INFECTION par le VIH

• Physiopathologie de l’infection par le VIH

• Aspects Virologiques

– Les différents VIH

– Les tests virologiques

Dr Diane DescampsLaboratoire de VirologieHôpital Bichat-Claude BernardUniversité Paris 7

HISTORIQUE

• Découverte du HIV en 1983• LAV : Lymphadenopathy Associated Virus• Françoise Barré-Sinoussi• laboratoire de Luc Montagnier• Institut Pasteur, Paris

• Découverte du VIH-2 en 1986• isolé à l ’hôpital Claude Bernard• Laboratoire de Françoise Brun-Vézinet• Caractérisation François Clavel, Institut Pasteur

FAMILLE DES RETROVIRUS

SPUMAVIRUSPathogénicité?

ONCOVIRUSHTLV-1, HTLV-2

LENTIVIRUSHIV-1, HIV-2

RETROVIRUS

• Definition : particules de 100 à 110nm de diamètre

• Structure

– ARN monocaténaire

– 2 sous unités identiques

– capside icosaèdrique

– enveloppe

• sortie de la cellule par bourgeonnement

• enzyme caractéristique : reverse transcriptase

– transcription retrograde de l ’ARN en ADN

Réplication du VIH

2 étapes• Intégration du virus dans le génome cellulaire

– enzyme virale : intégrase– pas d ’expression des gènes viraux – pas d ’intervention de mécanismes cellulaires

• Synthèse de nouveaux virions – régulée par des mécanismes viraux et cellulaires

Co-Récepteurs

– nécessaires à la pénétration du virus dans la cellule hôte

– récepteurs de chimiokines : attirant les cellules immunocompétentes aux sites de la réponse immune et de la réaction inflammatoire

co-récepteurs différents

• CXCR4, CCR5

• CCR2b, CCR8, Bonzo, Bob, etc..

Co-Récepteurs • Bêta-Chimiokines se fixant sur CCR5 :

– RANTES, MIP-1a, MCP-1

• Alpha-Chimiokines se fixant sur CXCR4:

– IL-8, SDF1

• Expression

– lymphocytes CD4

– macrophages

HIV : tropisme in vivo

• Récepteur CD4 :– Lymphocytes CD4+– Monocytes-Macrophages– Cellules folliculaires dendritiques (gg)– Cellules dendritiques– Cellules de Langherans (muqueuses)– Microglie

Tropisme • Tropisme macrophagique (M) : CCR5 ou virus R5

– 90% des souches transmises par voie sexuelle

– virus peu réplicatifs et peu cytopathogènes : NSI (Non Syncithia

Inducing)

– sujets asymptomatiques

– délétion de 32paires de bases gène CCR5

• synthèse protéine tronquée, non fonctionelle

• homozygote : 1% (population caucasienne)

• hétérozygote : 15 à 20%

Tropisme

• Tropisme lymphocytaire (T): CXCR4 ou X4

– hautement réplicatif dans les lymphocytes T activés

– effet cytopathogène prononcé : SI (Syncithia Inducing)

– isolés chez tous les patients qui présentent des symptômes

biologiques et cliniques

• Utilisation préférentielle des co-récepteurs liée à la diversité des

formes virales coexistant chez un individu infecté : variabilité

génétique et dissémination du VIH ?

HIV Envelope TropismR5-Tropic

Dual-Tropic Mixed-Tropic

X4-Tropic

CXCR4

CCR5

X4-tropic HIV

R5-tropic HIV

dual-tropic HIV

Cellules cibles et réservoirs du VIH (1)

• Lymphocytes CD4

• Cellules présentatrices de l’antigène

– monocytes sanguins et macrophages tissulaires

• réplication faible avec ECP peu important

– cellules dendritiques : vecteur de réservoir du virus

• peau, thymus, muqueuses, organes lymphoides, SNC et sang

périphérique

• absorption sur cellules dendritiques des muqueuses génitales

et transport aux organes lymphoides voisins par intermédiaire

d ’une lectine « DC-SIGN »

Cellules cibles et réservoirs du VIH (2)

• CD4 activés

– 99%de la réplication virale – libération de virus dont la demi vie est très courte

• CD4 non activés = cellules mémoires– chez les patients traités : virus persiste sous forme de DNA

proviral non défectif, infectieux– réplication virale persiste à bas bruit et n’est pas détectée

• évolution des séquences génétiques dans les réservoirs cellulaires

PATHOGENESE (1)

• Réplication virale continue dans les tissus lymphoides d ’un virus hautement variable qui s ’adapte aux conditions extérieures

• Mécanismes de destruction des lymphocytes CD4 : mal connu, origine multifactorielle– lyse directe des cellules infectées par effet cytopathogène

direct du virus– lyse des CD4 par les lymphocytes CD8 cytotoxiques non

infectés porteurs de glycoprotéines d ’enveloppe virale à leur surface

– apoptose par stimulation antigénique de cellules ayant été au contact d ’antigènes du virus

– hyperstimulation cellulaire entrainant une anergie cellulaire

PATHOGENESE (2)

Après exposition au virus : 4 phases

• Primo-infection: pic de réplication virale

– ARN et CD8 hauts, CD 4 bas

• Diminution spontanée du titre ARN

– réponse cytotoxique

• Phase de latence clinique

– réplication virale continue mais stable

– accumulation de virus et détérioration anatomique et fonctionnelle des tissus lymphoides

• Phase tardive : SIDA

– ARN haut et CD4 bas

Dynamique de la réplication du VIH-1

• production quotidienne de virus :

– 10x109 virus

• demi vie du virus plasmatique :

– 6 heures

• destruction quotidienne des lymphocytes

– 10x109 CD4

Primo-infection VIH

• Etudes chez le singe (infection intravaginale)

– 1ère cellules cibles :

• cellules de Langerhans

• cellules dendritiques de l’épithélium cervico-vaginal

– fusion avec cellules CD4+

– invasion des tissus profonds

– J2 post infection : virus détecté dans les ganglions lymphatiques

iliaques

– dissémination systémique

– J5 post infection : culture plasma positive

Primo-infection VIH

• Chez l’homme :– délai entre infection (muqueuse) et virémie initiale : 4 à 11

jours.– importance lésions et inflammation de la barrière

muqueuse

– après infection :

• rapide augmentation de la virémie plasmatique • dissémination du virus dans les organes lymphoïdes

PATHOGENESE (3)

• Patients non progresseurs à long terme : 5%

– faible charge virale circulante et ganglionnaires

– CD4 relativement stable

– préservation de la réponse immunitaire spécifique à

médiation cellulaire

• Patients progresseurs rapides :5 à 10%

PATHOGENESE (4)

Facteurs de risque de progression de la maladie• Hôte

– certains haplotypes HLA classe I– mutations gènes codant pour les co-récepteurs– taux de beta-chimiokines secrétées– qualité de la réponse cytotoxique primaire– persistance de la réponse spécifique CD4 anti VIH– état d ’activation des CD8

• Virus– tropisme– taille de l ’inoculum– étendue de la réplication virale– délétion au niveau de gènes viraux

Les passages inter-espèces des lentivirus des primates

Diversité des VIH

• Erreur de la RT:

– dépourvue de système de réparation

– 1 erreur par cycle de réplication (1 erreur pour 10 000 bases)

• Dynamique importante de la réplication virale 10 milliards de virus

produits /jour

• Recombinaisons multiples• Toute population virale est une quasi-espèce comportant une

multitude de variants

Définition d’un sous type

• 2 isolats , au moins, entièrement séquencés

• sans ressemblance avec sous-types connus

• sans lien épidémiologique

• divergence

– env : 20-30%

– gag : 15%

Classification des VIH

• Séquence nucléotidique

• Comparaison des séquences

– évaluation des distances génétiques

– fréquence des mutations synonymes et non synonymes

• Phylogénie moléculaire

– métode du plus proche voisin

– méthode de parcimonie

– méthode du maximum de vraisemblance

Classification des VIH-1

• 1985-1990 : origine géographique des souches

• 1992 : 5 sous-types (env : A-->E) (Myers 1992)

• 1994 :

– VIH1 groupe M et groupe O (Charneau, 19994)

– 8 sous types de VIH-1 groupe M

• 1998 :

– VIH-1 groupe N (Simon, 1998)

– 10 sous types de VIH-1 groupe M (A-->J)

Genetic Diversity of HIV-1

      - HIV-1 : 3 groups M, N, O- HIV-1 : 3 groups M, N, O

group M (major)• 9 subtypes: A B C D F G H J K Nucleotide diversity in pol 10-15%

Sub-subtypes: A1-A2, F1-F2, B-D

groups O (outlier) and N (non-M/non-O) low prevalence (West Central Africa)

• 16 CRFs (Circulating Recombinant Forms)

CRF01_AE = Southeast Asia

CRF02_AG = West Africa

CRF03_AB, CRF04_cpx …

North and Central AmericaNorth and Central America

South AmericaSouth America

Eastern EuropeEastern Europe

AustraliaAustralia

Western EuropeWestern Europe

ChinaChina

South AsiaSouth AsiaSoutheast AsiaSoutheast Asia

CC, , BB

CCCC

BBBB

BBBB

BBBB

BBBB

BBBB

F1, B/F, CF1, B/F, C

A/G, C, GA/G, C, G

A, A/B, B, CA, A/B, B, C

B’/C, A/EB’/C, A/E

A/E, BA/E, BA/G, A, G

A,A/G,C,D,F1,F2,A,A/G,C,D,F1,F2,G,H,J,K,A/E,O,NG,H,J,K,A/E,O,N

A, D

Worldwide the majority of HIV-1 are non-subtype B viruses

Recent studies have shown the increasing spreading of recombinant viruses

AfricaAfrica

Mosaic structures of HIV-1: Circulating Recombinant Forms (CRFs)

CRF01_AE

CRF03_AB

CRF02_AG

CRF04_cpx

CRF05_DF

CRF06_cpx

CRF07_BC

CRF08_BC

CRF10_CDCRF10_CD

CRF11_cpx

CRF12_BF

CRF13_cpx

CRF14_BG

CRF15_AEB

CRF16_A2D

A B C D E F G H

J K U B A2 CRF01_AE

Diversité des VIH-1 : conséquences

• Transmission : ? A/E

• Pathogénicité : ??

– C et D > A (Kanki 1999)

– A = D (Aleus, 1999)

• Diagnostic et suivi

– sérologie

– quantification de la charge virale

• Thérapeutique : Résistance aux ARV

• Vaccin ?

VIH-1 groupe O

• 30 cas identifiés à ce jour en France et près de 300 au Cameroun

• Epicentre de l ’épidémie : Cameroun• Grande diversité : 4 clades identifiées• Parfois mal reconnu au dépistage : faible

réactivité des EIA et WB indéterminé• non quantifié par les trousses commerciales de

charges virales excepté LCX Abbott• généralement résistant aux NNRTI

VIH-1 groupe N

• Nouveau variant décrit en 1998

• proche de SIV-cpz-Gab

• rares cas rapportés à ce jour

• étude de l ’extension épidémiologique en cours au Cameroun et au Gabon

REPRESENTATION PHYLOGENETIQUE DES VIH ET SIV

Diagnostic de l’infection VIH

1- Adulte : sérologie (dépistage puis confirmation) sauf dans le cas de la primo-infection (ARN viral + Acs), ou de variants.

2- Nouveau né : Mise en évidence (du virus) et/ou de l ’ADN proviral dans les lymphocytes ou de l ’ARN plasmatique.

Dépistage des anticorps anti-VIH

Nécessite obligatoirement, pour chaque sérum, 2 techniques ou 2 réactifs différents:

– soit 2 réactifs ELISA Mixtes,

– soit 1 réactif ELISA Mixte et un réactif HIV-1 monospécifique,

– Soit 1 réactif ELISA Mixte et un test unitaire rapide.

Direction Générale de la Santé

(08 septembre 1993)

Tests de dépistage des Anticorps anti-VIH

1985 Lysats de cellules infectées par VIH-1Faux négatifs, et spécificité médiocre

1986 Antigènes recombinants et peptides de synthèse

1987 Tests mixtes de détection des anticorps anti-VIH1 et VIH2

1991 Tests sandwich :- Sensibilité +++- Spécificité +++

1997 Tests combinés détectant: Acs anti-VIH1, Acs anti-VIH2 et Ag p24.

Enzyme immunoassay (EIA)Enzyme linked immunoassay (ELISA)

[Traité de virologie médicale, Huraux, Agut, Nicolas, Peigue-Lafeuille]

ELISA

Microplaque ELISA (rangées sécables)

Dépistage combiné : Ac + Ag (Vidas : HIV Duo)

Caractérisques et évolution des tests ELISA

1ère gen 2nd gen 3ème gen 4ème gen

Elisa indirect indirect sandwich indirect

Détection IgG IgG IgGIgM

AnticorpsAg P24

Sensibilité + ++ +++ ++++

Spécificité + +++ +++ +++

Année 1985 1987 1989 1997

Antigène

utiliséLysat viral

protéines et

peptides recombinants

protéineset

peptides recombinants

protéines et

peptidesrecombinants

Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2

•Ne nécessitent pas « d’équipements » de laboratoire 10-20 mn•Lecture visuelle•Sensibilité « légèrement » inférieure aux nouvelles techniques Elisa (séro-conversions)•Aide au diagnostic d’urgence et en situation de détresse materielle.•France : en association obligatoire avec les tests Elisa

Test rapide

—Agrément par l’Agence du Médicament :

• sensibilité

- panels locaux et commerciaux de séroconversions VIH-1 (50)- VIH-1 groupe M sous types ( 150)- VIH-2 ( 50)- VIH-O ( 10)

• Spécificité: 2000 sérums

— Réévaluation périodique des tests par ADM

—Contrôle de qualité des laboratoires, obligatoire, tous les 6 mois.

TESTS DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTI-VIH-1 ET VIH-2

Algorithme sérologique

Prélèvement n°1

Dépistage(2 tests)

–/–

Absence d’infection en l’absence d’exposition

de moins de 3 mois

+/+ ou +/–

Prélèvement n°2WB ou IB

VIH1

Positif

Infection à VIH

Différenciation VIH-1 - VIH-2

Négatif ou indéterminé

• Infection récente ?Ag p24 ou ARN VIH au mieux

• VIH2 ? WB VIH2

• Faux positif ? 3è prélèv .

• Erreur tube ? 3è prélèv .

• Variant ? Tests spécialisés

Différenciation Acs VIH1 / VIH2

• La différenciation entre Acs anti VIH-1 et VIH-2 n’est pas une obligation légale

• Recommandée par le groupe ANAES (janvier 2000)

• Peptides synthétiques spécifiques de chacun des 2 virus

Tests de confirmation: WB ou Immunoblot

• Utilise des tests VIH-1 en première intention• Confirme une séropositivité VIH-1• permet de « soupçonner » une primo-infection VIH-1• voire une séropositivité VIH-2, une infection par VIH1

groupe O.

Western Blot ou Immunoblot (HIV confirmation)

Recommended WB nomenclature of major genes and gene products of HIV1

GENE GENE PRODUCTS DESCRIPTION

ENV gp 160 Precursor gpgp 120 External gpgp 41 Transmembrane gp

GAG p 55 Precursorp 40 Precursorp 24 Corep 17 Matrix

POL p 66 Reverse Transcriptasep 51 Reverse Transcriptasep 32 Reverse endonuclease

OTHER p 160 GAG/POL precursorWHO, april 1990

Critères pour l’interprétation des Western Blots

Organisation Critères

Positivité (au minimum) Négativité

Organisation Mondiale de la Santé 2 bandes env Aucune bande

Centers for Disease Control 2 bandes parmi les:p24, gp41, gp120/160 Aucune bande

Consortium pour la standardisation 1 bande p24 ou p32 et Aucune bandede la Sérologie des Rétrovirus 1 bande gp41 ou gp120/160

Croix-Rouge Américaine Au moins une bande de Aucune bandegag, pol et env

Food & Drug Administration p24, p32, et gp41 ou gp120 Aucune bande

Les profils ne remplissant ni les critères de positivité ni les critères de négativité sont considérés comme « Indéterminés ».

WB ou Immunoblot VIH-1 indéterminé?

1 Séroconversion VIH-1?

2 Infection par VIH-2?

3 Erreur de tube?

4 Variant?

anti gp 160 gp 120 gp 41

set point

Time (daysTime (days))28-2928-2920-2120-21 14-1514-1511-1211-120 exposure

Detection limit of the markers

PLASMA HIV RNA

p24 AG

PROVIRAL DNA

ANTI-HIV ANTIBODY : ELISASEROLOGICAL

WINDOW PERIODANTI-HIV ANTIBODY : WB

Kinetics of viral markers during primary HIV-1 infection

Sérologie VIH

• Un Elisa positif faible, WB négatif nécessite un 2ème prélèvement :Elisa, WB, ARN viral

• Si suspicion clinique de primo-infection : prescription ARN viral plasmatique d’emblée

! Titres « faibles » d ’ARN viral (< 105 c/ml)

Les infections par VIH-2

•L’épidémie VIH-2 est virtuellement restreinte à l’Ouest Africain

•Lien épidémiologique avec l’Afrique de l’Ouest des cas importés

•Histoire naturelle différente de l’infection VIH-1

- plus longue incubation

- moindre transmissibilité

•La prévalence des anticorps augmente avec l’âge

•Mise en place d’une cohorte nationale en France

Le diagnostic sérologique des infections par VIH-2

• La réactivité croisée par WB est un problème pour confirmer ou infirmer une infection par VIH-2.

• Une stratégie utilisant des protéines spécifiques VIH-1 ou VIH-2 avec des tests évitant la réactivité croisée est nécessaire.

Doubles séropositifs VIH-1 et VIH-2

• Double réactivité sur les WB VHI-1 et VIH-2

• Double réactivité sur les peptides synthétiques VIH-1 et VIH-2

Double infection ou réaction sérologique croisée ?

PCR VIH-1 et PCR VIH-2

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant

• Transmission mère-enfant en fin de grossesse (35%) ou à l ’accouchement (65%)

• Lorsque la femme enceinte n’était pas déjà traitée par des antirétroviraux: prophylaxie antirétrovirale au début du 3ième trimestre (28 semaines), associée à une césarienne programmée et au traitement de l’enfant pendant 6 semaines.

• En l ’absence de prévention– VIH-1: 20-35%– VIH-2: 3-4%

• Transmission actuelle en France: 1 à 2%: 10 à 20 NN par an en France.• Facteurs prédictifs:

– statut VIH maternel: clinique, CD4, CV– Facteurs obstétricaux: infections cervico-vaginales, rupture prématurée des

membranes, chorio-amniotite maternelle– allaitement maternel: 15% TME

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant

• Prélèvements de l ’enfant :première semaine de vie, 1 mois, 2 mois, 3 mois et 6 mois

• Techniques– Isolement de virus à partir des lymphocytes reste interessant si variant:

vérification de la souche de la mère au cours de grossesse pour vérifier que les techniques de Biologie moléculaire sont adaptées+++++

– ADN proviral ou ARN plasmatique– Deux examens successifs positifs ( selon calendrier prévu)

ARN viral négatif avant l ’âge de 3-6 mois en cas de traitement

surveillance prolongée si allaitement (jusqu’à 3 mois après l’arrêt)

MESURE DE

L’ARN VIH-1 PLASMATIQUE

Charge virale VIH-1 associé à la progression de l’infection à VIH-1

Etude de Mellors (Ann.Int.Med 1997)

• 1604 patients cohorte MACS

• évaluation de la valeur pronostique de la charge virale, sur un seul prélèvement à l’entrée dans la cohorte, en comparaison avec les autres marqueurs cliniques et cellulaires

• analyse rétrospective (bDNA Chiron 2.0)

• 5 catégories de risque ont été définies en fonction de la valeur de la charge virale

charge virale %SIDA à 6 ans %de décès à 6 ans

< 500 5,4 0,9

501 - 3000 16,6 6,3

3001 - 10000 31,7 18,1

10001 - 30000 55,2 34,9

> 30000 80 69,5

SEROCO

• Cohorte à temps de séroconversion connue

• La valeur prédictive de la charge virale a été établie 4 à 6 mois après la séroconversion

ARN VIH-1 SIDA à 6 ans

<10 000 10%

10 000 - 30 000 22%

>30 000 47%

• Les CD4 sont également prédictifs de façon indépendante

CD4+ Count is Better than Plasma HIV-1 RNA in Determining When to Initiate HAART

• Retrospective review of the risk of a new OI or death based on CD4+ count and viral load at initiation of HAART

• 1162 patients followed up at Johns Hopkins

• Median time of therapy - 533 days

• Viral load prior to initiation of therapy was not associated with risk of disease progression but CD4+ count was:

CD4 at HAART Hazard Ratio (95% CI; P value)

CD4 < 200 4.3 (2.6, 7.2; P < 0.0001)

CD4 201-350 1.6 (0.9, 2.9; P = 0.11)

CD4 351-500 1.0

Adapted from T Sterling et al, 8th CROI

Quantification du VIH

• Développement de techniques de biologie Moléculaire—Actuellement: plusieurs tests commerciaux disponibles —Enregistrés à l’Agence du Médicament (juillet 96)—Cotation à partir du 30 octobre 1997: B 300

• Tests disponibles en 2006• Amplification de la cible

—Cobas amplicor (Roche PCR classique 50 copies/ml)—Cobas taqMan HIV-1(Roche PCR temps réel 40 copies/ml)—M2000RT (Abbott PCR temps réel 40 c/ml)—EasyQ (Biomérieux)

• Amplification du signal—bDNA 2.0 (Bayer) 50c/ml

En pratique (1)

— Anticoagulant : héparine proscrite.

— Transport : le délai entre le prélèvement de sang total et le recueil de plasma ne doit pas excéder 3 heures pour Roche, 6 heures pour Chiron et 2 heures pour Nasba.

— Prise en charge du prélèvement: dès réception, le sang doit être centrifugé et les échantillons de plasma stockés à -80°C.

— Nombre d’échantillons évaluables par technicien :• Roche: 20 / jour (plus avec les techniques automatisées)• Chiron : 42 / 2 jours

En pratique

— Utiliser toujours le même kit pour le même patient.

— Nécessite une formation pratique et théorique du personnel médico technique.

— Nécessite une infrastucture adaptée du laboratoire avec différentes zones (extraction, amplification et détection).

— Contrôle National de Qualité.

ConclusionsConclusions

—— Mesure ARN VIH1 plasmatique: paramètre important Mesure ARN VIH1 plasmatique: paramètre important dans la décision de changer un traitement.dans la décision de changer un traitement.

—— Nécessite d’avoir 2 mesures de charge virale dans le Nécessite d’avoir 2 mesures de charge virale dans le suivi récent du patient.suivi récent du patient.

—— Le résultat de la charge virale peut varier chez un Le résultat de la charge virale peut varier chez un même patient d’un facteur 3 (0,5 log) sur 2 points même patient d’un facteur 3 (0,5 log) sur 2 points successifs sans signification particulière.successifs sans signification particulière.

—— Infections intercurrentes, vaccination Infections intercurrentes, vaccination augmentation transitoire de la charge virale.augmentation transitoire de la charge virale.

CONCLUSION

• Progrès réalisés dans la compréhension de la pathogénie de l’infection à VIH

• Beaucoup de questions restent à résoudre :– mécanismes de la destruction des lymphocytes CD4– implication de la variabilité génétique du virus dans la

pathogénie– élaboration d’un vaccin