HPLCHigh Performance

Liquid Chromatography 

Nama Kelompok

BAIQ EZA JULIA AVRIANI

HUSNUL KHOTIMAH

ISNA NINGSIH

MEGA NUR AIDA SIAGIAN

PRIZIZA TRI UTARI

RIKI TARNANDA

SEJARAH HPLC Kromatografi ditemukan oleh Tswett pada tahun

1903. D.T. Day  juga menggunakan  kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu.

Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) ditetapkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian disempurnakan oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.

• Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas.

• Pada akhir  tahun 1960 an, semakin banyak  usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai  suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. 

Pengertian

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi

untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti

teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk

memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat

padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan

zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat

berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap

senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan

fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan

mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat

serta tinggi puncak suatu senyawa.

Kegunaan Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, �

anorganik, maupun senyawa biologis Analisis ketidakmurnian (impurities) Analisis senyawa-senyawa tidak mudah

menguap (non-volatil) Penentuan molekul-molekul netral, ionic,

maupun zwitter ion Isolasi dan pemurnian senyawa Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya

hampir sama. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah

sedikit (trace elements), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. 

Jenis-jenis HPLC Kromatografi Adsorbsi Pemisahan kromatografi

adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

Instrumentasi High Performance Liquid Chromatography

Instrumentasi HPLC terdiri dari :

Fase GerakPompaInjektorKolomDetektorPengolah data

Fase Gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).

Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. 

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

Injektor

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 

Posisi pada saat menyuntik sampel                 

Kolom Kolom adalah jantung kromatografi.

Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography (EC).

Detektor Pendeteksi dan penerjemah data yang akan di tampilkan pada komputer HPLC

o Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik (yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selekti) seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil. Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Prinsip Kerja Kromatografi merupakan teknik yang mana solute atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.  ELUSI = PROSES MENGEKSTRAKSI ZAT YANG UMUMNYA PADAT DARI CAMPURAN ZAT DENGAN MENGGUNAKAN ZAT CAIR (PELARUT)

Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama.

Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif.

SKEMA HPLC :

Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Jika ingin menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), tidak dapat diketahui jumlah relatifnya jika menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Kelebihan HPLCa. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

b. Mudah melaksanakannya

c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang

dianalisis

e. Resolusi yang baik

f. Dapat digunakan bermacam-macam detektor

g. Kolom dapat digunakan kembali

h. Mudah melakukan sample recovery

i. Dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan

termolabil

j. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai

polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair

Kelemahan HPLC

a. Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa,

kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrofotometri

massa

b. Harus diketahui kombinasi yang optimum antara pelarut,

analit, dan gradient elusi

c. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup

penelitian yang terbatas

d. Hanya bisa digunakan untuk asam organic

Perawatan HPLC Stabilitas pH

kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi

Teknik StabilitasFase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram.

Eluen

Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.

Penyimpanan KolomoUntuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat

disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.

oUntuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.

oUntuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.