呈味核苷酸含量基体标准物质研究

李 涵 1袁 高运华 2袁 吴 迪 1袁 李倩琪 1袁 杨 屹 1（1. 北京化工大学，北京 100029；2. 中国计量科学研究院，北京 100013）

摘 要院以市售鸡精为基体，研制呈味核苷酸含量基体标准物质。优化鸡精中核苷酸提取条件，建立有机溶剂法提取核

苷酸的技术手段。以核苷酸国家一级标准物质为标准，采用高效液相色谱外标法、离子色谱外标法两种技术对鸡精基

体中呈味核苷酸特性量值进行确定，检验标准物质的均匀性和稳定性，结果表明其均匀性良好，且一年内标准物质的

特性量值没有显著差异。同时建立基于离子色谱和高效液相色谱两种外标法对标准物质特性量值进行确定的不确定

度评定模型，对研制的标准物质进行不确定度评定，为复杂基体中核苷酸含量标准物质的研制提供了借鉴，为呈味核

苷酸检测的相关国家标准制定提供技术参考。

关键词院鸡精；基体；呈味核苷酸；含量；标准物质；不确定度评定

中图分类号院TS264.2+3曰O629.74曰O657.7+2曰Q524 文献标志码院A 文章编号院1674-5124渊2014冤05-0061-04

Study on matrix reference material of flavor nucleotides

LI Han1，GAO Yun-hua2，WU Di1，LI Qian-qi1，YANG Yi1（1. Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；

2. National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

Abstract: The reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix had beendeveloped. The method was established for extraction the nucleotide with chloroform. The primaryreference material for nucleotide had been used as the standard for certifying the value of flavornucleotides reference materials by the high performance liquid chromatography and ionicchromatography. The homogeneity of reference materials had been tested and the result was good.The stability of reference materials has been monitored and there was no significant differencebetween the characteristic values within a year. A model was developed to evaluate the uncertaintyof reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix. This paper can be usedas the reference for developing the complex matrix nucleotide content reference material andprovide the technical information for national standards of nucleotide.Key words: chicken essence；matrix；flavor nucleotides；content；reference material；uncertaintyof referenle material

收稿日期院2014-01-19曰收到修改稿日期院2014-03-23基金项目院科技部科技基础性工作专项（02-08-4GZ）

国家质检总局食品安全监管专项（ASPAQ1201）作者简介：李 涵（1987-），女，辽宁本溪市人，硕士研究生，

专业方向为分析化学。

0 引 言5忆-肌苷酸二钠（inosine 5忆-monophosphate，IMP）

和 5忆-鸟苷酸二钠（guamosine 5忆-monophosphate，GMP）

具有呈味性，与谷氨酸钠具有协同效应，可提高鲜味

数十倍，在调味品和食品中应用广泛[1]。呈味核苷酸

和谷氨酸钠是反映鸡精调味料质量的主要指标，

SB/T 10371—2003《鸡精调味料》规定，鸡精调味料

中呈味核苷酸二钠不得低于 1.10g/100 g，谷氨酸钠不

得低于 35.0 g/100 g。但 2008 年国家质检总局调味品

抽查结果显示，个别鸡精调味产品中呈味核苷酸二钠

为 0.35g/100 g，谷氨酸钠为 14.8 g/100 g，未达到要求。

中国测试CHINA MEASUREMENT & TEST Vol.40 No.5September，2014第 40 卷第 5 期2014 年 9 月

doi院10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.016

中国测试 2014 年 9 月

浙江省工商局对流通领域销售的调味品开展的质量

专项检测也发现，鸡精、味精等调味品的关键成分谷

氨酸钠、呈味核苷酸明显不足[2-4]。此外，谷氨酸钠和

呈味核苷酸都属于鸡精最关键的质量指标，可部分企

业并未将其列入标准项目内。文献表明，我国现行的

核苷酸检测标准 QB/T 2845—2007《食品添加剂呈

味核苷酸二钠》、SB/T 10371—2003《鸡精调味料》、

SB/T 10415—2007《鸡粉调味料》等均为企业标准和

行业标准，国家级检测标准仍为空白，这限制了国家

对调味品中呈味核苷酸的技术检验[5]。本文以市售鸡

精为基体，研制呈味核苷酸含量基体标准物质。

1 实验部分1.1 仪器设备

高效液相色谱仪：Agilent1200，包括四元低压梯

度输液泵、二极管阵列检测器、在线脱气和柱温控

制系统、自动进样器、仪器控制和数据处理工作站，

（美国 Agilent 公司）。

离子色谱仪：Dionex ICS-5000，包括梯度混合泵、

紫外和电导检测器、自动进样器、仪器控制和数据处

理工作站，（美国 Thermo Scientific 公司）。

高速冷冻离心机（Sigma 3K 30，Sigma 公司），

超纯水系统（Millipore QS，Millipore 公司），pH 计（奥

立龙）。

1.2 材料试剂

腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）标准物质（GBW09809），胞嘧啶核苷一磷酸（CMP）标准物质（GBW09810），鸟嘌呤核苷一磷酸（GMP）标准物质（GBW09811），

尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）标准物质（GBW09812），次黄嘌呤核苷一磷酸（IMP）标准物质（GBW09813）；甲醇（色谱纯）、乙酸（优级纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、

磷酸氢二钾（分析纯）、氯仿（色谱纯）、鸡精（市售）。

1.3 核苷酸提取分离

优化了酸碱沉淀和有机溶剂沉淀两种方法提取

鸡精中核苷酸的技术参数，并对两种提取方法进行了

比较，最后确定了氯仿沉淀和高速离心相结合的核

苷酸提取方法。具体步骤为：1）用天平精确称量 0.5 g鸡精样品（准确至 0.000 1 g），加入 10 g 超纯水后震

荡混匀 1min；2）50耀60益水浴 30min，每 5min 混匀震

荡一次，使鸡精中核苷酸充分溶解；3）室温静止

60min 后，加入 10mL 色谱纯的氯仿，震荡混匀 1min；4）20 000 r/min 离心 20 min；5）取上清液过 0.22 滋m滤膜，4益贮存待测。

1.4 核苷酸色谱分离分析条件

1.4.1 高效液相色谱条件

色谱柱为 Phenomenex，Gemini C18 柱，250 mm

伊4.6mm（i.d.），粒径 5滋m；柱温 25益；检测器为 DAD检测器；进样量 10 滋L；检测波长：AMP 257 nm，CMP280 nm，GMP.2Na 254 nm，UMP.2Na 262 nm，IMP.2Na249 nm。

流动相由两部分组成，其中，流动相 A 为 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，pH 5.6；流动相 B 为 0.1mol/L 磷

酸二氢钾溶液，pH 5.6，20%（v/v）甲醇。流动相梯度

变化见表 1。

1.4.2 离子色谱分离分析条件

色谱柱：IonPac AGl6 保护柱，IonPac ASl6 分离

柱；柱温 25益；检测器 UV 检测器；进样量 10 滋L；检测波长：AMP 257nm，CMP 280nm，GMP.2Na 254nm，

UMP.2Na 262 nm，IMP.2Na 249 nm。

流动相：KOH 溶液。

梯度洗脱程序：0耀12min，12 mmol/L；12耀22 min，由 12 mmol/L 线性增加至 55 mmol/L；22耀28 min，55 mmol/L；28耀28.1 min，由 55 mmol/L 线性降低至

12 mmol/L；28.1耀33min，12mmol/L，恢复至平衡状态，

流速 1.0mL/min。1.5 标准物质定值及不确定度分析

通过优化流动相、离子强度、pH、有机相含量、

分离柱、温度、电压等分离分析条件，建立了呈味核

苷酸高效液相色谱、离子色谱两种定量分析方法，以

国家一级标准物质为依据，用这两种方法进行了标准

物质特性量值的确定。利用液相色谱方法检验了标准

物质的均匀性、考察了标准物质的稳定性。基于与国

家一级标准物质进行比较，建立了对复杂基体中目标

成分含量进行确定的不确定度评定模型，以此评定

鸡精基体中呈味核苷酸含量标准物质特性量值的不

确定度。

2 结果与讨论2.1 核苷酸提取

市售鸡精成分复杂，具有相似性质的组份在分

析时会相互干扰，因此，核苷酸和干扰成分的有效分

离是进行定量分析的基础。现常用的分离方法有酸

时间/min 流动相 A/% 流动相 B/% 流速/渊mL窑min-1冤0 100 0 0.58.5 100 0 0.5

10 100 0 113.5 100 0 115.5 60 40 122 60 40 123 100 0 0.535 100 0 0.5

表 1 鸡精中核苷酸含量测量色谱梯度洗脱条件

62

第 40 卷第 5 期

碱沉淀法和层析柱法。酸碱沉淀法可有效地将杂质

组份与核苷酸分离开来，方法的重复性、准确度均较

好，回收率可以达到 99%以上；但该方法技术条件要

求较高，需要高速离心机、pH 计等精密仪器，同时

要严格控制酸碱等试剂的加入量，对技术人员要求

高。层析柱法的优点在于不需要精密仪器，技术要求

也不高，普通实验室和一般技术人员均可操作完成；

但其准确度不高，回收率无法保证，限制其广泛应用。

氯仿沉淀和高速离心相结合的核苷酸提取方法可有

效地将鸡精中对核苷酸定量分析产生干扰的成分分

离开来。氯仿和水不互溶，可使蛋白质完全变性沉淀

析出，使脂类溶于氯仿中被萃取出来，从而有效去除

蛋白质和脂类对核苷酸定量分析的影响；水相中含

有盐、糖、味精、麦芽糊精等水溶性成分，这些成分均

没有紫外吸收，对基于紫外吸收特性检测的核苷酸

定量分析没有干扰。该方法操作简便，虽然也需要高

速离心机，但是对技术人员的要求不高，普通实验

人员即可完成。且本方法的重复性、准确度均好于酸

碱沉淀和柱层析方法。图 1 为用氯仿和高速离心方

法处理后的核苷酸的高效液相色谱分析图谱。

由图 1 可以看出，IMP、GMP 和其他干扰成分已

经有效分离开，满足了定量分析的需要。

2.2 核苷酸色谱分离分析条件的优化

2.2.1 核苷酸 HPLC 色谱分离分析条件

用氯仿和高速离心法处理样品可将绝大部分干

扰成分去除，但是鸡精成分较复杂，除了标示的主要

成分外，还含有少量可能对核苷酸定量分析产生干扰

的成分，从图 1 也可以看出，色谱图中仍有杂质峰。因

此，优化色谱分析条件，使核苷酸和其杂质成分有效

分开是对其定量的必要条件。分别使用 5 种核苷酸标

准物质及相对应的核苷标准品进行色谱条件建立和

验证，能够对核苷酸进行准确的定量[6-7]。5 种核苷酸

标准物质的 HPLC 测量图谱见图 2，5 种核苷酸标准

物质和相对应的核苷标准品的HPLC测量图谱见图 3。从图 2和图 3可知，5种核苷酸自身与其相对应的核苷

都得到有效分离，可以进行定量分析。

2.2.2 核苷酸离子色谱分离分析条件

分别使用 5 种核苷酸标准物质进行色谱条件建

立和验证，能够对核苷酸进行准确的定量。5 种核苷

酸标准物质的 IC 测量图谱见图 4，从图 4 可知 5 种

核苷酸达到了基线分离，可以进行定量分析。

2.3 标准物质的均匀性考察

按照国家计量技术规范 JJF 1343—2012《标准

物质定值的通用原则及统计学原理》中对标准物质

均匀性评估的技术要求，从研制的标准物质中随机

抽取 15 个包装用高效液相色谱法做均匀性检验。

采用 F检验法对均匀性测量数据进行了统计检验，

检验结果见表 2。查表得到，F（0.05）=2.31，F<F（0.05），证明研制的标准物质样品均匀一致，符合标准物质

研制均匀性的要求。

2.4 标准物质的稳定性考察

鸡精基体标准物质稳定性检验采用高效液相

色谱法进行测定。采用国家计量技术规范JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》推荐

李 涵等：呈味核苷酸含量基体标准物质研究

图 1 氯仿沉淀处理鸡精样品后 HPLC 测定图谱

050

100150200250300

5 10 15 20 25 30时间/min

图 2 5 种核苷酸标准物质的 HPLC 测量图

5 10 15 20 25 30时间/min

050100150200250300350400

图 3 5 种核苷酸标准物质和相对应的核苷标准品的

HPLC 测量图谱

050

100150200250

5 10 15 20 25 30时间/min

图 4 5 种核苷酸标准物质的 IC 测量图谱

-0.3

25.020.015.010.05.0

时间/min12.4 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5

63

中国测试 2014 年 9 月

项目统计参数

IMP GMPQ1 0.08 0.07Q2 0.15 0.27S1^2 0.005 4 0.004 9S2^2 0.005 0.009 1F 1.09 0.54

表 2 鸡精标准物质均匀性检验结果

的标准物质稳定性评价方法进行了标准物质稳定性

检验及评价，检验结果见图 5。从图 5 可知，在 12 个

月时间内标准物质特性量值无显著性变化，符合标

准物质的稳定性要求，检验结果为稳定。

2.5 标准物质的定值

利用高精密度方法将复杂基体中目标成分含量

与已知的标准物质直接比较而确定其特性量值是

基体标准物质研制最有效的方法之一。利用本文建

立的高效液相色谱和高效离子色谱两种方法，依据

JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统

计学原理》的要求和 ISO 导则 34 的要求，对鸡精中

每个核苷酸的含量进行精确定量测定，确定了其特

性量值，结果见表 3。

2.6 标准物质的定值不确定度分析

本文中标准物质的定值结果不确定度评估主要

从核苷酸标准物质、标准物质的配制及系列稀释、仪

器测量、标准物质的不均匀性、标准物质的不稳定性

等部分进行了考察。标准物质的不确定度由标准物

质证书得到，将其转换为相对标准不确定度（uC）。标准物质和样品的配制产生的不确定度（uB）主要包含

天平本身的不确定度和标准曲线的线性两部分。仪

器测量不确定度（uM）用多次重复测量的标准偏差表

示。色谱不响应成分带来的不确定度（uS）用水分和

无机离子重复测量的标准偏差表示。不均匀性带来

的不确定度（uH）和不稳定性带来的不确定度（uT）由

ISO 导则 35 规定的计算方法进行计算。用如下公式

进行合成标准不确定度的计算：

u= u 2C +u 2

S +u 2M +u 2

B +u 2H +u 2

T姨结果为

uGMP=3.4%；uIMP=3.9%2.7 定值结果

定值结果表示为标准值依扩展不确定度。取包含

因子 k=2，则扩展不确定度可以表示为 U越k·u。鸡精

基体（IMP+GMP）核苷酸定值结果为：IMP：（4.08依0.32）g/100 g，（k=2）；GMP：（4.46依0.30）g/100g，（k=2）。3 结束语

针对国家调味品质量检验监督急需的基体标准

物质稀缺问题，建立了有机溶剂法提取核苷酸的技

术手段。以核苷酸国家一级标准物质为标准，采用高

效液相色谱外标法、离子色谱外标法两种技术对鸡

精基体中呈味核苷酸特性量值进行了确定，建立了

基于离子色谱和高效液相色谱两种外标法对标准物

质特性量值进行确定的不确定度评定模型，评定了

定值结果的不确定度，为复杂基体中核苷酸含量标

准物质的研制提供了借鉴。为呈味核苷酸检测的相

关国家标准制定提供了技术参考。

参考文献[1] 陈留记，金明凤.分析毛霉型豆豉现状 \研究其发展方向[J].

中国酿造，1998（5）：8-10援[2] 郝岩平，姜金斗，胡向蔚 . 反相高效液相色谱法测定乳

制品中核苷酸方法的研究[J]. 中国食品添加剂，2003（2）：114-118.

[3] 杨祖英. 食品检验[M]. 北京：化学工业出版社，2001：51.[4] 张燕婉，鲁红军，王津生. 高效液相色谱法测定食品中核

苷酸的含量[J]. 食品科学，1994（6）：59-62.[5] 马跃龙，薛峰，雷涛. 调味品中呈味核苷酸二钠含量测定

方法研究[J]. 分析检测，2011（5）：115-120.[6] 高运华，黎朋，侯东军，等. 配方奶粉中核苷酸含量高效液

相色谱测定[J]. 中国测试，2012（38）：44-47。[7] Perrin C，Meyer L，Mujahid C，et al. The analysis of

5忆-mononucleotides in infant formulae by HPLC[J]. FoodChemistry，2001（74）：245-253.

项目IMP/渊g窑渊100 g冤-1冤 GMP/渊g窑渊100 g冤-1冤HPLC IC HPLC IC

1 4.04 4.18 4.45 4.522 4.06 4.13 4.36 4.563 4.05 4.11 4.37 4.514 4.04 4.14 4.34 4.505 4.03 4.10 4.45 4.486 4.02 4.12 4.43 4.497 4.03 4.11 4.44 4.48X 4.08 4.46SD 0.05 0.06RSD 1.23 1.43

表 3 鸡精基体核苷酸标准物质定值结果

图 5 标准物质稳定性监测结果

0 2 4 6 8 10 12 14时间/月

4.124.104.084.064.044.024.003.98

每次很定性检测数据特性量值

64