Guia de PracticaMicrobiologia General 2016 I

GUIA DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

PAGE MICROBIOLOGIA GENERAL

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICA

GUA DE PRCTICA

MICROBIOLOGIA

CDIGO:

CICLO:VIII

2016-ILIMA - PER

INTRODUCCION:

La Microbiologa es una ciencia que estudia a los organismos microscpicos denominados microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos unicelulares o pluricelulares carentes de organizacin tisular y que no pueden ser visualizados al ojo humano necesitando para ello el microscopio

Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de tcnicas nicas denominadas Tcnicas microbiolgicas

Estas Tcnicas han permitido el conocimiento de las diferentes estructuras y composicin bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias se relacionan con el hombre ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismoEl estudio de la composicin bioqumica de la estructura bacteriana junto al conocimiento de su metabolismo permite hoy la comprensin del mecanismo de accin de los diferentes antibiticos

Hoy en da los avances de la gentica bacteriana hacen posible el desarrollo de tcnicas de Biologa molecular con aplicaciones a nivel de la investigacin cientfica y el diagnstico donde los microorganismos cumplen un rol protagnico

El conocimiento, ,manejo y utilizacin de los principales equipos, instrumentos y materiales utilizados en el laboratorio de microbiologa es indispensable para la ejecucin y desarrollo de las prcticas durante el curso de microbiologa general que permitirn al alumno, futuro profesional de la salud aplicar estos conocimientos en el estudio de diferentes especialidades en el campo de la microbiologa Los alumnos ingresarn al laboratorio con guardapolvo, cabello recogido en un moo alto, con zapatos cerrados y sin objetos colgantes como pulseras, aretes largos o anillos. Los ensayos a su vez se realizarn con mascarilla, gorro cobertor, guantes descartables y lentes de proteccin.

I- PRCTICA N 1

MANEJO DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS E INSTRUMENTOS, PREPARACIN DE MATERIAL DE VIDRIO, MATERIAL AUXILIAR Y SU FORMA DE ESTERILIZACIN1.1 Marco tericoEn el laboratorio de Microbiologa es necesario utilizar material limpio, sin trazas de detergente y estriles para el aislamiento y posterior identificacin de los grmenes que se est investigando, se entiende por

Limpieza al proceso fsico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar materia orgnica y residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.

Desinfeccin Es un proceso en el que se utilizan principalmente agentes qumicos y

Esterilizacin que viene a ser la destruccin de toda forma de vida, sta puede ser por vapor saturado (autoclave) o por calor seco ( horno ) 1.2 Competencias

Maneja y equipos y materiales en el usa Laboratorio. Estudia in Vitro a los microorganismos.

Prepara e identifica el material de vidrio y su forma de esterilizacin1. 3 Materiales y equipos Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, bao Mara, refrigeradora,, equipo para luz ultravioleta , equipo de esterilizacin por filtracin, cmara de flujo laminar, centrifuga y microscopio compuesto, Portaobjetos y cubreobjetos

Papel para lente

Aceite de inmersin

Torundas de algodn

Gasa

Asa de Kolle

Cultivo bacteriano

Papel kraft

Tubos de prueba

Placas Petri

Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraces de vidrio

Cinta indicadora de esterilizacin (para autoclave)

1. 4 Procedimiento1. Examina laminar , bao mara, equipo de esterilizacin por filtracin, centrifuga y microscopio e identifica sus componentes , su aplicacin y utilizacin en el laboratorio cada uno de los siguientes equipos e instrumentos del laboratorio: autoclave, horno, incubadora, cmara de flujo 2. Observa al microscopio las muestras que a continuacin se indican:

Cultivo bacteriano:

Coloca sobre la lmina portaobjeto una gota de cultivo bacteriano y deja caer la lmina cubreobjeto.3. .Preparacin de material de vidrio y material auxiliar

Confecciona tapones de algodn para el material de vidrio proporcionado, estos deben ser consistentes y de un tamao apropiado que permita su manipulacin.

Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma tambin se procede con todo el material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo a un proceso de esterilizacin y luego conservar su esterilidad .un tiempo adecuado Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven formando paquetes de tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial cuidado en que el papel utilizado se encuentre ntegro y sin orificios. Para las torundas e hisopos se procede de igual forma.

En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las envuelve en forma diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de papel en esta seccin, de esta forma la pipeta quedar ntegramente cubierta por el papel. Al final de la envoltura se dejar una porcin en la que se escribir en nmeros la capacidad de volumen de la pipeta. 1. 5 Resultados

Se registra detalladamente cada una de las observaciones hechas Y se realiza los esquemas y dibujos necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual forma con el material de laboratorio empleado1. 6 Cuestionario.1. Con qu propsito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2. En un cuadro comparativo explicar las diferentes formas y condiciones del proceso de esterilizacin que se emplea segn el tipo de material a esterilizar.

3. Informar en forma concisa el uso e importancia de los equipos descritos en la prctica1. 7 Fuentes de informacin Tortora,Berdell, Funke Christine.L.Case Introduccin a la Microbiologa 9 Edicion. Editorial Mdical Panamericana Espaa , 2007 Tortora G. J.; Funke, B. R.; Case, C. L.: Introduccin a la Microbiologa, Buenos Aires, 9 d. Editorial Acribia. 2000II .- PRACTICA N 2PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU FORMA DE ESTERILIZACIN MEDIOS DE CULTIVOSLIDOS, SEMISLIDOS Y LQUIDOS2.1 Marco terico

Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificacin, por lo que se utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio llamados medios de cultivo y su desarrollo es el cultivo Sus requerimientos varan considerablemente algunos slo requieren sustancias simples (bacterias no exigentes ) y otros requieren de sustancias complejas ( bacterias exigentes ) Medios de CultivoSon sustancias o compuestos nutritivos estriles que permiten el crecimiento y multiplicacin de los microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, y presin de oxgeno adecuados, adems de nutrientes y factores de crecimiento y estar exento de todo microorganismo contaminante con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas y proceder a su identificacin mediante estudios complementarios.

Clasificacin de los medios de cultivo:

Segn su composicin;-Medios empricos.- Extrados de alimentos naturales

-Medios semi- sintticos.- Son medios de cultivo empricos enriquecidos de ciertos compuestos qumicos

-Medios sintticos.- Medios qumicamente definidos

Segn su estado fsico: Medios lquidos, medios semislidos (con 0,3 a 0,5% de agar), medios slidos (con 1 a 2% de agar).

Segn su aplicacin:

Medios comunes o simples: permiten el desarrollo de la mayora de bacterias, sobre todo las no exigentes.

Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservacin y transporte medios selectivos y medios diferenciales.

Preparacin de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparacin los que debern ser esterilizados inmediatamente una vez preparados Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodn o tapas metlicas o plsticas con el fin de evitar la penetracin de microorganismos extraos, luego se esterilizan Las placas Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten aspticamente en ellas.

2.2 Competencias

2.3 Realiza un listado de los principales medios de cultivo y su aplicacin, as como los indicadores mas usados

Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo 2.3 Materiales y equipos:

Probetas de 1000 mL y frascos de 250, 500, 1000 mL

Solucin de: NaOH 1N y HCl 1N

Trpodes con rejilla metlica

Tubos estriles y placas Petri estriles ,baguetas ,beakers Papel indicador de pH

Agar: Tripticase de Soya (TSA), SIM (Azufre Indol Motilidad).EMB,gelatina Caldo: Tripticase de Soya (TSB). peptona Cloruro de sodio

2.4 Procedimiento Disuelve en agua destilada los medios comerciales proporcionados, segn la indicacin del envase, a los que contengan agar ser necesario someterlos a la accin del calor hasta su completa disolucin.

Enfra este preparado hasta aproximadamente 50C.

Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.

Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.

Envasa, rotula, sealando el tipo de medio y la fecha de preparacin.

Esteriliza por autoclave a 15 lb de presin por 15 a 20 minutos.

Controla la esterilidad del medio, por incubacin del mismo a 37C por 24 horas.

Para el caso del caldo peptonado, se proceder a la disolucin de los siguientes componentes: peptona 10 g y cloruro de sodio 10 g, luego se completa con agua destilada hasta 1000 mL; y se llevar a pH de 8.8 +/- 0,1.

2. 5 Resultados Se describir su composicin y el fundamento de las diferentes clases de medios de cultivo utilizados2.6 Cuestionario:

1. Que importancia tiene el uso de los medios slidos?

2. Qu sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo slido? De dnde se extrae?

2.7 Fuentes de informacin- Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biologa de los Microorganismos, 10ed. Madrid, Prentice Hall Iberia. Madrid, 2000.

- Levinson,W.E Jawetz,E Microbiologa e Inmunologa, 2ed. Editorial El Manual Moderno. Mxico,2000 III.- PRACTICA N 3TCNICAS DE SIEMBRA, ESTUDIO DEL DESARROLLO BACTERIANO EN MEDIOS LQUIDOS, SEMISLIDOS Y SLIDOS3.1 Marco terico1. Tcnicas de siembra:

Las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razn se utilizan diversas tcnicas para separar un microorganismo de otro y obtener as un cultivo puro que permita identificar al microorganismo aislado.

El diagnstico bacteriolgico se basa en el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra, por lo que es indispensable tener en cuenta las mximas condiciones de asepsia, desde la toma de muestra hasta la siembra, la cual debe efectuarse lo ms rpido posible.

Trminos importantes:

Siembra

Inculo

Cultivo puro

Cepa

Se denomina tcnica de siembra al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a los microorganismos con un medio de cultivo y despus de un perodo de incubacin se produce el desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra, entre los cuales estn los siguientes:

Siembra por dispersin y agotamiento

Siembra por puntura

Siembra por estra

Siembra por inoculacin

Siembra por incorporacin, en placa vertida, en masa o en todo el medio

Siembra por diseminacin o en superficie o con cayado

2. Desarrollo bacteriano

Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basndose en el aspecto que tienen sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es as que la observacin de las caractersticas de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio slido (agar) y lquido (caldo), puede ser de gran utilidad.

Estudio bacteriano en medio lquido:

Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rpido.

Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como: presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y pelcula.

Produccin de gas: formacin de burbujas.

Estudio bacteriano en medio semislido:

Movilidad

Cambios metablicos

Estudio bacteriano en medio slido:

Caractersticas morfolgicas de las colonias en cuanto a: elevacin, forma, borde, superficie, tamao, consistencia y color de pigmentacin.

3.2 Competencias Realizar diversas tcnicas de siembra para su cultivo y aislamiento

Aplica las tcnicas de aislamiento hasta la obtencin de cultivos puros

-Describe sus observaciones usando la terminologa tcnica apropiada3.3 Materiales y equipos1. Tcnicas de Siembra en Medios Lquidos, Semislidos y Slidos:

Placas petri con agar TSA

Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado Tubos con caldo TSB

Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa

2. Desarrollo bacteriano:

Utilizar los medios de cultivo preparados en la prctica anterior y proceder a realizar los sembrados en los distintos medios segn tcnicas

Ver figuras 3-1 a 3-4: Caractersticas morfolgicas de los cultivos bacterianos.

3.4 Procedimiento:

1. Tcnicas de Siembra en Medios Lquidos, Semislidos y Slidos:

Siguiendo la metodologa descrita segn los esquemas anexos, proceder tal como sigue:

Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de microorganismos, y sembrar por el mtodo de dispersin y agotamiento en las placas de TSA .

Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inculo del cultivo de bacterias y sembrar en agar SIM, por el mtodo de puntura.

Con el asa en aro, toma el inculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar en pico de flauta o plano inclinado, por el mtodo de estra. Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el mtodo de inoculacin en el tubo con TSB.


Efectuar la lectura de los cultivos proporcionados por la profesora y observa. Tener sumo cuidado de no sacudir los cultivos en caldo ya que esto puede trastornar los crecimientos superficiales; describir. Hacer los esquemas de todas las observaciones.3.5 Resultados: Reporta y describe

3.6 Cuestionario:

1. Con qu propsito se emplean cada una de las diferentes tcnicas de siembra?

2. Describe las caractersticas del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos proporcionados en la prctica. 3. Describe el mtodo de siembra por incorporacin y seala en que casos se emplea 3.7 Fuentes de informacion Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biologa de los Microorganismos. 10 ed, Madrid Prentice Hall Iberia., 1999.

Prescott L/ Harley J ,/ Klein D 576/P 85 2000 MadridIV .- PRACTICA N 4MTODOS DE COLORACIN

4.1 Marco terico1. Coloracin Simple:

Aquella coloracin en la que se utiliza slo un colorante, el cual va a permitir visualizar la morfologa de los microorganismos.

2. Coloracin Gram:

La diferenciacin de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solucin yodoyodurada de potasio, para luego someterlas a una decoloracin despus de la cual se usa una coloracin de contraste, casi siempre safranina. Las bacterias gram-positivas (coloracin azul o morada) son resistentes a la decoloracin y conservan el complejo cristal violeta-yodo, los microorganismos gram-negativos, toman la coloracin de contraste (coloracin rosa o roja).

3. Coloracin cido Resistente (Coloracin de Ziehl Neelsen):

En este mtodo de tincin, el colorante primario, fucsina cida, se formula con fenol para permitir el paso a travs de las paredes celulares de las micobacterias. El portaobjeto se calienta para facilitar la penetracin y se utiliza alcohol etlico como decolorante. Sin embargo, el reactivo se prepara con cido clorhdrico para ayudar a la decoloracin de las clulas que no son cido resistentes.

4. Coloracin de Esporas:

Para la observacin de esporas, es necesario que el colorante penetre la pared de la espora, la cual es relativamente impermeable, razn por la que se necesita de calentamiento.

5. Coloracin Negativa:

La tcnica de la tincin negativa incorpora materiales tales como la nigrosina o la tinta china, que al estar compuesta de partculas demasiado grandes para penetrar en una clula, permiten observar algunos microorganismos que permanecen sin teir y que resaltan sobre un fondo oscuro; se utiliza principalmente para observar la cpsula bacteriana. 4. 2 CompetenciasCapacita y adiestra al estudiante para que (el) (la):

Realice manualmente mtodos de tincin habituales usados en la preparacin de lminas de observacin

Describa minuciosamente sus observaciones, al microscopio4.3 Materiales y equiposCultivos bacterianos:

Cultivo de Escherichia coli

Cultivo de Staphylococcus aureus

Cultivo de Klebsiella

Lmina fijada con frotis de Mycobacterium tuberculosis

1. Coloracin simple:

Azul de Metileno

2. Coloracin Gram:

Violeta de genciana (colorante primario)

Lugol (mordiente)

alcohol acetona (decolorante)

Fucsina bsica (colorante de contraste)3. Coloracin cido Resistente:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Alcohol cido (decolorante)

Azul de metileno (colorante de contraste) 4. Coloracin de Esporas:

Solucin de azul de metileno

Solucin saturada alcohlica de eosina5. Coloracin negativa:

Tinta china4.4 Procedimiento1. Coloracin simple:

Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.

Fija al calor.

Cubre el frotis con el colorante Azul de Metileno y deja actuar por 3 a 5 minutos.

Lava con agua y deja secar.

Observa al microscopio con objetivo de inmersin.

2. Coloracin Gram:

Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.

Deja secar al aire y fija con calor.

Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.

Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.

Cubre el frotis con la solucin de lugol y deja actuar durante 2 minutos.

Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol acetona y seguir agregando hasta que la tintura ya no fluya del frotis.

Lava inmediatamente con agua corriente.

Cubrir el frotis con la solucin de safranina durante 30 segundos.

Lava con agua corriente y deja secar la preparacin.

Observa al microscopio utilizando el lente de inmersin.

3. Coloracin cido Resistente:

Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo reposar de 30 a 60 segundos antes de calentarlo.

Calienta la preparacin con suavidad, haciendo pasar el mechero de alcohol por debajo del portaobjeto. Seguir calentando hasta que se observe el desprendimiento de vapores. Evitar que el colorante hierva. Repetir 2 veces ms.

Enfra y lava con agua corriente.

Decolora con alcohol cido hasta que no arrastre colorante.

Lava con agua corriente.

Cubrir el frotis con azul de metileno, durante 1 minuto.

Lava con agua corriente.

Deja secar al aire.

Observa al microscopio con lente de inmersin. Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de rojo y los dems microorganismos de color azul.

4. Coloracin de Esporas:

Haga un frotis fino y fije a la llama.

Cubre con azul de metileno y calienta hasta hervir en forma intermitente por 1 minuto.

Lava con agua destilada.

Cubre con una mezcla de solucin saturada alcohlica de Eosina por 30 segundos.

Lava con agua destilada y deja secar al aire.

Examina al microscopio con lente de inmersin.

5. Coloracin negativa:

Coloca varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio, cerca de uno de los bordes.

Coloca un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.

Mezcla bien con el asa y luego extiende la mezcla a lo largo del portaobjetos, utilizando la tcnica del frotis sanguneo.

Deja secar el frotis.

Cubre con safranina durante 10 segundos, luego enjuaga con cuidado y deja secar al aire.

Observa al microscopio con lente de inmersin. Al examinar la preparacin, la cpsula aparecer como una zona transparente que rodea a la pared celular.

4.5 Resultados Registra, dibuja y colorea la morfologa de cada una de las muestras coloreadas4.6 Cuestionario1. Qu importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloracin de Gram?

2. Cules son las diferencias qumicas importantes que explican el estado cido-resistente?

4.7 Fuentes de informacin

Ingraham, J. L. y C.A.: Introduccin a la Microbiologa: Vol. 1 y 2. 3 ed./Editorial Revert, S.A. Espaa, 1998.

Jawetz, .;Melnlick y Adelberg. Brooks Geo F, Butel Janet S Microbiologa Mdica.23 ed. Mxico 2005 Agurto Saenz,Toms-Ramos Gobea. Juan Carlos Sena, Chumbes Fernando Microbiologa Bsica, 1 ed. Lima 2004V.- PRACTICA N 5METABOLISMO MICROBIANO

5.1. Marco terico

En esta prctica se presentar un panorama general de las reacciones bioqumicas microbianas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y sobre las protenas, haciendo uso de las pruebas bioqumicas diferenciales que permiten la identificacin de microorganismos (en especial los microorganismos patgenos).

5.2 Competencias Manipula e identifica los microorganismos en funcin a su comportamiento bioqumico.

5.3 Materiales y equipos Placas con agar nutritivo con 1% de almidn

Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR VP (Rojo de Metilo Voges Proskauer), caldo lactosado con indicador de Andrade.

Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y . . con TSA.

Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris, Staphylococcus. aureus, Streptococcus viridans. Lugol.

Reactivos de: kovacs, rojo de metilo, Voges Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amlico, KOH creatina al 40%

Tiras de papel de filtro impregnadas con solucin saturada de acetato de plomo.

Perxido de hidrgeno al 3%.

Campanas de Durham y pipetas Pasteur.5.4 Procedimientos1. Accin sobre los hidratos de carbono

Fermentacin de hidratos de carbono:

Primer da

Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris.

Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.

Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37C por 24 horas.

Segundo da

Despus del perodo de incubacin, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo control.

Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusin del indicador de Andrade.

Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metablico a CO2 e H+ se observar la presencia de gas, en forma de burbujas.

Hidrlisis del almidn:

Primer da

Con ayuda del lpiz de cera, divida por fuera la base de la placa Petri en 3 partes.

En la seccin 1, siembra B. Subtilis, en la seccin 2 siembra E. Coli y en la seccin 3 siembra Ps. aeruginosa

Incuba a 37C por 24 horas.

Segundo da

Agrega a toda la superficie del medio la solucin de lugol.

Observa la reaccin alrededor del crecimiento microbiano.

Produccin de cidos y acetil-metil-carbinol (acetona):

Prueba de Voges Proskauer (VP)

Primer da

Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.

Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.


Segundo da

A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.

Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto.

Deja en reposo durante 15 minutos.

La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol.

Si la lectura se realiza despus de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloracin cobriza, siendo esta una respuesta falsa positiva.

La reaccin es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.

Prueba de rojo de metilo:Primer da

Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.

Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.

Incuba a 37C por 48 a 72 horas.

Segundo da

Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo).

La prueba es negativa si da una coloracin amarillo naranja.

La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.

Principios bioqumicos de las reacciones en TSI:

Primer da

Con el asa de siembra, inocula una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estra la superficie del pico de flauta.

Rotula e incuba a 37C por 24 horas.

Segundo da

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.

Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.

Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de las peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxgeno, solo hay fermentacin y el medio permanece cido.

Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cido, por lo que el tubo permanece amarillo.

No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.

Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.2. Accin sobre las protenas

Hidrlisis de la gelatina:

Primer da

Rotula cada tubo con el nombre de la cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.

Inocula cada cepa en un tubo con gelatina, haciendo uso de un asa en punta, introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.


Segundo da

Observa los resultados. Observa la hidrlisis de la gelatina

Produccin de indol:

Primer da

Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.

Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.

Incuba a 37C por 24 horas

Segundo da

Agrega 4 gotas del reactivo de Kovacs, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.

La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo.

Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecern sin cambio alguno (reaccin negativa).

Produccin de sulfuro de hidrgeno:

Primer da

Por la tcnica de puntura y estra, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de E. coli y P. vulgaris.

Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.


Segundo da

Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la produccin del sulfuro de hidrgeno (reaccin positiva).

3. Pruebas bioqumicas diferenciales

Utilizacin del citrato:

Primer da

Siembra por la tcnica de estra en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter aerogenes.


Segundo da

La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en 24 a 48 horas.

Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

Hidrlisis de la rea:

Primer da

Por la tcnica de estra, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No inocular el fondo.


Segundo da

La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo.

La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.

Prueba de la catalasa:

Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inculo a un portaobjetos limpio.

Aade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.

Observa si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.

Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.

Reaccin de la citocromo oxidasa:

Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de E.coli o Ps. aeruginosa, y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.

Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo intensa en la tira, en un mximo de 5 segundos.

5.5 Resultados Reporta los resultados y explica el fundamento bioqumico de cada una de las pruebas . realizadas en la prctica5.6 Cuestionario.1. Cmo podra emplear las conclusiones que derivan de esta prctica para clasificar a las bacterias?5.7 Fuentes de informacin Prescott L / Harley J, / Klein D. Microbiologa 576/P 85, 2000 Mac faddin, Jean F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Madrid. 574.19285/412. 2003VI PRACTICA N 6METODOS FISICOS Y QUIMICOS DE CONTROL MICROBIANO

6.1 Marco terico1. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias

La muerte microbiana se produce cuando una clula no puede volver a dividirse para formar dos nuevas clulas o sea pierden su viabilidadEn esta prctica vamos a determinar si un tratamiento especfico mata todas las clulas, si reduce su nmero hasta niveles aceptables o si simplemente detienen el crecimiento durante un perodo de tiempo limitado

Los aspectos qumicos de esta prctica se limitan a los compuestos que son normalmente txicos y que se consideran como materiales desinfectantes o antispticos

2. Efecto de los desinfectantes qumicos:

Con frecuencia se desea una rpida desinfeccin y esterilizacin a temperatura ambiente, sobre todo para diferentes objetos que pueden daarse al aplicarles calor. Existen varios compuestos qumicos tales como los fenlicos, el formaldehdo, alcoholes, halgenos y detergentes, para la desinfeccin a la temperatura ambiente.Una prctica muy comn ha consistido en considerar al etanol al 70% y el isopropanol como soluciones esterilizantes universales.

6.2 Competencias Elabora un listado de productos farmacuticos cuya fabricacin sea resultado de procesos biotecnolgicos

Ensaya y observa el efecto de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias.6.3 Materiales y equipos


Cultivos de la prctica anterior sembrados en los distintos medios

Caractersticas morfolgicas de los cultivos bacterianos.

2. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias:

Lmpara de luz ultravioleta

Solucin de: merthiolate 1/1000, tintura de yodo, cristal violeta, fenol al 5%, Savlon 1/200

Discos de Papel filtro

Placas con agar nutritivo

Cultivo de: Escherichia coli, Staphylococcus, Bacillus subtilis

Bao maria

Frasco con 30 mL de caldo nutritivo

Pipetas estriles de: 1 mL y 5mL

Placas petri estriles (6 por cada grupo)

Tubos estriles (8 por cada grupo)

Tubos con Agar nutritivo (4 por cada grupo)

Hisopos estriles

Asas de siembra

6. 4 Procedimiento3. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre la viabilidad de las bacterias:Accin del calor (llama directa)

Esteriliza el asa de siembra a la llama directa del mechero.

Toma el inculo y siembra en la mitad de la placa con agar nutritivo

Esteriliza el asa de siembra, tomar otro inoculo, somete a la accin de la llama directa y siembra en la otra mitad del agar.

Rotula e incuba a 37C durante 24 horas.

Accin del calor hmedo

Contamina el fondo de cada uno de cuatro tubos con una gota de cultivo de Bacillus subtilis, evitando tocar las paredes del tubo.

Calienta cada uno de los tubos por flameado, desde la boca del tubo hasta unos 3 cm del fondo.

Sumerge por 10 minutos cada uno de los tubos, en un bao de agua tal como sigue: el primer tubo a 40C, el segundo tubo a 70C, el tercer tubo a 100C; el cuarto tubo servir de control.

Aade a cada uno de los tubos en condiciones aspticas 5 mL de caldo nutritivo.


Procede de manera similar con los otros 4 tubos, pero usando como cepa, el cultivo de Escherichia coli.

Accin de la radiacin ultravioleta

Licua el agar en bao maria a 50C.

Siembra en superficie:

Vierte el contenido de un tubo de agar licuado en una placa estril y deja solidificar. Hacer lo mismo en la placa restante.

Coloca una gota del cultivo asignado en el centro de cada una de las 2 placas y siembra con un hisopo estril en toda la superficie de la placa. Dejar secar 30 minutos

Siembra en el medio:

Transfiere 0.1 mL de los cultivos asignados, en cada uno de los 2 tubos restantes.

Mezcla por rotacin y vierte todo el contenido en su respectiva placa Petri. Deja solidificar

Exponer las placas a la lmpara ultravioleta en la forma siguiente:

Mtodo de siembra

Siembra en superficieSiembra en todo el medio

Placa N 1Placa N 2Placa N 1Placa N 2

Tiempo de exposicin a la luz ultravioleta2 minutos 5 minutos2 minutos 5 minutos

Incuba por 24 horas y anota los resultados Accin de los agentes qumicos

Inocula abundantemente la superficie de una placa de agar, con 3 asadas del microorganismo en estudio. Disemina uniformemente.

Con una pinza previamente esterilizada, coloca los discos de papel embebidos con las sustancias suministradas y equidistantes entre s.

Incuba a 37C por 24 horas.Efecto de los desinfectantes qumicos:

Inocula 0,1 mL de Escherichia coli, en un tubo conteniendo desinfectante.

Repite lo anterior utilizando TSB en lugar del desinfectante (tubo control).

Toma una asada del primer tubo a los 5 minutos y siembra por el mtodo de estra en un cuadrante de la placa de agar nutritivo.

Repite el procedimiento en los tres cuadrantes restantes a los 10, 20 y 30 minutos.

Procede de igual forma con el tubo control.

Incuba a 37C por 24 horas.6. 5 ResultadosReporta y describe:

1. Las caractersticas del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos ensayados.

6.6 Cuestionario1. El cuestionario se proporcionara a medida que se desarrolle la prctica6.7 Fuentes de informacin Brooks G. F Butel, J.S Morse S.A Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick, y Adelberg Editorial El Manual Moderno S.A de C.V 23. Edicin. Mxico, 2005.

VII PRACTICA N 7

EFECTOS DE LOS ANTIBITICOS SOBRE LAS BACTERIAS

7.1 Marco tericoLos antibiticos (anti, -contra; bios , -vida) constituyen un grupo de compuestos teraputicamente tiles. Estos compuestos qumicos se caracterizan por ser subproductos metablicos de un microorganismo, y casi siempre son letales para otro microorganismo no relacionado. A partir de 1940, se aislaron numerosos antibiticos, que probaron ser eficaces contra una variedad de m.o patgenos (bacterias y hongos) La investigacin en este campo sigue constituyendo uno de los principales objetivos de la industria farmacutica.

La accin de los antibiticos sobre las bacterias se puede demostrar in vitro de diferentes maneras. Un modo preciso de ellos es por el mtodo de dilucin en tubo. Existe tambin el mtodo del disco nico de sensibilidad ideado por Kirby y Bauer.

7. 2 Competencias Aplica mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana in -vitro

Obtiene la concentracin mnima inhibitoria de antibiticos en estudio

7. 3 Materiales y equipos Frasco con 100 mL de caldo Mueller Hinton

Placas con agar Mueller Hinton

Escala de Mc Farland 0.5

Cultivo de E.coli Cultivo de S.aureus

Cultivo de Ps.aeruginosa

Discos de antibiticos

Hisopos estriles

Pinzas estriles

Solucin de antibitico a una concentracin de 1000 mg/mL

Tubos estriles de 16 x 150

Pipetas estriles de 10 mL

Pipetas estriles de 5 mL

7. 4 Procedimiento1. Mtodo de difusin en agar

Primer da

Prepara una dilucin de la bacteria en estudio equivalente a 0.5 de la escala de Mc Farland (1.5 x 108 bacterias).

Siembra una placa de agar Mueller Hinton con un hisopo embebido en la dilucin anterior.

Coloca los discos de los antibiticos con ayuda de las pinzas estriles a 2 cm del borde de la placa y equidistantes entre si.

Presiona suavemente cada disco para que se adhiera al agar.


Segundo da

Despus de la incubacin, observa los halos de inhibicin alrededor de los discos de antibiticos.

La sensibilidad del microorganismo a los antibiticos utilizados, se establece por comparacin en una grfica de tamaos de la zona.2. Mtodo de dilucin en tubo

Primer da

Con una pipeta de 10 mL tomar el cultivo proporcionado y dejar caer una gota al frasco que contiene 100 mL de caldo Mueller Hinton.

Mezcla y con la misma pipeta, repartir el caldo en 10 tubos estriles, inoculando el primer tubo con 9 mL y los restantes con 5 mL del caldo.

Prepara una fila de diluciones del antibitico de 100 mg a 4 ug; con la pipeta de 5 mL toma 1 mL de la solucin de antibitico e inocula el primer tubo.

Mezcla y saca 5 mL para el segundo tubo y as sucesivamente hasta el noveno tubo.

Del noveno tubo, saca 5 mL y elimina conjuntamente con la pipeta.

El tubo N 10 no recibir antibitico y servir como control del desarrollo bacteriano.

Incuba los tubos a 37C por 24 horas.

Segundo da

Observa la turbidez de los tubos comparndola con la del tubo control (N 9).

Los tubos que no presentan turbidez se debe a que la bacteria fue inhibida en su desarrollo.

La menor concentracin de antibitico que inhibi el desarrollo bacteriano ser la MIC.

7.5 Resultados1. Reporta los resultados obtenidos (dimetro de los halos) de los microorganismos empleados frente al antibitico analizado.

7.6 Cuestionario- Se realizar a medida del desarrollo de la prctica7.7 Fuentes de informacin Brooks Geo F.; Butel, Janet. S., Morse Stephen. A.: Microbiologa mdica. 17a. Edicin. Mxico, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2002.

Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J. Brook. Biologa de los Microorganismos 10 ed. Madrid,. Prentice Hall Iberia. 1999

Ramos Gorbea Juan Carlos Sena Chumbes, Fernando Agurto Saenz Torres . Microbiologia bsica Colora ciones de bacterias y la bioqumica en los medios de cultivo 2004.VIII PRACTICA N 8PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( I )

8. 1 Marco terico1. Estudio de los estafilococos

La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por produccin de hemolisina, fermentacin del manitol y produccin de las enzimas coagulasa y desoxiribonucleasa.

2. Estudio de los estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hemates, as tenemos los estreptococos alfa, beta y gama hemolticos, segn sea la lisis parcial, total o nula.

Existen varias pruebas especficas para el estudio de estos microorganismos como son:

Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta hemoltico del Grupo A, de los Beta hemolticos del Grupo No A.

Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico Grupo A, del estreptococo beta hemoltico grupo B.

Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el perxido de hidrgeno.

Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al Optochin del y la resistencia del S. viridans 8. 2 Competencias Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro de especies representativas del gnero Staphylococcus y Streptococcus.8. 3 Material y mtodos

Placas con agar sangre Placas con agar manitol salado

Placas con agar DNA

Cultivo de: Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S. pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae Set de colorantes Gram

Reactivo de coagulasa

Solucin HCl 1N

Solucin de perxido de hidrgeno al 3%

Discos de Bacitracina

Discos de Optochin

8.4 Procedimiento1. Estudio de los estafilococos

Coloracin y morfologa

Efecta frotices en lminas portaobjetos con cada una de las cepas.

Despus de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.

Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.

Inoculacin en agar sangre

Primer da

Toma una placa de agar sangre y lo di vide en dos sectores.

Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S. aureus y S. epidermidis.


Segundo da

Observa el crecimiento en agar sangre.

Crecimiento en agar manitol salado

Primer da

Toma una placa de agar manitol salado y dividelo en dos sectores.

Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.


Segundo da

Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfologa de las colonias.

Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez

Prueba de la coagulasa

Primer da

Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).

Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.

Incuba a 37C.

Observa cada hora la aparicin de cogulos, por espacio de 4 horas.

De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24 horas.

Si aparece un cogulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.Accin de la DNAsa

Primer da

Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.

Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.

En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la lnea divisoria.


Segundo da

Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.

El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbindolo.

Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparicin de un halo transparente alrededor de la siembra, que indica la ausencia de DNA.Prueba de la catalasa

Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.

Aade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.


Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.

2. Estudio de los estreptococos


Efecta frotis en laminas portaobjetos con cada una de las cepas.

Despus de fijarlas al calor, realice coloraciones de Gram.

Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.Inoculacin en agar sangre

Primer da

Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.

Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S. viridans (alfa hemoltico) y S. pyogenes (beta hemoltico).


Segundo da

Observa las diferencias de hemlisis en agar sangre.Prueba de la bacitracina

Se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta hemoltico del Grupo A, de los Beta hemolticos del Grupo No A.

Primer da

Toma una placa de agar sangre y divde en dos sectores.

Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.agalactiae y S.pyogenes y coloca cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una pinza, un disco de Bacitracina en cada mitad.


Segundo da

Observa el halo de inhibicin, indicando la susceptibilidad a la Bacitracina del S. pyogenes.Prueba de CAMP

Se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico Grupo A, del estreptococo beta hemoltico grupo B.

Primer da

Inocula con trazo lineal en una placa de agar sangre, una colonia de S. aureus.

Luego perpendicular al trazo anterior, inocula las cepas de estreptococos: S. agalactiae y S. pyogenes en cada mitad de la placa sin tocar la cepa de estafilococo.


Segundo da

Observa los resultados obtenidos.

El estreptococo beta hemoltico Grupo B (S.agalactiae), produce una sustancia (factor CAMP), que agranda la zona de hemlisis producida por el estafilococo, factor que no posee el estreptococo beta hemoltico Grupo A (S. pyogenes).Prueba de la catalasa

Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un portaobjetos limpio.

Aada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.


Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.Prueba de Optochin

Primer da

Toma una placa de agar sangre y la divde en dos mitades.

Inocula una mitad de la placa con S. viridans y la otra mitad con S. Pneumoniae y coloca cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una pinza, un disco de Optochin en cada mitad.

Incuba a 37C por 24 horas.8. 5 ResultadosObserva y reporta los resultados8.6 Cuestionario Qu factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparacin con otras especies de estafilococos?

1. Qu enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?

2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse un examen de secrecin farngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes8. 7 Fuentes de informacin Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. ,23a ed. Mxico. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2005 616.01/B84/ 2005.

IX.- PRCTICA N 9PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( II )

9.1 Marco terico1. Grupo Enterobacterias

Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metablica en diferentes medios de cultivo que contienen carbohidratos, protenas, aminocidos, etc. Estos microorganismos no producen citocromo oxidasa, lo que las diferencia de las Pseudomonas, Alcalgenes, Aeromonas y Vibrios.

2. Grupo Pseudomonas

Algunas especies son patgenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante Pseudomonas aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con enfermedad humana. P.aeruginosa desarrolla fcilmente en los medios de cultivo, la mayora de las especies son identificadas en base a su olor caracterstico, morfologa colonial, pigmentos y otros.

3. Grupo Vibrios

En el gnero Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae, causante del clera y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no epidmicas. Otro grupo, lo conforman las especies halofilicas, que tienen afinidad por el cloruro de sodio. Entre estos, V. parahaemoliticus, que puede producir enfermedades similares al clera pero sin ser tan severas.

9.2 Competencias Ensaya los mtodos de identificacin diagnstica in Vitro en el laboratorio de especies representativas: Escherichia coli, Salmonella, Shigella , Vibrio.y Pseudomonas aeruginosa9.3 Materiales y mtodosGrupo Enterobacterias

Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons

Tubos con agar: Urea, SIM

Tubos con caldo: VP RM, peptonado, lactosado

Campanas de Durham

Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris

Set de colorantes Gram

Reactivos de: Kovacs, Rojo de Metilo, Voges Proskauer: (alfa naftol al 5% y KOH creatina al 40%), oxidasa

Lminas porta y cubreobjetos

Grupo Pseudomonas

Tubos con: TSA y TSI

Tubos con TSB

Cultivo de Pseudomonas aeruginosa

Set de coloracin Gram

Reactivo de oxidasaGrupo Vibrio

Cultivo de Vibrio cholerae Cultivo de Vibrio parahaemolyticus Placas con agar TCBS

Tubos con agar TSI

Reactivo de oxidasa

Set de coloracin Gram

Desoxicolato de sodio

9.4 Procedimiento1. Grupo Enterobacterias

Coloracin y morfologa En su mesa encontrar una cepa representativa de los siguientes grupos: Proteae, Escherichiae, Salmonellae, Shigellae, y Klebsiellae; con la cual trabajar durante toda la prctica.

Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.

Observa al microscopio con lente de inmersin.Movilidad

Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.

Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del microorganismo utilizando el objetivo de 40x.Inoculacin en agar Mc Conkey

Primer da

Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento la placa con agar Mc Conkey.


Segundo da

La degradacin de la lactosa a cidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del indicador de pH rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa positivas.

Las colonias que son lactosa negativas son incolorasInoculacin en agar EMB (Eosina Azul de Metileno)

Primer da

Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con agar EMB.


Segundo da

En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metlico verdoso, cuando metabolizan la lactosa o sacarosa y translcidas o de color mbar si son lactosa negativas.Inoculacin en agar SS (Salmonella Shigella)

Primer da

Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con agar SS.

Incubar a 37C por 24 horas.

Segundo da

En el medio SS, la deteccin de coliformes se comprueba cuando hay degradacin a cido mediante el indicador de pH rojo neutro y observar colonias negras, si las bacterias producen sulfuro de hidrgeno.Diferenciacin metablica del grupo de Enterobacterias

Primer da

Con la cepa asignada, procede a inocular por los mtodos de siembra adecuados, los siguientes medios:

Caldos: Lactosado, peptonado y MR-VP

Agar: Urea, TSI, SIM, Citrato


Segundo da

El alumno anotar los resultados de este ejercicio y efectuar la identificacin de la cepa proporcionada. Comparar los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla: 10-1.

a) Caldo Lactosado: despus del perodo de incubacin, observe el resultado obtenido (cambio de coloracin, presencia de gas) y compare con los resultados de los dems alumnos de la clase.

b) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo y es negativa, si el medio permanece del color original. Observe el resultado obtenido y compare con los resultados de los dems alumnos de la clase.

c) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:

Produccin de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.

Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo).

Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).

No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado).

Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.

d) Agar SIM (Azufre Indol Movilidad):

Detecta la produccin de hidrgeno sulfurado por medio de la observacin de un precipitado negro en el medio.

Realiza la prueba de produccin de indol como en (e)

Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscpico del medio por una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.

e) Caldo peptonado: despus del perodo de incubacin:

Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovacs, en cada tubo que presenta desarrollo bacteriano, luego agitar suavemente.

La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo y es negativa si no hay cambio alguno.

f) Caldo MR VP (reaccin de Rojo de Metilo):

Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4 (ROJO) y 6.0 (AMARILLO).

La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable y negativa si da una coloracin amarillo naranja.

g) Caldo MR VP (reaccin de Voges Proskauer): agregar a cada tubo:

10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.

Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto y deja en reposo durante 15 minutos.

La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos (presencia de acetil-metil-carbinol) y negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.

h) Agar Citrato:

La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en 24 a 48 horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificacin bioqumica que describen las reacciones de diagnstico clave para identificar los gneros de las bacterias entricas.

Reaccin de la Citocromo Oxidasa

Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa proporcionada, y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.

Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo intensa en la tira, en un mximo de 5 segundos.2. Grupo Pseudomonas


Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tincin de Gram.

Observa al microscopio con lente de inmersin.Inoculacin en TSA

Primer da

Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el mtodo de dispersin agotamiento.


Segundo da Observa las caractersticas de la colonia y presencia de pigmentacin

Inoculacin en agar TSI

Primer da

Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de flauta.


Segundo da

Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias

Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacteriasCultivo a 42C

Primer da

Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la tcnica de inoculacin.


Segundo da

Observa la presencia o no de crecimientomicrobiano a 42 C, en los tubos3. Grupo Vibrio


Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.

Observa al microscopio con lente de inmersin.Inoculacin en agar TCBS (Tiosulfato Citrato Sales biliares Sacarosa)

Primer da

Divide la placa de TCBS por la mitad y sembrar en cada mitad las cepas de Vibrio por el mtodo de dispersin agotamiento.


Segundo da

Las colonias de Vibrio cholerae que desarrollan en TCBS son circulares, con el borde ligeramente opaco, con un halo claro alrededor y son amarillas por que metabolizan la sacarosa.

Las colonias de Vibrio parahaemolyticus que desarrollan en TCBS son circulares, pegajosas, con halo claro alrededor, y son de color verde porque no degradan la sacarosaInoculacin en agar TSI

Primer da

Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de flauta.


Segundo da

Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias.

Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias.Prueba del filamento o String Test

Deposita una gota de la solucin de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lamina portaobjeto.

Emulsiona en ella una colonia de V.cholerae o V. Parahaemolyticus con el asa de siembra.

Detecta la presencia de filamento al levantar el asa.

9.5 Resultados1. Esquematiza, registra y reporta los resultados obtenidos, identificando en cada caso la especie. 9.6 Cuestionario. Describa el fundamento de las pruebas realizadas9.7 Fuentes de informacion Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Dowell Jr., V. R.; Janda, W. M.; Sommers, H. M.; Winn Jr, W. C.: Color, Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company. Third Edition. Philadelphia, 1997.

X. PRACTICA N 10MICOLOGIA

10. 1 Marco tericoLos hongos normalmente se encuentran en la naturaleza como organismos saprofitos libres y son principalmente patgenos oportunistas, la mayora de los hongos no son patgenos para el hombre. Solo unas 50 especies causan enfermedades en el hombre y la incidencia de enfermedades fngicas graves es muy baja, sin embargo ciertas infecciones fngicas superficiales son bastante comunes.

Su estudio en el laboratorio, es posible mediante un dispositivo para cultivo en Cmara Hmeda sistema esterilizado que consta de una placa petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio en Uque soporta dos lminas porta y cubre objetos. Aspticamente seccionar una pequea porcin de medio de Agar Sabouraud y colocar sobre la lmina porta objetos. Sembrar el hongo y cubrir la preparacin con la otra lmina. La placa es incubada a temperatura ambiente (20-25C) por 4 5 das.10. 2 CompetenciasEnsaya los mtodos de estudio in vitro para la identificacin e investigacin de especies representativas del medio ambiente y de importancia clnica.10. 3 Materiales y equipos Placas petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.

Agua destilada estril.

Dispositivo para cultivo en Cmara Hmeda.

Mechero de alcohol.

Solucin de KOH al 10%

Azul de metileno.

Papel filtro.

Varilla de vidrio en U.

Agar Sabouraud.

Lminas porta y cubre objetos, aspticas.

10. 4 Procedimiento Utilizando aguja de Kolle o estilete, picar una colonia y extrae una fraccin mnima o micelio.

Deposita esta fraccin sobre la porcin de agar dispuesta en el portaobjeto de la cmara hmeda.

Con ayuda de una pinza estril cubrir la preparacin con la lmina cubre objetos.

Humedece el papel filtro de la placa con agua estril. y examina diariamente al microscopio la lmina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo. Retira cada vez la lmina de cultivo y observa y si es necesario, aade ms agua al sistema.

Observa la germinacin de las esporas, el crecimiento y ramificacin del micelio, la aparicin de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproduccin.

Con ayuda de un Manual de identificacin de hongos determina el gnero correspondiente.

10.5 Resultados Observa esquematiza e informa los resultados. Elabora esquemas en cada etapa de desarrollo10.6 Cuestionario

1. Cul es la ventaja del empleo de la cmara hmeda en el estudio de los hongos?

2. Existe diferencias entre hongos a nivel del crecimiento y diferenciacin del micelio?. Explique.10 .7 Fuentes de informacin

Levinson, W. E.; Jawetz, E.: Microbiologa e Inmunologa. Editorial El Manual Moderno. Segunda Edicin. Mxico, 2000.

Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 16 dicion. Mxico. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.,.1999.

XI. PRCTICA N 11

CONTAMINACION MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS

11.1.- Marco terico:

La contaminacin biolgica de los alimentos, incluye sobre todo a microorganismos y es cuantitativamente mayor que la contaminacin por sustancias qumicas y agentes fsicos. As, la contaminacin microbiana merece gran atencin, tanto desde la perspectiva de la alteracin de los alimentos como de la salud de los consumidores.

11.2.- Competencias:Determina la higiene de los productos crnicos durante su proceso de preparacin y manipulacin.

Mtodo: Determinacin de la calidad de los alimentos crnicos por mtodos analticos adaptados de los recomendados por la AOAC Norteamericana.

11.3.- Materiales y Equipos:a. Muestras:Alimentos crudos y procesados: Carne de pollo o de res, en trozos o molida, carne de pescado, embutidos y hamburguesas. etc.

Materiales: Cuchillos, bolsas plsticas (con cierre hermtico), papel toalla, recipientes de plstico, etc.b. Materiales y Equipos:(*) El material y los medios indicados se entregar en forma proporcional al nmero de mesa de trabajo, calculados tomando en cuenta el total de alumnos agrupados de la siguiente forma: 5 alumnos por mesa de trabajo y teniendo como mximo 10.

MaterialCant. (*)Observacin

Placas petri(60) 6 x mesaEstriles (3 placas por c / medio)

Esptulas chicas y planas(10) 1 x mesaEstriles

Matraz de 250 mlS / Vol. de agarEstriles (contiene agar fundido)

Matraz de 125 ml(10) 1 x mesaEstriles (contiene el diluyente)

Tubos de ensayo 16 x150 mm(20) 2 x mesaEstriles (contiene el diluyente )

Gradillas p / tubos 16 x 150 mm5

Pipetas graduadas x 1 ml (50) 5 x mesaEstriles ( puede ser de 5 ml)

Mecheros 5Con alcohol

Propipetas de jebe5

Piceta con desinfectante1

Equipos Instrumentos

Incubadora1

Balanzas mecnicas5

c.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

DenominacinCantidad (*)Observacin

Agar Ogy (o Agar Saboraud)20 ml x placa (3 x mesa) Medio fundido para plaquear

Agar Plate Count (o A. nutritivo)20 ml x placa (3 x mesa) Medio fundido para plaquear

Diluyente: Soluc. 5% de tween 20 en agua triptonada al 0.1%En matraz x 125 ml90 ml x matraz (1 Mat. x mesa)

En tubo 16 x150 ml9 ml / tubo 16 x 150 mm (2 x mesa)

NOTA: Las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados se entregaran por separado (Incubacin a 25C y 37C).

11.4.- ProcedimientoA.- Preparacin y conservacin de la muestra:

Pesar 30 g de la muestra libre de la piel, o envoltorio de acuerdo al tipo de producto, reducirlo a trozos pequeos. La muestra debe guardarse en bolsas hermticas con cierre (cerrarlos por completo, para evitar la prdida de humedad).

Efectuar los anlisis antes de las 24h de muestreado y conservar en refrigeracin antes de su anlisis. Las muestras de alimentos naturales y procesados, se deben seleccionar y conservar en recipientes apropiados, bolsa bien cerrada o sellada y siguiendo las indicaciones del profesor.

B.- Preparacin de las diluciones de la muestra:

De la muestra inicial (carne molida, embutido o hamburguesa) pesar 10 g y pasarla a un matraz que contiene 90 ml de agua peptonada al 0.1% con Tween 20 al 5% y disolver hasta obtener una suspensin.

Considerar la concentracin de sta como 0.1 10-1.

Luego tomamos del matraz (dilucin 10 -1 ) con pipeta estril 1ml de la dilucin y vertemos en el Tubo 1 que contiene 9 ml de diluyente estril y mezclar. Esta sera dilucin de concentracin 10 -2.

Seguidamente tomamos 1ml del Tubo 1 con otra pipeta estril y vertemos al Tubo 2 y mezclar. Esta sera dilucin 10 -3.

Seleccionar las tres diluciones convenientes para la siembra.

C.- Recuento de microorganismos mesfilos aerobios viables.

De cada dilucin: 10-1,10-2, y 10-3 Tomar 1 ml y sembrar por el mtodo de incorporacin en correspondientes placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20 ml de medio de cultivo Agar Plate Count o Agar nutritivo fundido, mezclar y dejar enfriar hasta solidificacin completa.

Llevar a incubacin a 37C por 24 a 48 horas.

D.- Recuento de hongos

De las mismas diluciones: 10-1,10-2, y 10-3 tomar 1 ml (Utilizando la misma pipeta del mtodo anterior) sembrar por mtodo de incorporacin en correspondientes placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20 ml de medio de cultivo Agar Sabouraud o Agar OGY fundido, mezclar y dejar enfriar hasta solidificacin completa.

Llevar a incubacin a 25C por 5 a 7 das.E.- Lectura e interpretacin

Leer las placas anotando la cantidad de UFC y las caractersticas de las colonias formadas para identificar la presencia de microorganismos contaminantes: Bacterias y Hongos, respectivamente.

11.5.- Resultados

Realizar la determinacin de la calidad de los alimentos crnicos, anotando la presencia o no de Bacterias y Hongos en las muestras procesadas por Ud. Observar y registrar los resultados, esquematizar y establecer sus conclusiones.

11.6.- Cuestionario

Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar la calidad de los alimentos crnicos?. Qu medios de cultivo se han empleado para realizar las determinaciones de control de la calidad de alimentos crnicos que Ud. ha muestreado?

11.7.- Fuentes de informacin Martnez Hernndez A. Fundamentos de Nutricin y Diettica; 1ra.Edicin; Ao 2011; Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires Argentina.

Vidal Garca, E. Manual Prctico de Nutricin; 1ra. Edicin; Ao 2009,

Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010. Editorial MVA Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa.XII PRCTICA N 12DETERMINACION DE PATOGENOS EN ALIMENTOS

12.1.- Marco terico:

Los productos crnicos y derivados procesados estn expuestos a la presencia de bacterias patgenas, que incluso resisten las bajas temperaturas. Por ello es necesario aplicar mtodos y procedimientos que eviten la contaminacin, y as prevenir el desarrollo de muchas enfermedades toxicas e infecciosas en el hombre.

12.2.- Competencia:

Investiga la contaminacin patgena de los alimentos.

Mtodo:

Determinacin de la presencia de patgenos en alimentos crnicos por mtodos analticos adaptados de los recomendados por la AOAC Norteamericana.

12.3.- Materiales y Equipos:a.- Muestras:

Alimentos crudos y procesados: Carne de pollo o de res, en trozos o molida, carne de pescado, embutidos y hamburguesas. etc.

Materiales: Cuchillos, bolsas plsticas, papel toalla, recipientes de plstico, etc.

b.- Materiales y Equipos:(*) El material y los medios indicados se entregar en forma proporcional al nmero de mesa de trabajo, calculados tomando en cuenta el total de alumnos agrupados de la siguiente forma: 5 alumnos por mesa de trabajo y teniendo como mximo 10.

MaterialCantidadObservacin

Tubos de ensayo 20 x200 mm(30) 3 x mesaEstriles (contiene caldo brilla )

Tubos de Durham (30) 3 x mesaEstriles (contenido en el caldo brilla )

Placas petri(30) 3 x mesaEstriles

Esptulas chicas y planas(10) 1 x mesaEstriles

Matraz de 250 mls/Vol. de agarEstriles (contiene Agar Manitol Sal )

Matraz de 125 ml(10) 1 x mesaEstriles (contiene caldo peptonado)

Tubos de ensayo 16 x150 mm(30) 3 x mesaEstriles (contiene caldo peptonado)

Gradillas p / tubos 20 x200 mm5

Propipetas de jebe5

Pipetas graduadas x 1 ml(30) 3 x mesaEstriles


Mecheros de vidrio5Con alcohol

Piceta con desinfectante1Para limpieza de la mesa de trabajo

Equipos - Instrumentos

Incubadora1

Balanzas mecnicas5

D.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

ReactivoCantidadObservacin

Agar manitol salado20 ml x placa (3 x mesa)Medio fundido para plaquear

Caldo Brilla20 ml x tubo 20 x 200 (3 xmesa)Cada tubo c/ tubo de Durham

Caldo peptonadoEn matraz 125 ml90 ml x matraz (1 matraz x mesa)

En tubo 16 x 150 mm9 ml x tubo 16 x 150 (3 x mesa)

12.4.- ProcedimientoA.- Preparacin y conservacin de la muestra:

Pesar 30 g de la muestra libre de la piel, o envoltorio de acuerdo al tipo de producto, reducirlo a trozos pequeos.

La muestra debe guardarse en bolsas hermticas con cierre (cerrarlos por completo, para evitar la prdida de humedad).

Efectuar los anlisis antes de las 24 h de muestreado y conservar en refrigeracin antes de su anlisis. Las muestras de alimentos naturales y procesados, se deben seleccionar y conservar en recipientes apropiados, bolsa bien cerrada o sellada y siguiendo las indicaciones del profesor.

B.- Preparacin de las diluciones de la muestra:

De la muestra inicial (carne molida, embutido o hamburguesa) pesar 10 g y pasarla a un matraz que contiene 90 ml de caldo peptonado y disolver hasta obtener una suspensin. Considerar la concentracin de sta como 0.1 10-1. Luego tomamos del matraz (dilucin 10 -1) con pipeta estril 1ml de la dilucin y vertemos en el Tubo 1 que contiene 9 ml de diluyente estril y mezclar. Esta sera dilucin de concentracin 10 - 2.

Seguidamente tomamos 1ml del Tubo 1 con otra pipeta estril y vertemos al Tubo 2 y mezclar. Esta sera dilucin 10 -3.

Finalmente, tomamos 1ml del Tubo 2 con otra pipeta estril y vertemos al Tubo 3 y mezclar. Esta sera dilucin 10 -4.

Seleccionar las tres ltimas diluciones para la siembra.C.- Determinacin de la Presencia - Ausencia de Coliformes totales. De cada dilucin: 10-2, 10-3 y 10-4 tomar 1 ml con pipetas individuales y verter al tubo con caldo Brilla (triplicado) que contiene tubo de Durham correspondientes, empezando por la dilucin de mayor concentracin, tapar y marcar cada tubo.


D.- Determinacin de la Presencia de Staphylococcus aureus.

De las diluciones: 10-2,10-3 y 10-4, tomar 1 ml y sembrar por mtodo de incorporacin en correspondientes placas vacas estriles, luego agregar 15 a 20 ml de medio de cultivo Agar Manitol salado fundido, mezclar por rotacin y dejar enfriar hasta solidificacin completa.


E.- Lectura e interpretacin

Leer los tubos y determinar la presencia de coliformes totales.

Leer las placas anotando la cantidad de UFC y las caractersticas de las colonias formadas para determinar la presencia y cantidad total de UFC de Staphylococcus aureus.

12.5.- Resultados

Realizar la determinacin de patgenos en los alimentos crnicos, anotando la presencia de coliformes totales y la cantidad total de UFC de Staphylococcus aureus en las muestras procesadas por Ud.. Observar y registrar los resultados, esquematizar y establecer sus conclusiones.

12.6.- Cuestionario

Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar la presencia y cantidad de patgenos en los alimentos crnicos?.

Qu medios de cultivo se han empleado para realizar las determinaciones de control de la calidad de alimentos crnicos que Ud. ha muestreado?

12.7.- Referencia Bibliogrfica

Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010. Editorial MVA Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa.

XIII. PRCTICA N 13CONTROL DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS Y DE LA HIGIENE DE SUPERFICIES.13.1.- Marco Terico:

En la industria alimentaria se debe controlar la calidad del alimento de manera integral y con ello garantizar la higiene tanto del propio alimento, como del personal, los equipos, utensilios, el rea y superficies de trabajo. Esto permite reducir los factores de riesgo de contaminacin microbiana y de otra naturaleza.

13.2.- Competencias:

Ensaya los mtodos de control de limpieza en los manipuladores de alimentos y en las superficies de trabajo.

Mtodo:

Control microbiolgico de manipuladores de alimentos y de la higiene de superficies aplicando mtodos adaptados de los recomendados por la AOAC. 13.3.- Materiales y Equipos:

a.- Muestras:

Alimentos crudos y procesados: Carne de pollo o de res, en trozos o molida, carne de pescado, embutidos y hamburguesas. etc.

Materiales: cuchillos, bolsas plsticas, papel toalla, recipientes de plstico, etc.

b.- Materiales y Equipos:

(*) El material y los medios indicados se entregar en forma proporcional al nmero de mesa de trabajo, calculados tomando en cuenta el total de alumnos agrupados de la siguiente forma: 5 alumnos por mesa de trabajo y teniendo como mximo 10.

MaterialCantidad (*)Observacin

Placas petri(30) 3 x mesa1 placa de cada medio

Tubos de ensayo 16 x150 mm(10) 1 x mesaEstriles (conteniendo Agua peptonada )

Gradillas p/ tubos 16 x 150 mm5



Hisopos largos de madera(30) 3 x mesaEstriles

Propipetas de jebe5


Equipos - Instrumentos

Incubadora1

D.- MEDIOS DE CULTIVO Y/O REACTIVOS

ReactivoCantidad (*)Observacin

Agar Ogy20 ml x placa (1 placa x mesa) Plaqueado

Agar Nutritivo20 ml x placa (1 placa x mesa) Plaqueado

Agar Mac Conkey20 ml x placa (1 placa x mesa) Plaqueado

Agua triptonada: solucin al 5% de tween 20 / agua peptonada 0.1%10 ml x tubo de 16 x150 (1 x mesa)

NOTA: Las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados se entregaran por separado (Incubacin a 25C y 37C).

13.4.- Procedimiento

A.- Control higinico de los manipuladores de alimentos:

El personal debe estar correctamente aseado y con la indumentaria apropiada.

Seleccionar la zona a muestrear: manos, puos, gorros, mandil. etc.

B.- Procedimientos de toma de muestra:

Tomar un hisopo estril y humedecerlo en agua peptonada con tween 20 al 5% eliminar el exceso de medio diluyente

Hisopar la superficie seleccionada con los sentidos que indican los esquemas A, B, C.:

A B C Colocar el hisopo en el tubo con agua peptonada estril, dejar en reposo por 20 minutos.

Sembrar en Agar Mac Conkey, Agar Nutritivo y Agar Ogy, respectivamente: Tomar el hisopo del tubo con agua peptonada y eliminar el exceso de agua en las paredes del tubo.

Sembrar en uno de los medios por el mtodo de extensin, y eliminar el hisopo (previa incineracin).

Repetir el procedimiento de siembra para cada medio con hisopo nuevo estril.

Incubar las placas con Agar Nutritivo y Agar Mac Conkey a 37C por 24 a 48 horas y las placas con Agar Ogy a 25C por 5 - 7 das

C.- Control higinico de superficies de trabajo:

El rea de trabajo debe estar correctamente aseada y de acuerdo al procedimiento establecido.

Seleccionar las zonas a muestrear en la superficie de la mesa de trabajo.

Aplicar el mismo procedimiento anterior para la toma de muestra, siembra e incubacin,

D.- Lectura e interpretacin

Leer las placas anotando la cantidad de UFC y las caractersticas de las colonias formadas para determinar la presencia de grmenes contaminantes (bacterias y/o hongos).

13.5.- Resultados

Realizar la determinacin de patgenos durante el control de la indumentaria de los manipuladores de alimentos y de la higiene de superficies de trabajo, anotando la cantidad total de UFC segn el mtodo de recuento directo y las caractersticas de las mismas. Observar y registrar los resultados, esquematizar y establecer sus conclusiones.

13.6.- Cuestionario

Cules son los mtodos microbiolgicos aplicados en esta prctica, para determinar la presencia y cantidad de patgenos en la indumentaria de los manipuladores de alimentos y en las superficies de trabajo?.

Qu medios de cultivo se han empleado para realizar las determinaciones de control de los manipuladores de alimentos y en las superficies de trabajo que Ud. ha muestreado?.

13.7.- Fuentes de Informacin.

Madrid Vicente, A. Nuevo Manual de Industrias Alimentarias; 4ta.Edicin; Ao 2010. Editorial MVA Editores: Madrid Vicente, Antonio Editor. Madrid - Espaa.

XIV. PRCTICA N 14CONTROL MICROBIOLOGICO DE MEDICAMENTOS

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS.

14.1. Marco terico:

Los medicamentos deben poseer una pureza microbiolgica adecuada a su uso previsto. Los recuentos de microorganismos aerobios mesfilos viables en los medicamentos no estriles deben estar dentro de lmites mximos permisibles. 14.2. Competencias:

Determina la contaminacin microbiana de productos farmacuticos y superficies de trabajo.

Mtodo: Preparacin de la muestra segn mtodo descrito por USP 30. Recuento de los microorganismos aerobios totales y de hongos.

14.3. Materiales y equiposA. Muestras: Productos farmacuticos lquidos en solucin o productos naturales, asa de siembra, pabilo, bolsas plsticas, plumn marcador, algodn y papel kraft (por mesa de trabajo).

B. Materiales y Equipos:

MaterialCantidadObservacin

Placas petri(60) 6 x mesaEstriles

Matraz de 250 mlSegn VolumenEstriles (conteniendo los agares )

Matraz de 125 ml(10) 1 x mesaEstriles (conteniendo el diluyente)

Tubo de ensayo 16 x150 mm(20) 2 x mesaEstriles (conteniendo el diluyente )



Propipetas de jebe5

Pipetas graduadas x 1ml(20) 2 x mesaEstriles

Probeta graduada x 10 ml(10) 1 x mesaEstriles



Equipos

Incubadora1

Balanzas mecnicas51 x mesa de trabajo

C. ReactivosPara la entrega de los medios de cultivo y materiales se considerar un aproximado de 5 alumnos por mesa de trabajo y mximo 10 mesas de trabajo.

DenominacinCantidad (*)Observacin

Alcohol etlico 7050 ml

Agar tripticasa soyafundido20 ml x placa ( 3 placas x mesa ) en matraces x 250 ml

Agar Sabouraudfundido20 ml x placa ( 3 placas x mesa ) en matraces x 250 ml

Diluyente: Solucin al 5% de tween 20 en agua tamponada al 0.1% estrilEn matraz x 125 mlVolumen 90 ml x matraz. 1 matraz x mesa

En tubo 16 x 150 mmVolumen 9 ml x tubo 16 x 150 mm ( 2 tubos x mesa)

(*) Para Importante.- Al finalizar la prctica, las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados, se entregarn al Laboratorio por separado segn temperatura de incubacin. Los alumnos asistirn a verificar las placas y tubos, solo en los horarios establecidos por el Laboratorio. La presentacin es obligatoria con: mandil, guantes y mascarilla.14.4. ProcedimientoObtencin de la muestra

Desinfectar el envase del producto a analizar, usar alcohol etlico de 70 y algodn. Abrir el recipiente en forma asptica con ayuda del mechero, en caso de usar otros materiales estos deben estar esterilizados.

Preparacin de la muestra

Diluir 10 ml de la muestra en 90 ml del agua tamponada (Para muestras con alto contenido de lpidos cuenta con Tween 20 al 5%). Preparar diluciones seriadas 10-1; 10-2, 10-3.

Preparacin de las diluciones:

La solucin preparada anteriormente ser considerada como la dilucin 10-1 y seguir de acuerdo al esquema siguiente:

Interpretacin del esquema:

El matraz que contiene el diluyente con la muestra disuelta en l, sera la dilucin 10- 1. Luego tomamos del matraz (dilucin 10 - 1) con pipeta estril 1ml de la dilucin y vertemos en el Tubo 1 (esta seria nuestra dilucin 10 - 2).

Seguidamente tomamos 1ml del Tubo 1 con otra pipeta estril y vertemos al Tubo 2 (esta sera nuestra dilucin 10 - 3).

Seleccionar tres diluciones convenientes para la siembra.

Recuento de microorganismos en placa.-

Interpretacin: Contar el nmero de colonias crecidas en la placa de mayor dilucin y multiplica por la inversa del valor de dilucin. Reportar como UFC/ ml.

Recuento de mohos y levadura

Interpretacin: Contar el nmero de colonias crecidas en la placa de mayor dilucin y multiplicar por la inversa del valor de dilucin. Reportar como UFC/ml.

14.5. Resultados

Observar las caractersticas de las colonias.

Realizar el conteo y los clculos.

Anotar los resultados.

14.6.- Cuestionario

Cules son los microorganismos aerobios mesfilos viables?

Cul es la composicin y fundamento del agar tripticasa soya?

Cul es la composicin y fundamento del agar Sabouraud?

14.7.- Referencia Bibliogrfica

Secretaria de la Junta Directiva de la Convencin de la USP o del NF. 2007. USP 30 Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica. NF 25 Formulario Nacional. 30a ed. The United States Pharmacopeial Convention

XV. PRCTICA N 15CONTROL MICROBIOLGICO DE MEDICAMENTOS II. INVESTIGACIN DE PATGENOS

15.1.- Marco Terico:

Los medicamentos deben poseer una pureza microbiolgica adecuada a su uso previsto. Los microrganismos patgenos deben estar ausentes en los medicamentos.

15.2.- Competencia:

Conoce los procedimientos bsicos de investigacin de patgenos considerando el estudio de los agentes indicadores de contaminacin.

Mtodo: Mtodo adaptado de la USP XXX de investigacin de patgenos e indicadores de contaminacin (Sthaphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli).

15.3. Materiales y equipos:a. Muestras: Productos medicamentosos y/o naturales, algodn, asa de siembra, pabilo, bolsas plsticas, plumn marcador y papel kraft (por mesa de trabajo).b. Materiales y Equipos:

MaterialCant (*)DetalleObservacin

Esptulas chicas y planas(10) 1 x mesaEstrilesUn da antes

(Los alumnos debern venir un da antes de su prctica para el enriquecimiento de sus muestras)

Probeta x 10 ml(10) 1 x mesaEstriles

Matraz de 125 ml(20) 2 x mesa1 conteniendo caldo tripticasa soya

1 conteniendo caldo lactosado

Placas petri estriles(30) 3 x mesa1 placa de cada medioDa de la prctica

(Se entregaran los matraces del da anterior)


Mango de siembra

5

Mecheros de vidrio5

Mango de siembra5

Piceta con desinfectante1

Equipos

Incubadora1

Balanzas mecnicas5Uso en la primera parte

C. Reactivos

Para la entrega de los medios de cultivo y materiales se considerar un aproximado de 5 alumnos por mesa de trabajo y mximo 10 mesas de trabajo.

DenominacinCant. (*)Observacin

Alcohol etlico 7050 ml

Caldo Tripticasa SoyaVolumen 90 ml x matraz. 1 matraz x mesaUn dia antes de la prtica

Caldo LactosadoVolumen 90 ml x matraz. 1 matraz x mesa

Agar Manitol Salado20 ml x placa ( 1 placa x mesa ) - PlaqueadoDa de la prctica

(Se entregaran los matraces del da anterior)

Agar Mac Conkey 20 ml x placa (1 placa x mesa ) - Plaqueado

Agar Cetrimide 20 ml x placa ( 1 placa x mesa ) - Plaqueado

(*) Pa

rImportante.- Al finalizar la prctica, las placas conteniendo los medios de cultivo sembrados, se entregarn al Laboratorio. Los alumnos asistirn a verificar las placas y tubos, solo en los horarios establecidos por el Laboratorio. La presentacin es obligatoria con: mandil, guantes y mascarilla.

15.4. Procedimiento

15.4.1. Acondicionamiento del rea de trabajo y del personal

Efectuar la limpieza y desinfeccin de la zona de trabajo con desinfectante. El personal debe contar con guardapolvo, guantes, mascarillas y gorro.

El procedimiento incluye nicamente la fase de aislamiento e identificacin de colonias en medios de cultivo selectivos, no se realizan procedimientos de diferenciacin bioqumica (medios diferenciales).

15.4.2. Obtencin de la muestraDesinfectar el envase del producto a analizar, usar alcohol etlico de 70 y algodn. Abrir el recipiente en forma asptica con ayuda del mechero, en caso de usar otros materiales estos deben estar esterilizados.

15.4.3. Mtodo operatorioA) Un da antes de la prctica

Realizar el enriquecimiento un da antes de la prctica.

Investigacin de Patgenos I. Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosaEnriquecimiento de la muestra.

Sembrar 10 g o 10 ml de MP en 90 ml de caldo tripticasa soya e incubar a 37 por 24 h.

Investigacin de Patgenos II. E. coliEnriquecimiento de la muestra

Sembrar 10 g o 10 ml de MP en 90 ml de caldo lactosado e incubar a 37 por 24 h.

B) Da de la prctica

Se entregaran los matraces del da anterior para que se realice la siembra en las placas.

Caldo Tripticasa Soya

1. Siembra en medio selectivo para PseudomonaSiembra por extensin en superficie (agotamiento) en agar cetrimide. Incubar a 37 por 24 h.2. Siembra en medio selectivo para estafilococos.

Siembra por agotamiento en superficie en agar Manitol Salado. Incubar a 37 por 24 h.

Caldo Lactosado

a) Siembra en medio selectivo para E.coli.

Repicar a partir del caldo lactosado a agar Mac Conkey incubar a 37 por x 24 h.

C) Lectura de placas con medios

Se proceder tambin a realizar la lectura de las placas con medios sembrados el da anterior.

15.5. Resultados

Observar si hay crecimiento de colonias y sus caractersticas.

Anotar los resultados.

15.6. Cuestionario

Cul es la composicin y fundamento del caldo tripticasa soya?

Cul es la composicin y fundamento del caldo lactosado?

Cul es la composicin y fundamento del agar manitol salado?

Cul es la composicin y fundamento del agar cetrimide?

Cul es la composicin y fundamento del agar Mac Conkey?

15.7. Referencia Bibliogrfica

Secretaria de la Junta Directiva de la Convencin de la USP o del NF. 2007. USP 30 Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica. NF 25 Formulario Nacional. 30a ed. The United States Pharmacopeial Convention.

102 Tubo1

10-3Tubo2

1ml

1ml

Dilucin

10-1Matraz con la muestra

Cada tubo de 16 x 150 mm debe contener 9 ml del diluyente con tween 20 al 5%

10-1

1mLL LL LLLLL

10-2

1mLLLLLL

10-3

1m

Las placas deben estar vacas y estriles. El mtodo de siembra debe ser por incorporacin. Tomar 1 ml del tubo que contiene la mayor dilucin ( 10-3 ) y proceder a verterlo en la placa. Aadir 15 - 20 ml de AGAR TRIPTICASA SOYA a aproximadamente 46C - 48C. Mezclar por rotacin. Realizar el mismo procedimiento para las siguientes diluciones (10-2 y 10-1 respectivamente) empleando la misma pipeta y empezando por la de mayor dilucin (10-3; 10-2 y 10-1 respectivamente) Incubar a 37C por 24 - 48 h.

10-1

1mLL LL LLLLL

10-3

1m

10-2

1mLLLLLL

Las placas deben estar vacas y estriles. El mtodo de siembra debe ser por incorporacin Tomar 1 ml del tubo que contiene la mayor dilucin (10-3) y proceder a verterlo en la placa .Aadir 15 - 20 ml de AGAR SABOURAUD a aproximadamente 46C - 48C. Mezclar por rotacin. Realizar el mismo procedimiento para las siguientes diluciones (10-2 y 10-1 respectivamente) empleando la misma pipeta y empezando por la de mayor dilucin (10-3; 10-2 y 10-1 respectivamente) Incubar a 25C por 5 -7 das.

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