Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der ... · Probable-Number“-Methode (MPN) als Dreifachansatz angewendet. Darüber hinaus wurde ein „MPN“-Miniaturverfahren der

Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der

quantitativen Bestimmung gesamtcoliformer und

fäkalcoliformer Bakterien (E. coli) für die qualitative Bewertung

von Wasserproben

Diplomarbeit

im Studiengang Biotechnologie

vorgelegt von

Dzevrije Sabani Serani

Hamburg

am 21.02.20006

Gutachter: Prof. Dr. Birger Anspach Fachhochschule Hamburg

Dr. Klaus Roch Fachamt für

Umweltuntersuchungen,

Umweltbehörde Hamburg

Die Diplomarbeit wurde betreut und erstellt

im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg,

Marckmannstr. 129 b, 20539 Hamburg

Danksagungen

Diese Arbeit wurde erstellt mit freundlicher Unterstützung der Mitarbeiter im

Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg. Ein ganz besonderer Danke gilt

dabei Frau Keitel für ihre tatkräftige Unterstützung bei den praktischen Arbeiten

im Labor.

Für die freundliche Unterstützung bei der paktischen und theoretischen Arbeit

möchte ich mich herzlich bei Herrn Dr. Roch bedanken.

Für die umfassende Betreuung der Diplomarbeit danke ich Herrn Prof. Dr.

Anspach.

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Bakteriologische Wasseruntersuchung 1

2. Material und Methoden 2

2.1 Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien 2

2.2 Plattenmethoden 2

2.2.1 Allgemeines 2

2.2.2 Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden 3

2.2.3 Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen

Bakterien (E. coli) 4

2.2.3.1 Gerätschaften und Materialien 5

2.2.3.2 Oberflächenausstrich 8

2.2.3.3 Einmischverfahren (Plattengussverfahren) 9

2.2.3.4 Membranfiltration 9

2.2.3.5 Weitere Differenzierungen von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien 10

2.3 MPN-Verfahren (Mehrfachansatz) 11

2.3.1 Allgemeines 11

2.3.2 Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen

Bakterien (E. coli) 13

2.3.2.1 Durchführung der Untersuchungen 13

2.3.3 MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli 14

2.3.3.1 Allgemeines 14


2.3.4 Colilert-18®/Quanti-Tray®-Verfahren 17



2.3.4.3 Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch

die Lange Bunte Reihe 20

2.3.5 Membranfiltationsverfahren 29



2.3.6 Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden 34

2.4 Mikrobiologische Referenzmaterialien 35

2.4.1 Durchführung der Kultivierung von Kontrollstämme 35

2.4.2 Einsatz der Gebrauchskulturen 35

2.5 Statistische Prüfverfahren 36

2.5.1 Statistik für die Qualitätssicherung in der Wassermikrobiologie 36

2.5.2 Grundberechnungen 36

2.5.2.1 Arithmetisches Mittel 36

2.5.2.2 Varianz, Standardabeichung und Variationskoeffizienten 37

3. Ergebnisse 38

3.1 Vergleich verschiedener Untersuchungsverfahren 38

3.1.1 Durchführung der Plattenmethoden 38

3.1.2 Durchführung der MPN-Verfahren 39

3.1.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien

mit den Plattenmethoden 39

3.1.3.1 Differenzierungen der coliformen Bakterien von Chromocult-

Coliformen-Agar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar 40

3.1.4 Ergebnisse der Untersuchungen coliformen Bakterien mit den

MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren 43

3.1.4.1 Differenzierung der Colilert®-18-Verfahren mit der Langen

Bunten Reihe 46

3.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den

Plattenmethoden 48

3.2.1 Differenzierung der Escherichia coli von Chromocult-Coliformen-

Agar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar 49

3.2.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den

MPN-Verfahren und Coliler®-18-Verfahren 51

3.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli und coliformen

Bakterien mit dem Membranfiltrationsverfahren 53

3.4 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli 55

3.5 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von coliformen Bakterien

mit den einzelnen Verfahren 57

3.5.1 Chromocult-Coliformen-Agar 57

3.5.1.2 Endo-C-Agar 57

3.5.1.3 Desoxycholat-Agar 58

3.5.1.4 MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren 59

3.5.2 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von Escherichia coli mit den

einzelnen Verfahren 60

3.5.2.1 Desoxycholat-Agar 60

3.5.2.2 Endo-C-Agar 61

3.5.2.3 Fluorocult-ECD-Agar 61

3.5.2.4 Chromocult-Coliformen-Agar 61

3.5.2.5 MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren 62

3.5.2.6 Membranfiltrationsverfahren zur quantitativen Erfassung von

Escherichia coli und coliformen Bakterien 62

3.5.2.7 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli 63

3.6 Statistische Prüfverfahren zur quantitativen Erfassung der Ergebnisse 64

3.6.1 Anwendung statistischer Prüfverfahren auf die Ergebnisse der

Untersuchungen mit coliformen Bakterien 64

3.6.2 Ergebnisse der E. coli mit den statistischen Prüfverfahren 65

3.7 Untersuchungen von Umweltproben 66

3.8 Vergleich von Ergebnissen der Alster- und Elbeproben 67

3.8.1 Vergleich der Alsterproben mit den MPN-Verfahren 67

3.8.2 Vergleich der Elbeproben mit verschiedene Verfahren 68

3.8.2.1 Vergleich der Elbeproben aus der Kleine Elbe 68

3.8.2.2 Vergleich der Elbeproben aus der Großen Elbe 69

4. Schlussfolgerungen 70

4.1 Analytische Qualitätssicherung für coliforme Bakterien 70

4.2 Analytische Qualitätssicherung für fäkalcoliforme Bakterien (E. coli) 71

4.3 Bewertung der Bestimmungsmethoden 72

4.4 Zusammenfassung 74

4.5 Literaturverzeichnis 76

Kapitel 1: Einleitung

1

1.Einleitung

1.1 Bakteriologische Wasseruntersuchung

Die bakteriologische Untersuchung hat den Zweck, festzustellen, wie viele Bakterien einer

Wasserprobe auf einem Nährboden bestimmter Zusammensetzung zur Vermehrung zu

bringen sind.

Zur Erhaltung einer bestimmten Gewässerqualität sind nationale Gesetze und Verordnungen

sowie internationale Richtlinien erlassen worden.

Die EG-Richtlinien enthalten Qualitäts- bzw. Gewässergüteziele, die aquatische Schutzgüter

sichern, wenn die Grenzwerte eingehalten werden. In der EG-Richtlinie 76/160/EWG vom

08.12.1975 über die Qualität der Badegewässer werden z. B. für die Nutzung von natürlichen

Gewässern als Badegewässer bakteriologisch-hygienische Anforderungen gestellt (Tab. 1.1).

In Deutschland gilt auf der gesamtstaatlichen Ebene das Wasserhaushaltsgesetz (WHG). Das

WHG dient als Rahmengesetz, durch das der Bund einen Regelungsrahmen vorgibt, den die

Länder durch eigene Gesetze (Landeswassergesetze) auszufüllen haben. In den einzelnen

Bundesländern führte dies z. B. zum Erlass von Badegewässerverordnungen. Die

Überwachung des Wasserrechtes obliegt den zuständigen Behörden. [1]

Tabelle 1.1: Leit- und Grenzwerte der EG-Richtlinie über die Qualität der Badegewässer vom 08.12.1975 bei denen die Werte nicht überschritten werden dürfen.

Parameter Volumen Leitwert Grenzwert

Coliforme 100 ml 500 (80) 10 000 (95)1

Fäkalcoliforme 100 ml 100 (80) 2000 (95)

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien

Escherichia coli wurden daher verschieden bewährte und neuartige Verfahren eingesetzt.

Neben verschiedenen Palettenverfahren wie zum Beispiel Desoxycholat-Agar-Verfahren,

Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar wurde die „Most-

Probable-Number“-Methode (MPN) als Dreifachansatz angewendet. Darüber hinaus wurde

ein „MPN“-Miniaturverfahren der Firma BIO RAD, bei dem die Probe mit sogenannten

Mikrotiterplatten untersucht wird, eingesetzt. Ein weiteres Verfahren ist der

Membranfiltrationsverfahren, die als Alternativverfahren für das Colilert-18-Verfahren

zugelassen ist.

Die Zielsetzung dieser Arbeit umfasst somit nicht nur auf die Einführung einer anerkannten

qualitätssichernden Maßnahmen für den Bereich der bakteriologischen Wasseruntersuchung,

sonder auch den Vergleich verschiedener Methoden mit dem Ziel, die optimale

Bestimmungsmethode zu finden.

1 Probenzahlen in %

Kapitel 2: Material und Methoden

2

2. Methoden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien

2.1. Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien

Der direkte Nachweis von Krankheitserregern ist aufgrund der Vielzahl der Organismen und

ihrer meist geringen Dichte zeitlich und arbeitstechnisch sehr aufwendig und in den meisten

Fällen nicht durchführbar. Deshalb führt man bei der bakteriologischen

Gewässerüberwachung in der Regel nicht unmittelbar den direkten Nachweis von potentiell

pathogenen Organismen durch, sondern den von leichter erfassbaren Indikatorkeimen.

Es handelt sich dabei um Bakterien, die aus dem Darm von Menschen und warmblütigen

Tieren stammen und mit den Fäkalien bzw. dem gereinigten Abwasser in die Gewässer

gelangen. Als Fäkalindikatoren werden die coliformen Bakterien (Enterobacter, Klebsiella,

Citrobacter, Escherichia) und insbesondere fäkalcoliforme Bakterien der Art Escherichia coli

herangezogen. Das Vorkommen von coliformen Bakterien kann jedoch nur als Hinweis auf

eine fäkale Verunreinigung dienen, da Vertreter dieser Gruppe auch im Boden und im

Oberflächenwasser leben und damit nicht zwangsläufig fäkalen Ursprungs sein müssen. Eine

eindeutige Aussage kann somit nur über den Nachweis des obligaten Darmbewohners

Escherichia coli als Indikator einer fäkalen Verunreinigung gemacht werden. [1]

Escherichia coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Sie

sind sporenlose gramnegative Stäbchen, die Glucose und andere Kohlenhydrate unter Säure-

und Gasbildung metabolisieren. Die fakultativen Anaerobier sind auf den üblichen

Nährmedien leicht anzüchtbar. [4]

Die Verunreinigung von Gewässern durch Fäkalien und damit einhergehend mit

Krankheitserregern kann zu einer weitgehenden Einschränkung der Nutzung führen.

Betroffen sind dabei unter anderem die Trinkwassergewinnung oder die Landwirtschaft sowie

Freizeit und Erholung des Menschen.

2.2 Plattenmethoden

Bei der Plattenmethoden werden verschiedene Nährböden auf coliforme und fäkalcoliforme

Bakterien untersucht.

2.2.1 Allgemeines

Unter der Plattenmethode ist die Kultivierung von Bakterien in einem festen Nährmedium zu

verstehen. Dieses feste Medium besteht aus Gelatine, Agar-Gel oder Natriumsilikat, das

Nährstoffe und weitere selektive Substanzen enthält.

Je nach Untersuchungsziel werden die Bakterien auf verschiedenen Nährböden

unterschiedlich kultiviert. Man unterscheidet hauptsächlich folgende Medien:


3

� Selektivmedien, die das Wachstum einer bestimmten Gattung fördern und möglichst alle

andere Arten hemmen, aber auch Anreicherungsmedien, mit denen das Wachstum einer

Bakterienart in einer Mischprobe gegenüber anderen Keimen beschleunigt wird.

� Differenzierungsmedien zur Bestimmung mehrer Bakterienarten nebeneinander durch

Bildung charakteristischer Unterschiede im Koloniewachstum.

In der bakteriologischen Wasseruntersuchung sind vor allem selektive Nährböden von

Bedeutung, deren Inhaltsstoffe und Zusammensetzung das Wachstum des nachzuweisenden

Organismus fördern und gleichzeitig unerwünschte Begleitorganismen hemmen.

Das Festmedium wird üblicherweise in einer sterilen Petri-Schale angewendet. Es wird mit

einer geringen Menge an Probematerial beimpft und anschließend im Brutschrank bei einer

konstanten Temperatur bebrütet. Nach einer bestimmten Inkubationszeit entwickeln sich

durch die Vermehrung der Bakterien Kolonien. Jedes Bakterium braucht neben

verschiedenen, oft spezifischen Nährstoffen eine bestimmte Temperatur zum optimalen

Wachstum. Durch die Temperatur lassen sich bereits bestimmte Bakterien qualitativ

differenzieren. So wird bei einer Methode zur Gewässeruntersuchung beispielsweise zur

Bestimmung der coliformen Bakterien der Desoxycholat-Agar bei 37°C bebrütet, zur

Bestimmung der fäkalcoliforme Bakterien wird die Temperatur auf 44°C erhöht. Somit wird

die Tatsache genutzt, dass fäkalcoliforme Bakterien eine größere Thermotoleranz besitzen.

Die eindeutige Identifizierung eines Bakteriums erfolgt durch Form, Größe und Farbe der

Kolonien. Je nach Spezies können typische Kolonienformen entstehen. Durch den Zusatz von

chromogenen Substanzen kann ein weiteres Erkennungsmerkmal geschaffen werden, da diese

durch spezifische Stoffwechselprodukte der Bakterien in Farbkomplexe umgesetzt werden

und die Kolonien anfärben.

2.2.2 Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden

Bei der Plattenmethode läßt sich eine Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren zur

Beimpfung unterscheiden.

� Oberflächenausstrich

Beim Ausplattieren wird das Inokulum (0,1-0,5 ml) mit einer Impfschlinge auf dem festen

Nährboden ausgestrichen. Somit wachsen die Bakterien nur auf der Oberfläche des

Nährbodens. Diese Methode wird immer dann eingesetzt, wenn es sich um einen

Indikator-Agar handelt, bei dem eine eindeutige Farbreaktion mit den Kolonien stattfinden

muss. Abweichende Färbungen entstehen vor allem bei eingemischten Kolonien, da

beispielsweise unter der Oberfläche andere Sauerstoffverhältnisse herrschen können.

� Verdünnungsausstrich (fraktionierter Ausstrich)

Benötigt man einzelne, gut isolierte Kolonien, die aus einer Probe mit hoher Keimdichte

entstehen sollen, wird das Inokulum schrittweise „verdünnt“, so dass in einigen Zonen der

Platte einzelne Kolonien zurückbleiben.


4

� Einmischverfahren

Die Kolonien wachsen besser, wenn man zunächst das Inokulum in die leere Petri-Schale

pipettiert und anschließend mit zuvor verflüssigtem Nährboden übergießt. Dieses

Einmischverfahren ist vor allem bei beweglichen Bakterien anzuwenden, da diese sonst an

der Oberfläche schwärmen und einzelne Kolonien schwer zu erkennen sind. Auch bei

hoher Keimdichte der Proben bietet sich dieses Verfahren an, da die eingeschlossenen

Keime wesentlich kleinere und kompaktere Kolonien bilden als auf der Oberfläche.

Dadurch können viele Kolonien deutlich erkennbar nebeneinander wachsen, ohne dass

diese zusammentreffen und zu größeren Einheiten zusammenwachsen.

� Membranfiltration

Bei der bakteriologische Untersuchungen wird das Inokulum durch einen

bakterienundurchlässigen Membranfilter (Porengröße 0,45 µm, ∅ 50mm) mittels eines

Filtrationsgerätes filtriert. Das Filter wird auf einen geeigneten Agar gelegt und inkubiert.

Aus dem Nährboden diffundieren die Nährstoffe durch die Porenstruktur des Filters, so

dass sich einzelne Organismen vermehren können. Das Auszählen der Kolonien wird

durch eine entsprechende Farbe des Filters und durch das eingedruckte Gitternetz

erleichtert.

Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl werden die Kolonien unter einem Keimzählgerät

mit 6-8facher Vergrößerung ausgezählt. Das Ergebnis der Koloniezählung wird in

„Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter“ (KBE/ml) angegeben. Die Zahl der Kolonien pro

Platte sollte zwischen 30 und 300 liegen. Bei hoher Keimdichte zählt man nur einige zufällig

ausgewählte Quadrate im Sichtfeld und bestimmt mit dem Mittelwert dieser Einzelzählungen

die Gesamtzahl pro Platte. Das Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg gibt zur

Auswertung der Koloniezahl vor, dass bei starkem Bewuchs der Platte fünf zufällig

ausgewählte Quadrate (á 1 cm2) ausgezählt werden. Der aus diesen fünf Einzelzählungen

gebildete Mittelwert wird dann mit einem Faktor multipliziert, so dass man die

Gesamtkoloniezahl erhält. Ist die Keimdichte auf der Platte zu hoch (>>300/Platte) muss der

Ansatz mit höheren Verdünnungen wiederholt werden. Die Verdünnung erfolgt in der Regel

in Zehnerpotenzen.

2.2.3 Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen

Bakterien (E.coli)

Es werden bestimmte Selektiv-Nährböden wie Desoxycholat-Agar, Endo-C-Agar,

Chromocult-Coliformen-Agar und Fluorocult-ECD-Agar für die Bestimmung von coliformen

und fäkalcoliformen Bakterien angewendet.


5

2.2.3.1 Gerätschaften und Materialien

Zur Durchführung der verschiedenen Plattenmethoden und für die Zubereitung der

Nährboden werden folgende Materialien und Geräte benötigt:

� Sterile Petri-Schalen (BIOPUR, Art-Nr. 391K3660)

� Elektrische Heizplatte

� Wasserbad

� Brutschränke Memmert, thermostatisiert, 37°C und 44°C

� Eppendorf-Pipette 1 ml, 100 µl, 10 µl

� Sterile Pipettenspitzen 10-1000 µl (z. B. EPPENDORF BIOPUR)

� Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211)

� Membranfilter 0,45µm ( ME 25/21, SCLEICHER & SCHUELL)

� Vakuumpumpe (VACU USOG, Firma GERHARDT)

� Einmalbecher

� Waage (SARTORIUS BP 8100)

� Kolonienzählgerät mit Lupe (Keimzählgerät WTW BZG 28)

� Oxidase-Teststreifen, MERCK (Art. Nr.: 1.13300)

� Kovac´s Reagenz für Indol-Test, MERCK Art. Nr.: 109293

Desoxycholat-Agar

Dieser spezielle Desoxycholat-Citrat-Nährboden der Firma OXOID (Art. Nr.: CM 163) ist zur

Isolierung und Keimzählung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (Escherichia coli)

in Milch, Speiseeis und Wasser entwickelt. Er wird im Fachamt für Umweltuntersuchungen

Hamburg zum routinemäßigen Nachweis von coliformen und fäkalcoliformem Bakterien

(E. coli) in Oberflächengewässern verwendet.

Zusammensetzung der Bestandteile des Nährbodens in g je Liter:

� Pepton 10,0

� Laktose 10,0

� Natriumdesoxycholat 1,0

� Natriumchlorid 5,0

� di-kaliumhydrogenphosphat 2,0

� Eisen(III)-Citrat 1,0

� Natriumcitrat 1,0

� Neutralrot 0,3

� Technischer Agar 15,0


6

Die Laktose dient den coliformen Bakterien als fermentierbare Kohlenstoffquelle. Der Abbau

von Laktose zu Säure wird durch einen Farbumschlag des pH-Indikators Neutralrot nach rosa

und durch einen gleichzeitigen Präzipitalhof von Gallensäure angezeigt. Die Kolonien von

Escherichia coli erscheinen somit rot und haben einen Präzipitalhof. Die Selektivität des

Agars wird durch Desoxycholat und Citrat erhöht, wodurch die grampositive Begleitflora

gehemmt wird. Die Selektivität wird bei anderen Desoxycholat-Nährböden mit größeren

Anteilen an Natriumdesoxycholat noch gesteigert.

Endo-C-Agar

Es handelt sich um einen Selektivnährboden nach ENDO(1904) zum Nachweis von

coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (Escherichia coli) in den verschiedensten

Materialien. Der Endo-C-Agar von MERCK (Art. Nr.: 1.10684.0500) hat folgende

Zusammensetzung in g je Liter:

� Pepton 10,0

� Laktose 10,0

� di-kaliumhydrogenphosphat 2,5

� Natriumsulfit, wasserfrei 3,3

� Pararosanilin (Fuchsin) 0,3

� Agar-Agar 12,5

Natriumsulfit und Fuchsin hemmen grampositive Bakterien. E. coli und Coliforme verwerten

Laktose unter Bildung von Aldehyd und Säure. Aldehyd setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfid-

Verbindung frei, welches dann die Kolonien rot anfärbt. Bei E. coli ist diese Reaktion so

intensiv, dass das Fuchsin auskristallisiert und dadurch den Kolonien einen

grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. Die Coliformen zeigen

keinen Fuchsinglanz. Fuchsin gilt als potenziell krebserzeugend. Deshalb darf man Farbstoff

und Nährboden nicht mit der Haut in Berührung bringen.

Durch Sauerstoffeinwirkung wird der aufgegossene Nährboden infolge der Oxidation des

Sulfits allmählich rot und damit unbrauchbar. Selbst in Dunkelheit und bei

Kühlschranktemperaturen ist er nur wenige Tage haltbar.

Chromocult-Coliformen-Agar

Der von MERCK entwickelte Coliformen-Agar (Art. Nr.: 1.10426.0100/0500) gehört zur

Produktgruppe der Chromocult-Trockennährböden. Die Bestimmung von Bakterien durch

diese speziellen Nährböden erfolgt mittels chromogener Substrate. Sie ermöglichen eine

schnelle Identifizierung von Bakterien durch den Nachweis charakteristischer Enzyme. Beim

Chromocult-Coliformen-Agar handelt es sich um einen Selektivagar zum gleichzeitigen

Nachweis von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) bei der bakteriologischen


7

Untersuchung von Wasser und Lebensmitteln. Der Coliformen-Agar setzt sich wie folgt

zusammen in g je Liter:

� Pepton 3,0


� di-Natriumhydrogenphosphat 2,7

� Natriumpyruvat 1,0

� Natrium-di-hydrogenphosphat 2,2

� Tryptophan 1,0

� Agar-Agar 10,0

� Sorbit 1,0

� Tergitol-7 0,15

� Chromogenmischung 0,4

(Enthält u.a. Salmon-GAL und

X-Glucuronid)

Durch die Kombination von geeigneten Peptonen, Pyruvat, Sorbit und Phosphatpuffer wird

ein schnelles Anwachsen auch von subletal geschädigten coliformen Bakterien gewährleistet.

Der Gehalt an Tergitol-7 hemmt weitgehend das Wachstum grampositiver und einiger

gramnegativer Bakterien, ohne Einflüsse auf das Wachstum der Coliformen zu haben.

Der simultane Nachweis von Coliformen und E.coli wird durch die neue Kombination von

zwei chromogenen Substanzen möglich. Das Substrat Salmon-GAL wird durch die Coliforme

charakteristische ß-D-Galactosidase gespalten und bewirkt eine rosa-rote Färbung der

Coliformen-Kolonien. Der Nachweis der für E. coli charakteristischen ß-D-Glucuronidase

erfolgt über das Substrat X-Glucuronid, das eine Blaufärbung der positiven Kolonien bewirkt.

Da E. coli sowohl Salmon-GAL als auch X-Glucuronid spaltet, färben sie sich dunkelblau-

violett. Somit sind sie leicht von den übrigen, rosaroten coliformen Bakterien zu

differenzieren.

Fluorocult-ECD-Agar

Der von MERCK für den Nachweis von E. coli entwickelte Fluorocult-ECD-Agar (Art.Nr.

1.04038.0100/0500) gehört zur Produktgruppe der Fluorocult-Trockennährböden. Der

Nährboden wird in der üblichen Weise mittels Oberflächenausstrich beimpft.

Der Nährboden besteht aus (Angaben in g/l):

� Pepton aus Casein 20,0

� Laktose 5,0



8

� Gallesalzmischung 1,5

� di-Kaliumhydrogenphosphat 4,0

� Kaliumdihydrogenphosphat 1,5

� Agar-Agar 15,0

� Tryptophan 1,0

� 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid 0,07

Die Gallesalzmischung diese E. coli-Direkt-Agars hemmt weitgehend die nicht obligat im

Darm vorkommende Begleitflora. Die Kolonien, die durch Spaltung des 4-

Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronids) hellblau fluoreszieren, werden mittels einer UV-Lampe

abgelesen. Zusätzlich wird durch eine positiven Indolprobe, die eine Rotfärbung hervorruft,

die Anwesenheit von E.coli bestätigt.

Der Fluorocult-ECD-Agar wurde als Trockensubstanz geliefert und im Labor angesetzt. Es

werden 53,1 g des Pulvers eingewogen und in einem Liter destillierten Wasser gelöst. Die

Lösung wird mit Hilfe eines pH-Meters auf pH 7,0 eingestellt und 15 Minuten bei 121°C

autoklaviert. Nach dem Abkühlen (ca. 45-50°C) der Lösung im Wasserbad wird die Lösung

in sterilen Petri-Schalen gegossen.

Bei den vier verwendeten Nährböden wurden zwei unterschiedliche Beimpfungsmethoden

angewendet. Die jeweilige Methode ergibt sich aus den in der Literatur empfohlenen

Anwendungsverfahren. Bei Nährböden, für die mehrere Beimpfungsmethoden in Betracht

kommen, wurde entweder die im Labor bereits bewährte Methode übernommen oder in

Vorversuchen das geeignetste Verfahren ermittelt.

2.2.3.2 Oberflächenausstrich

Im Oberflächenausstrich wurden folgende Nährböden beimpft:

� Endo-C-Agar (coliforme Bakterien bei 37°C, E. coli bei 44°C)

� Chromocult-Coliformen-Agar (coliforme Bakterien und E. coli bei 37°C)

� Fluorocult-ECD-Agar (E. coli bei 44°C)

Die fertigen Platten mit dem festen Nährboden für Endo-C-Agar und Chromocult-

Coliformen-Agar werden gekühlt vorrätig gehalten.

Vor der Benutzung werden die Nährböden mit geöffnetem Deckel im Brutschrank bei 37°C

für ca. 15 Minuten vorgewärmt. Dadurch wird eventuell in den Schalen vorhandenes

Kondenswasser entfernt und der Nährboden eignet sich anschließend besser zum

Ausstreichen der Keime. Die vorgewärmten Platten werden mit einem bestimmten Volumen

der Probe befüllt.

Die geeignetste Probenmenge wurde bei den Vorversuchen ermittelt. Bei der Endo-C-

Agarplatte konnte kein großes Volumen gewählt werden, da der Nährboden für größere

Volumen sich nicht als „saugfähig“ festgestellt hat. Aber bei der Fluorocult-ECD-Agarplatte


9

war wiederum ein kleines Volumen als „nicht geeignet“ gefunden. Da bei den Vorversuchen

kaum Kolonien abzulesen waren. Für den Chromocult-Coliformen-Agar haben sich beide

Probenmengen als geeignet herausgestellt. Direkt im Anschluss werden die vorgewärmten

Platten mit der flüssigen Probe beimpft und mit Hilfe eines Spatels ein gleichmäßiger

Ausstrich durchgeführt. Durch Drehen der Platte im Licht kann man die Verteilung der

Flüssigkeit auf der Platte beobachten. Nachdem die ausgestrichenen Platten getrocknet sind,

werden sie mit dem Deckel nach unten in Brutschränke für 37°C (Endo-C-Agar, Chromocult-

Coliformen-Agar) und 44°C (Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar) gestellt.

2.2.3.3 Einmischverfahren (Plattengussverfahren)

Das Einmischverfahren wurde nur bei Desoxycholat-Agar für coliforme Bakterien bei 37°C

und fäkalcoliforme Bakterien bei 44°C angewendet.

Um die Ergebnisse besser zu präsentieren und eine Grundlage für einen Vergleich zu bilden

wurden bei diesem Verfahren Parallelansätze durchgeführt, d. h. mit eine beliebige Probe A

wurde das Einmischverfahren mit Desoxycholat-Agar, 4x als Parallelansatz durchgeführt.

Der Nährboden ist in Kulturröhrchen abgefüllt und wird kühl gelagert. Für jede Platte werden

zwei Kulturröhrchen in einem Emaillebecher auf einer elektrischen Heizplatte solange

aufgekocht, bis sich der gesamte Inhalt verflüssigt hat. Anschließend wird das Röhrchen im

Wasserbad auf 45-48°C abgekühlt. Von der gut homogenisierten, geschüttelten Probe wird

ein definiertes Volumen in eine sterile Petri-Schale gegeben. Der flüssige, auf 45-48°C

abgekühlte Agar eines Kulturröhrchens wird nun in die Petri-Schale gegossen. Durch

Bewegen der Schale wird der Agar mit der Probe sorgfältig vermischt. Nach Erstarren dieser

Mischung wird die Petri-Schale mit dem zweiten verflüssigtem Agar aufgegossen. Nach

Erstarren dieser Schicht wird die Petri-Schale mit dem Deckel nach unten gerichtet in die

Brutschränken gegeben.

2.2.3.4 Membranfiltration

Die Membranfiltration wurde beim Tergitol-7-Agar angewendet. Bei der Membran-

filtrationsverfahren werden die steril gelieferten Membranfilter auf die Filtrationsanlage

gelegt. Es ist darauf zu achten, dass zwischen den einzelnen Arbeitsgängen die

Filtrationsanlage per Flammensterilisation entkeimt wird.

Das Inokulationsvolumen von 0,1 ml Referenzsuspension wird mit sterilem Wasser auf 100

ml gefüllt. Dieser Vorgang wird in einem sterilen Erlenmeyerkolben vorbereitet. Nach der

Filtration wird das Filter mit einer sterilen Pinzette auf den Agar gelegt. Die Platten werden

ebenfalls mit dem Deckel nach unten gerichtet in den Brutschrank bei 37°C gestellt (siehe

Kapitel 2.3.5.2).


10

2.2.3.5 Weitere Differenzierung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien

Eine weitere Bearbeitung und Bewertung der relativ schwach selektiven Desoxycholat-Platten

erfolgt durch die Identifizierung der Kolonien mit einer kleinen „Bunte Reihe“. Während der

experimentellen Tätigkeiten ist die Koloniezahl eine von den höchsten Werten, die eine

Vermutung auf falsch-positive Ergebnisse liefert. Deshalb wird für die weiteren Proben eine

Auswertung mit biochemischen Reaktionen „Bunte Reihe“ beschlossen. Diese sind bei allen 4

Parallelansätzen durchzuführen.

Die Bunte Reihe setzt sich aus Glucose-Röhrchen, Laktose-Röhrchen, Indol-Röhrchen und

Citrat-Röhrchen zusammen.

Nach der Bebrütungszeit der Desoxycholat-Agarplatten werden die Kolonien mit einen

Keimzählgerät ausgewertet und dokumentiert. Dann werden die einzelnen Kolonien

(neutralrot-rot) mit ausgeglühter Impfnadel in einem Indol-Röhrchen (Tryphtophan-Bouillon)

suspendiert und 3-6 h2 bei 36°C bebrütet. Von dieser Flüssigkeitskultur werden die zur

weiteren biochemischen Identifizierung dienenden Nährböden und Nährlösungen beimpft.

Das Glucose-Röhrchen wird bei 44°C, die anderen drei Röhrchen bei 36°C für 24 h bebrütet.

Glucose-Röhrchen

Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung des grünen Agars, sonst negativ.

Laktose-Röhrchen

Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung, sonst negativ.

Indol-Röhrchen

Positiv: Abbau des Tryptophans. Die farblose Lösung wird ca. 0,2 ml Kovacs-Reagenz

überschichtet. Das zugefügte Reagenz färbt rot, sonst negativ.

Citrat-Röhrchen

Positiv: Blaufärbung des grünen Agars, sonst negativ.

Oxidase-Reaktion

Mit eine sterilen Impföse wird eine kleine Menge der verdächtigen Kolonien (rot-rosa) auf der

markierten Stelle des Oxidasen-Teststreifens verrieben. Wird an der Stelle das Teststäbchen

blau bis blau-violett, ist die Reaktion positiv, sonst ist sie negativ. Dieser Oxidase-Test wurde

auch bei der Endo-C-Agarülatte durchgeführt und die Ergebnisse dokumentiert.

2 Stunden


11

Die Zusammensetzungen der Nährböden und Nährlösung werden in 2.3.4.3 dokumentiert.

Dort folgt eine „Lange Bunte Reihe“ mit 36 Komponenten.

2.3 MPN-Verfahren (Mehrfachansatz)

2.3.1 Allgemeines

Das Most-Probable-Number-Verfahren (MPN) ist eine Methode zur Keimzahlbestimmung in

Flüssigmedium, bei der das Bakterienwachstum im Mehrfachansatz bei verschiedenen

Verdünnungen Rückschlüsse über die vermeintlich in der Probe enthaltene Keimzahl zulässt.

Die Grundlage des Verfahrens ist ein flüssiges Selektivnährmedium, in dem durch bestimmte

Substrate bei Anwesenheit eines Bakteriums eine spezifische enzymatische Reaktion

stattfindet, die zu einem optischen Erkennungsmerkmal führt. Dies kann zum Beispiel ein

Farbumschlag der Nährlösung nach entsprechender Inkubationszeit oder ein fluoreszierendes

Reaktionsprodukt sein.

Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl werden parallele Verdünnungsreihen von

einer Probe erstellt. Bei der Auswertung werden die jeweils positiven Röhrchen in den

einzelnen Verdünnungsstufen gezählt und die MPN-Kennzahl aufgestellt. Mit Hilfe einer

Statistiktabelle kann man aufgrund der vorliegenden Röhrchenkombination die

wahrscheinlichste Keimzahl ablesen. Beim MPN-Verfahren wird demnach nicht direkt die

sichtbare Koloniezahl bestimmt, sondern die wahrscheinlichste Keimzahl statistisch ermittelt.

Die statistische Sicherheit der Ergebnisse nimmt mit der Anzahl der Parallelansätze zu. Je

mehr Parallelansätze verwendet werden, desto höher ist die Genauigkeit der Tabellenwerte.

Die Anwendung der MPN-Methode kann in verschiedenen Fällen von Vorteil sein. Einerseits

gibt es Bakterien, die nicht auf festen Medien kultiviert werden können und somit nur mit

Flüssigmedien nachgewiesen werden können. Andererseits wird das Verfahren bevorzugt,

wenn die Kinetik des Wachstums verschiedener Bakterien in der Probe stark variiert. Wenn

zum Beispiel einige Keime sofort anfangen zu wachsen, sich ausbreiten und schließlich große

Kolonien bilden, können dabei die Kolonien der Bakterien, die von Interesse sind und die sich

erst später ausbilden, verdeckt werden.

MPN-Verfahren mit 3er- Ansatz

Bei z. B. 3 Parallelen führt ein Unterschied von einem positiven Röhrchen in der Kennzahl

(3-3-0 und 3-3-1) bereits zu einer Verdopplung der Keimzahl (24 und 46 KBE/ml). Damit

können Keimzahldifferenzen von weniger als 50% nicht quantitativ bestimmt werden.

Dagegen ist z. B. bei 10 Parallelen die Differenz der Tabellenwerte zweier

aufeinanderfolgender Kennzahlen wesentlich kleiner, es können Unterschiede von ca. 10%

bestimmt werden.

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt anhand der MPN-Statistiktabellen nach MC

CRADY(siehe Anhang), die für Auswertungen von 3er- und 5er-MPN verwendet werden. Bei

diesen mathematischen Ansätzen wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit einer Anzahl


12

bestimmter Volumina in verschiedenen Verdünnungsstufen eine gewisse Kombination an

positiven und negativen Röhrchen zu erhalten. Die Tabelle von MC CRADY wird zur

Auswertung der routinemäßigen Untersuchung der Oberflächengewässer mittels MPN-

Methode im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg verwendet.

Die Anwendung der Tabelle von MC CRADY beinhaltet genaue Vorgaben in bezug auf die

Verdünnungsstufen und Parallelansätze. Die Volumina, durch die bei gleichem Volumen der

Nährlösung die einzelnen Verdünnungen erreicht werden, sind bei MC CRADY festgelegt.

Die Tabelle gilt nur dann, wenn die erste Verdünnung (10-1) mit 1 ml, die zweite (10-2) mit

0,1 ml und die dritte(10-3) mit 0,01 ml angesetzt wird. Auch die Zahl der Parallelansätze ist

nicht frei wählbar, sondern mit 3 oder 5 ebenfalls vorgegeben.

Die Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen einzelner Röhrchenkombinationen ist in

Kategorie zwischen 1 (am wahrscheinlichsten) und 3 (wenig wahrscheinlich) angegeben. Im

Einzelnen bedeuten die Kategorien folgendes:

� Kategorie 1: Am wahrscheinlichsten vorkommende Röhrchenkombinationen. Andere

Kombinationen werden mit einer Wahrscheinlichkeit von höchstens 5% erhalten.

� Kategorie 2: Weniger wahrscheinlich als in Kategorie 1 vorkommende

Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 und 2 werden mit

einer Wahrscheinlichkeit vom höchsten 1 % erhalten.

� Kategorie 3: noch weniger wahrscheinlich als in Kategorie 2 vorkommende

Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 bis 3 werden mit einer

Wahrscheinlichkeit von höchstens 0,1 % erhalten.

Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A

Bei einem Oberflächengewässer und einem MPN-Ansatz mit 3 Parallelansätzen d.h. 9

Kulturröhrchen, hat sich für beliebige Probe A folgendes Schema ergeben:

Tabelle 2.1: Ermittlung der MPN-Kennzahl • = positive Röhrchen Parallelansätze

Impfvolumen[ml] Verdünnungen 1 2 3 Positive

1 1:10 • • • 3

0,1 1:100 • • • 3

0,01 1:1000 • - - 1

Um die MPN-Kennzahl zu ermitteln, wird diejenige Verdünnungsreihe für die letzte Ziffer

der Kennzahl ausgewählt, in der noch positive Röhrchen zu finden sind. Das wäre in diesem

Fall ein MPN-Kennzahl von 3-3-1 (Tab.: 2.1). In der Statistiktabelle von MC CRADY für 3

Parallelansätze findet man die entsprechend dieser speziellen Zahlenkombination

wahrscheinlichste Keimzahl. In diesem Beispiel würde sich aus der entsprechende Tabelle ein

Wert von 4600 Keimen pro 100 ml, beziehungsweise 1 ml der Probe entsprechen 46 Keime.


13

2.3.2 Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli)

Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl von Escherichia coli mit Hilfe der MPN-

Methode wurde Fluorocult-Laurylsulfat-Bouillon verwendet.

Der Nährboden von MERCK (Art.-Nr.: 1.12587.0100/0500) entspricht der DIN-Norm 10110

zur Untersuchung von Milch, den Vorschriften nach § 35 LMBG (06.00/36) zur

Untersuchung von Lebensmitteln und dem ISO Standard 6391 (1996) zur Untersuchung von

Milch und Milchprodukten. Weiterhin wird die MUG-Laurylsulfat-Bouillon als geeignete

Methode von Gesamtcoliformen und Fäkalcoliformen nach der Badegewässerrichtlinie

76/160/EWG empfohlen.

Zur Differenzierung der Gesamtcoliformen und der Fäkalcoliformen wird ein

fluoreszenzoptischer Test durchgeführt. Das 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid wird nur

von den Fäkalcoliformen (E. coli) gespalten und das Spaltprodukt Methylumbelliferon

entsteht. Diese Substanz erzeugt Fluoreszenz im UV-Licht bei 366 nm. Die MUG-

Laurylsulfat-Bouillon wird insbesondere für die Most-Probable-Number-Methode (MPN)

eingesetzt.

Der Nährboden enthält folgende Bestandteile in g/l:

� Tryptose 20,0

� Laktose 5,0

� Dikaliumhydrogenphosphat 2,75

� Laurylsulfat-Natriumsalz 0,1

� L-Tryptophan 1,0

� 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid(MUG) 0,1

Der Gehalt an Laurylsulfat hemmt weitgehend das Wachstum von Begleitorganismen,

insbesondere Pseudomonaden. Zum Nachweis der Gesamtcoliformen werden die

Kulturröhrchen mit Gärröhrchen nach DURHAM versehen. Nach einer Inkubationszeit von

48 h bei 37° C führt die Laktosegärung der Gesamtcoliformen zur Gasbildung im DURHAM-

Röhrchen.

2.3.2.1 Durchführung der Untersuchungen

Bei der Durchführung der MPN-Methode wurden folgende Materialien und Geräte benötigt:

� Brutschränke 37°C

� Eppendorf-Pipetten 1 ml, 100µl, 10µl

� Sterile Pipettenspitzen 1 ml, 100 µl (EPPENDOEF BIOPUR)

� Sterile Pipettenspitzen 10µl (EPPENDORF EUROTIPS)

� Reagenzständer

� UV-Lampe 366 nm


14

Für das Most-Probable-Number-Verahren wurden die Kulturröhrchen für die Proben A 4x als

Parallelansatz vorbereitet, d.h. für Probe A wurde jeweils 36 Röhrchen mit der flüssigen

Bouillon in drei Verdünnungsreihen zu je 3 Röhrchen im Reagenzständer aufgestellt. Die drei

Verdünnungen wurden mit 1:10, 1:100 und 1:1000 festgelegt, dementsprechend

Probenvolumina von 1 ml, 0,1 ml und 0,01 ml pipettiert. Die Suspension wurde den drei

Verdünnungsreihen entsprechend mit drei verschiedenen Pipetten zugegeben. Für jede Reihe

wurde eine Pipettenspitze benutzt, mit deren Spitze man in die Bouillon eintaucht und die

Flüssigkeit ausdrückt. Vor jedem Pipettiervorgang muss die Probe geschüttelt werden. Nach

der Bebrütungszeit werden die Kulturröhrchen nach Gasbildung für coliforme Bakterien und

Fluoreszenz für Escherichia coli untersucht.

Die Auswertung erfolgt durch die Ermittlung der MPN-Kennzahl und das Ablesen des

Ergebnisses aus der Statistiktabelle von MC CRADY. Dann wird von den einzelnen

Parallelansätzen der Mittelwert gebildet.

2.3.3 MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli

2.3.3.1 Allgemeines

Diese miniaturisierte Methode zur Keimzahlbestimmung in Wasserproben beruht auf

demselben Prinzip zur Ermittlung der wahrscheinlichsten Anzahl wie das herkömmliche

MPN-Verfahren.

Die Mikrotiterplatte besteht aus 96 Vertiefungen, in denen sich das Nährmedium in Form von

Trockensubstrat befindet. Die Aufteilung der Vertiefungen auf der Platte ergibt sich zu 12

Reihen mit jeweils 8 Vertiefungen. Jede einzelne Vertiefung ist aufgrund eines auf der Platte

eingravierten Planquadrates gekennzeichnet, so dass man die Einteilung in verschiedene

Verdünnungsstufen problemlos vornehmen kann. Je nach der zu erwartenden Keimzahl

werden die 96 Vertiefungen in 2, 4 oder 6 Verdünnungsstufen unterteilt. Die Wahl der

geeigneten Probenverdünnung lässt sich anhand der Probenherkunft in drei Kategorien

einteilen (Tab.: 2.2).

Tabelle 2.2: Verdünnungsstufen in Abhängigkeit der Keimzahl bei Verwendung von Mikrotiterplatten

Art der Probe Anzahl der Verdünnungsstufen

Anzahl der Vertiefungen je Verdünnungen

Messbereich [Keimzahl/ml]

Badegewässer 2 64 für 1:2 32 für 1:20

15∗10-2 – 3,5∗102

Oberflächengewässer

4

Jeweils 24 für 1:2, 1:20, 1:200 und

1:2000

40∗10-2 – 3,2∗104

Abwässer 6 Jeweils 16 für 1:2 bis 1:200 000

60∗10-2 – 6,7∗106


15

Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl in der Probe werden Statistiktabellen für

die einzelnen Anwendungsbereiche vom Hersteller BIO RAD mitgeliefert. Dabei wird zu

jeder Kennzahl zusätzlich das 95%-Intervall als Vertrauensbereich angegeben. Die Anzahl

positiver Reaktionen je Verdünnungsstufe ergibt die Kennzahl. Bei mehr als drei

Verdünnungsstufen sollte die dreistellige Kennzahl, wenn möglich in der dritten Verdünnung

keine Positiven mehr haben, also auf null enden.


Bei Oberflächengewässer werden zwei Verdünnungsstufen angewendet, da dass sich jeweils

eine zweistellige Kennzahl ergibt. Zum Beispiel erhält man folgende Werte:

Verdünnung 1:2: 25 positive Vertiefungen von 64

Verdünnung 1:200: 3 positive Vertiefungen von 32

Es ergibt sich daraus die Kennzahl 25/3. Aus der Statistiktabelle für zwei Verdünnungen

lassen sich folgende Werte ablesen:

Tabelle 2.3: Darstellung der charakteristischen Zahl mit den unteren- und oberen Grenzwerten

Charakteristische

Zahl

Statistische

Tabellenwert

Untere Grenzwert Obere Grenzwert

25/64 3/32 524 360 763

In diesem Beispiel erhält die Probe A 524 Keime/100 ml (95%-Vertrauensberiech: 360-763).

Der Nachweis der Fäkalindikatoren (E.coli) erfolgt durch eine enzymatische Reaktion der

Bakterien mit dem Substrat, das durch die Zugabe von Probe und Probenverdünnungspuffer

rekonstituiert wird. Bei positiver Reaktion wird eine fluoreszierende Substanz freigesetzt. Der

Nährboden wird als Trockensubstrat in den sterilen, gebrauchsfertigen Mikrotiterplatte der

Firma BIO RAD GmbH (Art.-Nr.: 3553785) geliefert. Bei dem Trockensubstrat in den 96

Vertiefungen der Mikrotiterplatte handelt es sich um einen Nährboden, der MUG (4-

Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid) enthält. Das Verfahren basiert auf demselben

fluoreszenzoptischen Nachweis von E. coli, der bereits bei der MPN-Methode erläutert wurde

(Kapitel 2.3.2).


Für die Anwendung der Mikrotiterplatten wurden folgende Materialien verwendet:

� Mikrotiterplatte E.coli (Art.-Nr.: 3553785) der Firma BIO RAD GmbH

� Spezial-Probenverdünnungspuffer SDP (BIO RAD GmbH, Art.-Nr.3554280)

� Abdeckfolien (Zubehör Mikrotiterplatten)

� Sterile Röhrchen

� Vollpipette, 10 ml


16

� Eppendorf-Pipette, 1 ml

� Mehrkanal- (8er)- Pipette

� Sterile Pipettenspitzen 100 µl

� Reagenz-Reservoirs für Mehrkanalpipetten (V-Form, 60 ml, WILKE und WITZEL, Art.-

Nr.: 9510027)

� UV-Lampe 366 nm

Zur Bestimmung der Keimzahl in Proben aus Oberflächengewässern ist ein Ansatz mit zwei

Verdünnungsstufen ausreichend, da die zu erwartende Keimzahl im unteren Drittel des

Messbereiches für zwei Verdünnungen liegt.

Die Probe A, die zu einem besseren Vergleich der Verfahren dienen sollte, war kaum belastet,

dass diese Probe beim Mikrotiterverfahren in Parallelansätzen nicht durchgeführt werden

konnte. Deshalb sind andere beliebige Proben, die eine höhere Keimzahlwachstum haben

untersucht. Sie werden wie folgt durchgeführt:

Für jede Mikrotiterplatte werden bei zwei Verdünnungsstufen je zwei Röhrchen à 9 ml

Probenverdünnungspuffer (SDP) benötigt. Dieser Verdünnungspuffer wird fertig geliefert und

musste nicht selbst hergestellt werden. In das erste Röhrchen werden 9 ml der Probe gegeben.

Die Vermischung der Flüssigkeiten im Röhrchen erfolgt durch mehrmaliges Aufziehen mit

der Vollpipette. Von dieser ersten Verdünnungsstufe (1:2) wird 1 ml mit der Eppendorf-

Pipette entnommen und in das zweite SDP-Röhrchen gegeben (Verdünnung 1:20) Mit diesen

Verdünnungen wird die Mikrotiterplatte beimpft. Mit der Acht-Kanal-Pipette werden z.B. die

ersten 64 (8∗8) Vertiefungen mit je 200 µl der ersten Verdünnung befüllt, die letzten 32 (4∗8)

Vertiefungen mit der zweiten Verdünnung. Anschließend wird die Platte mit einer

Abdeckfolie überklebt und in den Brutschrank für 48 h bei 44°C gestellt. Ausgehend von 10

ml Probensuspension werden 9 ml mit 9 ml SDP vermischt und ergeben damit die erste

Verdünnungsstufe für die Mikrotiterplatten (Verdünnung 1:2, 64 Vertiefungen). Von dieser

ersten Verdünnung ausgehend wird 1 ml erneut mit 9 ml Probenverdünnungspuffer vermischt

und es ergeben sich 10 ml der Verdünnung 1:20 für die zweite Verdünnungsstufe (32

Vertiefungen). Die Aufteilung der Proben in die Mikrotiterplatte mit der Mehrkanalpipette

bereitet keine Schwierigkeiten, da die speziellen Reagenz-Reservoirs eine V-Form besitzen

und dadurch selbst bei kleinen Flüssigkeitsmengen einen ausreichend hohen

Flüssigkeitsspiegel gewährleisten.

Tabelle 2.4: Vergleich von vorhandenem und benötigtem Suspensionsvolumen zur Beimpfung der Mikrotiterplatten

Mikrotiterplatten: Vorhandenes Volumen Benötigtes Volumen

1. Verdünnung

9 ml Suspension + 9 ml SDP = 18 ml

-1 ml für die 2. Verdünnung = 17 ml

64∗0,2 ml

= 12,8 ml

2. Verdünnung

1 ml Suspension (aus der 1.Verdünnung) + 9 ml SDP

= 10 ml

32∗0,2 ml = 6,4 ml


17

2.3.4 Colilert-18®/Quanti-Tray®-Verfahren

2.3.4.1 Allgemeines

Der Colilert 18/Quanti-Tray-Verfahren ist ein Schnellverfahren für Wasserproben. Das

Verfahren ermöglicht den endgültigen Nachweis von coliformen Bakterien und Escherichia

coli in einem einzigen Anreicherungsschritt innerhalb von 18 Stunden.

Die qualitative als auch die quantitative Auswertung erfolgt über die Beurteilung der

Gelbfärbungen bzw. der Fluoreszenz.

Verfahrensprinzip:

Coliforme Bakterien metabolisieren innerhalb von 18 Stunden bei 36°C das farblose ortho-

Nitrophenol-ß-D-Galaktopyranosid (ONPG), einen Indikatornährstoff, unter Abspaltung des

gelben ortho-Nitrophenols.

Escherichia coli ist zusätzlich in der Lage, 4-Methyl-Umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG),

einen weiteren Indikatornährstoff, unter Abspaltung des fluoreszierenden 4-Methyl-

Umbelliferons zu metabolisieren. Bei Anwesenheit von E. coli wird durch die Aktivität der ß-

Glucuronidase aus dem Substrat Methyl-umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG) das

fluoreszierende 4-Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UV-

Lampe sichtbar gemacht.


Für die Anwendung der Colilert-18/Quanti-Tray-Verfahren wurden folgende Materialien

verwendet:

� IDEXX-Geräte, -Nährböden und –Testreagenzien

� Reaktionsgefäß mit Antifoam IDEXX-Bestellnr. 98 06160 00

� Quanti-Tray-Sealer IDEXX-Bestellnr. 98 10896 00

� Quanti-Tray-Einwegtrays IDEXX- Bestellnr. 98 21378 00

� Quanti-Tray-2000 Einwegtrays (MPN=2419) IDEXX-Bestellnr. 98 21675 00

� UV-Sichtkasten der Fa. IDEXX-Bestellnr. 98 21322 00

� Gummimatte Quanti Tray IDEXX- Bestellnr. 98 21322 00

� Gummimatte Quanti Tray 2000 IDEXX-Bestellnr. 98 09226 00

� Quanti-Tray-/2000 Comperator IDEXX-Bestellnr. 98 09227 00

� Colilert 18/200 Blisterpacks für 100 ml Wasserprobe Bestellnr. 98 21373 00

� Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211)

� Steriles demineralisiertes Wasser, falls Verdünnungen erforderlich


18

� Brutschrank Memmert, thermostatisiert, (36±1)°C

� Kühlschrank

� Wasserfester Stift

Die 100 ml Wasserprobe wird unter sterilen Bedingungen in das versehene 100 ml-Colilert-

Kulturgefäß überführt. Unter dem Abzug wird der Inhalt einer Packung Colilert-18 (Pulver)

vorsichtig dazugegeben. Nach Auflösen des Pulvers (ca. 15 Min.) wird der Ansatz in einen

leeren, sterilen Quanti-Tray-Behälter überführt. Hierbei wird der Quant-Tray mit einer Hand

angefasst und senkrecht gehalten, wobei die Seite mit den Vertiefungen zur Handfläche

zeigen soll. Der obere Teil des Trays wird zusammengedrückt, so dass sich der Träger zur

Handfläche hinbiegt. Der Tray wird geöffnet, indem die Folienlasche von der Seite mit den

Vertiefungen abgezogen wird. Die vorbereitet Mischung aus Probe und Reagenzien wird

direkt in den Tray gegossen, dabei ist eine Berührung der Folienlasche unbedingt zu

vermeiden. Somit wird die Sterilität gesichert.

Die mit der Probe gefüllten Tray wird auf die Gummi-Trägerunterlage das Quanti-Tray-

Versiegelungsgerät gestellt. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten weisen,

damit sie in die Unterlage passt. Die Trägerunterlage wird in das Versiegelungsgerät

geschoben bis es vom Transportmechanismus erfasst und ins Gerät gezogen wird. Innerhalb

von 15 Sekunden wird der Tray versiegelt und auf der Rückseite des Gerätes ausgeworfen.

Der Tray wird aus der Trägerunterlage entnommen und 18 h im Brutschrank bei 36 ± 1 °C

inkubiert.

Hauptsächlich wurde die Verdünnung von 1:10 gewählt. Nur für die Abwasserproben war die

Verdünnungsstufe 1:100 sinnvoller. Die Verdünnungen wurden mit sterilem Wasser

durchgeführt.

Auswertung:

Die Proben müssen exakt nach 18 Stunden ausgewertet werden. Nach Ablauf von 18 Stunden

können andere heterotrophe Keime das Hemmsystem von Colilert-18 überwinden. Wenn

dann eine Gelbfärbung bzw. Gelbfärbung und Fluoreszenz beobachtet wird, gilt dies nicht als

positives Ergebnis. Um positive Reaktionen eindeutig von negativen unterscheiden zu

können, wird als Referenz die Komparator-Lösung mit dem Ansatz verglichen. Falls bei

einem Ansatz ohne Gelbfärbung eine Fluoreszenz auftreten sollte, ist dieser Ansatz als

negativ zu betrachten, es handelt sich auf keinen Fall um Escherichia coli.

Für Keimzahlen bis zu 200 wird ein Tray mit 51 großen Vertiefungen verwendet, für

Keimzahlen bis 2000 ein Tray mit 97 Vertiefung (Quanti-Tray-2000). Die Quanit-Tray-2000

enthält 49 große Vertiefungen und 48 kleine Vertiefungen. Bei einer hohen Keimbelastung

wird die Probe, vor der Zugabe des Pulvers, verdünnt. Nach der Bebrütungszeit wird die

Keimzahl anhand der Anzahl gelber bzw. fluoreszenter Vertiefungen ermittelt.


19

Tabelle 2.5: Qualitativer Nachweis von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (E. coli) Eigenschaften des Ansatzes Ergebnis

Farblos oder leichte Verfärbung (geringer als Komparator-Lösung)

Escherichia coli: n.n.3 Coliforme Bakterien: n.n.

Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Komparator-Lösung, ohne Fluoreszenz

Escherichia coli: n.n. Coliforme Bakterien: pos.

Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Komparator-Lösung, mit Fluoreszenz

Escherichia coli: pos. Coliforme Bakterien: pos.

Die gelben, positiven Vertiefungen werden für die Coliforme und zusätzlich den

fluoreszierenden Vertiefungen für E. coli entsprechend gezählt. Die aus der Anzahl der

positiven Reaktionen in den Wells4 sich ergebende wahrscheinliche Zahl (MPN) wird in der

„MPN-Tabelle für Quanti-Tray mit 51 Vertiefungen“(siehe Anhang) abgelesen. Die erste

Spalte beinhaltet die positiven Vertiefungen bei einer 100 ml Probe. Man sucht die Zeile der

positiven Vertiefungen und liest den dazugehörigen Wert in der zweiten Spalte ab. Die MPN-

Tabelle weist eine obere und untere Vertrauensgrenze von 95% auf.

Für die Auswertung des Quanti-Tray 2000 benutzt man die „Quanti-Tray 2000 MPN-Tabelle“

(siehe Anhang). In der ersten Spalte waagerecht sucht man den Zahlenwert der positiven

großen Vertiefungen und in der ersten horizontalen Spalte den Wert der positiven kleinen

Taschen. Dort wo sich die Spalten treffen, kann die wahrscheinliche Zahl (MPN) abgelesen

werden. Falls der Ansatz davor verdünnt wurde, muss der Verdünnungsfaktor mit

eingerechnet werden.


Tabelle 2.6: Darstellung der charakteristischen Zahl für Colilert-18 Positiven großen Vertiefungen

Positiven kleinen Vertiefungen

Charakteristische Zahl

Statistische

Tabellenwert

49 44 49/44 1553,1

In diesem Beispiel lautet der statistische Tabellenwert 1553,1/100 ml Wasserprobe. Da in

diesem Beispiel eine Verdünnung von 1:10 vorgenommen wurde, ist das Ergebnis 15531/100

ml Wasserprobe oder 1 ml der Probe entsprechen 155,31 Keime.

Absicherung der Befunde:

Eine weitere Untersuchung der Colilert-18 zur Identifizierung von coliformen und

fäkalcoliformen Bakterien ist die Weiterbearbeitung der Anreicherungsflüssigkeit nach der

Bebrütungszeit der Colilert-18. Die leichte Verfärbung der Vertiefungen, die nicht geringer

sind als der Komparator-Lösung, sollen unter sterilen Bedingungen auf Endo-C-Agar-Platten

ausgestrichen werden.

3 Nicht Nachweisbar 4 Vertiefungen


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Die Unterseite der versiegelten Trays wird mit Desinfektionsmittel gereinigt und mit sterilen

Impfnadeln gestochen. Die hellgelbe Anreicherungsflüssigkeit wird mit Hilfe einer sterilen

Impföse auf Endo-C-Agar-Platte ausgestrichen und bei 37°C bebrütet. Die fluoreszierende

Anreicherungsflüssigkeit auch ausgestrichen aber bei 44°C bebrütet.

Es war bei früheren Untersuchungen der Verdacht aufgetaucht, dass das Verfahren Colilert-18

falsch-positive Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse der Endo-C-Agar-Platten waren negativ.

Dieses Ergebnis stellt die These auf, dass das Colilert-18-Verfahren falsch-positive

Ergebnisse liefert. Um diese These zu bestätigen, wird eine „Lange Bunte Reihe“

durchgeführt.

2.3.4.3 Prüfungen biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch die Lange

Bunte Reihe

Die „Lange Bunte Reihe“ ist die Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen.

Sie besteht aus 36 Komponenten wie zum Beispiel Malonat-Test, Nitrat-Test, Citrat-Test etc.

und dient zur Identifizierung der einzelnen Kolonien anhand der positiven bzw. negativen

Reaktionen der einzelnen Nährböden. Die Auswertung der „Lange Bunte Reihe“erfolgt

anhand der „Table of Biochemical reaction“(Biochemical reaction of the nemed species,

biogroups, and Enteric Groups of the family Enterobacteriaceae).

Indolbildung

Gewisse Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Tryptophan abgebauter Eiweiße, Indol zu

bilden. Diese Substanz lässt sich im Medium mit einer Testlösung nachweisen. Hierfür

verwendete Reagenz ist das KOVACS´Reagens. Dieses Reagenz ist z. B. von „Merck“

erhältlich. Das tryptophanreiche Nährmedium wird von der Nährbodenküche geliefert.

Technik:

Nach Beimpfung wird das Röhrchen 24-48 h bei 36 °C bebrütet. Dann setzt man einige

Tropfen (ca. 1 ml) KOVACS´Reagenz zu.

Bewertung:

Positiv: Das zugesetzte Reagenz verfärbt sich an der Oberfläche rot.

Negativ: Keine Verfärbung des zugesetzten Reagenzes.

Nachweis der Kohlenhydrate

Die beim Abbau von Kohlenhydrate entstehende Säure wird durch den Umschlag eines dem

Testsubstrat zugesetzten Indikators sichtbar. Der meist hierfür benutzte Farbstoff

Bromthymolblau schlägt dabei von blaugrün nach gelb um; Alkalisierung führt zum

Umschlag nach blau. Die Reaktion kann nach 24 h Bebrütung abgelesen werden, wenn auch

die Säurebildung eingetreten ist.


21

Reagenzien und Testsubstrat:

Bromthymolblau-Lösung (2%ig Fertiglösung z. B. OXOID)

Grundsubstrat:

� Fleischextrakt (OXOID) 5,0 g

� Pepton 10,0 g

� NaCL 3,0 g

� Na2HPO4 2,0 g

� Aqua dest. 1000,0 ml

Monosaccharide sowie gewisse Alkohole, sind z. B. Dextrose, Mannit, Inosit, Maltose, Sorbit,

Adonit, Salicin, Arabinose und Dulcit. Sie können dem Grundsubstrat in eine Konzentration

von 0,5 – 2,0 % vor der Sterilisation zugesetzt werden. Die Nährmedien werden von der

Nährbodenküche geliefert.

Technik:

Kohlenhydratmedien mit geringer Mengen Kulturmaterial 20 h bei 37°C bebrüten.

Bewertung:

Positiv (Säurebildung):Farbumschlag nach gelb (Bromthymolblau), unter diffuser Trübung

des Substrates.

Negativ: Kein Indikatorumschlag; Trübung des Nährbodens.

Nachweis der Gasbildung:

Der Abbau der Kohlenhydrate kann mit oder ohne Bildung von Gas vor sich gehen. Die

Gasbildung wird mittels kleiner, in die kohlenhydrathaltigen Röhrchen eingebrachter

Gärröhrchen nach Durham nachgewiesen. Außerdem kann die Gasbildung wie bei Kligler-

Agar durch das Auftreten von Gasblasen, Rissen in der Agarsäule oder Zersprengen des

Nährbodens erkannt werden (siehe Kligler-Zweizucker-Eisen-Agar).

Oxidase-Reaktion

Oxidasen sind Enzyme, die Oxidationsvorgänge im Bakterienstoffwechsel katalysieren. Sie

finden sich vor allem bei obligaten Aeroben wie Pseudomonas. Zum Nachweis der Oxidasen

bedient sich gewisser Redox-Farbstoffe z.B. N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminhydrochlorid.

Durch Einwirkung der Bakterien-Oxidase nehmen diese im reduzierten Zustand farblosen

Reagenzien eine schwarzbraune bzw. blauviolette Farbe an.

Technik:

Heutzutage verwendet man Teststreifen, die mit Oxidase-Reagenz getränkt sind. Die zu

prüfende Kolonie wird mit einer Platinöse auf dem Teststreifen eingerieben.


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Bewertung:

Oxidase-positiv: Teststreifen verfärbt sich in blauviolett, z. B. Pseudomonas, Aeromonas,

Neisserien.

Oxidase-negativ: Teststreifen verfärbt sich in gelb bzw. farblos, z. B. E. coli, coliforme

Bakterien.

ß-Galaktosidase-Test (ONPG-Test)

Das Enzym ß-Galaktosidase spaltet Laktose, in Dextrose und Galaktose. Bei verzögertem

Laktoseabbau kann der Nachweis der ß-Galaktosidase die Diagnostik beschleunigen. Das

Ferment muss jedoch zunächst durch Tuluol aus dem Zellinneren der Bakterien freigesetzt

werden, bevor es mit o-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid (ONPG) nachgewiesen werden kann.

ONPG wird dabei in Galaktose und o-Nitrophenol, das eine kräftige gelbe Farbe besitzt,

gespalten.

Die beiden Lösungen:

Lösung 1(Pufferlösung, pH 7,0):

� NaH2PO4 ∗2H2O 6,9 g


pH-Wert mit konz. NaOH auf 7 einstellen und auf 50,0 ml Aqua dest. auffüllen.

Lösung 2(ONPG-Lösung):

� o-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid 0,08 g


Technik:

Die Pufferlösung (Lösung 1) vorher einige Minuten im Brutschrank zur Lösung der

Phosphatkristalle anwärmen. Beide Lösungen werden zu gleichen Teilen gemischt. Das

Röhrchen nach beimpfen 18 h, bei 37°C bebrüten. Die Anreicherungskultur in 0,25 ml NaCl-

Lösung aufschwemmen und 1 Tropfen Toluol zusetzen. Dann 10 Min. in den Brutschrank

(37°C) stellen. Anschließend 0,25 ml Reagenzlösung 2 zufügen.

Bewertung:

Ablesung nach 20 Minuten.

Positiv: Gelbfärbung (z. B. Hafnia, meiste Colistämme).

Negativ: Keine Farbänderung.


23

Methylrot-Reaktion

Bei Spaltung von Dextrose wird unter geeigneten Bedingungen auf etwa 4,5 erniedrigter pH-

Wert (Umschlagspunkt des Methyl-Rot-Indikators) durch bestimmte Mikroorganismen ein

längerer Zeitraum aufrechterhalten. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe weniger Tropfen

Methyrotindikatorlösung zum Testssubstrat.

Reagenz: Methylrotlösung (0,1 g Methylrot in 300 ml 96%igem Äthylalkohol lösen, dann 200

ml Aqua. dest. zusetzen).

� Testsubstrat ( z. B. OXOID):

� Pepton 7,0 g

� K2HPO4 5,0 g

� Glukose 5,0 g


Technik:

Nährboden nach Beimpfung 48 h bei 36 °C bebrüten, dann 5 Tropfen Reagenz zusetzen und

kurz schütteln.

Bewertung:

Positiv: Rotfärbung des Mediums nach Zugabe der Indikatorlösung.

Negativ: Gelbfärbung.

Voges-Proskauer-Reaktion

Während einigen Bakterien (z. B. E. coli) aus kohlenhydrathaltigen Medien Säuren bilden

(Methylrot-Reaktion: pos.), kommt es durch Einwirkung anderer Keime (z.B.

Enterobacteriaceae) zur Bildung von Acetylmethylcarbinol, einem Zwischenprodukt des

Kohlenhydratstoffwechsels.

Reagenzien: (Barrit-Methode)

1. 5%ige Lösung von α-Naphthol in absolutem Äthylalkohol

2. 40%ige wässrige Lösung von KOH.

Testsubstrat: Wie bei Methylrotreaktion.

Technik:

1 ml einer mindestens 2 Tage bebrüteten Bouillonkultur werden zunächst 0,6 ml α-Naphhol-

Lösung (5%ig in absolutem Alkohol) und 0,2 ml einer 40%igen KOH-Lösung zugefügt. Das

Gemisch wird geschüttelt und über der Flamme leicht erwärmt.


24

Bewertung:

Positive Reaktion: Rote Farbe (in wenigen Minuten).

Negative Reaktion: Gelblich-bräunliche-Farbe bzw. Niederschlag.

Phenylalanindeaminase-(PAD)-Test

Phenylalanindeaminase, ein bei Bakterien der Proteus-Providencia-Gruppe vorkommendes

Ferment, spaltet Phenylalanin unter Bildung von Phenylbrenztraubensäure. Diese reagiert mit

Eisen III-Salzen, wobei Grünfärbung entsteht.

Reagenz: 10%ige FeCl3-Lösung

Testsubstrat:

� Hefeextrakt 3,0 g

� DL-Phenylalanin 1,0 g

� Na2HPO4 1,0 g

� NaCl 5,0 g

� Agar Oxoid Nr.3 12,0 g

� Aqua. dest 1000,0 ml

Technik:

Schrägfläche des Nähbodens kräftig beimpfen, 24 h bei 36°C bebrütet, dann einige Tropfen

10%ige FeCl3-Lösung auftropfen und über die Schrägfläche laufen lassen.

Bewertung:

Positiv: Grüne Verfärbung der aufgetropften Flüssigkeit und zum Teil auch des Nährbodens.

Negativ: Keine Verfärbung.

Lysin- und Ornithindecarboxylase-, Arginindihydrolase-Test

Durch das Fermentsystem bestimmter Bakterien werden unter anaeroben Bedingungen

(Versuchsröhrchen mit Paraffin abdichten) die Aminosäure L-Lysin und L-Ornithin

decarboxyliert, wobei die entsprechenden Amine und CO2 entstehen. Durch die

Arginindihydrolase von gewissen Bakterien wird Arginin zu CO2 und NH3 abgebaut. Die

Folge ist ein Anstieg des pH-Wertes. Dieser Vorgang wird jedoch erst durch einen

erniedrigten pH-Wert ausgelöst. Das heißt, zunächst muss die im Nährboden vorhandene

Dextrose abgebaut werden; durch die sauren Abbauprodukte erniedrigt sicht der pH-Wert: es

kommt zum Farbumschlag nach gelb. Erst jetzt setzt die Decarboxylierung ein und es erfolgt

(oft erst nach 2-4 Tagen der Farb(rück) Umschlag nach violett. Ein stets mitzuführender

Kontrollröhrchen ohne Aminosäurezusatz bleibt in diesem Fall gelb. Die Röhrchen werden

von der Nährbodenküche fertig geliefert, die mit Paraffin beschichtet sind.


25

Testsubstrate:

� Fleischextrakt 5,0 g

� Pepton 5,0 g

� Pyridoxal 0,005 g

� Dextrose 0,5 g

� Bromkresolpurpurlösung 2,5 ml


Technik:

Die Kulturröhrchen und ein Kontrollröhrchen werden mittels Platinnadel durch die

Paraffinschicht hindurch geimpft. Sie werden 4 Tage bei 37°C bebrütet; (täglich auf

Indikatorumschlag prüfen).

Bewertung:

Positiv: Farbumschlag nach violett.

Negativ: Gelbe Farbe bleibt bestehen. Das Kontrollröhrchen (ohne Aminosäure-Zusatz) soll

die gelbe Farbe behalten.

Schwefelwasserstoff-Bildung/Kligler-(Zweizucker-)Eisen-Agar

Durch den Gehalt an Glukose, Laktose und im Dreizucker-Agar zusätzlich Saccharose sowie

Phenolrot und Eisen-II-Sulfat ermöglicht dieser Test die gleichzeitige Erkennung mehrer

biochemischer Leistungen. H2S-Bildung kann aus Eiweißkörpern bzw. den beim Abbau

entstehenden schwefelhaltigen Aminosäuren erfolgen. Die Intensität der H2S-bildung ist von

der Menge der vorhandenen Schwefelverbindungen und von der untersuchten Bakterienart

abhängig.

Testsubstrate:

� Hefeextrakt-Cystein-Basalmedium 1000,0 ml

� FeSO4 ∗ 7H2O 0,2 g

� Na2SO3 0,3 g

� Na2S2O3 5H2O (Na-Thiosulfat) 0,1 g

Substrat in Röhrchen (12/13x100) bis zu 5 ml abfüllen und mit Schrägschicht erstarren lassen,

so dass ein etwa gleich langer Hoch- und Schrägschichtteil entsteht. Sie werden fertig von der

Nährbodenküche geliefert.

Technik:

Material mit Nadel auf Schrägschicht deponieren, dann in den Hochschichtteil einstechen und

anschließend das deponierte Material auf der Schrägfläche verteilen, 18 h bei 36 ° bebrüten.


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Bewertung:

� Schrägfläche rot, Hochschicht gelb; Abbau von Glukose.

� Schrägfläche gelb, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose und Laktose(und/oder

Saccharose beim Dreizuckeragar).

� Schrägfläche rot, Hochschicht rot: keine fermentativer Glukose-, Laktose- und

Saccharoseabbau.

� Schwarzfärbung der Hochschicht: Bildung von H2S.

� Blasen- und Rissbildung: Gasbildung beim Glukoseabbau.

Beweglichkeitsprüfung

Es handelt sich um halbfeste Medien, denen nur eine geringe Menge Agar-Agar zur

Gliederung beigesetzt wurde. Begeißelte Mikroorganismen können sich sichtbar in den Agar

hineinbewegen (Trübung des Agars von Stichkanal ausgehen = Stichagar). Eine von vielen

Nährmedien ist der SIM-Nährboden.

SIM-Nährboden

Testsubstrat: Im Handel erhältlich (z. B. von Merck)

Technik:

Den in Hochschicht erstarrten Nährboden mit Platinnadel beimpfen und 18-24 h bei 37°C

bebrüten.

Bewertung:

Positiv: Diffuse Trübung des Mediums.

Negativ: Wachstum nur entlang dem Stichkanal.

Nitratreduktionstest

Bei Vorhandensein des Enzyms Nitratreduktase und Anwesenheit eines geeigneten

Wasserstoffdonators wird Nitrat zu Nitrit und ggf. weiter zu Ammoniak oder molekularen

Stickstoff reduziert.

Testsubstrat:

� KNO3 (nitritfrei) 0,2 g

� Pepton 5,0 g



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Technik:

Nach Beimpfung bis 4 Tage bei Optimaltemepatur bebrüten, dann 0,1 ml einer Mischung aus

beiden Teilen folgender Lösung zusetzen (Griess-Iiosvay-Reagenz zu Nachweis von Nitrit):

Lösung A:

� Sulfanilsäure 1,0 g

� 5 M Essigsäure 125,0 ml

Lösung B:

� α-Naphthylamin 1,0 g

� 5 M Essigsäure 200,0 ml

Bewertung:

Positiv: Rotfärbung (Nitritnachweis).

Negativ: Keine Rotfärbung nach Zugabe von Lösung A und B.

Gelatinasetest

Das Enzym Gelatinase bewirkt einen hydrolytischen Abbau der Gelatine. Durch Gelatine zur

Erstarrung gebrachtes Substrat wird dabei verflüssigt.

Testsubstrat:

� Fleischextrakt 7,5 g

� Pepton 25,0 g

� NaCl 5,0 g


� Gelatine 80,0 g

� Nähragar 1000,0 ml

Technik:

Die verdächtige Einzelkolonie strichförmig auf der Platte ausimpfen unter Mitführung eines

positiven und eines negativen Kontrollstammes, 48 h bei 36°C bebrüten. Anschließend die

strichförmig gewachsenen Kulturen mit einem HgCl2-Lösung getränkten Tupfer abwischen

und die Platte mit HgCl2-Lösung übergießen (HgCl2-Lösung: 15 g HgCl2 in 20 ml konz. HCL

mit 100 ml Aqua dest. lösen).

Bewertung:

Positiv: Substrat im Bereich des Impfstriches klar durchscheinende (unveränderte Gelatine

wird durch die Lösung getrübt).

Negativ: Nährboden im Strichbereich unverändert.


28

Tartrat-, Mukat- und Zitrat - Test

Ähnlich der Zuckerspaltung können gewisse Bakterien auch die organischen Säuren Tartrat,

Mukat und Zitrat abbauen, wobei saure Abbauprodukte entstehen, die mit einem Indikator

wie Bromthymolblau nachgewiesen werden können. Die Verdeutlichung der Tartratreaktion

kann noch mit gesättigter Bleiacetatlösung erfolgen.

Reagenz: Bleiacetat, 50%ige wässrige Lösung, kräftig schütteln. Vor Gebrauch 30 Min.

absetzen lassen.

Testsubstrat:

� Bacto-Pepton (z. B. Difco) 10,0 g

� M/10 NaOH-Lösung 8,5 ml

� Aqua. dest 1000,0 ml

� Bromthymolblaulösung, 0,2% 12,0 ml

Organische Säuren:

d-Tartrat, Zitrat und Mukat werden in 1%iger Konzentration dem Substrat zugefügt.

Technik:

Je 2 Röhrchen werden die Röhrchen beimpft und 48 h bei 36 °C bebrütet.

Bewertung:

Positiv: Farbumschlag über grüngelb nach weiß, dann zum Teil wieder zurück nach blau.

Die Ablesung erfolgt beim Tartrat nach Zugabe von 0,5 ml gesättigter Bleiazetatlösung und

beim Mukatsubstrat wird nur die Farbreaktion beurteilt.

Positiv: Farbumschlag über grüngelb nach weiß, dann zum Teil wieder zurück nach blau.

Negativ: Keine Färbung.

Präzipitatbildung nach Bleiazetatzusatz (bei Tartrat und Zitrat zu prüfen):

Positiv: Der bei Zugabe des Reagenz entsehende Niederschlag sinkt innerhalb 30 Min. auf

eine sehr geringe Menge ab.

Negativ: Der entstehende, kräftige Niederschlag bleibt im Röhrchen weitgehend bestehen und

nimmt nach 24 h noch mehr als die Hälfte der Flüssigkeit ein.

Malonat-Test

Na-Malonat wird von verschiedenen Bakterienarten unter Bildung alkalischer

Stoffwechselprodukte verwertet. Die Alkalisierung führt zum Umschlag dem dem

Testsubstrat zugesetzten Bromthymolblau nach blau.

Testsubstrat:

� Hefeextrakt 1,0 g


29

� (NH4)2 SO4 2,0 g

� K2HPO4 0,6 g

� KH2PO4 0,4 g

� NaCl 2,0 g

� Na-Malonat 3,0 g

� Glukose 0,25 g

� Bromthymolblau-Lösung 12,5 ml


Technik:

Substrat mit Material von einer Einzelkolonie beimpfen, 24-48 h bebrüten bei 36 °C.

Bewertung:

Positiv: Farbumschlag von grün nach blau.

Negativ: Keine Farbänderung.

Harnstoff-(Urease-)Reaktion nach Christensen

Durch das in verschiedenen Bakterienarten vorkommende Ferment Urease wird sie

hydrolysiert unter Bildung von Ammoniak und CO2. Wobei sich der pH-Wert zur alkalischen

Seite verschiebt. Die pH-Änderung wird durch den Indikator Phenolrot angezeigt. Außer der

sehr intensiven Alkalibildung aus Harnstoff tritt noch eine weitere Alkalisierung infolge

Eiweiß- bzw. Peptonabbaus auf. Um dies zu neutralisieren, setzt man Glucose hinzu, aus

deren Spaltung Säure hervorgeht. Wird im Medium nur Eiweiß gespalten, so überwiegt bei

glukosepositiven Keimen die Säurefermentation. Es wird zusätzlich Harnstoff abgebaut und

die Reaktion ist alkalisch.

Testsubstrat: (z. B. Oxoid)

� Pepton 1,0 g

� NaCl 5,0 g

� Glukose 1,0 g

� KH2PO4 2,0 g

� Phenolrot

(0,2%Lösung in 50%Äthylalkohol) 6,0 ml

� Agar (Oxoid) 15,0 g



30

Technik:

Schrägfläche mit steriler Impföse beimpfen, 1-4 Tage bei 36 °C bebrüten.

Bewertung:

Positiv: deutliche rotviolette Färbung des ganzen Mediums.

Negativ: keine Farbänderung.

Kaliumcyanid (KCN)-Test

Bei einem KCN-Gehalt des Nährbodens von 0,0075% können die meisten Bakterien nicht

mehr wachsen, wohl aber Keime der Klebsiellagruppe und Citrobactergruppe.

Testsubstrat:

� Pepton 10,0 g

� NaCl 5,0 g

� KH2PO4 225,0 mg

� Na2HPO4 ∗ H2O 5,64 g


Technik:

Röhrchen mit einer Impföse beimpfen, 2 Tage bei 36 °C bebrüten unter Mitführung eines in

gleicher Weise beimpften Röhrchens mit Basissubstrat (ohne KCN Zusatz).

Bewertung:

Positiv: Wachstum (Trübung) im KCN-haltigen und im KCN-freien Substrat.

Negativ: Kein Wachstum im KCN-hatigen aber Wachstum im KCN-freien Substrat.

2.3.5 Membranfiltrationsverfahren (Verfahren nach ISO 9308)

2.3.5.1 Allgemeines

Die Membranfiltrationsverfahren dienen zur Nachweis und Zählung von Escherichia coli und

coliformen Bakterien. Sie wird mit Hilfe einer Vakuumfiltrationsanlage durchgeführt. Dieses

Verfahren beinhaltet mehrer Arbeitsschritte, um den Nachweis von coliforme und

fäkalcoliforme Bakterien zu bestätigen. Hier werden 100 ml Probe über ein Membranfilter mit

0,45 µm Porengröße filtriert. Das Filter wird auf Laktose-TTC-Agar mit Tergitol-7 gelegt und

bei 36°C bebrütet.

Laktoseverwertende Bakterien, zu denen die coliformen Bakterien zählen, wachsen auf

diesem Medium als gelbe bis gelb-orange Kolonien, erzeugen eine entsprechende Verfärbung

des Mediums uns sind coliformverdächtig. Weisen diese im Oxidase-Test eine negative

Reaktion auf, gelten sie als coliforme Bakterien. Sind die verdächtigen Kolonien in der Lage


31

zusätzlich auf Tryptophan bei 44 °C Indol zu bilden, gilt der Nachweis für E. coli als

erbracht.

Das Colilert-Verfahren ist eine alternative zur Membranfiltrationsverfahren. Das

Membranfiltrationsverfahren ist besonders für Trinkwasser und technische Bäder geeignet,

die eine niedrige Keimzahlbelastung aufweisen. Für die Oberflächengewässer muss die Probe

unbedingt verdünnt werden. Hierfür gibt es keine konkreten Anweisungen aus der

Standardarbeitsanweisung des Fachamts für Umweltuntersuchungen Hamburg. Es wird durch

Durchführung mehrer Proben, der richtige Verdünnungsfaktor bestimmt.


Zuerst erfolgt die Bebrütung bei der Laktose-TTC-Agar mit Tergitol 7. Dann werden die

gewachsenen Kolonien auf Oxidase und Indolbildung geprüft.

Das Ergebnis der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien setzt sich auf mehreren Schritten

zusammen.

Als Beispiel wird eine beliebige Probe A bei folgender Koloniezahl ermittelt: Es wird der

Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien, die Zahl der verdächtigen Kolonien, die Zahl der

gelb-orange Kolonien dokumentiert. Wichtig sind die Ergebnisse der Oxidase-Test und Indol-

Test. Als coliformen Bakterien werden Laktose-positiven Kolonien mit negativer Oxidase-

Reaktion gezählt. Die E. coli gelten als Laktose-positiven Kolonien mit negativer Oxidase-

Reaktion und positivem Indol-Test.

Diese Parameter bilden ein gesamtes Ergebnis der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien.

Bei einer Anzahl verdächtiger Kolonien auf dem Membranfilter müssen mindestens ca. 10

Kolonien auf Oxidase und Indolbildung geprüft werden. Das Ergebnis der 10 verdächtigen

Kolonien) Untersuchungen wird auf die Gesamtheit der Anfangs gezählten, verdächtigen

Kolonien hochgerechnet.

Tabelle 2.7: Beispiel für Rechnung der verdächtigen Kolonien Anzahl der ver-

dächtiger Kolonien auf

dem Membranfilter:

keine Coliforme

Bakterien

Coliforme

Bakterien

E. coli

140 Kolonien 2 Kolonien 6 Kolonien 2 Kolonien

Gesamtkolonienzahl / 10 verdächtige Kolonien = Umrechnungswert

d. h. 140/10 = 14 Kolonien Insgesamt Kolonienzahl: Nicht identisierbar 6∗14=84 2∗14=28

Somit enthält die Probe A, 84 Kolonien für coliforme Bakterien und 28 Kolonien für E. coli.

Diese Probe wurde am Anfang der Membranfiltration mit einer Verdünnung (1:1000)

verdünnt, d. h. die Probe A enthält 840 Coliformen Keime pro 100 ml Wasserprobe.


32


Die Zusammensetzung der Nährböden und Nährlösungen:

Laktose-TTC-Agar mit Tergitol-7

(OXOID CM 793, hergestellt in der Nährbodenküche) in g/l:

� Laktose 20,0

� Pepton 10,0

� Hefeextrakt 6,0

� Fleischextrakt 5,0

� Bromthymolblau 0,05

� Agar 15,0

Zusätzlich wird ein Gemisch aus 2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid 0,05 g/100ml und

Natriumheptadecylsulfat 0,2g/100ml, je 5 ml, als Grundmedium zugegeben.

Tryptose-Soja-Agar(TSA)

(nichtselektiver Nähragar für Oxidase-Test, DIFCO 236950, hergestellt in der

Nährbodenküche) in g/l:

� Casein 15,0

� Sojapepton 5,0


� Agar 15,0

Tryptophan-Bouillon

(Trypton-Wasser, DIFCO 264410, hergestellt in der Nährbodenküche) in g/l:

� Pepton aus Casein 10,0


Die Durchführung der Membranfiltration erfordert folgende Materialien:

� Laktose-TTC-Agar mit Tergitol®7

� Tryptose-Soja-Agar (TSA)

� Röhrchen mit Tryptophanbouillon

� Kovac´s Reagenz für Indol-Test MERCK Art. Nr.: 109293

� Oxidase-Teststäbchen MERCK Art. Nr.: 1.13300

� Membranfiltrationsgerät mit sterilen Einwegtrichtern (MBSI System mit Trichterspender;

Schleicher & Schüll, 37568 Dassel)

� Membranpumpe ME 4R (Vacuubrand GmbH, 97866 Wertheim)


33

� Membranfilter (ME2521 STL, Porengröße 0,45 Ø 50 mm)

� Demineralisiertes Wasser

� Brutschrank Memmert, thermostatisiert, (36 ±2)°C und (44 ±0,5)°C

� Einmal-Impfösen, steril, 10 µl, Art. Nr.: 631Q2211

� Pinzetten

� Bunsenbrenner

Die Wasserproben werden durch ein steriles Membranfilter filtriert. Das Membranfilter wird

mit einer sterilen Pinzette blasenfrei auf den Laktose-TTC-Tergitol-7-Agar in einer

Petrischale gelegt und bis zu (21±3) °C aerob bebrütet. Die Keimbelastung der Wasserproben,

die bearbeitet wurden, war sehr hoch. Die Abbildung 2.1 zeigt eine Probe mit hohe

Keimbelastung, indem eine Keimzählung nicht möglich ist. Deshalb mussten sehr hohe

Verdünnungsstufen angesetzt werden.

Abbildung 2.1: Bebrütete Laktose-TTC-Tergitol-7-Agar

Die meist angesetzte Verdünnungsstufen waren:

Tabelle 2.8: Die Verdünnungsstufen für verschiedene Gewässern

Gewässer Verdünnungsstufen

Oberflächengewässer 1:500 Elbe 1:1000 bzw. 1:500 Abwasser 1:10 000

Nach Abschluss der Bebrütungszeit werden die verdächtigen Kolonien gezählt. Als

verdächtige Kolonien gelten, ungeachtet ihrer Größe, gelbe bzw. gelb-orange Kolonien, die

unter dem Membranfilter im Agar einen gelben Hof aufweisen. Diese Kolonien zählen als

Laktose-positive Bakterien. Die Ergebnisse der auf dem Laktose-TTC-Agar gewachsenen

verdächtigen Kolonien und die Zahl der auf TSA-Agar ausgestrichenen Kolonien werden

dokumentiert. Die Koloniezahl wird auf 100 ml des untersuchten Wassers bezogen. Bei

Verdünnungen wurde der Verdünnungsfaktor berücksichtigt.

Differenzierung/Absicherung

Für Oxidase-Test und der Indol-Test wird die repräsentative Anzahl von Kolonien auf

nichtselektiven TSA Agar, fraktioniert ausgestrichen und in Tryptophan-Bouillon angelegt.

Der Oxidase-Test und die Indolprüfung werden wie in Kapitel 2.2.4.3 „Lange Bunte Reihe“

durchgeführt.


34

2.3.6 Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden

In diesem Abschnitt sind alle Nährböden, die verwendet wurden, zusammengefasst.

Tabelle 2.9: Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden

Gesamtcoliforme Bakterien

Nährboden Hersteller Anwendung Zubereitung Bebrütung Auswertung Desoxy- cholat-Agar

Oxoid Einmisch- verfahren

Geliefert in Kulturröhrchen: Hygieneinstitut

24 h bei 37°C

Rote Kolonien mit Präzipitalhof

Endo-C- Agar

Merck Oberflächen- ausstrich

Gelieferte Platten; Hygieneinstitut

24 h bei 37°C

Rote Kolonien

Chromocult- Coliformen- Agar



24 h bei 37°C

Rosa-rote Kolonien

MPN-Methode Laurylsulfat- Bouillon

Merck MPN-Verfahren Gelieferte Kulturröhrchen;Hygieneinstitut

44 h bei 37°C

Gasbildung;Kennzahl zur Auswertung

Colilert 18- Testkit

Idexx MPN-Verfahren Gelieferte Pulver (Nährboden) mit Probe vermischen und in eine Quanti-Tray luftblasenfrei geben. Zum Schluss mit eine Quanti-Tray Sealer verließen

18 h bei 37°C

Gelbfärbung der Ver-tiefungen; Kennzahl zur Auswertung

Laktose-TTC-Agar mit Tergitol®7

Oxoid Cm 793 Gelieferte Platten; Hygieneinstitut

21 h bei 37°C

Gelbe bzw. gelb-orange Kolonien→ weitere Bearbeitung mit TSA-Agar

Tryptose-Soja-Agar (TSA)

Difco Gelieferte Platten; Hygieneinstitut

21 h bei 37°C

Auf Oxidase überprüfen

Tryptophan-Bouillon

Difco

Membran-Filtration

Gelieferte Kulturröhrchen; Hygieneinstitut

21 h bei 44°C

Auf Indolbildung untersuchen

Auswertung der Membranfiltration: Coliforme Bakterien: Oxidase-negativ und Indol-negativ Escherichia coli

Nährboden Hersteller Anwendung Zubereitung Bebrütung Auswertung Desoxy- cholat-Agar

Oxoid Einmisch- verfahren

Geliefert in Kulturröhrchen; Hygieneinstitut

24 h bei 44°C

Rote Kolonien mit Präzipitalhof

Endo-C- Agar



24 h bei 44°C

Rote Kolonien

Chromocult- Coliformen- Agar



24 h bei 44°C

Dunkelblau-violette Kolonien

MPN-Methode Laurylsulfat- Bouillon

Merck MPN-Verfahren Gelieferte Kulturröhrchen; Hygieneinstitut

44 h bei 37°C

Gasbildung und Fluoreszenz; Kennzahl zur Auswertung

Colilert 18- Testkitt

Idexx MPN-Verfahren Gelieferte Pulver mit Probe vermischen und in eine Quanti-Tray luftblasenfrei geben. Zum Schluss mit eine Quanti-Tray Sealer verließen.

18 h bei 37°C

Gelbfärbung und Fluoreszenz;der Ver-tiefunge; Kennzahl zur Auswertung

Laktose-TTC-Agar mit Tergitol®7

Oxoid Cm 793 Gelieferte Platten; Hygieneinstitut

21 h bei 37°C

Gelbe bzw. gelb-orange Kolonien

Tryptose-Soja-Agar

Difco Gelieferte Platten; Hygieneinstitut

21 h bei 37°C

Auf Oxidase überprüfen

Tryptophan-Bouillon

Difco

Membran-Filtration

Gelieferte Kulturröhrchen; Hygieneinstitut

21 h bei 44°C

Auf Indolbildung untersuchen

Auswertung der Membranfiltration: E. coli: Oxidase-negativ und Indol-positiv


35

2.4 Mikrobiologische Referenzmaterialien

2.4.1 Durchführung der Kultivierung von Kontrollstämme

Vom Kontrollstamm aus der Kulturensammlung (DSMZ-Referenzstamm5) wird eine

Mehrfachkonserve (Stammkultur, Subkultur des Kontrollstammes) für das Labor hergestellt.

Von dieser Stammkultur des Kontrollstammes werden nach Bedarf eine oder mehrere

Gebrauchskulturen (weitere Subkulturen) für den einmaligen Einsatz bei der Qualitätsprüfung

angelegt. Die Gebrauchkulturen waren frisch aus den gefriergetrockneten Kontrollstämme

angesetzt und konnten somit für die Prüfung der Verfahren verwendet werden.

2.4.2 Einsatz der Gebrauchskulturen

Von der Gebrauchskultur wird Material des Kontrollstammes auf bzw. in das bei dem

jeweiligen Untersuchungsverfahren angewendete erste Anreicherungs- bzw.

Nachweismedium eingebracht. Danach werden der jeweiligen SOP entsprechend sukzessive

alle weiteren Selektions-, Differenzierungs- und Nachweisprozeduren bis zum Endergebnis

vorgenommen. Dies gilt in gleicher Weise für die Kontrollstämme der nachzuweisenden

Bakterien (Positiv-Kontrolle) wie auch für die Kontrollstämme der Negativ-Kontrolle.

Die Plattenmethode beinhaltet folgende Nährböden:

� Desoxycholat-Agar

� Chromocult-Coliformen-Agar

� Endo-C-Agar

� Fluorocult-ECD-Agar

Für den Nachweis der thermophilen fäkalcoliforme Bakterien bei allen Nährböden wurde

Escherichia coli (DSMZ 30083) als Positivkontrolle verwendet. Die durchgeführten

Untersuchungsverfahren wie zum Beispiel Membranfiltrationsverfahren, Colilert-18-

Verfahren werden in Tabelle 2.10 mit den entsprechenden Referenzstämmen dokumentiert.

Tabelle 2.10: Einsatz von verschiedenen Gebrauchskulturen

Coliforme Bakterien Fäkalcoliforme Bakterien

Untersuchungsverfahren: Positivkontrolle Negativkontrolle Positivkontrolle Negativkontrolle

MPN-Verfahren Citrobacter

freundii

Pseudomonas

aeruginosa

E. coli Citrobacter

freundii

Colilert-18-Verfahren E. coli Aeromonas

hydrophila

E. coli Aeromonas

hydrophila

Miniaturverfahren E. coli Aeromonas

hydrophila

E. coli Aeromonas

hydrophila

Membranfiltrationsverfahren E. coli Aeromonas

hydrophila

E. coli Citrobacter

freundii

5 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH


36

Die qualitative Bestimmung der Referenzstämme mit Positiv-, wie auch Negativkontrollen,

wurde bei diesen Untersuchungsverfahren erfolgreich durchgeführt.

2.5 Statistische Prüfverfahren

2.5.1 Statistik für die Qualitätssicherung in der Wassermikrobiologie

Die Validierung mikrobiologischer Methoden und die Interpretation ihrer Ergebnisse sind

insofern kompliziert, als sie einen gewissen Grund an Variabilität aufweisen. Diese

Variabilität kann gleichermaßen systematischen Effekten aber auch der Zufallsvariation bei

der Probenentnahme und der Durchführung von analytischen Verfahren zugeschrieben

werden. Um diese zu berücksichtigen, ist es notwendig, vielseitige Informationen zu

sammeln. Das erreicht man durch wiederholtes Zählen, paralleles Ausplattieren und

mehrfache Verfahren.

In solchen Fällen können die einzelnen Ergebnisse zu einer Auswertung zusammengefasst

werden, die die Hauptmerkmale der Analyse bereibt und den Einfluss der Zufallsvariabilität

verringert. Dazu wurden wichtige statistische Methoden mit folgender Zielsetzung entwickelt:

� Zusammenfassung der Hauptmerkmale von Mehrfachproben und Schätzung des

Einflusses der Zufallsvariation

� Verallgemeinerung der Probenergebnisse für die Gesamtheit oder die Umwelt, auf der sie

entnommen wurden

� Vergleich der Resultate von verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung der

Zufallsvariation, sodass sich systematische und zufallsbedingte Abweichungen

unterscheiden lassen

2.5.2 Grundberechnungen

Zwei Hauptmerkmale bei einer Serie von Beobachtungen zum Beispiel bei einer Reihe von

Parallelplattenzählungen sind ihre Lage und ihre Streuung.

Im Fall von quantitativen Bestimmungen wird in der Statistik das arithmetische Mittel zur

Beschreibung der Lage verwendet und die Varianz, die Standardabweichung oder der

Variationskoeffizient als Maße der Dispersion.

2.5.2.1 Arithmetisches Mittel

Das arithmetische Mittel oder der Durchschnitt x wird definiert als die Summe aller

Einzelmessungen xi, geteilt durch die Anzahl der Werte n.

x = ∑=

n

i

ixn 1

1


37

Diese statistische Kenngröße bezüglich der Lage vermittelt jedoch nur dann den richtigen

Eindruck der Datenreihe, wenn die Einzelwerte symmetrisch um den Mittelwert verteilt sind,

weil jede Messung denselben Beitrag zum Durchschnitt leistet. Bei schiefen asymmetrischen

Verteilungen würde der Einfluss der höchsten bzw. niedrigsten Werte Durchschnitte ergeben,

die außerhalb der Mehrheit der Beobachtungen liegen.

2.5.2.2 Varianz, Standardabweichung und Variationskoeffizient

Das entsprechende Maß der Dispersion ist die Varianz s2, die aus den Differenzen der

Einzelmessungen xi und deren Durchschnitt x errechnet wird. Diese Differenzen werden

quadriert, um die Richtung der Abweichung auszuschalten, zusammengezählt und dann deren

Summe durch die Anzahl der Messungen minus eins dividiert.

2

1

2 )(1

1xx

ns

n

i

i −−

= ∑=

Ein Nachteil beim Beschreiben der Variation innerhalb einer Datenreihe als Varianz besteht

jedoch darin, dass dieser Wert wegen der quadrierten Abweichungen, die in der Berechnung

verwendet werden, nicht so einfach zu interpretieren ist. Daher wird die Standardabweichung

s angeführt.

2

1

2 )(1

1xx

nss i

n

i

−−

== ∑=

Ein Vergleich der Variation in zwei oder mehr Messreihen mit unterschiedlichen Mittelwerten

muss auf einer dritten statischen Größe für die Abweichung basieren, die man durch Division

der Standardabweichung durch den Mittelwert erhält.

Diese nennt man den relativen Standardabweichung v = s / x. Sie stellt die Variation der

Messungen im Verhältnis zu deren Mittelwert dar.

Die Standardabweichung, Varianz und der Variationskoeffizient werden in den

Parallelansätzen der Plattenmethode für die coliformen und fäkalcoliformen Bakterien

durchgeführt.

Kapitel 3: Ergebnisse

38

3. Ergebnisse

3.1 Vergleich verschiedener Untersuchungsverfahren

Die experimentelle Bestimmung der E. coli und coliformen Bakterien erfolgte mit Proben von

Oberflächengewässern und Abwasser. Insgesamt wurden an vier Proben unterschiedlicher

Herkunft intensiv untersucht. Es ging darum, aufzuzeigen inwieweit das Ergebnis von den

gewählten Methoden abhängt.

Die Verfahren wurden nach Anleitung von der SOP Standardarbeitsanweisung durchgeführt.

Bei den einzelnen Verfahren sollte vier Proben, die drei, vier und fünf Parallelansätze pro

Versuchsreihe enthalten durchgeführt werden, und der sich daraus ergebende Mittelwert für

die Auswertung herangezogen werden. Die Proben wurden mit folgenden Parallelansätzen

durchgeführt:

� Oberflächengewässer; Regensiel: 3 Parallelansätze

� Oberflächengewässer; Alster-Haselknick: 4 Parallelansätze

� Oberflächengewässer; Alster-Wulksfelde: 5 Parallelansätze

� Kläranlage; Dradenau: 4 Parallelansätze

Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung für E. coli und coliforme Bakterien werden im

Folgenden mit der Einheit KBE/ml als Mittelwerte angegeben. Die Wahl der Probenvolumen

bzw. Verdünnungsreihen wurde mit Vorversuchen bestimmt.

3.1.1 Durchführung der Plattenmethode

Bei der Plattenmethoden wurden mit folgenden Nährböden gearbeitet:

� Desoxycholat-Agar

� Chromocult®-Coliformen-Agar

� Fluorcult®-ECD-Agar

� Endo-C-Agar

Bei den Untersuchungen mit Desoxycholat-Agar und Chromocult-Coliformen-Agar wurden

zum Teil sehr hohe Werte erzielt. Deshalb wurde bei den Proben Regensiel, Haselknick und

Dradenau eine weitere Untersuchung zur Differenzierung der Bakterien vorgenommen (z. B.

Bunten Reihe für Desoxycholat-Agar und ein Oxidase-Test für Chromocult-Coliformen-Agar

und Endo-C-Agar durchgeführt).

Das Membranfiltrationsverfahren gehört zwar auch zu den Plattenmethoden wird aber separat

mit der Bestimmung von E. coli und coliformen Bakterien bearbeitet (siehe Kapitel 3.3).


39

3.1.2 Durchführung der MPN-Verfahren

Bei dem MPN-Ansatz wurde nur eine 3er MPN, in drei Parallelansätzen mit drei

Verdünnungsreihen 0,1 ml, 0,01 ml und 0,001 ml, wie auch bei der Untersuchungen von

Badegewässern üblich ist, durchgeführt. Alle vier Proben wurden mit diesem

Verdünnungsreihen bearbeitet.

Andere Verfahren, die auf dem MPN-Verfahren beruhen, sind Colilert-18 und

Miniaturverfahren. Das Colilert-18-Verfahren wurde bei allen Proben durchgeführt. Aber das

Miniaturverfahren wurde nur bei der ersten Probe (Regensiel) angewendet. Hier konnte kein

Ergebnis erzielt werden, da die Keimzahlbelastung der E. coli bei dieser Probe nicht hoch

genug war. Das Miniaturverfahren konnte bei den Paralleluntersuchungen nicht durchgeführt

werden, weil die Keimzahlbelastung der E. coli sehr gering waren.

3.1.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien mit den

Plattenmethoden

Bei der Plattenmethode wurden das Einmischverfahren bei der Desoxycholat-Agar und der

Oberflächenausstrich bei Chromocult-Coliformen-Agar und Endo-C-Agar verwendet.

Tabelle 3.1: Coliformenzahlen der Regensielprobe

Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe 1.Platte 2.Platte 3.Platte Mittelwert

Desoxycholat-Agar Regensiel 111 103 74 96

Chromocult-Agar Regensiel 500 400 490 463

Endo-C-Agar Regensiel 135 130 110 125

Tabelle 3.2: Coliformenzahlen der Haselknickprobe

Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe 1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte Mittelwert

Desoxycholat-Agar Haselknick 65 102 111 54 83

Chromocult-Agar Haselknick 205 300 295 255 264

Endo-C-Agar Haselknick 40 45 25 45 39

Tabelle 3.3: Coliformenzahlen der Wulksfeldeprobe

Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe 1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte 5.Platte Mittelwert

Desoxycholat-Agar Wulksfelde 504 470 460 426 336 439

Chromocult-Agar Wulksfelde 420 305 340 290 320 355

Endo-C-Agar Wulksfelde 25 20 20 40 50 31

Tabelle 3.4: Coliformenzahlen der Dradenauprobe


Desoxycholat-Agar Dradenau 55 45 50 35 46

Chromocult-Agar Dradenau 30 20 75 105 58

Endo-C-Agar Dradenau 20 25 55 20 30


40

Im Labor wurde die Information erteilt, dass die Desoxycholat-Agar-Methode erhöhte

Keimzahlbelastungen zeigt. Bei den experimentellen Untersuchungen wurden alle

Parallelverfahren auch den Chromocult-Coliformen-Agar eingesetzt. Dabei zeigte das

Desoxycholat-Agar die zweithöchste Keimbelastung.

Die Proben Regensiel, Haselknick und Dradenau (Tab. 3.1, 3.2 und 3.4) beim Chromocult-

Coliformen-Agar waren am meisten belastet. Die Ergebnisse deuten auf ein schnelles

Anwachsen von Coliformen hin, auch wenn sie möglicherweise subletal geschädigt waren.

Der Nährboden wurden bei den Vorversuchen auf die Empfindlichkeit der Temperatur

geprüft, d.h. mit eine beliebige Probe A wurde Platten ausgestrichen, die davor im

Brutschrank bei 37°C erwärmt wurden, aber auch Platten, die direkt aus dem Kühlschrank

entnommen wurden. Daraus ergab sich, dass die Keimzahl der beiden Platten identisch war.

Da keine weitere Fehlerquelle entdeckt wurde, ist anzunehmen, dass das Anwachsen der

subletal geschädigten Coliformen eine hohe Keimzahlbelastung hervorruft.

In der Probe Wulksfelde (Tab. 3.3) zeigte Chromocult-Coliformen-Agar einen niedrigeren

Mittelwert, als der Desoxycholat-Agar. Es könnte sein, dass Fehler während der Vorbereitung

des Nährbodens gemacht wurden. Der niedrige Mittelwert der Proben Regensiel, Haselknick

und Dradenau ließen vermuten, dass der größte Teil der Bakterien durch eine zu hohe

Temperatur des flüssigen Agars abgetötet wurden. Diese These kann nicht bestätigt werden,

weil der Nährboden nach dem Aufkochen über mehrere Stunden im Wasserbad temperiert

wurde. Darauf wurde sehr geachtet, da im Labor diese Vorinformation über diesen Verfahren

bekannt war. In der Abbildung 3.1 sind die Ergebnisse der coliformen Bakterien übersichtlich

dargestellt.

3.1.3.1 Differenzierungen der coliformen Bakterien von Chromocult-Coliformen-Agar,

Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar

Die experimentelle Untersuchung mit dem Nährboden Chromocult-Coliformen-Agar zeigte

die höchsten Ergebnisse. Deshalb wurde anschließend bei allen Proben ein Oxidase-Test

durchgeführt. Durch den Oxidase-Test wurden die coliforme Bakterien differenziert. Sie sind

Oxidase-negativ. (Oxidase-Reaktion: Kapitel. 2.3.4.3).

Die höchste Keimzahl zeigte die Probe Regensiel. Sie hatte einen Mittelwert von 463

Kolonien pro ml, davon sind 315 Kolonien (Tab. 3.5) keine coliforme Bakterien.

Bei der Probe Haselknick waren von 264 Kolonien, 209 Kolonien (Tab. 3.5) keine coliformen

Bakterien. Prozentual gesehen, besteht eine 79%ig niedrigere Keimzahlbelastung, als

angegeben.

Die Probe Wulksfelde hatte 330 Kolonien, die nicht zu den coliformen Bakterien gehörten,

d.h. 93% weniger Wachstum, als beim Mittelwert.

Auch die Kläranlage Dradenau zeigte auch ein niedrigeres Koloniewachstum, als der

ermittelte Wert. Hier wurden 58 Kolonien ermittelt, wobei der Oxidase-Test 48 Kolonien

weniger anzeigte und damit eine Abweichung von 83% ergab.


41

Tabelle 3.5: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Chromocult-Agar mit

Oxidase-Test

Coliforme Bakterien Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Chromocult-Agar (KBE/ml) 463 264 355 58 ∑ der untersuchten Kolonien 25 14 27 18 Oxidase-positiv (KBE/ml) 17 11 25 15 Oxidase-negativ (KBE/ml) 8 3 2 3 falsch-positive Abweichung (%) 68 79 93 83 Tatsächlicher Wert (KBE/ml) 148 55 25 10

Der Endo-C-Agar lieferte bei der Plattenmethode den niedrigsten Wert. Da hier mit den

gewachsenen rosa-roten Kolonien ein Oxidase-Test durchgeführt wurde, reduzierten sich

auch hier die Mittelwerte.

Bei genaueren Nachforschungen stellte sich heraus, dass der Endo-C-Agar möglicherweise zu

lange gelagert worden war, denn der Agar gilt als sehr empfindlich und wenige Tage haltbar.

Dadurch konnten die Ergebnisse beeinflusst worden sein. Im weiteren Verlauf der Arbeit

wurde versucht möglichst frischen Nährboden zu verwenden. Aber es konnte aus technischen

Gründen der Nährbodenküche leider nicht immer berücksichtigt werden. Der Agar wurde im

Dunkeln aufbewahrt.

Die Proben Haselknick, Wulksfelde und Dradenau lagen zwischen 11 – 16 Kolonien pro ml.

Damit zeigte der Oxidase-Test Falsch-positive im Bereich von 52 – 63 %. Bei der Probe

Regensiel wurde frisch gegossenes Agar direkt zum Einsatz gebracht. Deshalb waren die

Ergebnisse am höchsten. Der Mittelwert lag bei 125 Kolonien pro ml, die durch einen

Oxidase-Test einen Wert von 31 Kolonien pro ml enthielt (Tab. 3.6).

Tabelle 3.6: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Endo-Agar mit Oxidase-Test Coliforme Bakterien Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Endo-C-Agar (KBE/ml) 125 39 31 30 ∑ der untersuchten Kolonien 20 15 19 21 Oxidase-positiv (KBE/ml) 15 9 10 13 Oxidase-negativ (KBE/ml) 5 6 9 8 Falsch-positive Abweichung (%) 75 60 52 63 Tatsächlicher Wert (KBE/ml) 31 16 15 11

Im Gegensatz zum Endo-C-Agar wurde bei den Proben der Desoxycholat-Agar-Verfahren zur

Differenzierung der coliformen Bakterien eine kleine Bunte Reihe durchgeführt.

Die Röhrchen mit D-Glucose-, Laktose-Pepton-Bouillou, Indol- und Citrat-Agar wurden mit

den dunkelroten Kolonien, die auf dem Desoxycholat-Agar gewachsen waren, beimpft.

Daraus ergab sich, dass die tatsächlichen coliformen Bakterien der Probe Regensiel und

Haselknick um 33%, und die Probe Wulksfelde um 40% geringer war, als mit dem

Desoxycholat-Agar erschien. Bei der Probe Dradenau betrug die prozentuale Abweichung

46%.


42

Tabelle 3.7: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Desoxycholat-Agar durch die Bunte Reihe

Coliforme Bakterien Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Desoxycholat-Agar (KBE/ml) 96 83 439 46 ∑ der untersuchten Kolonien 15 12 15 13 Bunte Reihe: positiv (KBE/ml) 10 8 9 7 Falsch-positive Abweichung (%) 33 33 40 46 Tatsächlicher Wert (KBE/ml) 64 56 263 25

Die Differenzierung ergab, dass die tatsächliche Anzahl der coliformen Bakterien erheblich

geringer war, als mit den verschieden Agarplatten festgestellt wurde. Die Abbildungen 3.1

und 3.2 stellt ein Vergleich zwischen den ermittelten Anzahlen der coliformen Bakterien mit

und ohne die Differenzierung dar.

Abbildung 3.1: Ermittelte Anzahl der coliformen Bakterien nach der Differenzierung

148

25

263

5664

1025

55

11151631

0

100

200

300

400

500

Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

KB

E/m

l

Desoxycholat-Agar Chromocult-Agar Endo-Agar

Abbildung 3.2: Ermittelte Anzahl der coliformen Bakterien ohne die Differenzierung

83

439

4696

58

355

264

463

303139

125

0

100

200

300

400

500


KB

E/m

l

Desoxycholat-Agar Chromocult-Agar Endo-Agar


43

3.1.4 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien mit den MPN-Verfahren

und Colilert®18-Verfahren

Die Mittelwerte des Colilert-18 (Tab. 3.8 - 3.15) liegen eindeutig über dem Mittelwerte der

MPN-Verfahren. Für Colilert-18 wurde die Probe mit sterilem Leitungswasser (1:10),

verdünnt.

Tabelle 3.8: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Regensielprobe Positive Röhrchen

Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl

Statistischer Tabellenwert (KBE/100ml)

Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 3 0 3/3/0 2400 2 3 3 1 3/3/1 4600

Probe: Regensiel

3 3 3 1 3/3/1 4600

39

Bei den MPN-Verfahren ergab sich eine Koloniezahl von 39 KBE/ml (Tab. 3.8). Hier wurde

die Vorverdünnung mit berücksichtigt.

Im Gegensatz dazu lagen die Ergebnisse des Colilert-18 (Tab. 3.9) weit über den MPN-

Keimzahlen. Dies ist auch bei den anderen Proben (Tab. 3.11-3.15) zu beobachten.

Tabelle 3.9: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Regensielprobe Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells

Nr. Positive Reaktion

Charakteristische

Zahl


Verdünnung Mittelwert

(KBE/ml)

1 49 46 49/46 1986,3 1:10

2 49 44 49/44 1553,1 1:10 Probe: Regensiel

3 49 44 49/44 1553,1 1:10

170

Tabelle 3.10: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Haselknickprobe

Positive Röhrchen Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 0 0 3/0/0 230 2 2 0 0 2/0/0 90 3 2 0 0 2/0/0 90

Probe: Hasel-

knick

4 1 0 0 1/0/0 40

1

Die Probe Haselknick zeigte eine Keimzahl von 1 Kolonie pro ml und beim Colilert®18 –

Verfahren war die Keimzahl 9 Kolonien pro ml (Tab. 3.11). Dies zeigt eine 9-fache Erhöhung

der Keimzahl.


44

Tabelle 3.11: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Haselknickprobe Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells


Charakteristische

Zahl


Verdünnung

Mittelwert

(KBE/ml)

1 41 1 41/1 80,5 1:10

2 36 4 36/4 67,7 1:10

3 45 2 45/2 105,8 1:10

Probe: Hasel-

knick

4 40 9 40/9 95,9 1:10

9

Bei der Probe Wulksfelde wurden fünf Paralleluntersuchungen durchgeführt. Hier war der

Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren übereinstimmend (Tab. 3.12

und 3.13) mit den vorherigen Untersuchungen.

Tabelle 3.12: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Wulksfeldeprobe Positive Röhrchen

Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 3 0 3/3/0 2400 2 3 3 0 3/3/0 2400 3 3 2 1 3/2/1 1500 4 3 3 2 3/3/2 11000

Probe: Wulks-

felde

5 3 2 1 3/2/1 1500

38

Tabelle 3.13: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Wulksfeldeprobe Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells


Charakteristische

Zahl


Verdünnung

Mittelwert

(KBE/ml)

1 49 43 49/43 1413,6 1:10

2 49 41 49/41 1203,3 1:10

3 49 39 49/39 1046,2 1:10

4 48 42 48/42 755,5 1:10

Probe: Wulks-

felde

5 49 48 48/49 691 1:10

102

Bei der Probe Dradenau, war die Keimzahlbelastung sehr niedrig (Tab. 3.14 - 3.15). Trotzdem

waren hier die Ergebnisse der Colilert-18 höher als beim MPN-Verfahren. Diese Probe ist

eine Abwasserprobe und müsste eigentlich höhere Ergebnisse liefern.

Diese Ergebnisse wurden mit den jährlichen Untersuchungsergebnissen verglichen. Es stellte

sich heraus, dass die jährlichen Untersuchungsergebnisse der Kläranlage deutlich über den

ermittelten Wert lagen. Dies war darauf zurückzuführen, dass die Probe Dradenau erst nach

vier Wochen untersucht wurde.


45

Tabelle 3.14: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Dradenauprobe6


MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 2 1 3/2/1 1500 2 3 1 0 3/1/0 430 3 3 2 0 3/2/0 930

Probe: Dradenau

4 3 1 0 3/1/0 430

8

Tabelle 3.15: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Dradenauprobe Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells


Charakteristische

Zahl

Statistischer Tabellenwert (KBE/100 ml)

Verdünnung

Mittelwert

(KBE/ml)

1 44 3 44/3 102,0 1:10

2 44 4 44/4 105,4 1:10

3 43 7 43/7 108,1 1:10

Probe: Dradenau

4 47 10 47/10 160,7 1:10

12

Bei allen Proben war zu beobachten, dass das Colilert-18-Verfahren höhere Werte als das

MPN-Verfahren lieferte. Die Proben Regensiel und Wulksfelde zeigten die höchsten

Keimzahlbelastungen mit 170 – 102 KBE/ml.

Die anderen Proben Haselknick und Dradenau hatten eine recht niedrige Keimbelastung von

12 - 9 KBE/ml, die aber auch über den Ergebnissen mit dem MPN-Verfahren lagen.

Abbildung 3.3: MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren für coliforme Bakterien

8

170

9

102

12

3839

10

50

100

150

200


KB

E/m

l

MPN-Verfahren Colilert 18

6 abgestandene Probe


46

Durch erhöhte Werte der Colilert-18-Verfahren sollte eine Differenzierung mit dem Endo-C-

Agar und eine Identifizierung der Bakterien mit der „Langen Bunten Reihe“ durchgeführt

werden. Beim Colilert-18 wurden die gelben und die fluoreszierenden Vertiefungen, unter

sterilen Bedingungen, entnommen und auf Endo-C-Agar ausgestrichen.

Die qualitative Differenzierung der coliformen Bakterien wurde bei 37°C und E. coli bei

44°C, bei einer Bebrütungszeit von 24 h, durchgeführt. Als Ergebnis lieferte Endo-C-Agar

Kolonien, die nicht rosa-rot bzw. kein grünschimmernden, beständigen Metallglanz

(Fuchsinglanz) hatten, die in der Abbildung 3.4 zu beobachten ist.

Abbildung 3.4: Beimpfte Endo-C-Agarplatte mit Colilert-18-Flüssigkultur.

Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die These aufgestellt, dass das Colilert-18-Verfahren

falsch-positive Coliforme oder E. coli Ergebnisse liefern kann.

3.1.4.1 Differenzierung der Colilert®18-Verfahren mit der Langen

Bunte Reihe

Die Lange Bunte Reihe prüft die Stoffwechselleistungen der Bakterien. Sie wurde mit 36

Komponenten wie zum Beispiel Voges Proskauer-Reaktion, Malonat-, Methylrot-,

Gelatinase-Test etc. (Kapitel 2.2.4.4) durchgeführt. Diese Komponenten zeigen die

biochemischen Merkmale von Mikroorganismen, die der weiteren Identifizierung dienen.

Zuerst wurden neue Endo-C-Agar-Platten fraktioniert ausgestrichen. Somit bestand die

Möglichkeit, die Lange Bunte Reihe mit einzeln gewachsenen Kolonien durchzuführen.

Bei der Durchführung der Differenzierung wurden folgende Proben untersucht:

� Oberflächengewässer; Bille 61

� Oberflächengewässer; Bille 4

� Oberflächengewässer; Alster-Haselknick

Die einzeln gewachsenen Kolonien wurden mit Hilfe einer sterilen Impföse auf die

entsprechenden Nährböden ausgestrichen und die Nährboulliouns wurden beimpft.

Nach einer Bebrütungszeit von 24 – 48 h wurden die Röhrchen nach positiven bzw. negativen

Reaktionen ausgewertet. Hierzu ergab sich aus den 36 Komponenten eine Liste

(Ablaufprotokoll) mit positiven und negativen Reaktionen. Danach wurde diese Liste mit der


47

Identifizierungstabelle (Biochemical reactions of the named species, biogroups, and Enteric

Groups of the familiy Enterobacteriaceae, siehe Anhang) verglichen.

Dieser Identifizierungsbogen für Enterobacteriaceae enthält 31 Gruppen der Organismen wie

Citrobacter, Cedecea, Enterobacter, Salmonella, Escherichiae, Hafnia etc. und deren

Untergruppen, wie zum Beispiel, Escherichiae mit der Untergruppe von E. coli inaktiv, E.

blattae. Außerdem enthält die Identifizierungstabelle Angaben über prozentuelle Anteile

positiver und negativer Reaktionen.

Die Wahrscheinlichkeit der Organismen hängt von der Zusammenstellung der ausgewerteten

Liste (Ablaufprotokoll; siehe Anhang), die von einer fraktioniert ausgestrichenen Kolonie

bearbeitet wurde. Als Beispiel wird die Billeprobe 61 aufgeführt. Diese Probe hatte beim

Colilert-18-Verfahren, gelbe Vertiefungen, die als coliforme Bakterien zu beurteilen waren.

Vom positiven (gelben) Wells wurde Flüssigkeit auf Endo-C-Agar ausgestrichen. Die

Ergebnisse der Endo-C-Agar schienen atypisch zu sein, d.h. es wuchsen keine rot-rosa

Kolonien bzw. war kein grünschimmernder Metallganz zu sehen. Um sicher zu gehen wurden

einzeln gewachsenen Kolonien erneut auf eine neue Endo-C-Platte ausgestrichen und mit

einzeln gewachsene Kolonien die Nährböden und Nährbouillons der Langen Bunten Reihe

beimpft. Nach der Bebrütungszeit wurden sie ausgewertet und die positiven, sowie auch die

negativen Reaktionen dokumentiert. Somit war eine Liste erstellt, die mit der

Identifizierungstabelle verglichen wurde.

Die Identifizierungstabelle enthält prozentuelle Werte, wie zum Beispiel 100%, 80%, 50%

ect., die als positive und negative Reaktion zugeordnet werden.

Bei der Billeprobe 61 wurde eine Liste zusammengestellt, wo zum Beispiel die D-Glucose als

positiv bewertet wurde und dementsprechend ein 100%iger Anteil auf der

Identifizierungstabelle abzulesen war. Diese Vorgehensweise wurde bei allen 36

Komponenten durchgeführt.

Bei der Tabelle 3.16 werden die Mikroorganismen dargestellt, die durch die Differenzierung

mit der Langen Bunten Reihe ermittelt wurden.

Tabelle 3.16: Differenzierung durch die Lange Bunte Reihe Proben Probenbezeichnung Lange Bunte Reihe

Mikroorganismen

1. Probe Oberflächengewässer; Bille 61 E. coli inaktiv 2. Probe Oberflächengewässer; Bille 4 Enterobacter eloacae

3. Probe Oberflächengewässer; Alster-Haselknick Klebsiella pneumoniae

Bei der Differenzierung wurde festgestellt, dass die Billeprobe 61 mit E. coli, inaktiv belastet

war. Außerdem war bei der Billeprobe 4 Organismen wie Enterobacter eloacae zu

identifizieren. Die letzte Probe war die Alster-Haselknick, die mit dem Organismen Klebsiella

pneumoniae belastet war. Die Differenzierung durch die Lange Bunte Reihe bewies, dass das

Colilert 18-Verfahren kein falsch-positive Ergebnis geliefert hat. Denn alle untersuchten

Wells ergaben bei der Langen Bunten Reihe einen positiven Coliformen-Befund.


48

3.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den Plattenmethoden

Die Untersuchungen auf Escherichia coli werden in der gleichen Reihenfolge wie die der

coliformen Bakterien gezeigt, d. h. zuerst wird die Plattenmethode mit allen Proben und dann

das MPN-Verfahren vorgestellt. Zusätzlich wird das Fluorocult-ECD-Agar-Verfahren, das

nur als fluoreszenzoptischer Nachweis von E. coli dient, aufgenommen.

Tabelle 3.17: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Regensielprobe

Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe 1.Platte 2.Platte 3.Platte Mittelwert

Desoxycholat-Agar Regensiel 20 25 25 23

Chromocult-Agar Regensiel 10 0 0 3

Endo-C-Agar Regensiel 5 5 5 5

Fluorocult-ECD-Agar Regensiel 5 5 5 5

Bei der Plattenmethode hatte der Desoxycholat-Agar die höchsten E. coli-Zahlen bei den

Proben Regensiel und Dradenau. Regensiel hatte 23 Kolonien pro ml (Tab. 3.17) und

Dradenau mit 21 Kolonien pro ml (Tab. 3.18).

Tabelle 3.18: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Haselknickprobe


Desoxycholat-Agar Haselknick 11 15 8 7 10

Chromocult-Agar Haselknick 0 0 5 0 1

Endo-C-Agar Haselknick 20 25 5 10 15

Fluorocult-ECD-Agar Haselknick 10 0 5 0 4

Bei der Probe Haselknick wurde die größte E. coli-Zahlen der Endo-C-Agar mit 15 Kolonien

pro ml beobachtet (Tab. 3.18). Dann folgte die Probe Wulksfelde mit 10 Kolonien pro ml

(Tab. 3.19).

Die Probe Haselknick wurde mit frisch gegossener Endo-C-Agar durchgeführt. Deshalb war

nur hier der höchste E. coli-Zahl zu ermitteln. Bei den anderen Proben konnte aus technischen

Gründen kein frisch gegossener Endo-C-Agar aus der Nährbodenküche geliefert werden.

Deshalb konnten sie nicht sofort durchgeführt werden.

Tabelle 3.19: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Wulksfeldeprobe

Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe 1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte 5.Platte Mittelwert

Desoxycholat-Agar Wulksfelde 5 15 10 15 5 10

Chromocult-Agar Wulksfelde 0 0 10 0 0 2

Endo-C-Agar Wulksfelde 6 7 6 6 4 6

Fluorocult-Agar Wulksfelde 5 10 5 0 5 5

Das Fluorocult-ECD-Agar hatte bei allen Probe fast gleiche E. coli-Zahlen. Die Ergebnisse

waren übereinstimmend, d. h. sie lagen zwischen 4 – 5 Kolonien pro ml. Dies ist darauf

zurückzuführen, dass der Fluorocult-ECD-Agar ein Selektivagar ist.


49

Zusätzlich zur Bestätigung des Befundes wurden die fluoreszierenden Kolonien auf

Indolbildung geprüft. Außerdem wurde das Volumen der Proben bei den Vorversuchen

bestimmt. Es zeigte sich, dass ein kleines Volumen, wie z. B. 10 - 100 µl für den Fluorocult-

Agar zu niedrig war. Es wuchsen nur vereinzelte Kolonien, die jedoch im UV-Licht nicht

sichtbar waren. Deshalb wurde bei den weiteren Untersuchungen ein Volumen von 200 µl

gewählt und bei der Auswertung die Verdünnung berücksichtigt.

Tabelle 3.20: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Dradenauprobe Keimzahl in KBE/ml Plattenmethode Probe

1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte Mittelwert Desoxycholat-Agar Dradenau 25 20 10 30 21

Chromocult -Agar Dradenau 5 0 5 5 4

Endo-C-Agar Dradenau 5 0 0 0 1

Fluorocult-ECD-Agar Dradenau 5 5 0 5 4

Der Chromocult-Coliformen-Agar hatte bei allen Proben die niedrigsten Mittelwerte. Hier

lagen die Keimbelastungen zwischen 1 – 4 Kolonien pro ml. Die dunkelblau-violett gefärbten

Kolonien auf dem hellen Chromocult-Agar waren sehr gut zu identifizieren.

3.2.1 Differenzierung der Escherichia coli von Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-C-

Agar und Desoxycholat-Agar

Die Differenzierung der E. coli für Chromocult-Agar mit einem Oxidase-Test bewies, dass

alle dunkelblau-violett gewachsenen Kolonien coliforme Kolonien waren. Da die getesteten

Kolonien die Reaktion Oxidase-negativ zeigten (Tab. 3.21).

Tabelle 3.21: Differenzierung der E. coli für Chromocult-Agar mit Oxidase-Test E. coli Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Chromocult-Agar (KBE/ml) 3 1 2 4 ∑ der untersuchten Kolonien 3 1 2 4 Oxidase-positiv (KBE/ml) 0 0 0 0 Oxidase-negativ (KBE/ml) 3 1 2 4 Falsch-positive Abweichung (%) 0 0 0 0 Tatsächliche Wert (KBE/ml) 3 1 2 4

Bei der Differenzierung für Endo-C-Agar durch einen Oxidase-Test zeigten sich keine großen

prozentuellen Abweichungen, da die untersuchten Kolonien Oxidase-negativ waren.

Die Probe Haselknick enthielt eine Abweichung von 20% und die Dradenauprobe zeigte eine

100% Abweichung. Bei der Probe Dradenau konnte aber nur eine Kolonie auf Oxidase

untersucht werden. Somit ist die Wahrscheinlichkeit zu gering, um eine Aussage treffen zu

können (Tab. 3.23).


50

Tabelle 3.23: Differenzierung der E. coli für Endo-Agar mit dem Oxidase-Test Escherichia coli Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Endo-C-Agar (KBE/ml) 5 15 6 1 Oxidase-positiv (KBE/ml) 0 3 0 1 Oxidase-negativ (KBE/ml) 5 12 6 0 Prozentuale Abweichung (%) 0 20 0 100 Tatsächliche Wert (KBE/ml) 5 12 6 0

Bei der Überprüfung des Desoxycholat-Agars wurde die Differenzierung der E. coli mit den

Bunten Reihen durchgeführt. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigten die höchsten

Keimzahlen, weil der Nährböden die thermotoleranten Bakterien wachsen lassen.

Bei der Probe Haselknick und Wulksfelde lagen die Keimbelastungen zwischen 80 – 83 %

(Tab. 3.22) weniger als mit der Bestimmung von Desoxycholat-Agar.

Der Mittelwert der E. coli bei der Probe Dradenau war zu 71% weniger vorhanden, als in der

Tat die Probe enthielt. Die geringste prozentuale Abweichung zeigte die Probe Regensiel mit

65%.

Tabelle 3.22:Differenzierung der E. coli-Zahlen nach Desoxycholat-Agar durch die Bunte Reihe

Escherichia coli Regensiel Haselknick Wulksfelde Dradenau

Desoxycholat-Agar (KBE/ml) 23 10 6 21 ∑ der untersuchten Kolonien 8 5 6 7 Bunte Reihe: positiv (KBE/ml) 3 1 1 2 Falsch-positive Abweichung (%) 63 80 83 71 Tatsächliche Wert (KBE/ml) 8 2 1 6

Die Abbildungen 3.5 und 3.6 stellt ein Vergleich zwischen den ermittelten Anzahlen der

Escherichia coli mit und ohne die Differenzierung dar.

Abbildung 3.5: Ermittelte Anzahl der E. coli nach der Differenzierung

21

6

12

4

12

6

0

4 4

8

3

5 55

0

5

10

15

20

25


KB

E/m

l

Desoxycholat-Agar Chromocult-Agar Endo-Agar Fluorocult-Agar


51

Abbildung 3.6: Ermittelte Anzahl der E. coli ohne die Differenzierung

10 10

21

12

45

15

6

1

54

54

23

3

0

5

10

15

20

25


KB

E/m

l

Desoxycholat-Agar Chromocult-Agar Endo-Agar Fluorocult-Agar

3.2.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den MPN-Verfahren und

Colilert®18-Verfahren

Die Ergebnisse der MPN-Verfahren und der Colilert-18-Verfahren waren übereinstimmend.

Die Probe Regensiel hatte bei dem MPN-Verfahren weniger als 0,3 Kolonien pro ml (Tab.

3.24) und mit dem Colilert-18-Verfahren lag die Koloniezahl bei 0,3 Kolonien pro ml

(Tab. 3.25).

Tabelle 3.24: Ergebnisse der Probe Regensiel mit MPN-Verfahren Positive Röhrchen

Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 0 0 0 0/0/0 <30 2 0 0 0 0/0/0 <30

Probe: Regensiel

3 0 0 0 0/0/0 <30

<0,30

Tabelle 3.25: Ergebnisse der Probe Regensiel mit Colilert-18 Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells


Charakteristische

Zahl

Statistischer Tabellenwert (KBE/100 ml)

Verdünnung

Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 1 3/1 4,1 1:10

2 3 0 3/0 3,1 1:10 Probe: Regensiel

3 3 0 3/0 3,1 1:10

0,30

Die Probe Haselknick (Tab. 3.26 und 3.27) zeigte bei beiden Verfahren die gleiche Keimzahl-

belastung. Hier wurden 0,5 Kolonien pro ml ermittelt.


52

Tabelle 3.26: Ergebnisse der Probe Haselknick mit MPN-Verfahren Positive Röhrchen

Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 2 0 0 2/0/0 90 2 1 0 0 1/0/0 40 3 0 0 0 0/0/0 <30

Probe: Hasel-

knick

4 0 1 0 0/1/0 30

0,50

Tabelle 3.27: Ergebnisse der Probe Haselknick mit Colilert-18 Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells





(KBE/ml)

1 2 0 2/0 2,0 1:10

2 7 0 7/0 7,4 1:10

3 5 0 5/0 5,2 1:10

Probe: Hasel-

knick

4 3 1 3/1 4,1 1:10

0,50

Die Probe Wulksfelde zeigte einen Unterschied beim MPN-Verfahren. Sie zeigte eine

Keimzahl von 13 Kolonien pro ml (Tab. 3.28) und bei Colilert-18 lag sie bei 2 Kolonien pro

ml.

Tabelle 3.28: Ergebnisse der Probe Wulksfelde mit MPN-Verfahren


MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 3 3 0 3/3/0 2400 2 3 2 1 3/2/1 1500 3 3 2 0 3/2/0 930 4 3 1 1 3/1/1 750

Probe: Wulks-

felde

5 3 1 1 3/1/1 750

13

Tabelle 3.29: Ergebnisse der Probe Wulksfelde mit Colilert-18 Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells


Charakteristische

Zahl


Verdünnung

Mittelwert

(KBE/ml)

1 11 5 11/5 17,9 1:10

2 12 6 12/6 20,4 1:10

3 10 4 10/4 15,5 1:10

4 15 4 15/4 22,3 1:10

Probe: Wulks-

felde 5 11 4 11/4 16,8 1:10

2

Der Wert der E. coli-Zahlen bei der Probe Dradenau enthielt bei beiden Verfahren die gleiche

Keimzahlbelastung. Sie lag bei 1 Kolonie pro ml (Tab. 3.30 und 3.31).


53

Tabelle 3.30: Ergebnisse der Probe Dradenau mit MPN-Verfahren Positive Röhrchen

Volumen

MPN

Nr.

1:10

1:100

1:1000

Charakteristische

Zahl


Mittelwert

(KBE/ml)

1 2 0 0 2/0/0 90 2 1 0 0 1/0/0 40 3 2 0 0 2/0/0 90

Probe: Dradenau

4 2 1 0 2/1/0 150

1

Tabelle 3.31: Ergebnisse der Probe Dradenau mit Colilert-18 Colilert-18 Große

Wells Kleine Wells





(KBE/ml)

1 8 0 8/0 8,6 1:10

2 7 1 7/1 8,5 1:10

3 11 0 11/0 12,2 1:10

Probe: Dradenau

4 12 0 12/0 13,5 1:10

1

3.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli und coliformen Bakterien mit

dem Membranfiltrationsverfahren

Das Membranfiltrationsverfahren wird mit E. coli und coliformen Bakterien gemeinsam

präsentiert. Von den verdächtigen Kolonien auf dem Membranfilter wurden bis zu 10

Kolonien weiter untersucht und der Befund auf das Endergebnis hochgerechnet.

Das Membranfiltrationsverfahren wurde mit sehr großen Verdünnungen vorbereitet. Die

Standardarbeitsanweisung des Umweltamtes Hamburg beschreibt, dass dieses Verfahren mit

einem Volumen von 100 ml durchgeführt werden soll.

Während den Vorversuchen wurde festgestellt, dass die Durchführung des Verfahrens mit 100

ml Wasserprobe, ohne Verdünnung, zu keinen Ergebnissen führt. Dann wurden

Verdünnungen von 1:100 gewählt.

Die Identifizierung und Differenzierung der gelben bzw. gelb-orange Kolonien auf dem

Membranfilter konnte kaum ausgewertet werden, da die Kolonien meist aufeinander

gewachsen waren. Dies wurde nach 18 h Bebrütung bei 37°C beobachtet.

Bei den ersten drei Paralleluntersuchungen wurde eine Verdünnung von 1:1000 gewählt und

die Abwasserprobe wurde mit einer Verdünnung von 1:10000 durchgeführt. Erst mit diesen

Verdünnungen konnten Ergebnisse erzielt werden.

Die coliformen Bakterien waren bei der Probe Regensiel zu 90 Kolonien pro ml vorhanden.

Dies ist die meist belastete Probe beim Membranfiltrationsverfahren. Die fäkalcoliforme

Bakterien waren nicht vorhanden (Tab. 3.32).


54

Tabelle 3.32:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der Regensielprobe

Membran-

filtration

Nr.

Verdächtige

Kolonien auf

Membranfilter

Umrechnugs-

wert

Coliforme der untersuchten Kolonien

Coliforme

Bakterien

E. coli

Mittelwert

(KBE/ml)

1 28 28/47=7 3 21 0 2 20 20/4=5 1 5 0

Probe: Regen-siel 3 28 28/4=7 0 28 0

Coliforme: 90

E. coli: 0

Der Mittelwert der Probe Haselknick lag bei 53 Kolonien pro ml. Hier konnten auch keine

fäkalcoliforme Bakterien ermittelt werden (Tab. 3.33).

Tabelle 3.33:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der Haselknickprobe

Membran-

filtration

Nr.

Verdächtige

Kolonien auf

Membranfilter

Umrechnugs-

wert


Coliforme

Bakterien

E. coli

Mittelwert

(KBE/ml)

1 45 45/6=7,5 2 15 0

2 41 41/6=6,83 1 6,83 0

3 34 34/6=5,6 3 17 0

Probe: Hasel-

knick

4 22 22/6=3,6 1 3,6 0

Coliforme: 53

E. coli: 0

Die Probe Wulksfelde hatte die zweithöchste Keimzahlbelastung mit 73 Kolonien pro ml. Der

Mittelwert der E. coli lag bei 5 Kolonien pro ml (Tab. 3.34).

Tabelle 3.34:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der Wulksfeldeprobe

Membran-

filtration

Nr.

Verdächtige

Kolonien auf

Membranfilter

Umrechnugs-

wert


Coliforme

Bakterien

E. coli

Mittelwert

(KBE/ml)

1 28 28/6=4,6 4 18,6 4,6

2 30 30/6=5 1 5 0

3 35 35/6=5,8 2 12 0

4 48 48/6=8 3 24 0

Probe:

Wulks-

felde

5 82 82/6=13,6 1 13,6 0

Coliforme: 73

E. coli: 5

Die Probe Dradenau hatte einen Mittelwert von 49 Kolonien und die E. coli-Keimzahl lag bei

5 Kolonien pro ml (Tab. 3.35).

7 Anzahl der untersuchten Kolonien


55

Tabelle 3.35:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der Dradenauprobe

Membran-

filtration

Nr.

Verdächtige

Kolonien auf

Membranfilter

Umrechnugs-

wert


Coliforme

Bakterien

E. coli

Mittelwert

(KBE/ml)

1 11 11/7=1,57 3 4,71 0

2 13 13/6=2,16 1 2,16 0

3 11 11/7=1,57 3 4,71 0

Probe:Dra-

denau

4 12 12/6=2 4 8 2

Coliforme:49

E. coli:5

Alle coliformen Bakterien lagen zwischen 50 – 90 Kolonien pro ml und bei den E. coli lies

sich ein Mittelwert von 0 - 5 Kolonien pro ml feststellen. Diese Proben enthielten große

Verdünnungen.

3.4 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli

Es konnten keine Ergebnisse für die Proben Regensiel, Haselknick, Wulksfelde und Dradenau

bestimmt werden. Da diese Proben für ein Miniaturverfahren zu geringe E. coli-Keimzahlen

hatten. Deshalb wurde beschlossen Proben mit höheren E. coli-Keimzahlen für dieses

Verfahren einzusetzen.

Es wurden noch 7 zusätzliche Proben genommen. Diese Proben wurden sowohl mit dem

Miniaturverfahren (Mikrotiterplatten) als auch mit den anderen Verfahren untersucht.

Tabelle 3. 36: Miniaturverfahren und Colilert-18-Verfahren für E. coli Escherichia coli: in KBE/ml

Nr. Proben: Datum: Colilert-18 Miniaturverfahren

1 Schlemmer Bach, Billstedt 19.10.05 2 3

2 AS Billstedt 19.10.05 6 5 3 Winterhuder Brücke, Alster 25.10.05 17 2 4 Ammersbek, Bürgkamp 25.10.05 65 3 5 Moorfleet, Autobahn 24 07.11.05 4 3 6 Waltershof Autobahn 07.11.05 12 22

7 Georgswerder Bogen 14.11.05 2 3

Mittelwert in (KBE/ml) 15 6

Der Vergleich bei den Einzelwerten dieser 7 Proben, zwischen dem Colilert-18 und dem

Miniaturverfahren ergab, dass das Colilert-18 in 3 von 7 Fällen drastisch unterschiedliche

Ergebnisse liefert.

Der Mittelwert für das Verfahren Colilert-18 für 7 Proben betrug 15 Kolonien pro ml. Im

Gegensatz dazu erhielt das Miniaturverfahren einen Mittelwert von 7 Kolonien pro ml.

Damit zeigte das Colilert-18 mehr als 2-fachen Belastungen der E. coli.


56

Die Plattenmethoden für E. coli werden in Kolonienbildende Einheiten pro ml angegeben.

Damit eine bessere Übersicht entsteht, ist das Desoxycholat-Agar-Verfahren, die höchsten

Zahlen lieferte.

Tabelle 3. 37: Zusammenfassung der Plattenmethoden für E. coli Plattenmethoden: KBE/ml bei Escherichia coli

Nr. Proben: Desoxycholat-

Agar

Endo-C-

Agar

Chromocult-

Agar

Fluorocult-

Agar

1 Georgsweder Bogen 75 15 5 5 2 Schlemmer Bach, Billstedt 10 8 5 5 3 AS Billstedt 35 25 10 7 4 Moorfleet, Autobahn 24 15 20 10 5 5 Waltersdorf Autobahn 40 20 30 5 6 Winterhuder Brücke, Alster 40 25 45 10 7 Ammersbek, Bürgkamp 70 50 40 15

Mittelwert in KBE/ml 41 23 21 7

Mit dem Desoxycholat-Agar wurden höhere Belastungen festgestellt als mit den anderen

Nährböden. In nur 1 von 7 Fällen zeigte der Desoxycholat-Agar einen niedrigeren Wert (Tab.

3.37). Der Endo-C-Agar liefert geringe Anzahl der E. coli, als der Chromocult-Agar. Bei der

Fluorocult-ECD-Agar wuchsen die wenigsten Keimzahlen.

Im Zusammenhang mit Miniaturverfahren waren die Ergebnisse der Plattenmethode erheblich

höher, als der des Miniaturverfahrens. Bei sechs Verfahren, die in diesem Abschnitt behandelt

wurden, lag das Miniaturverfahren an der letzten Stelle mit den Keimzahlen (Abb. 3.6).

Abbildung 3.7: Ermittelte Anzahl der Escherichia coli

41

23 21

7 6

15

0

10

20

30

40

50

KBE/m

l

Desoxycholat-Agar Endo-C-Agar Chromocult-AgarColilert-18Verfahren Fluorocult-Agar Miniaturverfahren

Insgesamt betrachtet ist die Reihenfolge der Einzelwerte dieser Proben ähnlich der

Reihenfolge der Ergebnisse der Parallelansätze, die im Kapitel 3.2 ermittelt wurden. Außer

einige Werte, die man als Ausreißer bezeichnen könnte.


57

3.5 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von coliformen Bakterien mit den einzelnen

Verfahren

Beim Vergleich der Verfahren mit den Plattenmethoden werden die Endergebnisse, die durch

die Differenzierung und ohne die Differenzierung ermittelt wurden, dargestellt. Anschließend

folgt der Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren.

3.5.1 Chromocult-Coliformen-Agar

Mit diesem Agar wurde die höchste Keimzahl nach der Differenzierung mit der Oxidase-Text

erreicht. Insgesamt waren 225 Kolonien pro ml, die durch einen Oxidase-Test als falsch-

positive Bakterien ermittelt wurden. Dies entspricht einen prozentualen Anteil von 81% (siehe

Tab. 3.5).

Zur Identifizierung der Kolonien bietet der Coliformen–Agar von allen verwendeten

Nährböden eindeutig den besten Farbkontrast (Abb. 3.8). Auf dem hellen, transparenten

Nährboden sind die rosa-roten Coliformen deutlich zu erkennen. Die Aufnahme der Volumen

von dem Nährboden ist einwandfrei, da das Aufsaugen der Probe mit kleinen und großen

Volumen mit dem Oberflächenausstrich problemlos war.

Abbildung 3.8: Kolonien von coliformen Bakterien auf Chromocult-Coliformen-Agar

3.5.1.2 Endo-C-Agar

Mit dem Endo-C-Agar war im Verlauf der Untersuchungen ein durchgehend geringes

Koloniewachstum, mit Ausnahme einer Probe, festzustellen. In nur 1 von 4 Fällen wuchsen

auf Endo-C-Agar mehr Kolonien als bei den anderen Plattenmethoden. Mit dem Oxidase-Test

wurde ein Anteil von 63% an falsch positiven Nachweisen festgestellt (siehe Tab. 3.6).

Das Ausplattieren und Auszählen der Kolonien auf dem Endo-C-Agar erwies sich als

problematisch. Beim Ausplattieren mit dem Oberflächenausstrich durfte kein großes Volumen

eingesetzt werden. Die Flüssigkeit wurde schlecht von den Nährböden aufgesaugt. Auf dem

hellroten Nährboden wachsen die Kolonien in einem roten Farbton, so dass sie sehr schlecht

zu erkennen sind. Teilweise waren die Nährboden, die aus der Nährbodenküche geliefert

wurden, eher rot bis dunkelrot. Somit wurde die Identifizierung der Kolonien noch

schwieriger. Deshalb wurde eine Lampe zu Hilfe genommen, um die roten Kolonien und den


58

grünschimmernden Metallglanz besser überprüfen zu können. Ein beständiger,

grünschimmernder Metallglanz (Fuchsinglanz) der Kolonien war bei einigen Parallelansätzen

meist nicht zu erkennen (Abb. 3.9).

Abbildung 3.9: Kolonien von coliformen Bakterien auf Endo-C-Agar

3.5.1.3 Desoxycholat-Agar

Während der experimentellen Untersuchungen, ohne die Differenzierung, hatte das

Desoxycholat-Agar-Verfahren die zweithöchste Keimzahl. In der Abbildung 3.10 sind zwei

Ansätze für die Bunte Reihe aufgestellt. Der linke Ansatz ist eine bearbeitete Bunte Reihe und

zeigt die Gasbildung bei den Laktose und Glucose Röhrchen. Die Indolbildung ist durch die

violette Färbung zu erkennen und der Citrat-Röhrchen ist positiv. Der rechte Ansatz ist

unbehandelt und macht den Unterschied deutlich.

Abbildung 3.10: Die Bunte Reihe mit einem behandelten und unbehandelten Ansatz

Insgesamt war durch die Differenzierung mit einer Bunten Reihe ein Anteil von 38% an

falsch-positiven Bakterien (siehe Tab. 3.7). Dies ist darauf zuführen, dass der Desoxycholat-

Agar ein Nährboden ist, die thermotoleranten Bakterien wachsen lässt. Trotzdem zeigten die

Platten eine gute Aufteilung der Kolonien, die auf eine richtige Durchmischung der

Flüssigkeit mit Nährboden hindeutet.


59

Der helle Nährboden ermöglicht eine problemlose Identifizierung der dunkelroten Kolonien

mit dem Keimzählgerät (Abb. 3.11).

Abbildung 3.11: Kolonien von coliformen Bakterien auf Desoxycholat-Agar

3.5.1.4 MPN-Verfahren und Colilert®18-Verfahren

Die Ergebnisse der Keimzahlen von MPN-Ansätzen lagen deutlich unter den der Colilert-18-

Verfahren. In zwei Fällen wurde mit Colilert-18 sogar das 9 - 4fache als beim MPN-

Verfahren beobachtetBei dem MPN-Verfahren wurde keine weitere Differenzierung

vorgenommen und beim Colilert-18 wurde die Identifizierung der Bakterien durchgeführt.

Die Durchführung der MPN-Verfahren ist

problemlos. Die Durchführung nimmt nicht viel Zeit in Anspruch. Aber die Bebrütungszeit ist

im Gegensatz zu Colilert-18 doppelt so lang. Um ein schnelles Ergebnis zu erzielen ist der

Colilert-18 vorteilhafter. Bei Colilert-18-Verfahren ist die Bebrütungszeit 18 Stunden und der

Test muss exakt nach 18 Stunden ausgewertet werden. Nach Ablauf von 18 Stunden können

andere heterotrophe Keime das Hemmsystem von Colilert-18 überwinden und könnten zu

falsche Ergebnisse führen (Abb. 3.12).

Abbildung 3.12: Colilert-18-Verfahren für coliforme Bakterien


60

Die Auswertung der MPN-Röhrchen und der Colilert-18-Trays ist eindeutig. Die Gasbildung

in den Durham-Röhrchen ist klar zu erkennen. Die Beurteilung der gelben Vertiefungen beim

Colilert-18-Verfahren bereitet auch keine Probleme. Hierfür wird als Referenz die

Komparator-Lösung mit dem Ansatz verglichen.

Abbildung 3.13: MPN-Röhrchen für coliforme Bakterien

3.5.2 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von Escherichia coli mit den einzelnen

Verfahren

Beim Vergleich der Verfahren mit den Plattenmethoden werden die Endergebnisse, die durch

die Differenzierung ermittelt wurden, dargestellt. Zusätzlich wird noch der Fluorocult-ECD-

Agar eingesetzt, der nur für die Bestimmung von E. coli dient.

Anschließend folgt der Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren.

3.5.2.1 Desoxycholat-Agar

Mit diesem Agar hatten 3 Proben die höchsten Keimzahlen. Somit hatte der Desoxycholat-

Agar die höchsten Keimzahlen vor der Differenzierung mit der Bunten Reihe.

Durch die Differenzierung wurde festgestellt, dass darunter die meisten falsch-positive Keime

waren. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigte ein Anteil von 74% (siehe Tab. 3.22). In der

Abbildung 3.14 sind die E. coli Bakterien auf den hellen Nährboden zu erkennen.

Abbildung 3.14: Kolonien von E. coli auf dem Desoxycholat-Agar


61

3.5.2.2 Endo-C-Agar

Die Koloniezahlen, die mit Endo-C-Agar durch die Differenzierung erreicht wurde, liegen an

zweiter Stelle. In nur 1 von 4 Fällen wuchsen auf Endo-C-Agar mehr Kolonien als auf

Desoxycholat-Agar. Der Anteil an falsch-positiven Keimen bei dem Endo-C-Agar liegt bei

30% (siehe Tab. 3.23)

3.5.2.3 Fluorocult-ECD-Agar

Beim Fluorocult-Agar wurde die Differenzierung durch die Indolprüfung durchgeführt.

Dieser Agar zeigt den nächstkleinsten Keimzahlen. Die E. coli-Keimzahlen blieben selbst

durch die Indolprüfung unverändert (siehe Tab. 3.17-3.20).

Die Saugfähigkeit der Fluorocult-Agar war begrenzt. Im Gegensatz dazu erwies sich nur ein

Ansatz mit geringem Probenvolumen, als ungenügend. Deshalb müsste das gewählte

Volumen lange mit dem Spatel gerieben werden. Zusätzlich wurde der Agar, bei 37°C ca. 5

Minuten erwärmt und sofort behandelt.

Als vorteilhaft ist der helle Nährboden (Abb. 3.15) für die Identifizierung der hellblau

fluoreszierenden Kolonien sehr geeignet.

Abbildung 3.15: Fluorocult-ECD-Agar ohne Fluoroszenz


62

3.5.2.4 Chromocult-Coliformen-Agar

Der Chromocult-Coliformen-Agar zeigte die niedrigsten E. coli-Keimzahlen vor der

Differenzierung an. Hier ergaben sich bei allen 4 Untersuchungen geringe Keimzahlen außer

bei einer Probe. Da der Chromocult-Coliformen-Agar ein Selektiv-Nährboden ist, waren bei

der Differenzierung mit dem Oxisase-Test keine Unterschiede zu beobachten. Hier wurden

keine falsch-positiven Ergebnisse ermittelt (siehe Tab. 3.21).

Aufgrund der geringen Keimzahldichte auf den Platten hatten die Kolonien generell

optimalen Wachstumsraum und es kam nicht zu Anhäufungen von mehreren Kolonien.

Hier besteht kein Bedarf für die Nutzung eines Keimzählgerätes Dies zeigt auch die

Abbildung 3.16.

Abbildung 3.16: Kolonien von E. coli auf Chromocult-Coliformen-Agar

3.5.2.5 MPN-Verfahren und Colilert®18-Verfahren

Die ermittelten Keimzahlen mit dem MPN-Verfahren und dem Colilert-18-Verfahren für E.

coli waren übereinstimmend. In nur 1 von 4 Fällen lag das Ergebnis mit dem MPN-Verfahren

höher als das Colilert-18-Verfahren. Bei den anderen 3 Untersuchungen waren die Ergebnisse

der Keimzahlen identisch. Bei diesen Ergebnissen wurde keine Differenzierung

vorgenommen.

Die Auswertung der MPN-Röhrchen und der Colilert-18-Trays mit Hilfe einer UV-Lampe

zeigte eindeutig gut unterscheidbare positive und negative Reaktionen (Abb. 3.17).


63

Abbildung 3.17: MPN-Röhrchen mit Fluoreszenz

3.5.2.6 Membranfiltrationsverfahren zur quantitativen Erfassung von Escherichia coli

und coliformen Bakterien

Bei dem Membranfiltrationsverfahren wurden nur die laut DIN vorgeschriebenen

Differenzierungen durchgeführt. Die Keimzahlbestimmung bei den coliformen Bakterien

sowie der E. coli-Keimzahlen durch dieses Verfahren ist niedrig.

Die Durchführung des Verfahrens ist einwandfrei. Aber es ist ein Verfahren, das erst nach 48

Stunden Ergebnis liefert. Außerdem müssen sehr große Verdünnungen gewählt werden. Bei

der Abbildung 3.18 ist eine Membranfiltrationsanlage dargestellt.

Abbildung 3.18: Membranfiltrationsanlage

3.5.2.7 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli

Das Miniaturverfahren wurde mit 7 verschiedenen Proben durchgeführt. Das Verfahren ergab

sehr niedrige E. coli-Keimzahlen. Der Nachweis von E. coli durch Fluoreszenz im UV-Licht

war eindeutig und die Durchführung des Miniaturverfahrens lief einwandfrei.

Das Pipettieren mit der 8-Mehrkanal-Pipette wurde vor der Durchführung der Proben auf ihre

Volumen geprüft. Somit wurde diese Fehlerquelle von Anfang an ausgeschlossen.

Bei dem Miniaturverfahren sollten Proben gewählt werden, die höhere E. coli-

Keimzahlbelastung besitzen. Durch den Einsatz kleiner Probenvolumina ist dieses Verfahren


64

insbesondere für die Untersuchung von Abwasser- und Oberflächengewässern geeignet. Bei

der Abbildung 3.19 ist eine Mikrotiterplatte dargestellt.

Abbildung 3.19: Mikrotiterplatte für ein Miniaturverfahren

3.6. Statischtische Prüfverfahren zur quantitativen Erfassung der Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden die Plattenmethoden für die coliformen und fäkalcoliformen

Bakterien mit dem statischen Prüfverfahren untersucht. Es wurden die Mittelwerte der

Verfahren ohne die Differenzierung d.h. die Gesamt-Keimzahlen inklusive falsch-positiven

Ergebnisse betrachtet. Die Anzahl falsch-positiver Kolonien wurde auf die Gesamtheit der

Koloniezahlen aller Platten bezogen. Damit ist die Bestimmung der Koloniezahl falsch-

positiver Kolonien der einzelnen Platten nicht gewährleistet.

Aufgrund der Vielfalt der Bestimmungsmethoden wurde beschlossen nur die Ergebnisse der

Plattenmethoden mit statistischen Prüfverfahren zu analysieren.

3.6.1 Anwendung statistischer Prüfverfahren auf die Ergebnisse der Untersuchungen

mit coliformen Bakterien

Bei der quantitativen Analyse der Plattenmethoden beobachtet man eine Variabilität und

damit eine Streuung der Ergebnisse. Insgesamt wurden vier Proben mit verschiedenen

Parallelansätzen durchgeführt und das sich daraus ergebende arithmetische Mittel bzw. der

Mittelwert wurde für die Auswertung der Parallelansätze herangezogen.

Die Tabelle 3.38 ermöglicht eine besseren Übersicht über die Plattenmethoden und den

jeweiligen statistischen Größen. Die statistischen Größen setzen sich aus arithmetischem


65

Mittelwert, Varianz, Standardabweichung und Variationskoeffizienten zusammen. Die

Formeln für diese Größen sind im Kapitel 2.5.2.1 dargestellt.

Tabelle 3.38: Coliformenzahlen mit dem statischen Prüfverfahren

Plattenmethoden Proben x s2 s v V*100%

Regensiel 96 379 19,46 0,20 20 Haselknick 83 770 27,75 0,33 33 Wulksfelde 439 4084 63,90 0,15 15

Desoxycholat-

Agar Dradenau 46 73 8,54 0,19 19

Regensiel 463 3033 55,07 0,12 12 Haselknick 264 1940 44,04 0,17 17 Wulksfelde 355 3100 55,67 0,16 16

Chromocult-

Agar Dradenau 58 1575 39,69 0,68 68

Regensiel 125 175 13,23 0,11 11 Haselknick 39 89,67 9,47 0,24 24 Wulksfelde 31 180 13,42 0,43 43

Endo-C-Agar

Dradenau 30 150 12,25 0,40 40

Der Variationskoeffizient ist eine Kenngröße für das Ausmaß der zufälligen Fehler und damit

ein Maß für die Ungenauigkeit der verwendeten Bestimmungsmethode. Durch die

Bestimmung der Standardabweichung konnten die Variationskoeffizienten berechnet werden.

In 7 von 12 Fällen ist der Variationskoeffizient unter 20%. Je kleiner der Zahlenwert der

Variationskoeffizienten, desto größer ist die Präzision der Bestimmungsmethode. In 7 Fällen

ist die Genauigkeit der Bestimmungsmethode noch zu akzeptieren.

Die größeren Abweichungen über 20% hängen mit der Streuung der Einzelwerte um ihren

Mittelwert zusammen. In 5 Fällen sind diese Streuungen zu beobachten, in denen der

Variationskoeffizient in einem Bereich von 33 bis 63% liegt. Die Einzelwerte der

Plattenmethoden sind im Kapitel 3.2.3 nachzusehen.

3.6.2 Ergebnisse der E. coli mit dem statistischen Prüfverfahren

Bei den Ergebnissen der E. coli wurden auch arithmetischer Mittelwert, Varianz,

Standardabweichung und Variationskoeffizienten berechnet.

Tabelle 3.39: E. coli-Keimzahlen mit dem statischen Prüfverfahren

Plattenmethoden Proben x s2 s v V*100%

Regensiel 23 8,5 2,91 0,13 13 Haselknick 10 13 3,61 0,36 36 Wulksfelde 10 25 5 0,50 50

Desoxycholat-

Agar Dradenau 21 73 8,54 0,40 40

Regensiel 3 33,5 5,79 1,93 193 Haselknick 1 6,33 2,51 2,51 251 Wulksfelde 2 20 4,47 2,23 223

Chromocult-

Agar Dradenau 4 6,3 2,51 0,63 63


66

Regensiel 5 -8 - - -

Haselknick 15 58,3 7,64 0,50 50 Wulksfelde 6 1,25 1,12 0,18 18

Endo-C-Agar

Dradenau 1 6,3 2,51 2,51 251

Regensiel 5 - - - - Haselknick 4 23 4,79 1,19 119 Wulksfelde 5 12,5 3,5 0,70 70

Fluorocult-Agar

Dradenau 4 6,3 2,51 0,63 63

Die Ergebnisse der Variationskoeffizienten zeigen, dass nur die Bestimmungsmethode in nur

2 von 15 Fällen präzise ist mit einem Variationskoeffizient unter 20%. Bei den anderen Fällen

wurden sehr große Ungenauigkeiten ermittelt, obwohl die Streuung der Einzelwerte um ihren

Mittelwert teilweise gering war. Aber der arithmetische Mittelwert ist bei den E. coli-

Keimzahlen sehr gering und dementsprechend die einzelne Kolonienzahl der Platten. Dies

könnte ein Grund für die höheren Variationskoeffizienten sein. Ein weiterer Grund dafür ist

die geringe Anzahl der Proben. Diese Faktoren beeinflussen die Ermittlung der

Variationskoeffizienten für die E. coli-Keimzahlen. Durch diese Vorgehensweise ist

festzuhalten, dass die Standardabweichung, Varianz und der Variationskoeffizienten mit

geringer Anzahl der Kolonien und der Proben nicht zu bewerten ist.

In der Tabelle sind Bemerkungen wie „keine“ angeführt. Hier konnte die

Variationskoeffizienten nicht ermittelt werden, da die Streuung der Einzelwerte gleich dem

arithmetischen Mittelwert war. Somit ist ein statisches Prüfverfahren nicht durchführbar.

3.7 Untersuchungen von Umweltproben

Zusätzlich zu den Hauptuntersuchungen mit den Parallelansätzen (4 Proben) wurden

Untersuchungen mit verschiedenen Wasserproben durchgeführt. Insgesamt wurden 107

Proben aus der Bille, Elbe, Alster, einige Sonderproben und dem Ablauf der Kläranlage

Dradenau, untersucht. Die Proben wurden parallel vom Amt für Umweltuntersuchungen mit

den routinemäßigen Methoden analysiert.

Coliforme Bakterien und Escherichia coli

Bei der Untersuchung natürlicher Umweltproben tritt beim Endo-C-Agar, im Vergleich zu

den Paralleluntersuchungen, zum Teil ein wesentlich stärkerer Bewuchs der Platten auf. Hier

wurde möglichtst frische Nährböden verwendet. Das Auszählen der Kolonien von coliformen

Bakterien und E. coli auf Endo-C-Agar wird dadurch erschwert. Obwohl eine Lampe zur

Identifizierung der Kolonien genommen wurde, könnten viele Kolonien nicht eindeutig als

coliforme Bakterien bzw. E. coli identifiziert werden.

Zur Sicherheit wurde ein Oxidase-Test durchgeführt. Durch die Oxidation von Sulfit wird der

Nährboden rot gefärbt. Da die Kolonien von coliformen Bakterien und E. coli jedoch durch

8 nicht berechenbar


67

eine Rotfärbung identifiziert werden, ist der Farbkontrast zwischen Kolonien und Nährboden

gering. Zudem bilden Begleitorganismen zum Teil farblich ähnliche Kolonien. Der

theoretisch grünschimmernde Fuchsinglanz bei Kolonien von E. coli war nicht immer

festzustellen.

Der Chromocult-Coliformen-Agar ermöglicht den simultanen Nachweis von coliformen

Bakterien und E. coli. Die Kolonien coliformer Bakterien sind theoretisch rosa-rot gefärbt, die

von E. coli dunkelblau-violett. Bei der Untersuchung der Gewässerproben war dieser

Farbunterschied nicht in allen Fällen deutlich zu erkennen. Einige Kolonien waren weder

eindeutig rosa-rot noch eindeutig dunkelblau-violett gefärbt. Zur Identifizierung der Kolonien

wurde auch ein Oxidase-Test vorgenommen.

Das Auszählen der Kolonien auf Desoxycholat-Agar sowie die Auswertung der MPN-

Verfahren und Colilert-18-Verfahren ergab dagegen keine gravierenden Unterschiede zu den

Parallelansätzen. Im Anhang (CD-Rom) sind die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung

von coliformen Bakterien und E. coli der verschiedenen Gewässerproben dargestellt. Die

Ergebnisse aller Proben zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den Werten, die vom

Fachamt für Umweltuntersuchungen ermittelt wurden. Zudem liegen die Werte dicht

zusammen, es gibt keine signifikanten Abweichungen. Insgesamt sind die Keimzahlen der

Plattenmethoden vor allem Chromocult-Coliformen-Agar und Desoxycholat-Agar deutlich

über denen der MPN-Verfahren.

Auffallend sind die Minimalwerte beim Miniaturverfahren. Die Ergebnisse dieser Proben sind

im Anhang (CD-Rom) zu entnehmen.

3.8 Vergleich von Ergebnisse der Alster- und Elbeproben

In der Hygiene Institut Hamburg wird der Alster und die Elbe regelmäßig auf bestimmte

Parameter wie zum Beispiel E. coli, Coliforme Bakterien, Salmonellen, etc. untersucht. Hier

werden die Proben vom 2003 bis 2005 mit den Bestimmungsmethoden Desoxycholat-Agar-

Verfahren und Colilert-18-Verfahren ausgewertet.

3.8.1 Vergleich der Alsterproben mit den MPN-Verfahren

In diesem Abschnitt werden Vergleiche von den alten Proben aus Alster und Elbe

vorgenommen.

Zuerst werden die Proben aus der Alster 2003 – 2005 verglichen. Insgesamt werden 273

Proben, die während der Jahre 2003-2005 im Hygiene Institut Hamburg untersucht wurden,

behandelt.

Im Jahr 2003 wurden 44 Proben mit den MPN-Verfahren und dem Colilert-18-Verfahren

durchgeführt. Beim Vergleich zwischen den beiden Verfahren stellte sich heraus, dass das

Colilert-18-Verfahren bei den coliformen Bakterien geringfügigen Wert lieferte als das MPN-


68

Verfahren. Das Colilert-18-Verfahren zeigte einen Mittelwert von 3 KBE/ml und das MPN-

Verfahren einen Mittelwert von 2 KBE/ml.

Bei den fäkalcoliformen Bakterien lieferten beide Verfahren Ergebnisse unter 1 KBE/ml.

Diese Proben hatten keine Richtwertüberschreitungen gem. EG-Badegewässerrichtlinie. Es

wurden Informationen aus der Wetterdienststelle9 zur Wetterbeobachtung für das Jahr 2003

beschafft. Hier wurden die Wetterdaten vom April bis September ausgewertet. Auffallend

sind die Ergebnisse bei den Wettereigenschaften wie Regen und erhöhte Temperaturen. Es ist

festzuhalten, dass erhöhte Werte bei diesen Parametern häufiger auftraten. Da beide

Verfahren gleichzeitig durchgeführt wurden, sind die Ergebnisse der MPN-Verfahren und

Colilert-18-Verfahren kaum zu unterscheiden.

Im Jahr 2004 und 2005 wurde nur das MPN-Verfahren durchgeführt. Insgesamt waren, im

Jahr 2004, 149 Proben und im Jahr 2005, 80 Proben bearbeitet worden. Die Ergebnisse von

2004 bei den coliformen Bakterien zeigten einen Mittelwert von 15 KBE/ml und bei den

fäkalcoliformen Bakterien von 3 KBE/ml. In diesem Jahr sind die Ergebnisse deutlich höher

als im Jahr 2003. Der Grund dafür ist, dass im Jahr 2004 sehr hohe Temperaturen zwischen

den Monaten Juni bis Mitte September zu beobachten waren. Die Temperaturen lagen

teilweise über 30°C, was die starke Vermehrung der Bakterien erklären könnte. Außerdem

waren häufig auftretende Regenfälle ein Grund für die Grenzwertüberschreitungen gem. EG-

Badegewässerrichtlinien, die während 2004 zu verfolgen waren.

Im Gegensatz dazu waren die Ergebnisse im Jahr 2005 niedriger. Die coliformen Bakterien

lagen mit einem Mittelwert von 7 KBE/ml und die fäkalcoliformen Bakterien waren unter

einer Kolonie pro ml.

Der Vergleich bei den Alsterproben von 2003 bis 2005 beim MPN-Verfahren macht deutlich,

dass im Jahr 2004 die höchsten Werte an Koloniebildenden Einheiten zu finden sind. Wenn

andere Bestimmungsmethoden parallel zu den MPN-Verfahren durchgeführt worden wären,

würde man bessere und sichere Aussagen über die erhöhten Ergebnisse machen können.

3.8.2 Vergleich der Elbeproben mit verschiedenen Verfahren

Die Elbeproben werden in zwei Bereiche unterteilt. Der erste Bereich ist die „Kleine Elbe“

und der zweite die „Große Elbe“. Die „Kleine Elbe“ besteht aus den Probenahmestellen

Zollenspieker und Seemannshöft und die „Große Elbe“ aus 36 Probenahmestellen wie zum

Beispiel Cuxhaven Kugelbake, Hallerwettern, Glückstadt Nebenelbe etc.

3.8.2.1 Vergleich der Elbeproben aus der „Kleine Elbe“

Bei der Probenahmestellen Zollenspieker und Seemannshöft wurde das MPN-Verfahren und

das Desoxycholat-Agar-Verfahren durchgeführt.

9 Quelle: www.wetteronline.de


69

Im Jahr 2003 wurden insgesamt 9 Untersuchungen auf coliforme und fäkalcoliforme

Bakterien mit den beiden Bestimmungsmethoden für die Probe Zollenspieker vorgenommen.

Das Desoxycholat-Agar-Verfahren für diese Probestelle bei den coliformen Bakterien hatte

einen Mittelwert von 71 KBE/ml und bei den fäkalcoliformen Bakterien von 5 KBE/ml

geliefert.

An der Probenahmestelle Seemannshöft wurden im Jahr 2003 insgesamt 11 Proben

entnommen. Davon wurden 9 Proben auf coliforme und fäkalcoliforme Bakterien und 2

Proben nur auf fäkalcoliforme Bakterien untersucht. Der Anzahl der coliformer Bakterien

liegt beim Desoxycholat-Agar-Verfahren bei 39 KBE/ml und bei der Anzahl fäkalcoliformer

bei 6 KBE/ml. Mit dem MPN-Verfahren wurden Mittelwerte von 25 KBE/ml und bei den

fäkalcoliformen von 4 KBE/ml ermittelt. Hier ist festzustellen, dass der Desoxycholat-Agar

die höchsten Ergebnisse liefert.Bei der Auswertung der Wetterdaten für 2003 wurde

festgestellt, dass die Temperaturen zwischen Juni bis September recht hoch waren. Sie lagen

zwischen 20 – 35°C.

Die Proben, die im Jahr 2004 und 2005 untersucht wurden, zeigen die gleiche Rangordnung

der Verfahren. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigte immer die höheren Mittelwerte.

Teilweise sind die Mittelwerte der Desoxycholat-Agar-Verfahren 5-7fach höher als die der

MPN-Verfahren. Der Grund dafür ist, dass auf Desoxycholat-Agar auch weitere

thermotolerante Bakterien wachsen.

Bei diesen Proben wurde auch beobachtet, dass bei Regenwetter höhere Keimzahlen zu

ermitteln waren. Der Regen verursacht eine zusätzliche Nährquelle für Bakterien, die diese

Nährstoffe in ihrem Stoffwechsel aufnehmen. Die Temperaturen im Jahr 2004 und 2005 lagen

zwischen 20 – 32°C, die auch eine Begünstigung für die Vermehrung der coliformen

Bakterien darstellt. Teilweise wurde sogar in einigen Tagen die Erhöhung der Temperaturen

über 30°C beobachtet, die sich bei den Ergebnissen der Desoxycholat-Agar-Verfahren

widerspiegeln.

Allgemein betrachtet liegen die coliformen sowie auch die fäkalcoliformen Bakterien unter

den Leit- und Grenzwerten der EG-Richtlinien.

3.8.2.2 Vergleich der Elbeproben aus der „Große Elbe“

Im Jahr 2004 wurden vier Untersuchungen10 und 2005 wurden fünf Untersuchungen der

„Große Elbe“ mit 36 Proben durchgeführt.

Diese Untersuchungen wurden mit dem Colilert-18-Verfahren bearbeitet. Bei diesen Proben

werden für 2004 und 2005 vier Untersuchungen aus den Stellen von Vogelsand Norderelbe

bis zur Oberhalb Elbstorf, Geesthacht Proben ausgewertet.

Die Keimzahlen der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien sind in diesen Jahren sehr

gering. Deshalb wird die Koloniebildende Einheiten in 100 ml Wasserprobe angegeben.

10 Summe der bearbeitende Proben


70

Die Ergebnisse im Jahr 2004 liefern im Vergleich zu 2005 höhere Mittelwerte. Im Jahr 2004

liegen beim Colilert-18-Verfahren die coliformen Bakterien bei 2314 KBE pro 100 ml und die

fäkalcoliformen Bakterien bei 42 KBE pro 100 ml. Der Mittelwert der coliformen Bakterien

ist erheblich höher als der von fäkalcoliformen Bakterien.

Der Sommer 2004 hatte hohe Temperaturen von 25-35 °C, die optimale Bedingungen für die

Vermehrung der coliformen Bakterien hindeutet. Die fäkalcoliformen Bakterien hatten nicht

dieselben Bedingungen wie von den coliformen Bakterien. Deshalb könnte keine Vermehrung

stattfinden.

Die Ergebnisse im Jahr 2005 waren niedriger als im Jahr 2004. Aber die fäkalcoliformen

Bakterien waren im Gegensatz zu den Fäkalcoliformen im Jahr 2004 sehr hoch. Der

Mittelwert der fäkalcoliformen Bakterien beträgt 104 KBE pro 100 ml und der von

coliformen Bakterien 1392 pro 100 ml.

Allgemein betrachtet liegen die Ergebnisse der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien

unter den Leit- und Grenzwerten der EG-Richtlinien.

Kapitel 4: Schlussfolgerungen

70

4. Schlussfolgerungen

4.1 Analytische Qualitätssicherung für coliforme Bakterien

Bei der quantitativen Analytik von biologischen Parametern sind bislang nur wenige

Maßnahmen zur analytischen Qualitätssicherung im Einsatz. Als grundlegendes Element der

statistischen Datenkontrolle quantitativer Bestimmungen gelten Kontrollkarten. Die

Verwendung der Kontrollkarten zur analytischen Qualitätssicherung mit Hilfe von

Referenzmaterial, führt zu einer übersichtlichen Darstellung der Ergebnisse. Während der

experimentellen Untersuchungen wurden nur Referenzmaterial für die qualitative

Bestimmung der Verfahren verwendet. Aufgrund dessen konnte keine Anwendung der

Kontrollkarten stattfinden.

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen

Bakterien wurden daher verschiedene bewährte Verfahren eingesetzt. Es wurden Selektiv-

Nährböden, wie zum Beispiel Desoxycholat-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-C-

Agar und Fluorocult-ECD-Agar angewendet. Zusätzlich wurde das MPN-Verfahren als

Dreifachansatz, MPN-Miniaturverfahren, Colilert-18-Verfahren und das

Membranfiltrationsverfahren eingesetzt.

Die Vorgehensweise dieser experimentellen Untersuchung beruht auf statistischen Verfahren.

Die einzelnen Verfahren werden mit vier Proben, die drei, vier und fünf Parallelansätze pro

Versuchsreihe enthalten, durchgeführt. Die sich daraus ergebenden Mittelwerte, Varianzen,

Standardabweichungen, sowie Variationskoeffizienten werden für die Auswertung

herangezogen. Aufgrund der auftretenden Streuung und damit einer oft beträchtlichen

Variabilität, finden die statistischen Verfahren bei den quantitativen Untersuchungen eine

Anwendung. Es ist zu bemerken, dass aus der Vielfalt der Bestimmungsmethoden nur bei den

Plattenmethoden eine statistische Auswertung durchgeführt wird.

Insgesamt betrachtet ist der Chromocult-Coliformen-Agar der Nährboden, der das höchste

Koloniewachstum zeigt. Als zweites kommt das Desoxycholat-Agar für die coliformen

Bakterien. Das Colilert-18-Verfahren zeigt die nächstkleinste Keimzahlbelastung. Dann folgt

das Membranfiltrationsverfahren mit den coliformen Bakterien. Anschließend kommt das

Endo-C-Agar und zum Schluss das MPN-Verfahren.

Die Ermittlung der Varianzkoeffizienten bei den einzelnen Proben zeigt, dass das

Desoxycholat-Agar-Verfahren die geringsten zufälligen Fehler hervorruft. Hier ist die

Streuung der Einzelwerte um ihren Mittelwert gering und damit ist die Präzision der

Bestimmungsmethode bedeutend. Dies spiegelt sich bei den Ergebnissen nach der

Differenzierung der Plattenmethoden wieder. Hier zeigt das Desoxycholat-Agar-Verfahren

prozentual die niedrigsten falsch-positiven Anteile, im Gegensatz zu dem Chromocult-

Coliformen-Agar und dem Endo-C-Agar. Der Desoxycholat-Agar steht an erster Stelle mit

einem Anteil von 38% (Tab. 3.7). Die Differenzierung der coliformen Bakterien wird durch

einen Oxidase-Test, für Endo-C-Agar sowie Chromocult-Coliformen-Agar, und eine Bunte

Reihe für Desoxycholat-Agar durchgeführt. Bei der Differenzierung mit dem Oxidase-Test


71

steht der Endo-C-Agar an zweiter Stelle. Er zeigt einen falsch-positiven Anteil an coliformen

Bakterien von 63% (Tab. 3.6).

Der Chromocult-Coliformen-Agar ist ein Nährboden, der die höchsten falsch-positiven

Ergebnisse mit einem Anteil von 81 % anzeigt. Die prozentualen Anteile sind als Mittelwert

der einzelnen Verfahren zusammengefasst.

4.2 Analytische Qualitätssicherung für fäkalcoliforme Bakterien (E. coli)

Die E. coli-Keimzahlen unterscheiden sich von den Keimzahlen der coliformen Bakterien.

Der Desoxycholat-Agar zeigt das höchste Koloniewachstum von allen Verfahren. Die

zweithöchste Keimzahl liefert der Endo-C-Agar. Dann folgt der Fluorocult-ECD-Agar, der

nur für die Bestimmung von E. coli dient. Als nächstes folgt das MPN-Verfahren, dem der

Chromocult-Coliformen-Agar und das Membranfiltrationsverfahren, mit den gleichen

KBE/ml, folgen. Das Colilert-18-Verfahren zeigt die kleinste Keimzahlbelastung von E. coli

an.

Die Validierung der Plattenmethoden mit statistischen Prüfverfahren und die Interpretation

ihrer Ergebnisse sind kompliziert, da sie bei den fäkalcoliformen Bakterien einen erheblichen

Grund an Variabilität aufweisen. Hier ist nur das Desoxycholat-Agar-Verfahren, das einen

prozentuellen Mittelwert der Variationskoeffizienten von 35% liefert. Bei den anderen

Plattenmethoden sind sehr große Abweichungen, die teilweise bis zu 100% erreichen, zu

beobachten. Der Grund für große Abweichung ist die geringe Anzahl der Proben sowie auch

der vorhandenen Kolonien auf den Nährböden. Daraus ergibt sich, dass ein statistisches

Prüfverfahren nur mit höherer Anzahl von Proben durchzuführen ist.

Der Chromocult-Coliformen-Agar zeigt kein Unterschied durch die Differenzierung mit

einem Oxidase-Test. Dies macht deutlich, dass der Chromocult-Agar bei den fäkalcoliformen

Bakterien keine falsch-positiven Ergebnisse liefert. Bei der Differenzierung der Endo-C-Agar

mit dem Oxidase-Test liefert das Verfahren einen Anteil von 30% (Tab. 3.23). Der

Desoxycholat-Agar zeigt durch die Differenzierung einen Anteil an falsch-positiven Kolonien

von 74% (Tab. 3.22).

Das Miniaturverfahren wird gesondert in 7 Wasserproben mit dem Colilert-18-Verfahren und

den verschiedenen Plattenmethoden verglichen. Der Vergleich zwischen Colilert-18-

Verfahren und Miniaturverfahren macht deutlich, dass der Colilert-18 höhere Ergebnisse

liefert. Hier ist eine Verdopplung der festgestellten E. coli-Keimzahlen zu beobachten (Tab.

3.36). Bei den Plattenmethoden ist der Desoxycholat-Agar an erster Stelle mit den E. coli-

Keimzahlen (Tab. 3.37). Die Reihenfolge der Plattenmethoden, bei den 7 Wasserproben,

haben die gleiche Reihenfolge der E. coli-Keimzahlen der Hauptuntersuchung11.

Insgesamt liefert das Miniaturverfahren niedrigere E. coli-Keimzahlen. Es liegt an letzter

Stelle bei allen Verfahren.

11 Parallelansätze von 4 Proben


72

4.3 Bewertung der Bestimmungsmethoden

Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung mit den Parallelansätzen bei coliformen Bakterien

und anschließend die statistische Auswertung (Kapitel 3.5 3) führen zu der Erkenntnis, dass

die Anwendung des Desoxycholat-Agar-Verfahrens von Oxoid bei den Plattenmethoden die

zuverlässigste Methode darstellt. Die Durchführung sowie die Auswertung auf dem hellroten

Nährboden sind einwandfrei. Im Vergleich dazu kann der Chromocult-Coliformen-Agar für

coliforme Bakterien nicht empfohlen werden. Dieses Verfahren liefert keine ausreichend

präzisen Ergebnisse, wie durch die Differenzierung mit einem Oxidase-Test und die

statistische Auswertung ermittelt wurde. Im Gegensatz dazu zeigte das Chromocult-

Coliformen-Agar bei den fäkalcoliformen Bakterien präzise Ergebnisse, die durch die

Differenzierung bestätigt wurde. Die Durchführung sowie die Auswertung der Ergebnisse auf

dem hellen Nährboden erfolgten dagegen problemlos.

Der Fluorocult-ECD-Agar bewies, dass sie zuverlässige Ergebnisse liefert. Die E. coli-

Keimzahlen blieben selbst durch die Indolprüfung unverändert. Als vorteilhaft ist der helle

Nährboden für die Identifizierung der hellblau fluoreszierenden Kolonien sehr gut geeignet.

Im Gegensatz dazu ist die Saugfähigkeit der Fluorocult-Agar begrenzt und somit besitzt das

Verfahren einen erheblich großen Arbeitsaufwand sowie auch Materialaufwand.

Die Verwendung von Endo-C-Agar kann aufgrund der unbefriedigenden Ergebnisse, die sich

auch während der ersten Differenzierung der Colilert-18-Verfahren bewiesen hat, sowie der

Schwierigkeit beim Auszählen der Kolonien nicht empfohlen werden. Generell sollte dieser

Nährboden wegen seiner gesundheitlich bedenklichen Wirkstoffe nicht für den täglichen

Gebrauch eingesetzt werden.

Bei den Colilert-18-Verfahren, MPN-Verfahren, Miniaturverfahren und

Membranfiltrationsverfahren wurden keine statistischen Prüfverfahren angewendet.

Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung mit den Parallelansätzen führen zu der Erkenntnis,

dass die Anwendung des Colilert-18-Verfahrens von Idexx die zuverlässigste Methode

darstellt. Bei der Auswertung der Ergebnisse des Colilert-18 ist ein Verdacht auf falsch-

positive Ergebnisse entstanden. Durch die zweite Differenzierung mit der „Langen Bunten

Reihe“ wurde bestätigt, dass die untersuchten Kolonien coliforme und auch fäkalcoliforme

Bakterien sind. Das Verfahren ermöglicht den endgültigen Nachweis der coliformen und

fäkalcoliforme Bakterien in einem Anreicherungsschritt innerhalb von 18 Stunden.

Die Durchführung sowie die Auswertung der MPN-Verfahren (Mehrfachansatz) mit 3

Parallelansätzen können nicht empfohlen werden. Dieses Verfahren liefert keine ausreichend

präzisen Ergebnisse. Hinzu kommt der erheblich höhere Arbeits- und Materialaufwand. Für

das miniaturisierte MPN-Verfahren mit Mikrotiterplatten hingegen ist eine ausreichende

statistische Sicherheit durch die hohe Zahl an Parallelansätzen gewährleistet. Die Beimpfung

der Mikrotiterplatten mit Hilfe des speziellen Zubehörs lässt sich wesentlich schneller und

übersichtlicher als das Pipettieren bei einem MPN-Mehrfachansatz durchführen. Die optische

Auswertung der bebrüteten Mikrotiterplatten ist problemlos. Dieses Verfahren zeigt bei allen

Untersuchungsverfahren die niedrigste E. coli-Keimzahlen. Deshalb ist das Verfahren für


73

Proben mit Vorinformation auf die Keimbelastung bzw. für die Untersuchung von

Abwasserproben geeignet.

Die Verwendung der Membranfiltrationsverfahren kann nur für Proben mit Vorinformation

empfohlen werden. Die Durchführung ohne den geeigneten Verdünnungsfaktor liefert keine

Ergebnisse aufgrund des massenhaften Koloniewachstums. Hierzu kommt noch der erheblich

größere Zeitaufwand des Verfahrens. Die Tabelle 4.1 zeigt eine Übersicht über den

Materialaufwand für die einzelnen Verfahren.

Tabelle 4.1: Materialkosten der unterschiedlichen Flüssig- und Festnährböden

Methode Materialkosten in € für einen Bestimmungstest

Plattenverfahren: Desoxychoalt-Agar Chromocult-Coliformen-Agar Endo-C-Agar Fluorocult-ECD-Agar

(1 Platte) 0,72 0,35 0,35 1,19

MPN-3er Ansatz 5,4 (9 Röhrchen)

Colilert-18-Verfahren 5,65 Miniaturverfahren mit Mikrotiterplatten

11,12 (1 Platte)

Membranfiltrationsverfahren 1,15

Beim Vergleich aller Verfahren zur Bestimmung von Coliformen lässt sich feststellen, dass

das Einmischverfahren mit Desoxycholat-Agar nach der Differenzierung mit der Bunten

Reihe, und der Colilert-18-Verfahren die besten Resultate liefert.

Beim Vergleich der Verfahren zur Bestimmung von E. coli lässt sich feststellen, dass der

Oberflächenausstrich mit Fluorcult-ECD-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, Colilert-18-

Verfahren und das Miniaturverfahren die präzisen Ergebnisse liefern.

Die Tabelle 4.2 und 4.3 zeigen eine Zusammenfassung über die Bewertung der einzelnen

Verfahren.

Tabelle 4.2 Zusammenfassung über die Bewertung der Bestimmungsmethoden für coliforme

Bakterien

Bestimmungsmethoden für coliformen Bakterien

Bestimmungs- Methoden:

Durchführung Oxidase- Test

Bunte Reihe

Bebrütungs-zeit

Material-aufwand

Zuver-lässigkeit

Chromocult-Agar ++ x12 ++ ++ -- Desoxycholat-Agar + x ++ + + Endo-C-Agar -- x ++ ++ -- MPN-Verfahren - - - - Colilert-18-Verfahren + x ++ - ++ Membranfiltations- verfahren

- x -- + 0

Bewertungsmerkmale: sehr schlecht:“ -- „ schlecht:“ - „ trifft nicht zu:“ 0 „ gut:“ + „ sehr gut:“++ „

12 durchgefüht


74

Tabelle 4.3 Zusammenfassung über die Bewertung der Bestimmungsmethoden für

fäkalcoliforme Bakterien

Bestimmungsmethoden für fäkalcoliforme Bakterien

Bestimmungs- Methoden:

Durchführung Oxidase- Test

Bunte Reihe

Bebrütungs-zeit

Material-aufwand

Zuver-lässigkeit

Chromocult-Agar ++ x ++ ++ ++ Desoxycholat-Agar + x ++ + - Endo-C-Agar -- x ++ ++ -- Fluorocult-ECD-Agar - ++ + ++ MPN-Verfahren - - - - Colilert-18-Verfahren + x ++ - ++ Miniaturverfahren ++ - -- ++ Membranfiltations- verfahren

- x -- + 0

Bewertungsmerkmale: sehr schlecht:“ -- „ schlecht:“ - „ trifft nicht zu:“ 0 „ gut:“ + „ sehr gut:“++ „

Kapitel 4: Zusammenfassung

75

Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg Sabani Serani, Dzevrije

Fachbereich Naturwissenschaftliche Technik Studiengang: Biotechnologie

Zusammenfassung der Diplomarbeit

Thema: „Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der quantitativen Bestimmung

gesamtcoliformer und fäkalcoliformer Bakterien (E. coli) für die qualitative Bewertung von

Wasserproben“.

Zur Optimierung der analytischen Qualitätssicherung bei der quantitativen Bestimmung von

gesamtcoliformen und fäkalcoliformen Bakterien in Wasserproben, wurden im

Hygieneinstitut Hamburg, Untersuchungen mit mehreren Bestimmungsmethoden

durchgeführt. Neben verschiedenen Plattenmethoden wurde das MPN-Verfahren als

Dreifachansatz, MPN-Miniaturverfahren mit Mikrotiterplatten, Colilert-18-Verfahren und das

Membranfiltrationsverfahren eingesetzt. Die einzelnen Verfahren wurden mit vier Proben, die

drei, vier und fünf Parallelansätze pro Versuchsreihe (Hauptuntersuchung) enthielten,

durchgeführt.

Die Auswertung der Ergebnisse der Plattenmethode erfolgte mit Hilfe von weiteren

Differenzierungen und von statistischen Prüfverfahren. Die Differenzierung wurde durch ein

Oxidase-Test, für Endo-C-Agar sowie Chromocult-Coliformen-Agar und einer Bunte Reihe

für Desoxycholat-Agar durchgeführt. Eine weitere Differenzierung wurde bei dem Colilert-

18-Verfahren mit der Langen Bunten Reihe vorgenommen.

Bei der statistischen Prüfverfahren wurden die arithmetischen Mittelwerte, Varianzen,

Standardabweichungen, sowie Variationskoeffizienten zur Auswertung der Ergebnisse

herangezogen. Es ist zu bemerken, dass aus der Vielfalt der Bestimmungsmethoden nur bei

den Plattenmethoden eine statistische Auswertung durchgeführt wurde.

Es stellt sich heraus, dass ein statistisches Prüfverfahren mit geringer Anzahl von Proben in

der bakteriologischen Wasseruntersuchung nicht zu empfehlen ist. Deshalb sind die

Differenzierungen der experimentellen Untersuchungen von Bedeutung.

Die quantitative Bestimmung von coliformen Bakterien ergibt, dass das Desoxycholat-Agar-

Verfahren der Firma Oxoid und das Colilert-18-Verfahren der Firma Merck die quantitativ

besten Ergebnisse liefern. Für den Nachweis von E. coli eignet sich vor allem der Fluorocult-

ECD-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, sowie Colilert-18-Verfahren der Firma Merck.

Das Miniaturverfahren der Firma Bio Rad GmbH ist ebenfalls geeignet.

Der Vergleich zwischen realen Umweltproben und Parallelansätzen der Hauptuntersuchung

stimmen überein. Diese Feststellung bestätigt, dass die empfohlenen Bestimmungsmethoden

die optimalen Verfahren zur quantitativen Bestimmung der gesamtcoliformen und

fäkalcoliformen Bakterien sind.

Literaturverzeichnis

[1] Gunkel, G. : Bioindikation in aquatischen Ökosystemen, Jena, G. Fischer Verlag,

1994, 175-177; 440-459

[2] CEN – Europäisches Komitee für Normung: Wasserbeschaffenheit – Nachweis und

Zählung von Escherichia coli und coliformen Bakterien (Entwurf prEN ISO 9308-1),

Brüssel, 1998

[3] Fachamt für Umweltuntersuchungen, Umweltbehörde Hamburg: Nachweis von

fäkalcoliforme (Escherichia coli) und gesamtcoliforme Bakterien in

Oberflächengewässern (limnologische Routineuntersuchungen), Qualitäts-

Management-Handbuch, 2001

[4] Hütter, L. A.: Wasser und Wasseruntersuchung, 6, Frankfurt a. M., Otto Salle Verlag,

1994, 408

[5] Länderarbeitsgemeinschaft Wasser (LAWA): AQS – Analytische Qualitätssicherung –

Rahmenempfehlung der LAWA für Wasser-, Abwasser- und

Schlammuntersuchungen, Berlin, Erich Schmidt Verlag, 1989

[6] Lightfood N. F., Maier E. A.: Mikrobiologische Analysen: Richtlinien zur

Qualitätssicherung, Berlin, Springer Verlag, 2003, 231-234

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77

Anhang: FREIE UND HANSESTADT HAMBURG Behörde für Umwelt und Gesundheit

Hygiene Institut Hamburg

Abteilung Mikrobiologischer Verbraucherschutz- Nationales Referenzzentrum

Probenaufbereitung: Ablaufprotokoll EDV-Dateneingabe: keine Proben-Bearbeitung: Sabani Serani Probenaufkleber: Oberflächengewässer; Billeprobe 4 Datum: 26.10.2005 Salmonella/Enterobateriaceae

Indol negativ Lactose positiv Glucose/Gas positiv/ positiv Saccharose positiv Harnstoff negativ Adonit negativ Salicin positiv Arabinose positiv Dulcit negativ Inosit positiv Rhamnose positiv Trehalose positiv Xylose positiv Maltose positiv Mannit positiv Sorbit positiv Kligler/H2S negativ/negativ Beweglichkeit negativ Citrat positiv Voges Proskauer positiv Methylrot negativ LDC negativ ODC positiv ADH positiv L(+) d-Tartrat negativ Mucat positiv Malonat positiv ONPG positiv KCN positiv Gelatinase positiv PAD negativ Nitrat positiv Oxidase negativ Cellobiose positiv Melibiose positiv Raffinose positiv

Ergebnis: Enterobacter eloacae

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Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der ... · Probable-Number“-Methode (MPN) als Dreifachansatz angewendet. Darüber hinaus wurde ein „MPN“-Miniaturverfahren der