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近赤外光領域にりん光示すイリジウム錯体を

利用した癌組織イメージング技術

群馬大学大学院工学研究科

応用化学・生物化学専攻

助教 吉原 利忠

2

方法 解像度 深度 長所 短所

PET 1～2mm 無制限 高感度 サイクロトロンなど深部解析 大掛かりな装置が必要

MRI 25～100μm 無制限 高解像度 低感度深部解析 大掛かりな装置が必要

発光 3～5mm 1～2cm 高感度 基質の投与が必要簡便性，迅速性 深部観察が困難

蛍光 2～3mm < 1cm 高感度 バックグランドが高いりん光 簡便性，迅速性 深部観察が困難

リアルタイム観測

Medical Bio 2007, No.11

研究背景癌組織を対象とする分子イメージング技術の比較

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発光プローブ顕微鏡技術

細胞や組織の可視化

細胞生物学医学

細胞の構造と機能

これまで目で見えなかった生物の様々な生命現象を，

細胞や動物が生きたままの状態で，リアルタイムで可視化

光イメージング技術

in vivo 光イメージング技術

癌の光イメージング

イメージング技術

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低酸素領域

正常組織 腫瘍

ネクローシス

不安定な血流（急性低酸素）

血管

正常組織

腫瘍

組織中の酸素分圧の模式図

頻度

酸素分圧 / mmHg

0 20 40 60 80 100

低酸素領域

実験医学 Vol.25 No.14

酸素分圧（濃度）に依存して，発光特性が変化するプローブ分子を用いる。

低酸素領域としての癌組織

5

励起一重項状態

励起三重項状態

基底状態

光吸収

項間交差

蛍光

りん光 項間交差

発光寿命が長い

3O2

1O2

エネルギー移動

りん光強度，寿命が酸素濃度に依存して変化する。

一般的に有機化合物のりん光は室温において非常に弱い。ベンゾフェノン （Φp = 0.02）ルテニウム錯体，金属ポルフィリン錯体 （ Φp＜ 0.1 ）

りん光プローブ分子の特徴

6

S

N O

OIr

2

BTP

CHO cells HeLa cellsU251 Human Glioma cells

20 % O2

5 % O2

BTP(50μM)2h

投与前 投与1時間後

ヒト扁平上皮癌

イリジウム錯体の特徴

（１）高いりん光量子収率（りん光放射速度定数が大きい）

（２）吸収，りん光波長が配位子に依存

（３）脂溶性

イリジウム錯体を用いたりん光イメージング

7

1. 近赤外光励起，近赤外光検出が可能なイリジウム錯体2. 生体投与において有機溶媒を必要としないイリジウム錯体（生理食塩水中において凝集しない）

BTP(10mM) in ジメチルスルホキシド(DMSO)

生理食塩水

BTP(1mM) in 10%DMSO溶液

250μl投与in vivo イメージングに最も適した波長域

R. Wessleder, Nature Biotech., 2001, 19, 316.

600nm

in vivo イメージングを指向した設計指針

8

新しい低酸素感知イリジウム錯体の設計・開発指針

S

N O

OIr

2

光物理特性を支配する配位子

S

N

S

N

S

N

（１） 長波長化O O

OH

OO O

HN

O

NH2

（２） 水溶性化

Asp

Asp-Asp

O OHN

OCOOH

OH

O

O OHN

OCOOH

NH

O

OH

COOH

O

光物理特性にほとんど影響しない配位子

癌を光検出するための新しいりん光プローブ分子の開発

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イリジウム錯体の吸収・りん光スペクトルの長波長化

Φp= 0.33τp = 5.5 μs

Φp= 0.40τp = 3.3 μs

Φp= 0.14τp = 1.4 μs

Φp= 0.32τp = 2.1 μs

0

0.5

1

0

0.5

1

0

0.5

1

600 700 8000

0.5

1

Wavelength / nm

Intn

esity

/ ar

b. u

nit

λ > 670 nm （近赤外光領域）

0

1

2

0

1

2

0

1

2

400 500 600 7000

1

2

Wavelength / nm

ε / 1

04 dm3 m

ol–1

cm–1

N

SIr

O

O

2

N

SIr

O

O

2

N

SIr

O

O

2

N

SIr

O

O

2

BTP

BTQ

BTIQ

BTPH

10

イリジウム錯体の水への溶解度

O O

OH

O

O OHN

O

NH2

O O

水（Tris-HCl緩衝液）への溶解度 / mgL-1

溶解しない

溶解しない（ 23.1 Tris-HCl緩衝液：DMSO（95：5））

0.62

30.0

377

配位子

BTP

O OHN

OCOOH

OH

O

O OHN

OCOOH

NH

O

OH

COOH

O

11

担癌マウスを用いた腫瘍のin vivoりん光イメージング

N

SIr

O

O

2

Maestro FL500 (CRi社)

励起波長 : 575 - 605 nm検出波長 : > 645 nm

投与前

BTPH< 250 nmol

投与1時間後

BTPHは水への溶解性が非常に低く，生理食塩水中で凝集してしまうためマウスへの投与が困難

腫瘍のりん光イメージング画像を得ることができない。

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担癌マウスを用いた腫瘍のin vivoりん光イメージング

N

SIr

O

O

2

OHO

投与前BTPHSA 188 nmol

吸収・りん光波長の長波長化

イリジウム錯体の凝集を抑制

投与1時間後

腫瘍のりん光イメージング画像を得ることができる。

励起波長 : 575 - 605 nm検出波長 : > 645 nm

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腫瘍りん光イメージングの検出深度の検討

担癌マウスに250nmolのBTP，BTPHSAを投与

2時間後腫瘍を摘出し，マウスの皮下約5mmに移植

移植2時間後Maestroで観察

BTPBTPHSA

0

1

2

0

0.5

1

400 500 600 7000

1

2

0

0.5

1

Wavelength / nm

ε / 1

04 dm3 m

ol–1

cm–1

Phos

. int

ensi

ty /

arb.

uni

t

①

②

③

④

Ex.445-495nm

Ex.575-605nm

①

③

②

④

長波長励起が可能なBTPHSAでは深部の癌をイメージングすることができる。

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従来技術とその問題点

（１）微小電極を組織に挿入する方法

生体組織あるいは細胞中の酸素濃度を測定する技術

電極近傍の１点の酸素濃度しか測定できない。細胞のような微小環境の酸素濃度は測定できない。

（２）常磁性プローブ分子のESR信号幅から求める方法リアルタイムの酸素濃度測定できない。

（３）ニトロイミダゾール系低酸素組織診断薬剤を使う方法

薬剤の代謝に時間を要するため，薬剤投与後数時間経過しないとデータが得られない。

（４）金属ポルフィリン，ルテニウム錯体のりん光を用いる方法

センサー分子をポリマー等でコートしなければならない。

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新技術の特徴・従来技術との比較

• 分子レベルのセンサーであるため，細胞やマイクロチャンネルのような微小空間の酸素濃度計測が可能。

• 癌腫瘍のような低酸素組織を選択的に可視化することができる。

• 発光法に基づいているため，非侵襲的かつ高感度の計測が可能。

• リアルタイムで酸素濃度の変化を計測可能。• 分子を外界から保護する必要がないため，分子単独でセンサーとして用いることができる。

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想定される用途

• 酸素濃度測定試薬• 低酸素腫瘍診断試薬• 生体内低酸素領域検査試薬• DO (dissolved oxygen) センサー• 顕微鏡下でりん光寿命測定を行うことにより，細胞中の酸素濃度のマッピングが可能となることも期待される。

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想定される業界

• 医療・医薬品関係試薬会社製薬会社光イメージング関係研究所等

• 環境計測各種センサー製造メーカー環境関係研究所等

• 市場規模

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実用化に向けた課題

• 現在、検出波長について近赤外検出が可能なところまで開発済み。しかし、励起波長の近赤外化の点が未解決である。

• 今後、励起波長の近赤外化について実験データを取得し、生体深部腫瘍イメージングに適用していく場合の条件設定を行っていく。

• 実用化に向けて、腫瘍の検出の精度を１ｍｍ以下まで向上できるよう技術を確立する必要もあり。

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企業への期待

• 更なる近赤外化や水溶性化については，化合物合成の技術により克服できると考えている。

• 化合物合成、化合物の毒性評価の技術を持つ企業との共同研究を希望。

• また、酸素濃度測定試薬を開発中の企業，創薬，環境分野への展開を考えている企業には，本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：新規錯体化合物，並びにそれを用いた酸素濃度測定試薬および癌診断薬

• 出願番号 ：特願2009-166878• 出願人 ：群馬大学• 発明者 ：吉原利忠，飛田成史，穂坂正博，竹内利行

• 発明の名称 ：新規水溶性イリジウム錯体化合物およびそれを用いた酸素濃度測定試薬

• 出願番号 ：特願2008-239660特開2010-070494

• 出願人 ：群馬大学• 発明者 ：吉原利忠，飛田成史，穂坂正博，竹内利行

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産学連携の経歴

• 2007年-2008年 JST産学共同シーズイノベーション化事業（顕在化ステージ）に採択

• 2009年- JST産学イノベーション加速事業先端計測分析技術・機器開発

（要素技術プログラム）に採択

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