ExpoCiencias Nacional 2011

México, Distrito Federal

Diseño de un biorreactor de inmersión temporal para la

micropropagación de Aztekium hintonii

Alan de Jesús Juárez Gómez

Enrique Joel Manjarrez Rodríguez

Héctor Alan Barrón León

Área: Medio ambiente

Categoría: Superior

Irapuato, Guanajuato, a 6 de octubre de 2011.

Sumario

Aztekium hintonii es una especie endémica en peligro de extinción con propiedades medicinales y atractiva para los cactófilos. El objetivo del proyecto es micropropagar la especie Aztekium hintonii a través del diseño y construcción de un biorreactor de inmersión temporal para repoblar y conservar su hábitat natural. Utilizar un biorreactor de Inmersión Temporal ofrece las ventajas de ser una tecnología importante en la reducción de la mano de obra y tiempo, en ofrecer bajos costos de producción, automatización del proceso, permite controlar las condiciones de operación todo esto en comparación con el cultivo in vitro en medio solido y con biorreactores comerciales. Con los biorreactores diseñados en el presente proyecto se obtuvo en un lote una producción de biomasa del 73 % mayor comparado con el medio sólido. Además de tener la eficiencia de reactores comerciales, se logró construir dos prototipos de menor costo y con más aplicaciones en distintas aéreas científicas, dando soluciones a varias problemáticas sin descuidar el objetivo principal del proyecto. Basados en los resultados obtenidos, se concluye que el biorreactor de inmersión temporal diseñado es una solución biotecnológica para micropropagar de forma masiva el cactus Aztekium hintonii.

1. Introducción

Aztekium hintonii pertenece a la familia cactaceae, se desarrollan en regiones nativas áridas y semiáridas donde las condiciones de alta temperatura y falta de agua son criticas. Tienen presencia de espinas, ausencia de hojas y son plantas suculentas. Esta especie es endémica del estado de Nuevo Leon y fue descubierta en 1992 (Glass & W. A. Fitz Maurice 1992), por lo que no habita en ningún otro lugar del mundo. Esta especie tiene importancia medicinal y es muy buscado por coleccionistas nacionales y extranjeros, de modo que las extraen de su hábitat natural causando que esté en peligro de extinción.

Figura 1. Aztekium hintonii (Johansson C. 2007)

La micropropagación con medio solido es una técnica biotecnológica de cultivo in vitro aplicada a la propagación vegetativa de plantas, con ventajas como tasas de crecimiento mayores que en condiciones naturales lo que permite obtener una gran cantidad de plantas en corto tiempo, la superficie necesaria para mantener gran cantidad de plantas es pequeña, la obtención de plantas libres de bacterias, hongos y virus, la posibilidad de producir plantas durante todo el año. No obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones ya que requiere gran cantidad de pequeños recipientes de cultivo, mano de obra calificada, una escasa posibilidad de automatización, la eficiencia de propagación es limitada y son altos los costos de producción.

Figura 2. Cultivo in vitro de A. hintonii en medio solido.

Un biorreactor es un sistema de cultivo dentro de un recipiente cuya función principal es proporcionar un ambiente controlado que permita alcanzar las condiciones óptimas para la micropropagación.

Figura 3. Reactor de Inmersión Temporal comercial (RITA

TM).

La Inmersión Temporal es un método que consiste en humedecer de manera intermitente y por un corto periodo de tiempo el tejido de una planta con medio líquido seguido por el secado por gravedad, todo esto ocurre dentro de un biorreactor.

Utilizar un biorreactor de Inmersión Temporal es la mejor alternativa para la solución de los problemas del cultivo in vitro en medio solido, debido a que ofrece las ventajas de ser una tecnología importante en el incremento considerable de la velocidad de producción de biomasa en los explantes cultivados, reducción de la mano de obra, ofrece bajos costos de producción, automatización del proceso, permite controlar las condiciones de operación y es suficiente para el establecimiento de un sistema práctico para la propagación masiva de Aztekium hintonii. Todas las

ventajas mencionadas se deben principalmente a que se maximiza el área de contacto del medio de cultivo con el explante, ya que se sumerge completo en el medio líquido.

Figura 4. Funcionamiento de un Biorreactor de Inmersión Temporal (Dupta, Ibaraki, 2006).

Existen biorreactores comerciales que permiten micropropagar plantas y tienen una gran aplicación en la biotecnología, dichos reactores se venden solo en el extranjero con un alto costo, además estos prototipos son desechables.

2. Problema

Actualmente en México existe una gran cantidad de cactáceas en peligro de extinción, entre ellas se encuentra la especie Aztekium hintonii, esta sufre sobreexplotación debido a que se utiliza de ornamento y de compuesto para fármacos, además esta presenta poca viabilidad de sus semillas y una lenta velocidad de

crecimiento tomando 4 años en crecer hasta 5 mm (Heller, 1965), es por esta razón que se deben aplicar técnicas biotecnológicas para lograr el rescate y conservación de la especie Aztekium hintonii dichas técnicas han permitido establecer un avance significativo de producción a nivel laboratorio en cuanto a la micropropagación de plantas, pero a pesar de sus ventajas este sistema presenta una gran limitante: el elevado costo por planta y esto se debe a que las etapas de producción se realizan de forma manual, por lo que esta técnica se aplica sólo en especies que tienen un alto valor económico.

Existe también la problemática de diseñar y construir un biorreactor de inmersión temporal que sea de bajo costo y con igual o mejor eficiencia que los prototipos comerciales. Adquirirlos en el mercado extranjero y su alto precio son motivos por los que no se ha implementado esta tecnología en países en vías de desarrollo.

De aquí la importancia de identificar y desarrollar nuevas tecnologías que permitan reducir los costos y aún más los tiempos de producción de las plantas.

3. Objetivos.

Micropropagar la especie Aztekium hintonii a través del diseño y construcción de un biorreactor de inmersión temporal para repoblar y conservar su hábitat natural.

3.1 Objetivos específicos.

3.1.1 Diseñar y construir un biorreactor inmersión temporal de bajo costo y alta eficiencia.

3.1.2 Encontrar las condiciones de operación óptimas en el biorreactor para obtener un proceso eficiente.

3.1.3 Aclimatación de los explantes de Aztekium hintonii en invernadero.

3.1.4 Diseñar e implementar la automatización del biorreactor.

4. Hipótesis

La velocidad de crecimiento del Aztekium hintonii es mayor en un biorreactor de inmersión temporal en comparación con la micropropagación convencional in vitro, lo que permitirá salvar y conservar la especie a través de un proceso eficaz y rentable.

5. Justificación del proyecto

Utilizar la tecnología de los Biorreactores de Inmersión Temporal para micropropagar la especie A. hintonii ofrece las siguientes ventajas en comparación con el cultivo in vitro:

Costos.- el consumo del sustrato es de manera eficiente ya que proporciona una mayor área de contacto con el explante reduciendo el costo por planta. El diseño y construcción de un biorreactor propio implica una menor inversión comparada con prototipos comerciales que son desechables y de alto costo.

Tiempo.- la velocidad de crecimiento es mayor, por lo tanto se obtiene explantes de igual tamaño en menor tiempo.

Automatización.- reduce la mano de obra empleada en el proceso lo cual repercute en costos de operación. También permite que el proyecto sea reproducible debido a que el control del proceso esta supervisado por computadora y es

autónomo la mayor parte del tiempo.

Control de los parámetros de operación.- permite que la micropropagación sea más eficiente ya que se proporcionan las condiciones óptimas para el desarrollo de los explantes. También se pueden controlar algunas variables del proceso como el tiempo de inmersión y la frecuencia, el fotoperiodo y el flujo de CO2.

Escalamiento.- el trabajar con medio líquido permite micropropagar muchas plantas en un mismo espacio, por lo tanto aumentar el volumen de operación permitirá producir más explantes.

Mejoramiento del porcentaje de enraizamiento y sobrevivencia en la etapa de aclimatación.- el reactor permite cambiar y/o renovar la atmosfera interna cambiando los contenidos de O2 y CO2, lo cual repercute en el aspecto del desarrollo de la planta dando una preaclimatación.

La conjunción de todos los aspectos que abarca el presente proyecto nos permite alcanzar nuestro objetivo principal de salvar y repoblar el hábitat natural de la especie A. hintonii, pero también aporta soluciones a problemáticas en varios ámbitos científicos y mejora las técnicas y reactores ya existentes.

Todas las ventajas antes mencionadas son aprovechadas para diseñar un biorreactor que nos permita lograr nuestro objetivo, haciendo de éste un proyecto eficaz, rentable y con una recuperación de la inversión en poco tiempo.

6. Metodología

6.1 Proceso de micropropagación de Aztekium hintonii

6.1.1 Desinfección de semillas

Se utilizó un protocolo de desinfección para las semillas de A. hintonii que consiste en exponer a las semillas a varios lavados con alcohol 70%, Hipoclorito de sodio y Tween 20, seguido de enjuagues con agua destilada estéril.

6.1.2 Cultivo in vitro de Aztekium hintonii

Se colocaron 10 semillas por cada frasco con 20 mL de medio MS sólido sin hormonas para lograr la producción de brotes, todo esto se realizó bajo condiciones asépticas. Posteriormente, se traspasaron los brotes a medio MS sólido suplementado con fitohormonas ANA y BA para obtener brotes diferenciados propagados en varios frascos de cultivo.

6.1.3 Diseño del reactor de inmersión temporal automatizado

Se diseñaron dos tipos de biorreactores, de inmersión mecánica y de inmersión neumática en base a las necesidades de la inmersión de los explantes, así como de su crecimiento. Se les equipó con sistemas automatización a través de microcontroladores. También se diseño el diagrama de flujo que controla el proceso de automatización.

6.1.4 Producción de biomasa de A. hintonii en el reactor

El biorreactor se esterilizó en autoclave a 121ºC a 1 atm de presión durante 15 minutos. Se inoculó el reactor con brotes de aproximadamente 1 cm longitud en condiciones de asepsia. Las condiciones de operación del reactor fueron de: 600 h (producción en lote), 25ºC, fotoperiodo de

16 h luz - 8 h oscuridad y un tiempo de inmersión de los explantes de 1 minuto cada 12 h.

6.1.5 Aclimatación de los explantes

Al final del lote de producción, se descargaron los brotes crecidos en el biorreactor y se llevaron a aclimatar en condiciones de invernadero. Se utilizó un sustrato que consistió en una mezcla de sustratos como tierra de hoja seca, lombricomposta y tezontle. Se les dio un tratamiento de 4 semanas para observar su adaptación al sustrato utilizado así como el enraizamiento de los cactus.

En el anexo 1 se muestra un diagrama de flujo con la metodología del proceso de micropropagación de Aztekium hintonii.

6.2 Simulación de la producción de biomasa en el biorreactor

6.2.1 Reacción general para la producción de Aztekium hintonii

Para el planteamiento del balance es importante considerar que la fuente de carbono es la sacarosa y la composición celular del metabolito que se produce, que en este caso sólo es biomasa del cactus. Se tomó como base 1 mol de sacarosa para obtener los coeficientes de cada componente.

C12H22O11 + αNH4NO3 + βH2O

= ηCH 1.89 N 0.03 O 0.63 + ϕO2 (1)

Dónde:

C12H22O11.- Sacarosa, fuente de carbono.

NH4NO3.- Nitrato de amonio, fuente de nitrógeno.

H2O.- Agua, suministrada para elaboración del medio.

CH1.89N0.03O0.63.- Composición celular tomada de Catharanthus roseus.

O2.- Oxigeno obtenido al final de la reacción.

5.2.2 Determinación de parámetros cinéticos

Para calcular la velocidad específica de crecimiento (μ) de la planta se utilizó un modelo para crecimiento vegetal (Catie, 1990). El cálculo se realizó obteniendo los pesos húmedos de la biomasa de la planta Aztekium hintonii, los cuales se tomaron en 10 semanas de los que se obtuvo la velocidad especifica de crecimiento máxima (μmax).

t

P

PF

0

ln

max (2)

Los explantes que se tomaron para los cálculos se obtuvieron de cultivos in vitro en frascos de vidrio con 20 mL de medio MS sólido, de los cuales se retiró la biomasa para su obtener el peso húmedo. Se obtuvo el rendimiento de biomasa respecto al sustrato de acuerdo al balance estequiométrico de la reacción establecido.

6.2.3 Modelación de la cinética de crecimiento de la biomasa y consumo de sustrato.

El modelo que se utilizó para la simulación de la producción de biomasa fue el modelo de monod por lote, esta simulación se realizó en el software comercial MathCad para una producción por lote con las siguientes relaciones:

(3)

(4)

(5)

Las ecuaciones describen el crecimiento de biomasa y consumo de sustrato con respecto al tiempo.

6.2.4 Cálculo de los coeficientes de transferencia de masa sólido – gas (explante-CO2) y líquido – sólido (medio MS-explante)

En el cálculo de la transferencia de masa se plantearon dos sistemas: La difusión del medio en los explantes y la difusión del CO2 en los mismos, en los cuales se utilizaron modelos como el de Steinberger y Treyball (Lobo, 1997), además de números adimensionales tales como Reynolds (Re), Schmidt (Sc) y Sherwood (Sh).

33.05.0Re6.00.2 ScSh (6)

2CODSc

(7)

c

CO

L

ShDk 2

(8)

7. Resultados

En los anexos 2, 3, 4 y 5 se muestran los diagramas de control y los diseños de los biorreactores mecánico y neumático.

Se obtuvieron los coeficientes de cada componente de la reacción como se describe a continuación:

C12H22O11 + 0.18 NH4NO3 - 0.33H2O

= 12 CH 1.89 N 0.03 O 0.63 + 1.825 O2 (9)

Los coeficientes indican que por cada mol de sacarosa se producen 12 moles de biomasa, utilizando estos datos se obtiene el rendimiento de producción celular con respecto al sustrato, el cual es 0.855 gB/gS, esto indica que la sacarosa se aprovecha en un 85% para producir biomasa de cactus y el 15% restante en otras rutas metabólicas. Dicho rendimiento nos permite saber que el proceso que se está implementando es eficiente y que el aprovechamiento del sustrato permite la micropropagación del cactus de manera eficaz.

La siguiente tabla muestra los tiempos y pesos registrados de 10 ejemplares de A. hintonii para hacer el cálculo de la velocidad máxima de crecimiento:

Tabla 1. Pesos de diferentes explantes tomados a lo

largo de diez semanas.

Promediando los valores de μ, el resultado es 0.00367 h-1, esta es la velocidad a la que se produce biomasa y crecen los explantes.

Los resultados de la simulación con el software se muestran a continuación:

Tabla 2. Datos obtenidos de la simulación en cultivo

por lote.

La simulación se hizo en un volumen de 2 L hasta las 600 h debido a que en este punto de tiempo la concentración de sustrato estaba muy cercana a cero y ya no habría producción celular. La biomasa obtenida en el lote es 22.819 g con un explante de peso inicial de 0.189 g y de la concentración de sustrato final es 3.76 g/L.

Si comparamos los resultados; en el mismo tiempo de 168 h (1 semana) obtenemos una producción de biomasa 73% mayor en el cultivo en biorreactor comparado con el cultivo in vitro. Cabe mencionar que después de dicho tiempo, el crecimiento de biomasa se dispara exponencialmente en el biorreactor, lo cual indica que la velocidad de producción de masa celular incrementa aun más.

En la siguiente figura se puede apreciar el cambio en el aumento de la biomasa respecto al tiempo, mientras cómo se consume el sustrato del medio cultivo.

Figura 5. Curva de crecimiento biomasa-sustrato vs

tiempo.

El coeficiente de transferencia de masa (k) del CO2 que se difunde hacia los explantes fue de 6.65114x10-3 m/s y los números adimensionales utilizados para éste modelo fueron: Sc= 0.5123, Re=14.6378 y Sh= 3.8372.

El coeficiente de transferencia de masa (k) del medio MS que se difunde hacia los explantes fue de 0.68 m/s y los números adimensionales utilizados para éste modelo fueron: Sc= 1.0464X10-3, Re=41.9140 y Sh= 5.9862

8. Conclusiones

Se determinaron los parámetros cinéticos de acuerdo al modelo de Monod con modificaciones para crecimiento en plantas, con el cual a partir del balance de masa (12 mol biomasa/1 mol sacarosa) se determinó la velocidad máxima de crecimiento (μmáx 0.00367 h-1) y el rendimiento biomasa/sustrato (YX/S 0.8557) el cual es muy grande lo que indica que la eficiencia del sistema es alta. En un lote de producción de 600 h, con un volumen de operación de 2L, se determinó una producción de biomasa del 73 % mayor

en el cultivo en biorreactor comparado en el medio sólido. Los biorreactores diseñados en este proyecto tienen la misma aplicación en una gran variedad de especies de plantas, por esta razón se tiene una visión a futuro más económicamente rentable para el proyecto. La automatización del sistema nos permitirá un proceso reproducible y rentable para tener mayor control de las variables de operación así como un registro de funcionamiento del sistema.

Basados en los resultados obtenidos, se concluye que el biorreactor de inmersión temporal diseñado es una solución biotecnológica para micropropagar de forma masiva el cactus Aztekium hintonii para repoblar y conservar su hábitat natural.

9. Futuras líneas de investigación

Tanto los biorreactores de inmersión neumática y mecánica pueden escalarse a un volumen mayor de operación lo que permitiría un mayor número de plantas por lote en el biorreactor, de manera que aumentando las dimensiones del sistema se podrá producir plantas a nivel industrial y competir en el mercado.

Ambos biorreactores pueden utilizarse para propagar cualquier especie de planta económicamente más atractiva, se puede ofrecer un costo más bajo en el mercado para productores independientes, invernaderos o agricultores; por lo que uan vez terminado el presente proyecto se planea micropropagar una especie que se comercialice la región como la fresa.

La automatización de los biorreactores en tiempo real y en línea permite un mayor control y supervisión de las variables a

controlar esto para evitar el error humano, poder realizar un historial de funcionamiento del sistema y realizar una interfaz a distancia para controlar el biorreactor, debido a esto el próximo paso en automatización es controlar el biorreactor a través de una interfaz por internet.

10. Referencias

Heller, R. (1965). Some aspects of the inorganic Nutrition of plant tissue cultures. In: White, P.R. and Grove, A.R. (Eds). Proceedings of an International Conference on Plant Tissue Culture. England.

Sutta Gupta S. and Yasuomi Ibaraki. (2006) Plant Tissue Culture Engineering. Centre for Veterinary and Agrochemical Research, Tervuren, Belgium.

Catie. (1990). Conceptos metodológicos sobre investigación y desarrollo de tecnología para sistemas de producción de cultivos. Volumen 2. Cidia. Turrialba, Costa Rica.

Lobo R. (1997). Principios de Transferencia de Masa, Universidad Autónoma Metropolitana. México, D.F.

Stanbury, Whitaker & Hall (1998). Principles

of Fermentation Technology, 2da. Edición,

editorial Butterworth – Heinemann.

Murashige, T and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growt and bioassays with tobacco tissue cultures.

11. Anexos

Figura 6. Diagrama de flujo general del proceso de micropropagación de A. hintonii.

Figura 7. Diseño del biorreactor de inmersión mecánica automatizado.

Figura 8. Diagrama de control del biorreactor de inmersión mecánica automatizado.

On/Inicio

Abrir válvula de CO2

Activar Motor giro derecha

(bajar)

Cerrar válvula de CO2

Activar Motor giro Izquierda

(subir)

Activar lámpara

Desactivar lámpara

Medio en el

tanque

Después de 1

min.

Después de

16 horas

Cerrar válvula de CO2

Apagar motor

Apagar lámparas

Off/Apagado

InmediatamenteDespués de

8 horas

Después de

12 horas

Figura 9. Diseño del biorreactor de inmersión temporal neumático.

INDICADOR DE

TEMPERATURA

12 VON

OFF

Microcontrolador

On/Inicio

Activar válvula

Activar compresor

Desactivar válvula

Desactivar compresor

Activar lámpara

Desactivar lámpara

Medio en el

tanque

Después de 1

min.

Después de

16 horas

Apagar válvula

Apagar compresor

Apagar lámpara

Off/Apagado

Después de

12 horas

Después de

8 horas

Figura 10. Diagrama de control del biorreactor de inmersión neumática automatizado.