受容体の活性化

ligand の結合

シグナル伝達因子の活性化

核内にシグナルが伝達

特別な遺伝子の発現

特異的なシグナル伝達因子の活性化

リン酸化酵素が特異的なタンパク質をリン酸化する。

G-タンパク質がGDPを遊離し、GTPを結合。

特異的なタンパク質どうしが結合

細胞の増殖

活性化★

核

細胞膜

ligandreceptor

リン酸化活性化

活性化

活性化

受容体に結合

細胞内シグナル伝達因子

核に移行

特異的な遺伝子の発現

細胞膜

細胞内シグナル伝達

signaling cascade因子が活性化し、それが次の因子を次々に活性化すること

細胞の分子生物学第１５章　Fig.15-16

活性化

細胞が応答　増殖開始、または分化誘導

シグナルが増幅する

どの遺伝子の組み合わせが発現するかで細胞がどのように応答するか（増殖するか、どのように分化するか）が決まる。

不活性化

ATP

リン酸化反応のカスケード

Molecular Switch 分子スイッチ

P

脱リン酸化

活性型不活性型

GDP

GTPGDP

GTP

PiGTP加水分解

活性型不活性型

チロシン残基のリン酸化セリン・スレオニン残基のリン酸化

GTP 結合型

small G proteins Ras

MAP Kinase

細胞の分子生物学15章 Fig.15-17

分子細胞生物学20章 Fig.20-5

Src KinaseATP

リン酸化

GDP 結合型

リン酸化型

GAP

GEF

GTPase activating protein

Guanine nucleotide exchange factor

Kinase （リン酸化酵素）

リン酸化

ligandreceptor

受容体に結合

細胞膜

活性化

不活性化

ATP

Tyr残基がリン酸化したタンパク質に結合活性化

反応★

酵素と結合していて、酵素を伴って結合

ligandreceptor

受容体に結合

活性化ATP ★

リン酸化したタンパク質に結合

反応

SH2 ドメイン

SH3 ドメインproline の多い部分に常に結合

Pro

SH3

SH2

SH2

特異的なタンパク質の結合

SH3

Pro

タンパク質の特異的結合細胞内シグナル伝達タンパク質は特異的な複合体を形成

Src homology 2 domain SH2 domainリン酸化チロシンに結合

Src homology 3 domain SH3 domainプロリンが多くつらなった部分に結合(proline-rich domain)

Src kinase

SH3

SH2kinase domain

Phospho-Tyrosine

SH2 domain

細胞の分子生物学15章 Fig.15-20, 15-53

分子細胞生物学20章 Fig.20-26, 27

SH3 SH2kinase domainSH1

Rouse Sarcoma virus のがん遺伝子

Pro

SH3

トリ肉腫ウイルス

Rous Sarcoma virus の原

因遺伝子v-src として発見

正常な細胞も、v-src ほとん

ど同じ遺伝子を持つ。　c-src

SH2リン酸化Tyr

Proが多い部分

リン酸化チロシン

リン酸化チロシン残基に結合

receptor

リン酸化酵素

SH3はProが多いところに結合

Ligand

P P

２量体化 互いの部位を自己リン酸化チロシンリン酸化酵素部位

autophosphorylation

Growth Factor が受容体に結合すると細胞内では何が起こり、細胞は増殖を始めるのか？

細胞が増殖

核内にシグナルが伝達し、特定の遺伝子の発現が起こる

細胞膜での反応がどの様にして核のなかにとどくか？

Growth Factorreceptor tyrosine kinase (RTK) 細胞膜

特に、増殖因子受容体はチロシンリン酸化酵素として作用する。

DNA合成酵素などが作られるDNA合成、細胞分裂

human bladder cancer膀胱ガン

DNAを抽出

DNAを抽出

再び3T3細胞に導入

腫瘍状の細胞のかたまりが形成

正常細胞は平面状にしか成育しない

再び腫瘍状の細胞のかたまりが形成

DNAを抽出

phage vector に cloning

human DNA には約300baseの特徴的な繰り返し配列（Alu sequence）がある。Alu sequence を含む断片がhuman由来のDNA断片

mouse 3T3 cells

がん遺伝子は、変異型 ras 遺伝子

活性型Rasは細胞を増殖させる

Gly12->Val

Alu配列をもつDNA

human 由来

Ras functions downstream of Receptor Tyrosine Kinase (PDGF receptor).

signal

細胞増殖 シグナル伝達を阻害

抗Ras抗体を細胞にミクロインジェクション

Ras

増殖を阻害

Ras

活性型変異のRasをミクロインジェクション

活性型RasRasに対する抗体

signal

PDGF を加えなくても細胞増殖

PDGF

PDGF

PDGF が受容体に結合すると、細胞内で不活性型Rasが活性型Ｒasに変換する。　　　 =>　　　これにより、細胞が増殖する。活性型変異（GTPを分解しない）Rasは細胞をがん化させる。

receptor

分子細胞生物学20章 20.4

Ras は 受容体チロシンキナーゼの下流で働いている。

microinjection

GDP

GTP

GDP

GTP

GEFGAP

Pi

活性型 Ras

不活性型 Ras

Guanine Nucleotide-Exchange Factor

GTPase

activating

protein

Ras の活性化には、専用の酵素 GEF が必要細胞の分子生物学15章 Fig.15-54

分子細胞生物学20章 Fig.20-22

PDGF が受容体に結合すると、 =>　　細胞内で　GEF が不活性型Rasに作用する様になり、 =>　　活性型Rasに変換する。 =>　　　これにより、細胞が増殖する。

GTPの加水分解

受容体の活性化

細胞の増殖

Ras専用のGEF

(SOS)

P P

２量体化 互いの部位を自己リン酸化チロシンリン酸化酵素部位

Growth Factor が受容体に結合する

細胞が増殖

核内にシグナルが伝達し、特定の遺伝子の発現が起こる

細胞膜での反応がどの様にして核の中にとどくか？

Growth Factor

receptor tyrosine kinase (RTK)

細胞膜

増殖因子受容体はチロシンリン酸化酵素として作用する。

DNA合成酵素などが作られるDNA合成、細胞分裂

RasGDP

RasGTP

活性型

核

複眼約800の目の集まり。　それぞれを　ommatidia

　単眼 (ommatidium)

それぞれの ommatidium は、　　22個の細胞からできている。

22個の細胞の　8個が、　photo-sensitive neuron =

retinulaR cells, R1, R2, - - - , R8

R7 cell 紫外線を検出する神経

Drosophila melanogaster ショウジョウバエの複眼の変異

分子細胞生物学　Fig.20-24遺伝学的解析増殖因子　受容体

リン酸化

アダプター分子の結合

Rasの活性化

リン酸化酵素の活性化

転写因子の活性化

遺伝子発現

細胞増殖

細胞膜

核

Ｇタンパク質

細胞質

retinula R cells, R1, R2, - - - , R8

R7 cell 紫外線を検出する神経

分子細胞生物学　Fig.20-24

2525

34 2534

16

R8 cell

2534

16ハエの遺伝子に変異を導入し紫外線が見えない変異型のハエを単離　　⇒　　R7 細胞が欠損

R7 細胞の欠損sevenless 変異

R2, R5 が生成

次にR3, R4

が生成

R1, R6が生成 最後に R7 細胞が生成

正常なショウジョウバエでの視神経の形成

ひとつ目のphoto-sensitive

neuron

retinula 単眼　ommatidium

紫外線に反応しないハエ　ーーーー＞　　R7 細胞が欠損

⇒　遺伝子をクローン化　⇒　どのタンパク質の遺伝子の欠損か？

8

2534

167

8

8

Drosophila melanogaster

複眼

ひとつ目のphoto-sensitive neuron

retinula

ショウジョウバエ

野生型の複眼のphotoreceptor sevenless 変異の複眼のphotoreceptorＲ７細胞が形成されていない

R7 細胞の欠損

Sevenless 変異 紫外線に反応しないハエの変異遺伝子のクローニング　=> sevenless遺伝子産物のアミノ酸配列を推定 Receptor Tyrosine Kinase （膜貫通型タンパク質・受容体　　　　細胞質がわにタンパク質のチロシン残基をリン酸化するドメインを有する）

R7 細胞表面に発現動物の増殖因子受容体に類似した構造

チロシンリン酸化部位

リガンド結合部位

R7 前駆細胞

sevenless タンパク質 (Sev)他の　紫外線に非感受性変異

bride of sevenless (boss)Boss タンパク質は R8 細胞表面に発現Sevenless (Sev) のリガンドとして作用R7 前駆細胞上の Sev に結合するとR7 細胞内にシグナルを送り、成熟R7細胞ができる。

R8 細胞

Boss タンパク質

p

分子細胞生物学20章 Fig.20-24, 25

紫外線に反応しないハエは、R7細胞の形成に異常がある。

p

成熟Ｒ７細胞（光感受性神経細胞 retinula ）

その他の変異から同定された、Boss-Sev のシグナル伝達経路のタンパク質

Drosophila Ras 哺乳類のRas とアミノ酸配列が約80％同一

Guaninenucleotide exchange factor

son of sevenless (SOS) 哺乳類の SOS と 約４５％同一

SH2 ドメインをもつ、アダプタータンパク質downstream of receptor kinase (Drk)

Sem-5 like protein (C. elegance 線虫)

哺乳類　Grb2 タンパク質と約64％同一

GTPase activating protein (GAP) の変異 Ras が常に活性化Sev 変異でも、　R7 細胞ができる。（紫外線に応答する）

R8 cell

BOSS

Grb2 (Drk)

SOSSH2SH3

Pro

SOS

sevenless

リン酸化

BOSS

Grb2 のSH2ドメインがリン酸化した受容体に結合Grb2 のSH3ドメインに結合していたSOSが細胞膜内側に引き寄せられる。（SOSにはGEF作用がある）SOSが細胞膜に結合した不活性型RasをGTP結合型Rasに変換　活性化

受容体

細胞質中のGrb2-SOS複合体

R7 前駆細胞

R7 細胞が生成する

SOSはRasに対してGTPを解離しGTP

を結合させる作用がある。（GEF活性）

不活性型Ras 活性型Ras

adaptor proteins

他のタンパク質と特異的に結合するドメインを持つ。SH2, PTB, SH3

酵素活性を持たない。

外部からの刺激依存に、特異的なタンパク質と結合し、複合体を形成。

発がん遺伝子ともなりうる。 Crk chicken fibrosarcoma

Grb2

SH2 domain リン酸化Tyrに結合

SH3 domain Pro rich 領域に結合

PR Proline-rich Proを多く含む

P P

P P

２量体化互いの部位を自己リン酸化チロシンリン酸化酵素部位

P P

P P

adaptor protein

Grb2

Guanine nucleotide exchange protein

SOS

SH2SH3

SOS

GDP GTP

SOS 受容体に結合することにより、Ras が存在する膜近傍に移動

膜の内側にある不活性型 Ras 活性型 Ras

Ras を活性化GDPを解離させGTPを結合させる

Ras の活性化

細胞の分子生物学15章 Fig.15-55

分子細胞生物学20章 Fig.20-23

SH2 ドメイン

Grb2

SH3 ドメイン細胞質のGrb2-SOS複合体

Growth Factor によるシグナル伝達でしばしば見られる

receptor tyrosine kinase

EGF, PDGF, insulin など

SOSが細胞膜の内側に引き寄せられる

GTP

活性型 Ras

不活性型 Raf

膜結合型（活性型）Raf　　　（MAPKKをリン酸化する）

P

P

活性型

MAP kinase kinase (MAPKK),(MEK)　　　MAPKをリン酸化

不活性型 MAP kinase kinase

不活性型 MAP kinase

活性型 MAP kinase(MAPK)

MAP kinase 動物Mitogen-Activated Protein Kinase 　の活性化

細胞の分子生物学第４版 Fig.15-56

分子細胞生物学　第４版　20.5章

P PP

種々のタンパク質をリン酸化

他の kinase 細胞骨格タンパク質

転写因子Elk-1SRF

RNA合成酵素

Fos 遺伝子の発現immediate early genes

GDP

不活性型 Ras

Raf

Rafは膜上で活性型Rasと結合すると活性化する

RasはGTPを結合するとRaf

と結合できる様になる。

DNA合成を開始させる酵素の遺伝子を発現

リン酸化のカスケード

Cytokine

受容体が活性化すると、リン酸化反応がおこり、　細胞内でシグナル伝達因子が結合する

特異的複合体の形成

シグナルを伝達受容体複合体形成

シグナル伝達因子

P

SH2 ドメインSH3 ドメインPTB ドメイン

受容体が２量体を形成

　自己リン酸化

P P

P

P遺伝子発現

JakによるSTATの活性化

P遺伝子発現

転写因子のリン酸化、活性化

Ras - MAP Kinase 経路 の活性化

核内へ移行

受容体

Cytokineシグナル伝達経路の活性化

細胞の増殖・分化

STAT

Jak-STAT 経路Ras - MAP Kinase 経路

受容体のニ量体化

Jak Jak kinase

P P

P Pkinaseドメイン

受容体Tyrosine kinase

growth factor (PDGF etc.)

(G-CSF, EPO, IL-3, IFN, etc.)

cytokine 受容体は　それ自体、酵素として働かないが、細胞質側で、チロシンリン酸化酵素、Jak　をいつも結合している。

Grb2 SOS Ras Raf MAPKK MAPK

STAT

Virus

感染

interferon を分泌

Interferon ( IFN )　　　タンパク質（サイトカイン）

interferon

他の細胞に作用し　抗Virusタンパク質を生成

Virusに耐性となる

細胞によりinterferonの種類が異なる。

interferon α

interferon β

interferon γ

Hepatitis B Ｂ型肝炎ウイルスHepatitis C Ｃ型肝炎ウイルス

papilloma virus, HIV (AIDS),

rhinovirus などにも有効

Jak-STATのシグナル伝達

Jak-STAT signaling pathway Jim Darnell

ISRE

遺伝子発現RNA合成酵素

General Transcription Factors

Interferon-Stimulated Response Element AGTTTCNNTTTCNC/T

Interferon α/β

(Type I Interferon)ウイルスに感染した細胞が放出するサイトカイン他の細胞に作用し、ウイルス抵抗性のタンパク質をつくらせる。

ISGF3

Interferon-stimulated

gene factor 3

(ISGF3)

１．Interferon により発現する遺伝子をクローン化２．その遺伝子の promoter 領域を解析。

cis-element (ISRE) を同定３．ISRE に結合する核タンパク質（転写因子）をカラムを用いて、生化学的に精製。　ISGF3

４．ISGF3 のアミノ酸配列を決める。５．アミノ酸配列をもとに、その遺伝子をクローン化。

ISGF3 STAT1, STAT2, IRF9 の複合体

Interferon 受容体

抗 virus 作用のタンパク質の遺伝子

(p48)

細胞の分子生物学15章 Fig.15-63

分子細胞生物学 Fig.10-68

細胞膜

De novo and salvage pathways for nucleotde synthesis

5-phosphoribosyl -1-pyrophosphate (PRPP)

IMP AMPGMP

Guanine HypoxantinePRPP PRPP

HGPRT

HGPRT : Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase

dATPdGTP XMP

HGPRT

Xanthine動物にはこの経路はない

⇄ ⇄ ⇄ ⇄ ⇄

aminopterinHAT medium

DNA

6-thioguanine は　HGPRT　で毒性の化合物となるHGPRT欠損細胞は　6-thioguanine耐性株として単離できる。HGPRT欠損細胞はHAT mediumでは飼育できない。

De novo pathways

Salvage

pathways

cis-element ISRE に gpt 遺伝子を結合IFN　により、GPTが発現し、細胞が死ぬ

ISRE

gpt

GPT

毒

IFN

GPT: Guanine Phosphoribosyl Transferase6-thioguanine存在下、毒性を示す。

ISRE

gpt

GPTは発現せず

IFN

IFNを加えても生き残る細胞を単離。シグナルを伝達するタンパク質の遺伝子の変異が予想される。

シグナル伝達経路のタンパク質の変異株の単離　　　George Stark の実験Somatic Cell Genetics

6-thioguanine存在下細胞は生き残る

細胞を変異原物質で処理変異株を単離

変異した遺伝子を解析

どの遺伝子産物がシグナル伝達に関与しているかがわかる。

細菌のGPT遺伝子

6-thioguanine存在下

シグナル伝達因子

インターフェロン応答性動物細胞受容体

HGPRT - 株

P P

PP

細胞株 遺伝子U1 Tyk2U2 p48U3 STAT1U4 Jak1 IFN α/β signaling pathwayU5 ?U6 STAT2

γ1 Jak2 IFN γ signaling pathwayγ2 ?

George Stark の単離した細胞株

STAT2STAT1

p48

ISGF3

STAT1 STAT1

IFNγ 受容体IFNα/β 受容体

遺伝子発現 遺伝子発現

GASISRE

Jak1 Tyk2 kinaseJak1 Jak2 kinase

6-thioguanine 存在下　Interferon

　を加えても生き残る細胞株

DNA

JAK family kinase: Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2　　受容体にIFNが結合すると活性化する。

STAT family: Signal Transducer and Activator of Transcription STAT1. STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6

Jakによりリン酸化するとニ量体化し、核内に移行しDNAに結合　ー＞　遺伝子発現を誘導

IFN α/β signaling pathway IFN γ signaling pathway

Jak kinase によるSTAT のチロシン残基のリン酸化

受容体の２量体化

Jakの活性化

核への移行

遺伝子発現

どの遺伝子（の組み合わせ）が発現するかで、細胞がどのように変化して行くかが決まる。

細胞の分子生物学15章Fig.15-63

分子細胞生物学

Fig.10-68

Tyk2Jak2

Jak1Jak1

STAT1STAT2

P

Pリン酸化酵素の活性化

P遺伝子発現

転写因子のリン酸化、活性化

受容体のニ量体化Cytokine

シグナル伝達経路が常に活性化すると細胞はがん化する

細胞の増殖がん化

シグナル伝達因子の活性化

シグナル伝達因子が常に活性化しているとサイトカインの刺激なしに常に細胞が増殖し続ける。　⇒　細胞のがん化

Bcr-Abl リン酸化酵素 Abl が常に活性化しているPhiladelphia chromosome

abl gene is on Chromosome 9

bcr gene is on Chromosome 22

Ras (G12V) Gly12 が Val に置換。GTPを加水分解しにくい。常にGTP結合型（活性型）

分子細胞生物学24章 24.2

細胞の分子生物学２３章proto-oncogene

cytokine 不在でもP