sản phẩm động

vật. Tuy nhiên, nó phải được lưu ý rằng một số động vật bị nhiễm bệnh có thể

không có axit nucleic phát hiện trong các mô được kiểm tra.

2. Cân nhắc phát triển xét nghiệm ban đầu

a) Các cảnh báo và điều khiển

Xem xét sự không chắc chắn về sự an toàn và độ tin cậy của PCR trong chẩn đoán

thường xuyên, biện pháp phòng ngừa đặc biệt nên được áp dụng trong bất kỳ

phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng PCR để phát hiện các tác nhân lây nhiễm để

tránh kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả. Này, cùng với kiểm soát nội bộ (ví

dụ như bắt chước) đảm bảo việc đánh giá an toàn của các kết quả, miễn phí từ các

kết quả dương tính giả gây ra do ô nhiễm. Kiểm soát nội bộ thực sự bằng cách sử

dụng các nhà gen giữ cũng hoàn thành với mục tiêu PCR nhưng chỉ cho thuốc thử

là vượt quá rộng lớn như polymerase và nucleotide. Tối thiểu cạnh tranh ngụ ý

rằng mức độ của mục tiêu thực sự được biết đến, mà không thể là trường hợp cho

các mẫu thực địa. RNA bọc thép cho phép bắt chước được thêm vào trong quá

trình khai thác, mà là một bước tiến trong việc biết rằng việc khai thác đã làm việc.

Một hệ thống kiểm soát nội bộ thực sự cung cấp thêm tự tin rằng khai thác đã được

thực hiện một cách chính xác. Các xuống bên bằng cách sử dụng các gen giữ nhà

như kiểm soát nội bộ là họ có thể có mặt với số lượng lớn hơn các tác nhân gây

bệnh mục tiêu.

b) Các cảnh báo thực hiện để tránh kết quả dương tính giả

Kết quả dương tính giả (mẫu tiêu cực cho thấy một phản ứng tích cực), có thể phát

sinh từ hoặc các vấn đề liên quan đến phòng thí nghiệm, như ô nhiễm chéo, hoặc

các yếu tố liên quan đến khảo nghiệm, như tối ưu hóa không hiệu quả hoặc thực

hiện khảo nghiệm. Sản phẩm thực hiện giao từ mẫu dương tính, hoặc phổ biến hơn,

từ ô nhiễm chéo bởi các sản phẩm PCR từ các thí nghiệm trước đây là một nguồn

có thể của lỗi, và thực hành và các công cụ khác nhau đã được áp dụng để ngăn

chặn các kết quả PCR dương tính giả. Mẫu và thuốc thử nên được xử lý riêng biệt

laminar luồng không khí lưu mũ trùm, thường xuyên được khử trùng bằng cách sử

dụng ánh sáng UV (nhu cầu sử dụng ánh sáng UV-bảo dưỡng rất cẩn thận để có

hiệu lực) và thuốc tẩy. Xây dựng và sử dụng các ống đặc biệt chủ sở hữu và cụ mở

cũng có thể giúp ngăn ngừa giả tích cực (2). Ngoài ra, thực hành phòng thí nghiệm

tốt nên được áp dụng, tức là thực hiện các bước cơ bản (chiết xuất DNA, trộn và

chuẩn bị mồi, chuẩn bị mẫu, agarose gel điện di sản phẩm khuếch đại, vv ...) tại

các khu vực phòng thí nghiệm tách hoặc phòng (Hình 1; refs 1 , 4,

17). Bộ khác nhau của ống hút nên được sử dụng cho mỗi bước. Việc sử dụng các

chuyển tích cực và lời khuyên lọc được khuyến khích. Đây cũng là, nếu có thể,

khuyến khích để có người khác nhau thực hiện các bước khác nhau, những người

được giới hạn cho các khu vực phòng thí nghiệm tương ứng. Biện pháp phòng

ngừa cần được thực hiện để ngăn chặn sự ra đời của vật liệu khuếch đại từ các

phòng thí nghiệm có khả năng bị ô nhiễm vào các khu vực phòng thí nghiệm 'sạch'

hạn chế di chuyển trên mẫu, giấy tờ, trang thiết bị, các cá nhân hoặc bất kỳ phương

pháp khác có tiềm năng gây ô nhiễm. Di chuyển theo hướng ngược lại chỉ xảy ra

sau khi khử trùng bề mặt của thiết bị và vv ống và thay đổi áo khoác phòng thí

nghiệm và găng tay. Nếu mẫu dự kiến sẽ có một số tiền cao của đại lý hoặc axit

nucleic mục tiêu, đó là thích hợp hơn để pha loãng trước khi giới thiệu nó vào các

khu vực phòng thí nghiệm 'sạch'

Hình 1. Đê phòng thí nghiệm, chẩn đoán real-time PCR. Các mẫu được phân tích

được chuyển vào phòng thí nghiệm Chuẩn bị cho khai thác của acid nucleic. PCR

kết hợp tổng thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm Clean 'và chuyển giao cho'

phòng thí nghiệm Chuẩn bị 'cho phân phát vào tấm PCR và thêm mẫu. Ready-

made ống phản ứng / tấm được sau đó được chuyển vào phòng Thiết bị cho chạy

PCR. Các

'Sạch phòng thí nghiệm được sử dụng chỉ để chuẩn bị PCR chủ kết hợp, không có

DNA hoặc sản phẩm PCR được cho phép trong phòng. Đó là khuyến khích để có

một không khí khóa lối vào phòng thí nghiệm Clean 'để thay đổi vào một chiếc áo

khoác phòng thí nghiệm và giày mà chỉ được sử dụng ở đây. 'Chuẩn bị phòng thí

nghiệm được sử dụng để xử lý mẫu và thiết lập

Phản ứng PCR (với tổng thể kết hợp chuẩn bị trong phòng thí nghiệm Clean ').

Không có sản phẩm PCR được trong căn phòng này và không có gì từ phòng thí

nghiệm Chuẩn bị 'trở lại' phòng thí nghiệm Clean '. Thiết bị phòng chứa máy PCR

và không có gì từ phòng này đi trở lại phòng thí nghiệm sạch 'hoặc

'Chuẩn bị phòng thí nghiệm'. Nếu phòng thí nghiệm có một hệ thống kiểm soát

không khí, phòng thí nghiệm sạch sẽ nên được tích cực và tiêu cực khác. Nếu lồng

nhau PCR sẽ được thực hiện, hai phòng nhiều hơn được khuyến khích.

A 'phòng thí nghiệm PCR thứ hai cho việc thiết lập phản ứng PCR thứ hai (mà sẽ

liên quan đến xử lý

Sản phẩm PCR, do đó làm cho nó không thể làm điều này trong phòng thí nghiệm

Chuẩn bị "') và một' Electrophoreses phòng thí nghiệm để phân tích sản phẩm PCR

trong agarose gel.

Nó cũng rất quan trọng bao gồm điều khiển tiêu cực, các mẫu tức là tương tự như

các mẫu thử nghiệm càng tốt, nhưng mà không có mục tiêu. Trong phòng thí

nghiệm gặp vấn đề với ô nhiễm chéo, ít nhất một tiêu cực kiểm soát trên năm mẫu

chẩn đoán đã được khuyến cáo. Mẫu điều khiển cả tích cực và tiêu cực nên thường

xuyên được xen kẽ với các mẫu chẩn đoán để đánh giá hiệu suất xét nghiệm PCR.

c) Các cảnh báo thực hiện để tránh kết quả âm tính giả

PCR đã được chứng minh là một phương pháp rất hiệu quả của phát hiện axit

nucleic, chẳng hạn như bộ gen của virus trong các mẫu lâm sàng. Tuy nhiên, một

con vật bị nhiễm bệnh trong giai đoạn cuối của bệnh có thể không còn có acid

nucleic của virus trong các mô được kiểm tra. Do đó, trong trường hợp như vậy,

các kết quả PCR âm tính nên được coi là một phần của một cuộc kiểm tra chẩn

đoán phức tạp.

Kết quả âm tính giả (mẫu có chứa tác nhân quan tâm nhưng thử nghiệm là tiêu

cực) chủ yếu xảy ra do tác dụng ức chế và / hoặc pipetting lỗi, tuy nhiên, các vấn

đề do xử lý mẫu cũng có thể mang lại giả

50 OIE Terrestrial Manual 2008

Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp PCR để

chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

kết quả âm tính. Vì vậy, kiểm soát nội bộ có thể được sử dụng như các chỉ số hiệu

quả xét nghiệm PCR. PCR kiểm soát nội bộ có thể bao gồm nước ngoài DNA được

thêm vào với mẫu hay DNA phổ biến tự nhiên trong mẫu. Ngoại DNA mẫu, có thể

bao gồm DNA hoặc RNA bắt chước. Bắt chước DNA, oligonucleotides sản xuất,

có trình tự cùng một mồi ràng buộc như là mục tiêu PCR, nhưng sườn một đoạn

DNA dị của một kích thước khác nhau. Chuỗi nucleotid primer-ràng buộc cho

phép đồng khuếch đại của mục tiêu và bắt chước trong ống cùng với cạnh tranh tối

thiểu. Sự khác biệt kích thước cung cấp phân biệt đối xử dễ dàng phân tích dấu vết

phía Nam. Armored RNA ®, một khái niệm giống hệt nhau để bắt chước DNA, sử

dụng một điều khiển RNA đoạn đóng gói trong protein lông vi khuẩn để bảo vệ

hoặc ổn định RNA để kiểm soát hoặc tiêu chuẩn hóa các xét nghiệm RT-PCR (biết

thêm chi tiết về kiểm soát nội bộ, xem ở trên).

Với xét nghiệm PCR thời gian thực, nó cũng có thể sử dụng hệ thống kiểm soát nội

bộ, giữ nhà một gen tự nhiên, chọn một mảnh của bộ gen của vật chủ như beta-

actin, GAPDH, hoặc RNA ribosome. Bằng cách ghép như một điều khiển nội tại

với một fluorophore phóng viên đặc biệt màu, nó có thể kiểm tra chất lượng mẫu

và xác nhận hiệu quả PCR, như là tác nhân mục tiêu và DNA nội tại đồng thời phát

hiện (14).

Kiểm soát nội bộ (ví dụ như 'bắt chước') làm tăng độ tin cậy của chẩn đoán PCR

(1, 4). Phạt cảnh cáo phải được sử dụng khi thiết kế và kiểm tra kiểm soát nội bộ.

Mở rộng thử nghiệm là cần thiết để đảm bảo rằng khuếch đại PCR của kiểm soát

nội bộ tăng không cạnh tranh với PCR chẩn đoán và do đó giảm độ nhạy phân tích.

Kiểm soát nội bộ được sử dụng ở nồng độ cao hơn so với giới hạn phát hiện của

PCR chẩn đoán để đảm bảo hiệu suất của thử nghiệm. Nó cũng nên nhớ rằng kiểm

soát nội bộ có một bất lợi, tương tự như với các mẫu đinh, không phải là đại diện

của acid nucleic mục tiêu và có thể dẫn đến kết quả âm tính giả.

d) Chuẩn bị tiêu chuẩn

Các phòng thí nghiệm tham chiếu nên cung cấp tiêu chuẩn mẫu đại diện của một

tác nhân gây bệnh. Mẫu này có thể trồng được các tác nhân lây nhiễm hoặc các

mẫu lâm sàng, vv, được phân phối trong một cách thức rằng các tác nhân gây bệnh

được bảo tồn tốt. Vì vậy, các mẫu được phân phối đông lạnh, trong các dung môi

hữu cơ (ví dụ như Trizol) hoặc cách thức phù hợp khác. Các mẫu cũng có thể được

gửi như axit nucleic (đông lạnh, đông lạnh khô hoặc ethanol). Để biết chi tiết cụ

thể, xem chương bệnh cá nhân. Tham khảo các phòng thí nghiệm cũng nên cung

cấp bắt chước thích hợp.

Sự sẵn có của mẫu chuẩn là rất quan trọng cho một xác nhận khảo nghiệm thành

công. Thật không may này thường là vấn đề khó giải quyết nhất để giải quyết khi

lập kế hoạch một dự án xác nhận. Nó không phải là đủ để sử dụng các đại lý chỉ

canh tác hoặc các mẫu đinh, mẫu thực sự từ trường có thể có những đặc điểm rất

khác so với những mẫu được tạo ra trong phòng thí nghiệm. Nó có thể chứng minh

rất khó khăn để có được các mẫu từ các lĩnh vực mà thực sự tiêu cực hay tích cực,

đặc biệt là PCR thường có độ nhạy cao hơn phân tích hơn so với các phương pháp

của hầu hết các tiêu chuẩn vàng, do đó làm cho nó khó khăn để xác định tình trạng

của các mẫu xác nhận dự định sử dụng đã thành lập thử nghiệm. Như đã đề cập

trước đây, các phòng thí nghiệm tham chiếu có thể là một nguồn tiềm năng cho

mẫu chuẩn đó. Ngoài ra, phương pháp Bayesian cung cấp các phương pháp tiếp

cận xác suất để xác nhận các xét nghiệm chẩn đoán trong trường hợp không có một

tiêu chuẩn vàng (5), nhưng không được tiếp tục thảo luận trong chương này.

D. Định lượng xác nhận - PART 1

1. Tối ưu hóa và tiêu chuẩn hóa các chất phản ứng và xác định các thông số kiểm

soát tới hạn

Bộ sưu tập mẫu, chuẩn bị và vận chuyển (xem Chương 1.1.1 Thu thập và vận

chuyển mẫu vật chẩn đoán) và phương pháp chiết xuất axit nucleic (xem Chương

1.1.7 Công nghệ sinh học trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và phát triển

vắc-xin) là tất cả các thông số quan trọng trong hoạt động kiểm tra và nên được tối

ưu hóa để chẩn đoán bệnh. Phương pháp phù hợp khác nhau tùy thuộc vào mẫu và

loại sinh vật. Nói chung, huyết thanh, các mô cơ thể và các mẫu tăm bông là những

mẫu phù hợp cho khai thác dễ dàng của các axit mục tiêu nucleic, trong khi phân,

vật liệu và mẫu tinh dịch tự phân là khó khăn hơn để xử lý. Khai thác các mục tiêu

RNA khác từ khai thác của các mục tiêu DNA và RNA là dễ bị suy thoái. Cả hai

thương mại (robot, cột quay, nam châm nhổ, vv) và tiêu chuẩn hoá phương pháp

này được sử dụng để chiết xuất DNA hoặc RNA. Điều quan trọng là để xác định

phương pháp chiết xuất tái sản xuất và hiệu quả nhất trước khi tiếp tục xác nhận

khảo nghiệm được thực hiện. Nếu các phương pháp khai thác được thay đổi, dữ

liệu tương đương nên được tạo ra hoặc toàn bộ các thủ tục xác nhận cần phải được

lặp đi lặp lại.

Tất cả các thiết bị được sử dụng trong quá trình này phải được duy trì. Thiết bị

(khối sưởi, tủ lạnh, tủ đá, thermocyclers, ống hút, vv) yêu cầu hiệu chuẩn phải

được kiểm tra theo các giao thức đảm bảo chất lượng của phòng thí nghiệm. Nó

cũng quan trọng để xác nhận các thiết bị và giao thức sử dụng đúng cách. Một ví

dụ gần đây là việc thực hiện các phương pháp khai thác robot để chế biến chẩn

đoán thường qui. Nó không phải là

đủ để so sánh các đặc điểm của kỹ thuật này với các phương pháp khai thác sử

dụng trước đó. Các robot và các giao thức phải được xác nhận để xác nhận rằng

không có nguy cơ ô nhiễm chéo, ví dụ như bằng cách chạy một tập hợp các mẫu

hỗn hợp tích cực và tiêu cực.

Khi phát triển 'cổ điển' hoặc xét nghiệm PCR thời gian thực, tất cả các thông số,

các giao thức và các thuốc thử cần phải được tối ưu hóa. Một xét nghiệm tiêu

chuẩn hóa là một phương pháp mà luôn cho cùng một kết quả cho một mẫu nhất

định khi lặp đi lặp lại nhiều lần và khi được thực hiện bởi các nhà phân tích khác

nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau.

Trong quá trình tối ưu hóa của các xét nghiệm PCR, nó cũng có thể để đánh giá

năng lực của các phương pháp để không bị ảnh hưởng bởi những thay đổi nhỏ

trong các thông số chính. Để đạt được một xét nghiệm PCR tối ưu hóa, nó là điều

cần thiết để đánh giá các thông số quan trọng trong việc khảo nghiệm. Ví dụ về các

thông số đó bao gồm: thời gian ủ và nhiệt độ, nồng độ của bộ đệm, sơn lót, MgCl2,

vv, pH, số lượng của các thành phần khác được thêm vào (ví dụ dNTP, albumin

huyết thanh bò, vv ...). Các đặc tính của các thông số kiểm soát quan trọng là rất

quan trọng để xác định điểm quan trọng cần phải được kiểm soát trong khảo

nghiệm. Các biến thể có chủ ý các thông số có thể dẫn đến một biểu hiện mạnh mẽ

khảo nghiệm sơ bộ

E. KHẢO NGHIỆM xác nhận - PHẦN 2

Đặc tính hiệu suất (hoặc các thông số khảo nghiệm) cung cấp thông tin về một

chức năng như thế nào phương pháp theo quy định điều kiện. Một số đặc điểm

thực hiện điển hình được đưa ra trong Chương 1.1.4.

Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp PCR để

chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

1. Xác định đặc tính hoạt động khảo nghiệm

a) quần thể động vật tham khảo

i) động vật tham khảo tiêu cực

Mẫu âm đúng, mẫu tức là từ động vật chưa từng có tiếp xúc có thể đến các đại lý,

đôi khi có thể khó khăn để có được. Thường thì nó có thể để thu thập mẫu từ các

quốc gia có loại trừ bệnh trong câu hỏi. Điều quan trọng là các mẫu âm tính thu

được là đại diện của các mẫu sẽ được phân tích, ví dụ như loài, tuổi, giới tính,

giống, vv

ii) Tích cực tham chiếu động vật

Nói chung đây là vấn đề để tìm các động vật tham khảo tích cực với số lượng đủ.

Nhiễm tự nhiên hoặc động vật thí nghiệm bị nhiễm là cần thiết và tích cực tình

trạng của họ được chứng minh bằng phân lập của các đại lý. Trước khi sử dụng

động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh, xin vui lòng xem Chương 1.1.4.

iii) tình trạng tham khảo động vật được xác định bởi các xét nghiệm khác. Thuật

ngữ "tiêu chuẩn vàng" thường được dùng để mô tả bất kỳ tiêu chuẩn so sánh và cần

được giới hạn các phương pháp một cách rõ ràng phân loại động vật bị nhiễm bệnh

hoặc không bị nhiễm bệnh. PCR xét nghiệm dự kiến sẽ tốt hơn bất kỳ phương pháp

đã có tiêu chuẩn vàng và do đó thành lập 'Tiêu chuẩn vàng' có thể không phù hợp

để sử dụng như một sự so sánh. Điều này đặc biệt đúng khi chứng minh rằng một

con vật tham khảo tiêu cực thực sự là tiêu cực. Xác nhận của các xét nghiệm phân

tử bằng cách so sánh chúng vào một.Thử nghiệm "tiêu chuẩn vàng" có thể được

phức tạp bằng PCR là nhạy cảm hơn, kết quả rõ rang giảm đặc hiệu. Đến một mức

độ này có thể được giải quyết bằng cách đánh giá mẫu nguồn gốc, lịch sử lâm sang

và trình tự bất kỳ sản phẩm PCR để xác nhận danh tính.

2. Threshold xác định chẩn đoán nhạy cảm (DSE, tỷ trọng của các loài động vật

tham khảo nổi tiếng bị nhiễm xét nghiệm dương tính của xét nghiệm) và đặc hiệu

(DSP, tỷ trọng của các loài động vật tham khảo nổi tiếng không bị nhiễm xét

nghiệm âm tính của xét nghiệm). Số lượng mẫu tài liệu tham khảo cần thiết để xác

định dự toán và các lỗi cho phép của cả hai DSE và DSP có thể được tính toán. Để

làm điều này, một dự đoán hợp lý của cả hai DSE và DSP phải được sử dụng. Nói

chung, sự tự tin trong dự toán đặt ở 95%. Tuy nhiên, không có công thức có thể tài

khoản cho các máy chủ / sinh vật rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả các

kiểm tra. Số lượng các mẫu để xác định ước tính của DSE và DSP được nêu trong

Chương 1.1.4. Đối với một bệnh đó không phải là đặc hữu và lan rộng, nó có thể

khó khăn ban đầu để có được số lượng mẫu để đạt được một thỏa đáng tin cậy,

nhưng qua thời gian, dồn tích của các dữ liệu bổ sung sẽ tăng cường sự tự tin trong

ngưỡng. Việc sử dụng mẫu đinh trong phản ứng PCR là một phương sách cuối

cùng bởi vì các mẫu như vậy có thể không được đại diện một cách tự nhiên bị

nhiễm mẫu. Nếu mẫu từ động vật nhiễm tự nhiên không có sẵn, nhiễm trùng gây ra

bởi có nghĩa là nhiễm trùng bắt chước tự nhiên có thể cung cấp các mẫu hữu ích.

Một ví dụ là tick-borne nhiễm trùng gây ra bởi tiếp xúc với bọ ve bị nhiễm bệnh.

Nó không phải là luôn luôn có thể để phù hợp với hướng dẫn gợi ý (ví dụ như OIE

khuyến nghị về kiểm tra xác nhận). Đối mặt với số lượng thấp của các mẫu cho bài

kiểm tra đánh giá, hoặc cho các bài kiểm tra không có tiêu chuẩn vàng, một trong

những phương pháp tiếp cận là để giới thiệu xét nghiệm phân tử như một phần xác

nhận 'và sau đó thêm dữ liệu xác nhận nếu số lượng đáng kể các mẫu lâm sang thử

nghiệm. Trong hệ thống này, số ca được xác nhận bằng các phương tiện khác,

chẳng hạn như sự cô lập của các tác nhân gây bệnh trong câu hỏi hoặc trình tự, và

một mẫu của âm cũng được xác nhận là phù hợp (không ức chế) cho PCR thử

nghiệm bằng cách sử dụng kiểm soát gen. Nguyên tắc này xác nhận trên cho phép

nhanh chóng giới thiệu thử nghiệm mới và làm giảm chi phíxác nhận. Quá trình

này phải được sử dụng theo các điều kiện quy định. Nó chỉ được áp dụng khi

không có âm thanh bằng chứngthử nghiệm một phạm vi thích hợp của các nền văn

hóa biết, mẫu gai (để cung cấp dữ liệu phân tích) và một số lâm sang

F. KHẢO NGHIỆM xác nhận - Phần 3

1. Xây dựng khả năng tái của khảo nghiệm

2. Độ lặp lại là một tham số quan trọng trong khảo nghiệm chính xác. Độ lặp

lại được xác định trong một số phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng khảo

nghiệm giống hệt nhau (giao thức, chất phản ứng và điều khiển). Mỗi phòng

trong ít nhất ba phòng thí nghiệm kiểm tra cùng một bảng điều khiển mẫu

(tối thiểu là 20 mẫu), với phần phân ước giống hệt nhau đi đến phòng thí

nghiệm từng. Nỗ lực này sẽ mang lạ ước tính về độ chắc chắn khảo nghiệm.

Dự toán lặp lại để khảo nghiệm là rất cần thiết trước khi nó có thể được coi

là hợp lệ cho việc triển khai cho các phòng thí nghiệm khác.Hiện nay, khả

năng lặp lại hiếm khi hoàn toàn đánh giá trong phòng thí nghiệm thú y chẩn

đoán thực hiện PCR xét nghiệm. Theo truyền thống, nhiều phòng thí nghiệm

đã được sử dụng thử nghiệm phát triển trong nhà, có lẽ vì lý do thực

tế.Chương 1.1.5. - Xác nhận và kiểm soát chất lượng của các phương pháp

PCR để chẩn đoán bệnh truyền nhiễmKhi có thể, công bố phương pháp tiêu

chuẩn và xác nhận, đặc biệt là các phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE,

ECRLshoặc phòng thí nghiệm quốc gia, cần được theo sau. Ngoài ra quá

trình liên phòng thí nghiệm xác nhận nên được thực ra ngoài. Công việc này

sẽ giúp chuẩn hóa xét nghiệm, cho phép hài hoà hoạt động chẩn đoán ở các

quốc gia khác nhau.

G. KHẢO NGHIỆM xác nhận - PHẦN 4

1. Chương trình thực hiện

Tham khảo các phòng thí nghiệm đóng một vai trò quan trọng trong việc thực hiện

mới hoặc xác nhận xét nghiệm phân tử hiện có. OIE Phòng thí nghiệm tham chiếu

ECRLs và các phòng thí nghiệm quốc gia được khuyến khích để hỗ trợ trong việc

thực hiện các hứa hẹn xét nghiệm mới cho căn bệnh mà họ quan tâm. Một ví dụ là

sự hỗ trợ được cung cấp bởi OIE và CDRL để thực hiện các chẩn đoán phân tử

cúm gia cầm ở châu Âu.

2. Giám sát hiệu lực thực hiện khảo nghiệm

a) Giải thích kết quả kiểm tra các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực khảo nghiệm Một

yếu tố chính ảnh hưởng đến giải thích các kết quả thử nghiệm là sự phổ biến của

các chất phân tích trong mục tiêu dân số. Một xét nghiệm PCR chính xác cao và

chính xác, với ước tính của DSE và DSP tiếp cận 99%, vẫn có thể cung cấp kết

luận sai (xem Chương 1.1.4). Đối với các xét nghiệm acid nucleic, kết quả dương

tính giả quan tâm đặc biệt trong các quần thể có tỉ lệ thấp. Trong trường hợp này,

nó có thể là cần thiết để xác nhận PCR dương tính kết quả phân tích trình tự của

sản phẩm khuếch đại để hỗ trợ sửa lỗi do không đặc hiệu mục tiêu hoặc ràng buộc

mồi.

b) Duy trì các tiêu chí xác nhận

Khi khảo nghiệm được sử dụng như một bài kiểm tra thường xuyên, nó là quan

trọng để duy trì QC nội bộ. Khảo nghiệm cần phải được luôn theo dõi để lặp lại và

độ chính xác. Độ lặp lại giữa phòng thí nghiệm (trình độ thử nghiệm) là khuyến

cáo của OIE được hoàn thành ít nhất hai lần một năm (16). Thử nghiệm này

thường là quản lý bởi một phòng thí nghiệm tham chiếu phân phối tấm mẫu, nhận

được kết quả từ các phòng thí nghiệm, phân tích dữ liệu, và báo cáo kết quả lại cho

các phòng thí nghiệm. Nếu khảo nghiệm được áp dụng trong một vùng địa lý và /

hoặc dân số, nó có thể là cần thiết để hợp lệ lại hoặc tài liệu tương đương theo các

điều kiện mới. Tái xác nhận giá trị sử dụng hoặc tương đương nên được xác định,

nếu thử nghiệm áp dụng đối với một ma trận mẫu khác nhau, ví dụ như xác nhận

trên máu và được sử dụng trên mô khác, hoặc xác nhận cho gia súc mô và được sử

dụng trên một loài khác. Giao thức khai thác khác nhau có thể là cần thiết nếu một

loài khác hay mô được kiểm tra, có thể chứa các yếu tố ức chế khác nhau. Điều này

đặc biệt đúng đối với PCR xét nghiệm vì nó rất phổ biến cho các đột biến điểm xảy

ra nhiều tại các đại lý truyền nhiễm (tức là RNA virus).Đột biến, có thể xảy ra

trong lớp sơn lót hoặc các trang web thăm dò, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của

các khảo nghiệm, làm như vậy, các tiêu chí thực hiện được thành lập không còn giá

trị. Nó cũng khuyến khích thường xuyên xác nhận trình tự mục tiêu tại các vùng

gien được lựa chọn cho phân lập quốc gia hoặc khu vực của các tác nhân gây bệnh.

Điều này đặc biệt đúng đối với các trang web mồi, để đảm bảo rằng họ vẫn ổn định

để xác nhận.khảo nghiệm có thể không được đặt câu hỏi. Xác nhận và dự toán

mạnh mẽ có thể cần phải được lặp đi lặp lại khi các kiểm tra được chuyển từ phòng

thí nghiệm phát triển cho lĩnh vực này là các điều kiện có thể ít hơn tối ưu và nhân

viên ít kinh nghiệm.