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Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Departamento de Bioingeniería
Academia de Ingeniería de Bioconversiones
Manual de Prácticas
del
Laboratorio de Biorreactores
M. en C. Dynora Vázquez Gurrola
M. en C. Carlos Orozco Álvarez
M. en C. Leobardo Ordaz Contreras
Dr. Sergio García Salas
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Índice
PRÁCTICA 1. PRESENTACIÓN DE BIORREACTORES DIVERSOS .............................................................. 3
PRÁCTICA 2. INSTRUMENTACIÓN PARA EL SEGUIMIENTO Y CONTROL DE LA BIORREACCIÓN
....................................................................................................................................................................................... 9
PRÁCTICA 3. SERVICIOS AUXILIARES ............................................................................................................ 26
PRÁCTICA 4. TIEMPO DE MEZCLADO EN BIORREACTORES .................................................................. 39
PRÁCTICA 5. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO .............. 48
PRÁCTICA 6. MANTENIMIENTO DE ASEPSIA EN BIORREACTORES ..................................................... 59
PRÁCTICA 7. ESTERILIZACIÓN DEL SISTEMA DE BIORREACCIÓN ...................................................... 63
PRÁCTICA 8. PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN CULTIVO POR LOTE ...................................................... 72
PRÁCTICA 9. PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO.......................... 81
PÁCTICA 10. PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN CULTIVO CONTINUO ...................................................... 92
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PRÁCTICA 1
Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos
Presentación de
biorreactores
diversos
INTRODUCCIÓN
Cualquier proceso biotecnológico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operación: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).
Cada escala tiene sus propias características y objetivos, mismos que serán tratados en
otra asignatura (Ingeniería de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores
habrá que hacer la distinción entre tamaños, forma de operación y configuración
geométrica.
El biorreactor puede considerarse como el corazón de todo proceso biotecnológico, ya
que en él se lleva a cabo la transformación de la materia prima al producto de interés y
su operación deberá garantizar la maximización en la conversión, por lo que su
funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en
aquellos catalogados como de “altos volúmenes de producción y bajo valor agregado”.
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CARACTERÍSTICAS DE LOS BIORREACTORES
Entre las características que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:
1. Calidad de mezclado, incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que
favorezcan tanto la distribución de la materia prima en el biorreactor como su
conversión a producto.
2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economía aceptable.
3. Factibilidad técnica y económica en la construcción de unidades de gran
volumen.
4. Bajos costos de operación y mantenimiento.
5. Operación aséptica.
CLASIFICACIÓN DE BIORREACTORES
Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:
A continuación se describe cada tipo de biorreactor.
Agitado
Columna Biorreactores
Propelas
Airlift
Jet
Circulación
5
Biorreactores agitados
Este tipo de biorreactor es muy empleado en todas las escalas de producción, en
laboratorios de investigación o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse
incluso para fermentaciones de reología compleja y en procesos en los que se exigen
altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten en un cuerpo cilíndrico
con tapas elipsoidales, semiesféricas o toriesféricas y generalmente su relación
altura/diámetro es menor a tres y más comúnmente menor a dos.
Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de transmisión que contiene a su vez
los impulsores que agitarán el líquido. Dependiendo del tamaño del reactor, el motor
puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de
sellos mecánicos para garantizar el trabajo aséptico. Generalmente la “aireación” se
realiza a través de tubos (o placas) perforados, efectuándose la dispersión del aire en
las zonas cercanas a los impulsores.
Son muy onerosos a pesar de su versatilidad, sus costos de construcción, operación y
mantenimiento. Por limitaciones técnicas referentes a la transmisión de potencia y a los
problemas de sostenimiento del conjunto “flecha de transmisión – impulsores” no es
posible construir unidades mayores a los 300 m3.
Biorreactores de columna
Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el
caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyección de aire en el líquido desde el
fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la
turbulencia del líquido. Generalmente la relación altura/diámetro es mayor a tres. Si las
columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones
intermedias de las mismas para “redispersar” las burbujas de gas.
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Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y mantenimiento de este
tipo de biorreactores son más económicos que cualquier otro tipo. Quizá el mayor gasto
de operación sea el de compresión de aire, debido a los altos flujos requeridos.
Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.
Biorreactores de circulación
La denominación de esto tipo de reactores se debe al patrón de circulación definido del
líquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulación externa o
interna. Externa si el líquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al
cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior, y de circulación interna si
el líquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros
sólo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a
utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales,
alcanzando volúmenes de hasta 13,600 m3.
OBJETIVO
Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniería
Biotecnológica se relaciona con el diseño, construcción, implementación, operación y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente práctica se propone como
objetivo que el alumno identifique y describa los diferentes tipos de biorreactores y sus
partes accesorias, al igual que la forma como se operan, controlan, esterilizan, cargan y
descargan, etcétera.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
En principio para la sesión de introducción de esta práctica el alumno deberá haber
consultado en todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel
laboratorio, planta piloto e industrial, tras lo que se le mostrará los diversos tipos de
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biorreactores de nivel laboratorio y planta piloto de la unidad para el estudio de sus
componentes.
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
El alumno realizará un informe detallado de los biorreactores presentados donde deberá
reportar los siguientes puntos:
Tipo de biorreactor.
Capacidad.
Características geométricas (incluyendo el esquema del biorreactor).
Sistema de carga y descarga.
Sistema de agitación del líquido de reacción.
Patrones de flujo. Sistema de aireación.
Sistemas de control (incluyendo el sistema de enfriamiento).
Método o forma de esterilización de los medios de cultivo, reactor (incluyendo su
limpieza), aire, aditivos de fermentación (ácidos, álcalis, antiespumante,
etcétera).
Métodos de Cultivo (lote, lote alimentado o cultivo continuo) que se lleva a cabo
en el biorreactor.
Producción.
Dispositivo de toma de muestra y de inoculación.
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BIBLIOGRAFÍA
Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. (1983), “Bioreactors for Submerged Culture”,
Adv. Biotech, Process, 1: 1-30.
Charles, M. (1985). “Fermentation Scale-Up: Problems and Possibilities”, Trends in
Biotech, 3: 80-84.
Schüegerl, K. (1982), “New Biorreactors for Aerobic Processes”, Int. Chem. Eng., 22:
591-610.
Schüegerl, K. (1985), “Nonmechanical Agitated Biorreactor Systems” en Comprehensive
Biotechnology, M. Moo-Young, Pergamon Press, 2: 99-118.
Sitting, W. (1983), “Fermentation Reactors”, Chem. Tech., 13: 606-613.
Zlokarnik, M. (1985), “Tower-Shaped Reactors for Aerobic Biological Waste Water
Treatment”, en Biotechnology, Rehm, H. J. y G. Reed, 2: 537-569.
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PRÁCTICA 2
Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción
Instrumentación para el
seguimiento y control
de la biorreacción
INTRODUCCIÓN
Los biorreactores están equipados con distintos instrumentos que se utilizan para
facilitar el registro y análisis de las variables de operación y de parámetros específicos
que sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operación de la biorreacción con el fin de maximizar la productividad y garantizar el
éxito de la biorreacción.
La instrumentación ha sido definida como “una ventana al proceso” y su objetivo es
mantener al mínimo la diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de
un parámetro particular se lleva a cabo a través de un sistema que consta de un sensor
(o electrodo), un medidor y un controlador:
Sensor: dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir
en otra que facilita su medida.
Medidor: recibe la medida del valor de la propiedad que emite el sensor.
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Controlador: compara dicha medida con un valor fijo.
Del resultado de la comparación, el controlador toma una decisión enviando una señal
(generalmente eléctrica) a algún dispositivo que ajustará el valor medido de la
propiedad hasta el valor predeterminado o de control (“set point”). La señal usualmente
implica la modificación del estado de una válvula, el encendido o apagado de una
bomba dosificadora, la modificación de la velocidad de giro de un motor de algún
equipo, etcétera.
Si, por ejemplo, se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el
estado de una válvula se requerirá de un “transductor” y de un “actuador”.
Transductor: es un dispositivo que convierte un tipo de energía en otro tipo de energía.
Actuadores: dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energía eléctrica,
gaseosa o líquida. Existen tres tipos de actuadores:
Hidráulicos, que se usan cuando lo que se necesita es potencia.
Neumáticos, simples posicionamientos.
Eléctricos, usados para manejar aparatos electrónicos o mecatrónicos.
Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa líquida o sólida de fermentación), en cuyo caso se dice que están “en
línea”, si no están conectados directamente al biorreactor, entonces se dice que están
“fuera de línea”.
REQUISITOS DE LOS SENSORES EN LÍNEA
Debido a la naturaleza de la biorreacción se requiere que la gran mayoría de los
“sensores en línea” reúnan, entre otros, los siguientes requisitos:
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Que sean capaces de resistir el proceso térmico al que se somete el caldo de
cultivo en el biorreactor (esterilización con calor húmedo).
Que sean capaces de resistir las presiones de operación.
Que sean de fácil calibración.
Que muestren valores estables.
Que su mantenimiento sea fácil y económico.
Que tengan una adecuada vida media útil.
Estos sensores “en línea” se utilizan básicamente para medir propiedades físicas o
variables de operación como la temperatura, presión, intensidad de agitación o
velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de líquidos y gases, y para
medir ciertas propiedades químicas como el pH, concentración de oxígeno disuelto y
gaseoso, concentración de dióxido de carbono disuelto y en el gas la concentración de
azúcares disueltos, concentración de algunos productos celulares, entre otros.
Para conocer el estado de una variable de operación o de un parámetro específico con
sensores “fuera de línea” se deberá tomar asépticamente una muestra para que en ella
se mida la propiedad.
Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos es fácil concluir que los sensores en
línea son mucho más adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreacción.
PROPIEDADES MEDIBLES EN LOS BIORREACTORES
Entre las propiedades más comunes que se miden en un biorreactor figuran las
siguientes:
Temperatura.
pH.
Flujo de aire.
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Presión.
Intensidad de agitación.
Nivel o volumen de medio de cultivo.
Espuma.
Concentración de oxígeno disuelto.
Concentración celular.
Concentración de sustrato.
Concentración de producto.
A continuación detallamos algunas de estas mediciones.
Medición y control de pH
El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H+) en una disolución acuosa
y está definida por la siguiente ecuación:
pH = - log10 [H+] (1)
Para la medición y control del valor del pH se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma aséptica, en el biorreactor y que está directamente en contacto con el caldo de
fermentación. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medición.
Un electrodo de pH está integrado por dos celdas: un elemento sensor del pH y un
elemento de referencia.
El elemento sensor consiste en un alambre de plata cubierto con cloruro de plata
inmerso en una solución buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que termina
con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste en otro
alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer saturada
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de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a la que se
medirá el pH.
Dicho electrodo comúnmente se construye como una sola unidad con el sensor de
referencia construido en una parte anular del elemento sensor, tal como puede
apreciarse en la Figura 1.
El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos
caras de la membrana de vidrio expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su
valor de pH. A temperatura constante la magnitud de esta diferencia de potencial es
directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.
Figura 1. Esquema de un electrodo de pH.
Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un
comportamiento imperfecto es preciso calibrar el dispositivo de determinación del pH
con dos disoluciones patrón antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, los
electrodos se sumergen sucesivamente en dos disoluciones patrón con valor conocido,
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denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolución problema y
seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolución problema esté comprendida
entre los valores de pH P1 y P2.
Como el valor del pH del caldo de fermentación puede cambiar después de ser
esterilizado debido al drástico tratamiento térmico se recomienda recalibrar el electrodo,
para lo que se hace necesario tomar asépticamente una muestra del caldo de
fermentación y medir su valor de pH con un medidor y un electrodo “fuera de línea”. En
caso de que el valor del electrodo “en línea” sea distinto del que marca el “fuera de
línea” se ajustará el valor de aquél con el equipo de medición empleado en el
biorreactor.
Una vez realizado todo lo anterior se está en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreacción en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitirá una señal eléctrica con la que se
podrá activar alguna bomba para adicionar “ácido” o “álcali”, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.
En la Figura 2.2 se puede observar la disposición de un sistema de medición y control
del valor de una variable cualquiera de un caldo de cultivo contenido en un biorreactor.
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Figura 2. Diagrama de bloques de un circuito de control.
Medición y control de temperatura
Aunque no existe un consenso para establecer cuál de todas las variables de operación
es la más importante de mantener y controlar en una biorreacción, la temperatura se
cuenta entre las más importantes. El control, la medición precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreacción. Un sistema de medición de la
temperatura debe presentar una precisión menor a los 0.5 °C respecto a la temperatura
de medición y en muchos casos una variación de 1 a 1.5 °C durante la biorreacción
puede dar lugar a grandes pérdidas económicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 °C.
Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores RTD (Resistance
Temperature Devices), ya que son los que presentan las mejores características antes
mencionadas; constan de un elemento metálico cuya resistencia eléctrica cambia con la
temperatura, hecho en el que se basa la medición de la misma. Debido a sus óptimas
características lineales de cambio respecto a la temperatura usualmente se utiliza
platino, aunque también se usa níquel, cobre y aleaciones de níquel, sin embargo, una
desventaja del platino es su precio moderamente alto.
CONTROLADOR ACTUADOR
BIORREACTOR
V
VM
VSP
E = VM -VSP
SENSOR MEDIDOR
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La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de
temperatura (en °C o K). El valor medido de la temperatura es comparado con el del
control y de la diferencia entre los valores, el controlador emitirá una señal que servirá
para realizar una acción de control de la misma.
La acción puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor a través de un
serpentín inmerso en el caldo de biorreacción o a través de la “chaqueta” del biorreactor
para ajustar la temperatura al punto de control.
Para sensores RTD la relación entre la temperatura y la resistencia está descrita por la
siguiente ecuación:
1 0 01
1 0 01
0
TTT
RRT (2)
Ecuación en la que:
TR = resistencia a la temperatura T [=]
0R = resistencia a 0°C [=]
= una constante (0.00382 – 0.00393 para Platino)
T = temperatura [=] °C
= una constante (1.48 – 1.51 para Platino)
Dicha ecuación aplica para intervalos de temperatura comprendidos entre 0 y 630 °C.
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Medición y control del oxígeno disuelto
El oxígeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreacción aeróbica,
por lo que su medición y control es un parámetro importante para el desarrollo y
producción económicamente rentable de bioproductos.
El oxígeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreacción. Una parte del oxígeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxígeno disuelto es el que
utilizarán los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformación de
la materia prima a producto. Por esta razón es importante distinguir entre “oxígeno
disuelto” y “oxígeno en el gas”.
La medición del oxígeno disuelto se realiza de forma “amperométrica”, por la reducción
del oxígeno en la superficie del cátodo y la formación de cloruro de plata en el ánodo.
Una solución electrolítica une al ánodo estableciéndose un voltaje de polarización entre
ellos. Cuando un fluido que contiene oxígeno disuelto se pone en contacto con el
electrodo, el oxígeno se difunde a través de una membrana semipermeable
estableciéndose la siguiente reacción:
Cátodo: O2 + 2H2O + 4e- 4OH-
Ánodo: 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-
El resultado es una corriente eléctrica que es proporcional a la actividad del oxígeno
disuelto o presión parcial del mismo.
En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores
controladores de oxígeno disuelto que los usuarios podrán elegir.
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El control del oxígeno disuelto en una biorreacción ocurre a través de la modificación
del flujo de gas (aire u oxígeno puro) o de la intensidad de agitación del caldo de cultivo.
Medición y control de espuma
Cuando en el caldo de cultivo existen compuestos orgánicos, como proteínas y
carbohidratos, generalmente se forma espuma. Esto se favorece a altos flujos de aire y
alta intensidad de agitación.
La formación de espuma es crítica en los biorreactores por muchas razones, las más
destacadas son las siguientes:
Disminución del volumen del líquido en el interior del biorreactor si la espuma
sale por el venteo o salida del gas agotado.
Contaminación microbiológica del bioproceso si la espuma alcanza a salir por el
venteo o salida del gas agotado.
Disminución de la actividad biológica del bioproducto si posee propiedades
tensoactivas y es sensible a fuerzas de torsión.
Razones por las cuales la medición y el control de la espuma es imprescindible en los
Bioprocesos.
El control del volumen de la espuma se logra a través de un “rompedor mecánico” o
mediante la adición controlada de un “antiespumante”. El rompedor de espuma es un
impulsor colocado generalmente por encima del caldo de cultivo que gira a altas
velocidades entrando en contacto con la espuma para actuar en forma semejante a una
centrífuga, con lo que impulsa al fondo a la fase pesada, dejando pasar la fase ligera, el
gas.
El antiespumante rompe la espuma cambiando la tensión superficial del caldo de
cultivo.
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La selección del sistema de control de espuma ocurrirá después de evaluar las
características técnicas y económicas de ambos sistemas.
Un rompedor mecánico requiere de energía adicional y de acciones costosas de
mantenimiento preventivo y correctivo, mientras que los antiespumantes son
compuestos químicos extraños al sistema biológico de la biorreacción que
potencialmente pueden llegar a contaminar el producto final a pesar de que existan
antiespumantes aprobados por instituciones internacionales.
No obstante lo anterior, el sistema más empleado para controlar la formación de
espuma es usando antiespumantes. El control de espuma se basa en la conductividad
eléctrica que presentan los medios de cultivo. Cuando la espuma asciende y hace
contacto con el sensor, que es una varilla metálica colocada en la parte superior del
biorreactor, cierra un circuito eléctrico que envía una señal a un controlador que acciona
la bomba de adición de antiespumante. Una vez que la espuma se ha destruido deja de
hacer contacto con el sensor y la bomba deja de adicionar antiespumante.
OBJETIVO
El alumno manejará los sistemas de medición y control de variables de operación de
biorreactores de tanques agitados a través de las determinaciones en línea de la
temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma.
MATERIALES Y MÉTODOS
EQUIPO
Biorreactor tipo tanque agitado.
Tanque de nitrógeno puro con válvula de control de presión y de flujo.
Vasos de precipitados de 250 mL, 500 mL y de 2000 mL.
Probetas de 1000 mL.
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Mangueras de silicón para bombas peristálticas.
REACTIVOS
Solución de NaOH 0.5N.
Solución de HCl 0.5N.
Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua.
Solución proteica o un detergente.
INSTRUMENTOS
Sistema de medición y control de temperatura.
Sistema de medición y control de pH.
Sistema de medición y control de oxígeno disuelto.
Sistema de medición y control de espuma.
Elementos del sistema de medición y control de pH
Electrodo de pH con su camisa presurizable y conectores para el biorreactor.
Medidor.
Controlador.
Bombas de adición de ácido o álcali.
Elementos del sistema de medición y control de temperatura
Sensor RTD.
Medidor.
Controlador.
Recipiente de agua de enfriamiento con una resistencia eléctrica de inmersión.
Bomba de agua de enfriamiento.
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Elementos del sistema de medición y control de oxígeno disuelto
Electrodo polarográfico.
Medidor.
Controlador.
Elementos del sistema de medición y control de espuma
Electrodo.
Medidor.
Controlador.
Bomba de adición de antiespumante.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ACTIVIDADES PREVIAS
Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
Consultar los manuales de operación tanto del biorreactor como de los equipos
de medición y control que se utilizarán.
Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medición y control de temperatura,
pH, oxígeno disuelto y espuma.
Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solución proteica o de
detergente (el profesor lo indicará).
Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxígeno disuelto.
Establecer las condiciones de operación.
* Todo lo anterior se realizará auxiliado por sus instructores.
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ACTIVIDADES PARA MEDIR LAS PROPIEDADES DE LOS BIORREACTORES
A continuación se detallan las actividades para la medición de algunas propiedades de
los biorreactores.
Medición y control del pH
Establezca una velocidad de agitación del biorreactor siguiendo las indicaciones
establecidas en el manual de operación del equipo.
Encienda el equipo de medición y control y verifique que el valor de pH que
registra el mismo sea igual que el de la muestra tomada del biorreactor y medida
fuera de línea. De no ser así, ajuste el equipo de acuerdo a las indicaciones del
manual.
Ajuste el pH a un valor de cinco con una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N. y
establezca en el equipo un valor de Set Point de cinco (consulte el manual del
equipo).
El equipo de medición y control debe tener acoplado el sistema de adición de
álcali que consta de una bomba peristáltica capaz de agregar al biorreactor una
disolución de NaOH 0.5 N, de acuerdo a la señal del controlador.
Agregue al biorreactor 10 mL de una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N con
objeto de simular una biorreacción acidogénica (disminuye el valor del pH
conforme pasa el tiempo).
Observe como el controlador enviará una señal a la bomba peristáltica para
adicionar el álcali. La bomba dejará de funcionar (de adicionar álcali) cuando el
pH alcance o sobrepase el valor del Set Point.
Repita el procedimiento hasta que quede comprendido el sistema de medición y
control.
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Medición y control de la temperatura
Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y
establezca una velocidad de agitación de 300 rpm ayudado por su instructor.
A través de la chaqueta verifique que las válvulas del circuito de circulación del
agua de enfriamiento estén abiertas y encienda el equipo de medición y control
de la temperatura, que consta de los elementos ya descritos.
Establezca en el controlador de temperatura un valor de Set Point de 33°C
ayudado por su instructor.
Encienda la bomba de circulación del agua y espere hasta que la temperatura en
el interior del biorreactor alcance la temperatura del Set Point.
Medición del oxígeno disuelto
Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y con la
ayuda de su instructor establezca una velocidad de agitación de 300 rpm.
Establezca un flujo de aire a un valor de 0.5 vvm (verifíquelo en el rotámetro).
Encienda el equipo de medición de oxígeno disuelto y espere unos 15 minutos
hasta que la lectura permanezca estable.
Con este valor, establezca en el equipo el 100% del valor de saturación.
Ayudado por sus instructores conecte un tanque de nitrógeno puro al sistema de
introducción de aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrógeno tal
que no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifíquelo en el rotámetro), con objeto
de disminuir la presión parcial de oxígeno en el aire. Esto provocará que la
concentración de oxígeno disuelto sea menor que cuando se burbujea aire
solamente.
Observe como el oxígeno disuelto baja en el equipo de medición.
Ahora cierre completamente el flujo de nitrógeno y observe como el valor de
oxígeno disuelto volverá a su valor normal (100% del de saturación).
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Medición y control de la espuma
Agregue al biorreactor 10 litros de agua con 2% de detergente (o de ser posible
una disolución protéica) a temperatura ambiente (25°C) y establezca con la
ayuda de su instructor una velocidad de agitación de 250 rpm y un flujo de aire
de 0.15 vvm que deberá verificar con el rotámetro.
A esta velocidad observe si se forma espuma.
Incremente la velocidad de agitación en intervalos de 50 rpm hasta llegar a 400.
Mantenga las diferentes velocidades durante 10 minutos y observe lo que ocurre
con la formación de espuma (debe incrementarse su velocidad de formación) y
anote sus observaciones.
Estando a 400 rpm incremente el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm,
observe y anote lo que pasa con la formación de espuma.
Conecte el sistema de control de espuma. La bomba peristáltica de adición de
antiespumante debe estar conectada y la manguera debe estar inmersa en una
solución de antiespumante Mazu al 10% en agua.
Elija una velocidad de agitación y un flujo de aire que tengan la más alta
formación de espuma, con objeto de que el controlador envíe la señal de adición
de antiespumante. Anote y discuta sus observaciones.
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
Elabore diagramas (en Autocad) donde se observen los sistemas de medición y
control de pH, temperatura, oxígeno disuelto y espuma en un biorreactor.
Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a
las necesidades de instrumentación y control en las biorreacciones.
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BIBLIOGRAFÍA
Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis N. F. (1973), Biochemical Engineering, 2ª edición,
Edition Academic.
Harper, E. H. (2000), El ABC de la instrumentación en el control de procesos
industriales, Limusa, 1ª edición, México.
Lydersen, B. K., D’Elia N. A., Kim, L. M. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc., USA.
Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley and Sons.
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PRÁCTICA 3
Práctica 3. Servicios auxiliares
Servicios Auxiliares
INTRODUCCIÓN
Los servicios auxiliares necesarios en la operación de un biorreactor incluyen aire
comprimido, diversos gases comprimidos (nitrógeno, oxígeno, etcétera), agua de
enfriamiento (agua helada y agua de torre), agua para servicios varios, vapor de planta
y energía eléctrica.
AIRE
El aire tiene varios usos en un biorreactor, a continuación mencionaremos algunos de
ellos por orden de importancia:
Proveer oxígeno al medio de cultivo.
Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa.
Como fuerza motriz para transferir líquidos de un recipiente a otro.
Para accionar instrumentación de control de tipo neumático.
Como medio de enfriamiento para los recipientes después de la esterilización.
La elección del tipo de aire a utilizar dependerá del uso que se haga de él. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Además cuando se requiera que el proceso o producto no se
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afecte por la introducción de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de
aire, será necesario que éste sea estéril.
Esterilización del aire
Actualmente para la esterilización del aire que se introducirá al biorreactor se utilizan
prefiltros y filtros absolutos. Los prefiltros son casi obligatorios para compresores
lubricados con aceite para eliminar partículas de este lubricante, sin embargo, en la
actualidad los compresores libres de aceite van ganando terreno, por lo que en estos
casos los prefiltros sirven para aumentar la eficiencia y vida media de servicio de los
filtros absolutos. Estos últimos deberán tener 100% de retención de partículas de hasta
0.01 µm en el aire de servicio.
Los filtros constan de dos elementos principales: el cartucho que contiene el elemento
filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho. En el comercio especializado se
encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos de los materiales utilizados para
los cartuchos son: ésteres de celulosa, polisulfonas, fluoruro de polivinilo y
politetrafluoroetileno, mientras que el material más utilizado para la camisa es el acero
inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rápido y hermético. El
diámetro de los cartuchos es de 2½” a 2¾”, con longitudes variables que van desde 10”
(0.25 m) hasta 40” (1m).
Se recomienda que los filtros a emplear en los biorreactores sean del tipo de membrana
hidrofóbica (que repele el agua). La naturaleza hidrofóbica de estas membranas pueden
alcanzar 100% de remoción de bacterias y bacteriófagos en condiciones de operación
húmedas o secas. La esterilización de los filtros se realiza con vapor saturado que
circula en el sentido de la introducción del aire al biorreactor.
28
Sistemas de compresión de aire
Los sistemas de compresión de aire constan de los siguientes componentes:
compresor, filtro de admisión de aire, sistema de enfriamiento (si lo tiene), depósito de
almacenamiento y sistema de control de presión. En varios puntos del sistema de
distribución se deben colocar trampas o purgas para eliminar condensados.
Los compresores de aire para plantas biotecnológicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo, aunque también existen los
compresores de tipo centrífugo para grandes volúmenes de aire a bajas presiones. El
aire es tomado directamente de la atmósfera. Independientemente del tipo de
preferencia deberán ser especificados como libres de aceite.
La tubería de distribución puede ser especificada en diferentes materiales dependiendo
del servicio: desde acero al carbón para aire de equipos y motores, hasta acero
inoxidable 304 o 316 acabado sanitario para el aire proveniente del filtro absoluto hacia
el punto de suministro al biorreactor o para líneas de distribución instaladas en un
cuarto limpio.
Además del aire comprimido algunos gases comprimidos también tienen aplicaciones
en biorreactores, los más comunes son nitrógeno y oxígeno puros: el nitrógeno es útil
para la formación de atmósferas inertes y el oxígeno se usa para enriquecer el aire y
alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxígeno en el biorreactor. Estos
gases generalmente son suministrados en cilindros a una mayor presión que la
atmosférica, de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubería de
distribución y suministro debe cumplir con las mismas características que la del aire.
VAPOR
El vapor de planta es utilizado como el medio principal de calentamiento en miles de
industrias y como de uso secundario para la generación de energía eléctrica. Además el
29
vapor limpio o puro se utiliza en el procesamiento de alimentos y medicinas en la
esterilización de productos y equipos, entre otros. Su uso generalizado se debe a las
siguientes razones:
La generación de vapor es una de las formas más económicas de generación de
energía.
El vapor puede controlarse de manera relativamente sencilla debido a que circula
de una zona de alta presión a una de menor presión sin necesidad de otro
equipo.
El vapor es fácil de producir ya que se obtiene del agua, la cual puede ser
reutilizable.
Un generador de vapor o caldera es aquel equipo que transforma el agua en vapor
aprovechando el calor generado por la combustión de un material combustible, teniendo
como característica principal que es un recipiente cerrado sujeto a una presión mayor a
la atmosférica.
Tipos de generadores de vapor
Existen dos tipos de generadores de vapor:
Generadores de tubos de agua: en los cuales el agua circula al interior de una
serie de tubos (serpentín), mientras que el calor se transfiere de la cámara de
combustión hacia el interior de los tubos, así el agua contenida dentro de los
tubos comienza a elevar su temperatura hasta evaporarse. Este es el tipo más
común y con el que cuenta la UPIBI.
Generadores de tubos de humo: en forma totalmente opuesta, en este tipo de
generadores los gases de combustión circulan por los tubos, mientras que el
agua se encuentra almacenada en la cámara exterior, así el calor se transfiere
del interior de los tubos hacia el agua almacenada alrededor de éstos
30
La capacidad de un generador de vapor se mide bajo un estándar internacional llamado
Caballo Caldera, el cual es equivalente a generar 15.65 kg/h de vapor con una
temperatura de 100 ºC a presión atmosférica y que es alimentado con agua a 100 ºC.
Otra definición nos dice que con estos 15.65 kg/h de vapor es posible obtener 8,430
kcal/h de calor aprovechable en un proceso. Así un generador de vapor que tenga una
capacidad de 100 caballos caldera será capaz de generar 1565 kg/h de vapor.
Partes de las calderas
Las calderas generalmente vienen como paquetes en tamaños estandarizados que
incluyen:
Tanque de condensados, que se instala generalmente 2 m arriba de la bomba de
alimentación de agua al generador.
Bomba de agua, que envía el agua a presión hacia el serpentín del generador.
Generador de vapor de tubos de agua por donde circulan en sentido contrario el
agua y los gases de combustión, de tal manera que a medida que el agua
avanza en su recorrido encuentra temperaturas más altas, por lo que incrementa
su temperatura hasta convertirse en vapor. Los componentes básicos del
generador son el serpentín, el quemador-ventilador y la cámara de combustión.
Separador de vapor, donde por medios mecánicos se provoca el
desprendimiento de pequeñas partículas de agua (humedad) que arrastra el
vapor.
Trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los envía
de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo.
Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: las válvulas de alivio
y de seguridad, los manómetros, el control principal de temperatura con
termopar, los interruptores del termostato, el interruptor de presión de vapor y el
interruptor del nivel de aceite.
31
El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo para proteger
los equipos contra la incrustación, la corrosión y otras complicaciones (ver Cuadro 1).
Por eso es necesario acoplar a ésta un sistema de acondicionamiento previo del agua,
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.
El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catiónica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene
como función regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio
iónico.
Cuadro 1. Características del agua de alimentación a una caldera
Dureza: cero
Oxígeno disuelto, CO2 : cero
Sulfitos: 50 – 100 ppm
pH: 10.5 a 11.5
Sólidos en suspensión: cero
Sólidos disueltos: < 6000 ppm
Sistema de distribución de vapor
El sistema de distribución de vapor se realiza por medio de tuberías, generalmente de
acero al carbón cédula 40, cuidando que las velocidades y caídas de presión estén
comprendidas en los intervalos recomendados para el dimensionamiento de las
mismas. El vapor puro requerirá de tuberías de acero inoxidable con acabado sanitario.
32
En adición al sistema de distribución de vapor deberán preverse los sistemas de manejo
de condensados, ya que éstos pueden reutilizarse con un importante ahorro en el
acondicionamiento del agua de alimentación a la caldera y en la energía requerida para
el calentamiento de la misma hasta el punto de ebullición.
AGUA DE ENFRIAMIENTO
El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentación en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la
biorreacción, ni con las superficies en contacto con éstos, circula a través de las
chaquetas o serpentines según el diseño del biorreactor.
Tipos de agua de enfriamiento
En la práctica el agua es un servicio escaso y es necesario recircularla, enfriarla y
reutilizarla. Dependiendo de la temperatura requerida para el agua de enfriamiento ésta
puede ser:
Agua de torre. Con una temperatura de entre 10 °C y 25 °C dependiendo del
diseño de la torre y de las condiciones ambientales del lugar. Los equipos más
utilizados en la industria biotecnológica por su tamaño compacto son las torres
de enfriamiento por evaporación. Otros sistemas para mayores capacidades son
las torres atmosféricas y los estanques de enfriamiento, los cuales requieren
grandes espacios para su instalación. El agua de torre es susceptible de
degradación debido al crecimiento de organismos o bien al aumento en la
concentración de sales que favorecen la incrustación, por lo tanto las torres de
enfriamiento requieren un mantenimiento constante que implica: tratamiento con
algunos químicos para impedir la incrustación de sales, cloración para impedir la
formación de microorganismos y purgas frecuentes para impedir la acumulación
de sólidos.
33
Agua helada. Con una temperatura de entre 5°C y 10 °C, los componentes
principales de un sistema de agua helada son los mismos que los de un ciclo de
refrigeración: el compresor, el condensador, la válvula de expansión, el
evaporador, la bomba de recirculación y el tanque de expansión. El evaporador
es simplemente un intercambiador de calor donde el refrigerante se vaporiza a
expensas de la energía que toma del agua, que como resultado de este proceso
se enfría. Esta agua helada se dirige a los puntos donde se necesita y de ahí se
retorna al evaporador por medio de la bomba de recirculación. Por otro lado, el
gas refrigerante se comprime, se enfría en el condensador y se dirige
nuevamente al evaporador pasando por una válvula de expansión donde se
vaporiza parcialmente disminuyendo aún más su temperatura.
Para dimensionar un sistema de enfriamiento será necesario conocer la demanda de
agua (flujo) y el intervalo de temperaturas entre el agua que sale hacia el proceso y la
que regresa al sistema. Las tuberías de transporte y suministro del agua de
enfriamiento por lo general son de acero al carbón y cobre en un diámetro adecuado
para los flujos que se manejen.
Agua para servicios varios
Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del área de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningún tratamiento adicional.
ENERGÍA ELÉCTRICA
La instalación eléctrica tiene como propósito proporcionar la energía para accionar
bombas, compresores, motores eléctricos y otros equipos mecánicos, instrumentos,
tableros de control y alumbrado. El sistema se debe adecuar para entregar en el punto
que se requiera la energía necesaria sin causar sobrecalentamiento o cambios de
34
voltaje innecesarios, lo cual se logra a través de líneas de alambrado que unen el
generador con el punto donde es necesaria la energía, conectando todos los
componentes que se dividen en secciones según el servicio y el área, dando lugar a los
circuitos.
El sistema eléctrico básico está constituido por la fuente, el equipo de transformación,
los dispositivos de protección, las líneas de distribución y los puntos de uso.
Elementos del sistema eléctrico
Voltajes de distribución
La energía comprada o generada se suministra a voltajes muy altos y para usarse en la
planta debe ser reducida al voltaje de utilización, para esto se requiere el uso de
subestaciones reductoras o transformadores. El voltaje de operación recomendado por
los fabricantes de motores y demás equipo eléctrico aparece en la placa o en las
instrucciones de operación de dicho equipo. La especificación típica para motores
eléctricos y demás equipos accionados eléctricamente es de 120 V, 240 V y en algunos
casos hasta 480 V, los instrumentos generalmente necesitan voltajes de 12-24 V.
Corriente: la cual puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC), que es periódica con
pequeñas oscilaciones, desde un valor máximo en un sentido hasta el mismo valor pero
en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y la corriente
continua o directa (DC o CC), que proporciona un valor constante todo el tiempo, como
la producida por dínamos, pilas y acumuladores.
Dispositivos de protección
Los circuitos y equipos deben ser protegidos por dispositivos que abran los circuitos
para que la corriente no fluya en condiciones de sobrecarga o falla, lo cual se hace a
través de interruptores. Mediante los transformadores se obtienen voltajes reducidos
35
que alimentan los diferentes circuitos, cada uno de los cuales debe tener su interruptor
de desconexión.
Equipo eléctrico para áreas peligrosas
Cuando las materias primas o productos de la biorreacción son potencialmente
peligrosos, es decir, emiten cantidades de partículas muy pequeñas a la atmósfera
grande que pueden penetrar hacia los circuitos eléctricos e iniciar una chispa (por
ejemplo, polvos, solventes, entre otros), tanto el equipo eléctrico como los
transformadores, mecanismos de distribución y motores deben ser especificados a
prueba de explosión.
Conductores
Del punto de suministro al punto de utilización (equipo, compresores, bombas,
etcétera), la corriente eléctrica se distribuye por medio de conductores que pueden ser
alambres, cordones o cables, los cuales pueden ser vistos como las arterias y venas
por donde viaja la corriente:
Hilo o alambre: es un conductor constituido por un único alambre macizo,
generalmente de cobre.
Cordón: conductor constituido por varios hilos unidos eléctricamente enrollados
helicoidalmente alrededor de uno o varios hilos centrales.
Cable: conductor formado por uno o varios hilos o cordones aislados
eléctricamente entre sí. Según el número hilos o cordones que lleva un cable se
denomina unipolar, bipolar, tripolar, etcétera.
Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberías metálicas o canales
para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosión los golpes,
etcétera, que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares
36
se entierran dichas tuberías bajo el piso, aunque esto lo hace de difícil acceso y
mantenimiento.
OBJETIVO
El alumno identificará los servicios auxiliares necesarios para la operación de un
biorreactor, describirá sus componentes y explicará su funcionamiento.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno buscará, en todas las fuentes
posibles, información sobre los tipos de sistemas de compresión de aire, generación de
vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnológica. También
investigará los elementos básicos de una instalación eléctrica industrial.
Para la sesión experimental:
Se mostrará a los alumnos el cuarto de calderas, se les pedirá que identifiquen
todos sus componentes y la elaboración del diagrama de flujo de este sistema.
Se expondrán a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedirá que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
El profesor y el técnico a cargo describirán los procedimientos de arranque y
paro de la caldera y los compresores, así como una breve descripción de su
funcionamiento.
Los alumnos identificarán las líneas de agua, vapor, aire y electricidad de la
planta piloto, observando su ruta y registrando sus características: materiales,
aislamiento, diámetros, color, etcétera. Se hará lo mismo en el laboratorio de
biorreactores indicando la clasificación de colores en caso que la haya. Los
alumnos realizarán un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas
37
de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarán en prácticas
posteriores.
Se mostrará a los alumnos el biorreactor New Brunswick Scientific para que
identifiquen en éste las líneas de suministro de agua, aire, vapor y condensados,
así como sus accesorios (filtros, trampas de vapor, reguladores de presión,
válvulas, etcétera). Se hará especial énfasis en los filtros para aire y vapor, y en
el sistema de esterilización para las líneas de agua y aire. Los alumnos
observarán el cambio de materiales en las tuberías de entrada al biorreactor.
En cada actividad los alumnos deberán anotar sus observaciones en la bitácora,
acompañándolas de esquemas, dibujos y demás documentos.
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
El alumno realizará un informe de las actividades desarrolladas que deberá contener los
siguientes puntos:
Introducción.
Objetivo.
Tipo y descripción de caldera.
Tipo y descripción de compresores.
Diagrama de flujo de servicios.
Diagrama de ruta de servicios.
Observaciones sobre cada una de las actividades realizadas.
Conclusiones generales sobre el desarrollo de la práctica y bibliografía.
38
BIBLIOGRAFÍA
Clayton, A. (2000), Curso de operación y mantenimiento preventivo a generadores de
vapor.
Lydersen, B. K., D’Elia N. A., Kim, L. N. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc., USA.
Perry, R. H., Green, D. W. (2004), Manual del Ingeniero Químico, McGraw-Hill.
Rase, H. F., Barrow, M. H. (1981), Ingeniería de proyectos para plantas de proceso,
CECSA.
39
PRÁCTICA 4
Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores
Tiempo de mezclado en
biorreactores
INTRODUCCIÓN
TANQUE AGITADO
La agitación y aireación en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes
propósitos:
Suministrar el oxígeno necesario a los microorganismos para que se realicen
apropiadamente sus actividades metabólicas.
Mantener en suspensión a los microorganismos.
En los biorreactores de tanque agitado, la agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante dos formas:
40
Por el movimiento de dispositivos mecánicos, como impulsores de tipo turbina o
de propelas.
Por el movimiento ascendente de burbujas de aire.
Por lo tanto, la intensidad de agitación depende de la velocidad de movimiento de los
impulsores y de la velocidad de aireación.
La agitación puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como
el tiempo que transcurre desde la adición de un trazador hasta que éste se distribuye
homogéneamente en el biorreactor. En ocasiones se determina el tiempo de mezclado
tm 95, que significa el tiempo transcurrido para alcanzar un 95% de homogeneidad.
Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones
de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxígeno o de algún otro nutriente,
gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtención de
bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de
las variables de operación sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el
biorreactor.
COLUMNA
La agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo en los biorreactores de columna
mediante el movimiento ascendente de las burbujas de aire. El número y tamaño de las
burbujas de aire dependen de la velocidad de aireación, de las propiedades físicas del
caldo de cultivo, del tipo de dispersor, de la altura de la columna y de la presencia de
dispersores colocados a lo largo de la columna. Un aumento en la velocidad de
aireación incrementará la fracción de gas retenido y las velocidades locales del líquido.
Junto con esto, se hacen más pronunciados los perfiles parabólicos de la fracción de
gas retenido a través de la sección transversal de la columna con su máximo en el
centro.
41
El elemento estructural a través del cual tiene lugar la dispersión del gas se llama
dispositivo de dispersión primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersión secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa el aire se
introduce a través de dispositivo de dispersión primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, donde es dispersado finamente. También las
burbujas de aire que aumentan de tamaño debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a través de dispositivos de dispersión secundaria, como mallas o
bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores de
columna de burbujas multietapa la dispersión de aire se lleva a cabo
predominantemente en los dispositivos de dispersión primaria.
AIRLIFT
Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
líquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersión gas-líquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-líquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulación del líquido en el biorreactor.
Debido al movimiento del líquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirán más rápido, disminuyendo la fracción de gas retenido y la diferencia de presión
hidrostática. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribución más uniforme de la fase gaseosa a través de la sección transversal de
la zona de flujo ascendente, con un máximo de la fracción de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. También, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de líquido mucho más altas. La velocidad del
líquido afecta decisivamente todos los parámetros que caracterizan el desempeño del
42
biorreactor: la fracción de gas retenido, el tiempo de mezclado y el desempeño en
cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del líquido en los
biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireación, la geometría del
biorreactor y las propiedades físicas de la fase líquida.
El mezclado del líquido es predominantemente producido por la circulación del líquido y
en menor grado por la dispersión axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El
mezclado ocurre predominantemente en las zonas de deflexión superior e inferior,
debido a las diferencias de velocidad ahí existentes. Para una geometría definida, la
rapidez del mezclado puede expresarse en términos del tiempo de circulación, el cual
se define como el tiempo requerido para que el líquido circule una vez dentro del
biorreactor. Por ello el conocimiento del tiempo de circulación y de los factores que lo
afectan es necesario para el diseño, modelado y operación de un biorreactor airlift.
OBJETIVOS
TANQUE AGITADO
El alumno determinará el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo
diferentes condiciones de aireación y agitación.
COLUMNA Y AIRLIFT
El alumno determinará el tiempo de mezclado en biorreactores de columna de burbujas
y airlift bajo diferentes condiciones de aireación.
43
MATERIALES Y MÉTODOS
BIORREACTORES
Biorreactor de tanque agitado.
Biorreactor de columna de burbujas.
Biorreactor airlift.
INSTRUMENTOS
1. Cronómetros.
2. Rotámetros.
3. Manómetros.
4. Termómetros.
REACTIVOS
1. Solución de NaOH 6N.
2. Solución de HCl 6N.
3. Solución indicadora (azul de bromocresol o fenolftaleína)
4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.
44
DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE MEZCLADO EN LOS BIORREACTORES
El método que se utilizará es del de adición de trazadores tales como ácidos y bases.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ACTIVIDADES PREVIAS
Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
Llenar el biorreactor con agua de la llave.
Agregar al biorreactor 0.2 mL de la solución de indicador.
CONDICIONES DE OPERACIÓN
El profesor puede seguir o cambiar las siguientes condiciones de operación,
dependiendo del tipo y tamaño del biorreactor a utilizar.
Tanque agitado
Las velocidades de agitación serán: 300 y 500 rpm.
Para cada velocidad de agitación se probarán las siguientes velocidades de
aireación: 0.6, 1.0, 1.2 y 1.5 vvm.
Columna y Airlift
Velocidades de aireación: 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, y 1.5 vvm.
45
MEDICIÓN DEL TIEMPO DE MEZCLADO
Método de adición de pulsos
La adición de pulsos se realizará en una zona lo más alejada del electrodo de pH. El
tiempo de mezclado es el tiempo que transcurre desde que adiciona un pulso de ácido
hasta lo obtención de la homogenización del color del líquido en el biorreactor o hasta la
obtención de un valor de pH constante. El procedimiento es:
a) Ajustar el pH a un valor entre 8.0 y 9.0.
b) Adicionar rápidamente un pulso de HCl 6N, para cambiar el pH a un valor entre 3
y 4. El volumen del pulso de HCl deberá determinarlo previamente. Registre el
tiempo de mezclado.
c) Adicionar rápidamente un pulso de NaOH 6N, para cambiar el pH a un valor
entre 8 y 9. Registre el tiempo de mezclado.
d) Cuando el tiempo de mezclado obtenido con pulsos de ácido sea igual (más
menos 5%), cambiar las condiciones de operación.
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
TANQUE AGITADO
Calcular el tiempo de mezclado.
Elaborar una tabla que incluya el tiempo de mezclado para cambios de pH de
básico a ácido y el tiempo de mezclado para cambios de pH de ácido a básico.
Para reactores de tanque agitado: calcular la potencia de agitación sin aireación
y con aireación así como la potencia de aireación.
Para reactores neumáticos: calcular la potencia de aireación.
46
Construir gráficas del tiempo de mezclado en función de las variables de
operación (la agitación en rpm y la aireación expresada en vvm y vs).
Obtener correlaciones matemáticas del tiempo de mezclado en función de las
variables de operación empleadas.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La discusión deberá incluir al menos lo siguiente:
Comparación de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condición de
operación.
Comparación de las potencias de aireación y de agitación.
Comentarios sobre el aspecto de la dispersión gas-líquido.
BIBLIOGRAFÍA
TANQUE AGITADO
Aiba, S., Humphrey A. E., Millis, N.F. (1973), Biochemical Engineering, 2a edición,
Edition Academic.
Hicks, R. W., Gates, L. E. (1976), “How to Select Turbine Agitators for Dispersing Gas
Into Liquids” en Chem. Eng., July 19: 141-148.
Moser, A. (1988), “Bioprocess technology” en Kinetics and reactors, Springer - Verlag.
47
Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and enzyme technology, John Wiley and Sons.
COLUMNA
Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. (1983), “The Size of Bubbles Generated From
Perforated Plates” en Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.
Schüegerl, K. (1982), “New Bioreactors for Aerobic Processes” en Int. Chem. Engng.,
22, 4: 591-610.
Schüegerl, K., Lucke, J., Oels, U. (1980), “Bubble Column Bioreactors”, Adv. In
Biochem. Engng., 45. 7: 1-84.
AIRLIFT
Blenke, H. (1985), “Biochemical Loop Reactors” en Biotechnology 2, Rehm, H. J. y G.
Reed.
Joep, J. M. (1988), “Gas Hold up Measurements in Bioreactors” en Trends in
Biotechnology, 6: 19-22.
Weiland, P., Onken, V. (1981), “Differences in the Behaviour of Bubble Columns and
Airlift Loop Reactors” en Ger. Chem. Eng., 4: 174-181.
48
PRÁCTICA 5
Práctica 5. Determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno
Determinación de la
Velocidad de Transferencia de Oxígeno
INTRODUCCIÓN
Las conversiones microbianas aeróbicas son reacciones de oxidación que requieren oxígeno
molecular disuelto. Una gran diferencia del oxígeno con respecto a otros nutrientes, es su
extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la transferencia de oxígeno puede
llegar a ser uno de los principales factores limitantes de la productividad celular y/o de
metabolitos, debido a la influencia de la concentración del oxígeno disuelto sobre las actividades
metabólicas de las células. La velocidad de transferencia de oxígeno de un biorreactor depende de
las condiciones de operación (aireación y/o agitación) y de las propiedades físicas del líquido. La
ecuación que describe la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO) es:
VTO = kLa (C* - C) (1)
donde:
kLa : coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (h-1
).
C*: concentración de oxígeno disuelto en equilibrio con la fase gaseosa (g/L).
C: concentración de oxígeno disuelto (g/L).
49
El kLa es un parámetro que sirve para tener una idea de la rapidez con la que se transfiere oxígeno
del aire al líquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes métodos para determinar la
velocidad de transferencia de oxígeno. Dos de ellos son el método del sulfito y el método
dinámico.
Otro parámetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxígeno de un
biorreactor es la fracción de gas retenido (ε) o "gas holdup", definido como la fracción de
volumen de la dispersión gas-líquido que es ocupada por la fase gaseosa. Cuando el tamaño
promedio de las burbujas es constante, una mayor fracción de gas retenido, implica una mayor
área interfacial gas-líquido y en consecuencia una mayor transferencia de oxígeno.
La velocidad de transferencia de oxígeno es determinada de manera importante por el área
superficial de las burbujas de aire, de aquí que el aire se disperse en forma de burbujas pequeñas
para proveer una gran área de contacto entre las fases líquida y gaseosa. Sin embargo, en algunos
líquidos, las burbujas pequeñas tienden a unirse formando burbujas más grandes. Así con una
dispersión primaria muy fina y dependiendo de las propiedades físicas del líquido y de la
intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden crecer hasta
aproximadamente 6 mm de diámetro después de dejar la zona de dispersión. Este fenómeno
conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho de que una película líquida
entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez más delgada hasta que eventualmente se
rompe.
En una dispersión gas-líquido cuyo comportamiento es 100% coalescente, el líquido es un líquido
puro. Al ir aumentando la concentración de electrolitos disueltos en dicho líquido, se va
inhibiendo la coalescencia de las burbujas. También la presencia de proteínas, alcoholes y
substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia de las burbujas. La coalescencia de las
burbujas afecta entonces el diámetro de las burbujas. Éste, junto con la fracción de gas retenido,
determina el área superficial de contacto entre las fases líquida y gaseosa.
Si el oxígeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al líquido donde se
desarrollan los microorganismos, el oxígeno disuelto sería consumido en pocos segundos bajo
condiciones normales de operación, debido a la baja solubilidad del oxígeno en agua. El
50
suministro del oxígeno es por lo tanto un aspecto muy importante en el diseño de biorreactores
para procesos aeróbicos.
El kLa es un parámetro que depende del grado de coalescencia del líquido. Por ejemplo, el kLa
empleando una solución acuosa con una fuerza iónica de I=0.4, es más grande, por un factor de
seis, que el obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del área interfacial.
En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas retenido
más grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fracción de gas retenido disminuye al
aumentar la velocidad de circulación del líquido. La velocidad del líquido representa por lo tanto,
un parámetro muy importante para adaptar la fracción de gas retenido y el tiempo de residencia
promedio de las burbujas a los requerimientos de proceso.
En los biorreactores airlift, la velocidad de transferencia de masa cambia a lo largo de la ruta de
flujo de una manera complicada, debido a que el área interfacial y la diferencia de concentración
de oxígeno cambian de una altura a otra debido a la expansión o compresión, al consumo de
oxígeno y a cambios en la presión hidrostática.
51
OBJETIVO
Determinar la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO), el coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno (kLa) y la fracción de gas retenido global (ε) en diferentes tipos de
biorreactores.
EQUIPO, MATERIALES Y MÉTODOS
Biorreactores
Biorreactor de tanque agitado.
Biorreactor de columna de burbujeo.
Biorreactor airlift.
Electrodo y medidor de oxígeno disuelto.
Reactivos
Sulfito de sodio
Sulfato de cobre pentahidratado
Solución de Yodo 0.1 N.
Solución de Tiosulfato de sodio 0.1 N.
Método del sulfito para la determinación de VTO y kLa.
En el método de oxidación del sulfito, la oxidación del ión sulfito a ión sulfato es casi instantánea
y la velocidad es independiente de las concentraciones de sulfito y de oxígeno disuelto. Puesto
que la velocidad de reacción es mucho más rápida que la velocidad de transferencia, la velocidad
de oxidación es controlada por la velocidad de transferencia de oxígeno a la solución, donde la C
es prácticamente de cero. Para determinar el kLa por este método, se usa una solución de NaSO3
que contiene Cu+2
como catalizador, después de un tiempo de operación, se toma una muestra
para determinar la concentración de ión sulfito que no reaccionó mediante la titulación con una
solución de Yodo. El Yodo que no reaccionó se cuantifica titulándolo con Tiosulfato de sodio.
52
Las reacciones que se llevan a cabo en este método son:
2 Na2SO3 + O2 2 Na2SO4
2 Na2SO3 + 2 I2 + 2 H2O 2 Na2SO4 + 4 HI
2 I2 + 4 Na2S2O3 4 NaI + 4 Na2S4O6
Preparación de soluciones
Solución de Sulfito de sodio 0.4 M.
Esta solución se prepara justo antes de ser empleada. El volumen a preparar depende del volumen
de operación del biorreactor que empleen.
Solución de Sulfato de cobre.
La solución a preparar deberá tener una concentración tal que al agregarla al biorreactor resulte
en una concentración de 0.003 M
Determinación del kLa por el método dinámico.
Este método se basa en un balance dinámico de oxígeno bajo condiciones no estacionarias.
Cuando se aplica este método en un biorreactor que no contiene microorganismos se usa la
ecuación (2); es igual que la ecuación (1) pero sustituyendo VTO por el cambio de la
concentración de oxígeno con respecto al tiempo (dC/dt).
)2()*( CCakdt
dCL
53
En este método el suministro de aire se reemplaza por un suministro de nitrógeno, que desplaza al
oxígeno presente en el seno del líquido, disminuyendo C. Después se inicia la aireación a una
velocidad constante y se mide el aumento de C. En esta etapa, el balance de oxígeno se describe
por la ecuación (2), que al integrarla entre los límites C1 y C2 obtenemos la ecuación (3). Una
grafica de ln[(C*- C2)/(C* - C1)] vs tiempo produce una línea recta con una pendiente que es
igual a –kLa. La figura (1a) muestra el cambio de C y la figura (1b) muestra la línea obtenida con
la ecuación (3).
(a) (b)
Figura 1. Determinación de kLa usando el método dinámico.
)3(*
*ln 12
1
2 ttakCC
CCL
Tiempo
akL
Tiempo
C
Eliminación
de oxígeno
Inicio de
aireación
1
2
*
*ln
CC
CC
54
Determinación de la fracción de gas retenido global por el método de expansión
Medir el volumen del líquido aireado y el volumen del líquido sin airear
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Determinación del kLa por el método del sulfito
1. Agregar al biorreactor la solución de Sulfito de sodio 0.4 M.
2. Adicionar la solución de Sulfato de cobre al biorreactor.
3. Ajustar el pH a un valor de 7.2 con HCl concentrado.
4. Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operación.
5. Tomar una muestra de 3 mL y verter inmediatamente 1 mL a cada uno de dos matraces
erlenmeyer de 250 mL, que contienen 10 mL de solución de Yodo 0.1N.
6. Titular el exceso de Yodo con solución de Tiosulfato de sodio 0.1N. Registrar el volumen
gastado de Tiosulfato de sodio.
7. Tomar otra muestra después de 5 minutos de haber tomado la primera y repetir los pasos
5 y 6. Si el volumen gastado de Tiosulfato de sodio aumenta significativamente, mantener
5 minutos entre la toma de cada muestra, sino es así, modificar ese tiempo de acuerdo a la
capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor.
8. Hacer una gráfica del volumen gastado de Tiosulfato de sodio en función del tiempo. Si al
graficar 3 puntos se obtiene una línea recta con un coeficiente de correlación mayor a 0.95
ya podrá determinar la velocidad de transferencia de oxígeno. Si no es así, continúe
tomando muestras hasta que obtenga una línea recta.
9. Una vez que determine la velocidad de transferencia de oxígeno, cambie las condiciones
de operación y repita este procedimiento.
Determinación del kLa por el método dinámico
o Calibrar el electrodo de oxígeno disuelto e instalarlo en el biorreactor.
o Llenar el biorreactor con agua de la llave hasta alcanzar el volumen de operación.
o Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operación.
55
o Después de que el biorreactor alcance una operación estable, suministrar nitrógeno para
que la C disminuya.
o Cuando la C sea baja, del orden de 0% a 10% de saturación, suspender el suministro de
nitrógeno e iniciar el suministro de oxígeno a un flujo correspondiente a una condición de
operación, registrando el % de saturación de oxígeno disuelto cada 15 s. Este tiempo
puede ser diferente de acuerdo a la capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor.
Después del primer experimento usted establecerá cada cuanto tiempo debe registrar % de
saturación de oxígeno disuelto.
o Cuando el % de saturación de oxígeno disuelto sea alto, del orden de 90% a 100% puede
terminar el experimento.
Condiciones de operación
Las siguientes condiciones de operación se sugieren, queda en el profesor seguirlas o cambiarlas
por otras, de acuerdo al tipo y tamaño de biorreactor que se utilice.
Biorreactor tanque agitado.
Velocidades de agitación: 300 y 700 rpm.
Para cada velocidad de agitación se probarán las siguientes velocidades de aireación: 0.3, 0.6,
1.0, 1.2 y 1.5 vvm.
Biorreactores de columna de burbujeo y airlift.
Velocidad de aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.2 y 1.5 vvm.
Medición de la fracción de gas retenido global por el método de expansión.
Medir el nivel del líquido sin airear y el nivel del líquido aireado para cada condición de
operación en cada tipo de biorreactor
56
RESULTADOS
Para el método del sulfito
1. Elabore graficas del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en las titulaciones vs el
tiempo (h).
2. Calcule la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO) de acuerdo a la ecuación (4).
3. La VTO es la pendiente de la grafica del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en
la titulación vs el tiempo (h).
Donde:
V1 y V2: volúmenes de la solución de Tiosulfato de sodio gastados (en mL),
correspondientes al tiempo t1 y t2 (en h), respectivamente.
N: normalidad de la solución de Tiosulfato de sodio (meq/mL).
V: volumen de muestra (L).
A: equivalente estequiométrico de oxígeno a Tiosulfato de sodio e igual a 0.25 mMoles
O2/meq de Tiosulfato de sodio.
4. Calcule el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) de acuerdo a la
ecuación (1).
5. Elabore una grafica de kLa en función de fracción de gas retenido, velocidad de agitación,
velocidad de aireación, potencia de agitación con aireación y potencia de aireación.
)4(12
12
Vtt
ANVVVTO
57
6. Obtenga la correlación del kLa en función de cada una de las variables mencionadas en el
párrafo anterior.
Para el método dinámico
1. Tabule los valores de tiempo (s) y % de saturación de oxígeno. Calcule el valor de C*
(g/L) usando la Ley de Henry; este valor es el 100% de saturación. Calcule la C (g/L).
Haga una grafica de C (g/L) vs tiempo (h).
2. Tabule los valores necesarios para que elabore una grafica que le permita obtener el kLa
(h-1
)
3. Calcule la VTO, el kLa y la fracción de gas retenido global para cada condición de
operación.
4. Obtenga la correlación del kLa en función de la fracción de gas retenido, velocidad de
agitación, la velocidad de aireación, la potencia de agitación con aireación y la potencia
de aireación.
DISCUSIÓN
La discusión deberá contener al menos la siguiente información:
1. Comparación de las diferentes condiciones de operación y fracciones de gas retenido con
respecto a los valores del kLa.
2. Comparación de los valores de kLa que obtuvo para cada uno de los biorreactores
empleados y explique el porqué de las diferencias.
58
3. Cuál es el aspecto de la dispersión gas-líquido para cada condición de operación.
4. Explicación de los valores de kLa de los líquidos que promueven la coalescencia y de los
líquidos que la evitan.
BIBLIOGRAFÍA
TANQUE AGITADO Y COLUMNA
1. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
2. Wang, D .I .C ., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D. 1978.
Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
3. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic Press.
AIRLIFT
1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.
2. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
3. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and airlift loop
reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.
4. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.
59
PRÁCTICA 6
Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores
Mantenimiento de asepsia en
biorreactores
INTRODUCCIÓN
En esta práctica la asepsia se considera como el conjunto de procedimientos
destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las
tuberías conectadas a él con el propósito de asegurar que únicamente estén presentes
el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas responsables de efectuar la
bioconversión de materias primas a un producto especificado. En consecuencia, la
asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él garantizan que los procesos de
bioconversión se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraños.
Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado
por el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor,
incluso pueden producir sustancias que dañen al microorganismo cultivado o inactiven a
las enzimas. Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan
que los rendimientos y productividades de producción establecidos no se puedan
alcanzar, ocasionando pérdidas económicas.
60
Para lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él se deben
proponer desde la etapa de diseño una geometría interna y arreglos de tuberías que
eviten la acumulación de sustancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las sustancias
acumuladas pueden propiciar una contaminación. También la asepsia se facilita
mediante una limpieza efectiva del biorreactor y de las tuberías, lo que se alcanza al
especificar materiales de construcción con un acabado que evite el atrapamiento de
partículas sólidas con microorganismos. Las partículas sólidas eventualmente limitan la
transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilización y por lo tanto dejándolos viables para generar una
contaminación.
Una vez lavado el biorreactor y las tuberías, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilización. Después de la esterilización el biorreactor debe operar
asépticamente. Para lograrlo es necesario el buen funcionamiento del sello mecánico
para mantener una presión positiva que evite la entrada de microorganismos. También
se requiere el más alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de remoción
del filtro para la esterilización del aire.
Existen diferentes métodos para probar la integridad de filtros, uno de ellos es la prueba
de la intrusión del agua. Es una prueba práctica y validada que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofóbicos para la esterilización del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presión.
OBJETIVO
El alumno conocerá las pruebas de intrusión de agua y de mantenimiento de la presión
para probar la integridad de filtros de aire con los que se garantice la operación aséptica
en biorreactores.
PRUEBA DE INTRUSIÓN DE AGUA
61
El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofóbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofóbica de la membrana porosa
prevendrá el flujo del líquido a través del filtro hasta que se alcanza la presión de la
intrusión. A presiones por debajo de la presión de intrusión ocurre un flujo pequeño,
pero medible del agua a través de la membrana. La presencia de poros más grandes en
el filtro será detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros.
La Figura 3 muestra el principio de esta prueba.
Figura 3. Principio de la prueba de intrusión de agua. Si el tamaño de los poros es como
el tamaño del poro B, el flujo de agua será menor que el flujo correspondiente a poros
del tamaño del poro A.
El Cuadro 2 muestra el resultado de una prueba de intrusión de agua para un filtro de
membrana de la marca Pall. Los parámetros de la prueba son específicos para cada
filtro y deben ser proporcionados por el fabricante.
Carcasa
Aire
Agua
Filtro:
Membrana
hidrofóbica
Aire
Agua
Membrana
hidrofóbica
Presión
Poro A
Poro B
Unidad de filtración
62
Cuadro 2. Parámetros de la prueba de intrusión de agua para un filtro de cartucho
EMFLON PFR de Pall
Número de catálogo: AB1PFR7PVH4
Presión de prueba: 2500 mbar
Flujo máximo permisible: 0.33 mL/min
Usando agua desionizada a una temperatura de 20° ± 2°C.
PRUEBA DE MANTENIMIENTO DE LA PRESIÓN
La prueba de mantenimiento de la presión es una forma modificada de una prueba de
flujo difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. Ésta
puede llevarse a cabo después de la esterilización del filtro, antes de la filtración y
después de la filtración estéril, puesto que las conexiones estériles corriente abajo no se
desconectan. Una ventaja de la prueba de mantenimiento de la presión es que también
confirma la integridad de la unidad de filtración, incluyendo los sellos de la carcasa.
BIBLIOGRAFÍA
Lydersen B. K., D´Elia N. A., Nelson, K. M. L. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc. New York.
Johnston P. R. (2004), Fluid Sterilization by Filtration, Interpharm, CRC Press LLC.
Jornitz. M. W. (2006), Sterile Filtration, Springer-Verlag, Berlin.
63
PRÁCTICA 7
Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción
Esterilización del sistema de
biorreacción
INTRODUCCIÓN
Una esterilización adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el éxito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propósito se emplea cualquier
método capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La técnica más común es la destrucción de los microorganismos contaminantes. El
término destrucción, en este caso, significa la pérdida de viabilidad del microorganismo.
La destrucción de microorganismos se puede llevar a cabo por varios métodos:
Calor, ya sea seco o húmedo.
Agentes químicos.
Radiaciones.
Vibraciones sónicas.
El método que se utiliza con mayor frecuencia para medios líquidos es el de calor
húmedo, ya que es simple, confiable y económico.
64
CINÉTICA DE MUERTE TÉRMICA DE MICROORGANISMOS
Generalmente la velocidad de muerte de los microorganismos se clasifica en: velocidad
de muerte logarítmica y velocidad de muerte no logarítmica.
VELOCIDAD DE MUERTE LOGARÍTMICA
La velocidad de muerte logarítmica se puede expresar matemáticamente mediante la
ecuación:
- dN
dtkN (1)
Separando variables e integrando.
lnN
Nokt (2)
N
Nokt exp( ) (3)
La ecuación (3) describe apropiadamente la cinética de muerte térmica de células
vegetativas.
VELOCIDAD DE MUERTE NO LOGARÍTMICA
Este tipo de comportamiento de muerte térmica se encuentra a menudo en esporas
bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta: germinación de
esporas, técnicas experimentales deficientes, impactos múltiples para la inactivación y
eventos secuenciales en la inducción de muerte.
65
El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte se suscite de la siguiente
manera:
N N NR
k
S
k
DR S (4)
Se propone que una espora resistente NR sufre inactivación o muerte a un estado final
ND a través de un intermediario sensible NS.
Se establecen las ecuaciones diferenciales:
dN
dtk NR
R R (5)
dN
dtk N k NS
R R S S (6)
La solución a estas ecuaciones diferenciales simultáneas es:
tkexp
k
ktkexp
kk
k
N
NR
R
SS
SR
R
0
(7)
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA CINÉTICA DE MUERTE
Considerando la muerte térmica de los microorganismos de manera similar a las
reacciones químicas, la relación entre las constantes cinéticas y la temperatura
presenta un comportamiento análogo. La teoría más frecuentemente empleada es la
teoría de Arrhenius.
66
Esta relación se expresa matemáticamente como:
k AE
RT
exp (8)
ESTERILIZACIÓN POR LOTE
En el proceso de esterilización por lote el medio se coloca en el biorreactor y el
contenido se calienta a la temperatura de esterilización asignada. Para establecer la
relación entre tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuación (1). Sin embargo, k
durante la esterilización por lote no es constante ya que la temperatura durante el
calentamiento y enfriamiento varían. Incorporando el efecto de la temperatura
establecido por la ecuación de Arrhenius la ecuación queda:
TOTAL
tNo
NA
E
RTdtln exp
0
(9)
El símbolo representa el grado de destrucción en todo el proceso.
El ciclo de esterilización está formado por tres periodos:
Elevación de temperatura o calentamiento.
Mantenimiento de temperatura
Descenso de temperatura o enfriamiento.
El perfil temperatura–tiempo durante la fase de calentamiento es función de varios
factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea
inyección directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta mediante serpentines
o eléctricamente. El Cuadro 3 muestra las relaciones tiempo–temperatura de acuerdo a
la forma de transferencia de calor.
67
Cuadro 3. Relaciones tiempo–temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de calor
TIPO DE
TRANSFERENCIA DE
CALOR
RELACIÓN
TEMPERATURA–
TIEMPO
a y b
Adición de vapor al
medio
T Toat
bt
1
1
(Hiperbólica )
ahs
MToC
bs
M
Calentamiento con
dispositivo eléctrico
T To at 1
(lineal)
aq
MToC
Calentamiento con vapor
(intercambiador de calor)
T T beH
at 1
(exponencial)
aUa
MC
bTo T
T
H
H
Enfriamiento
(Intercambiador de calor)
T T be at
1
CW
aU
eMC
CWa 1
bTo T
T
68
OBJETIVO
El alumno diseñará el ciclo de esterilización para un medio de cultivo en un biorreactor.
MATERIAL
Biorreactor de 12 litros.
Cronómetro.
Cajas de Petri estériles.
Pipetas estériles.
Agar nutritivo.
Mechero.
Esporas de Bacillus stearothermophilus.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus stearothermophilus.
Establecer la temperatura de esterilización.
Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilización,
en intervalos de un minuto.
Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de
esterilización (No), al final del periodo de calentamiento (N1), al final del periodo
de mantenimiento (N2), y al final del periodo de enfriamiento (N3).
Obtener el flujo del agua de enfriamiento para calcular el gasto masa (W).
De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilución seriada y se
siembran por duplicado las últimas tres diluciones de la serie en cajas de Petri
69
utilizando la técnica de vaciado en placas. Se incuban a 30 ºC, hacer cuenta de
colonias cada 24 h, durante tres días.
En el cuadro 4 se muestran las diluciones sugeridas para cada una de las
muestras, las cuales pueden cambiar de acuerdo a las instrucciones del profesor.
Cuadro 4. Diluciones sugeridas a realizar para cada una de las muestras tomadas durante el ciclo de esterilización.
MUESTRA DILUCIONES
NO 10-1 a 10-8
N1 10-1 a 10-7
N2 10-1 a 10-6
N3 10-1 a 10-5
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
Presentar los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de esterilización en
un cuadro.
Graficar los perfiles para las etapas de calentamiento, mantenimiento y
enfriamiento.
Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en función
del tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.
Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (UiD) para las etapas de
calentamiento y enfriamiento.
Con los valores de No, N1, N2 y N3 determinar el grado de destrucción para el
calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el ciclo de esterilización .
En el periodo de mantenimiento determinar el valor de la energía de activación
conociendo el valor de la constante de Arrhenius: A = 7.49 X 1038 min-1.
70
Elaborar un cuadro de valores de (k) en función del tiempo y trazar la gráfica
correspondiente. Obtener el grado de destrucción para calentamiento,
mantenimiento, enfriamiento y total por integración gráfica en la curva anterior y
por algún método numérico.
En el caso de que la esterilización haya sido deficiente, recalcular el tiempo de
mantenimiento, suponiendo los criterios de diseño de calentamiento y
enfriamiento constantes y una población final de microorganismos viables de 10-3
(probabilidad de que en mil lotes de esterilización, uno resulte contaminado).
BIBLIOGRAFÍA
Abbot, F. J., Clamen, A. (1973). Biotechnol. Bioeng., 15:117-127.
Bailey, J. E., Ollis, D. F. (1977). Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill,
Inc.
Deindoerfer, F. H. y Humphrey, A. E. (1959), Appl. Microbiol. 7: 256-264.
Richards, J. W. (1961). Progress in Ind. Microbiol. 5: 143-173.
Wang, I. C. D., y col. (1979), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley, N. Y.
71
ANEXO 1
NOMENCLATURA
a’ - Área de transferencia de calor: calcularla experimentalmente
A - Constante de Arrhenius, min-1.
C - Calor específico del medio de cultivo, kcal/ kg C.
C’ - Calor específico del elemento enfriador, kcal / kg C.
E - Energía de activación, cal / g mol, kcal / kg mol.
h - Entalpía relativa al medio, kcal / kg (entalpía del vapor a la temperatura del
medio de cultivo).
k - Constante específica de velocidad de muerte, min. -1.
kR - Constante específica de inactivación de esporas resistentes.
ks - Constante específica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentración de microorganismos en el tiempo t.
No - Concentración de microorganismos to.
N1 - Concentración de microorganismos t1.
N2 - Concentración de microorganismos t2.
N3 - Concentración de microorganismos t3.
ND - Concentración de esporas inactivas.
NR - Concentración de esporas resistentes.
NS - Concentración de esporas sensibles.
q - Velocidad de transferencia de calor, kcal / s.
R - Constante universal de los gases, 1.98 cal / g Mol ºK.
s - Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t - Tiempo, min, h.
T - Temperatura absoluta ºK.
T0 - Temperatura inicial del medio ºK.
TH - Temperatura de la fuente de calentamiento ºK.
T - Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 ºK.
U - Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m2 h ºC.
W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente, kg/h.
72
PRÁCTICA 8
Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote
Producción de biomasa en
Cultivo por lote
INTRODUCCIÓN
Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: cerrados, abiertos y sistemas
semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente
desde el siglo antepasado, en el cual una vez iniciada la fermentación ya no existe
entrada ni salida de materiales.
Hasta la fecha la gran mayoría de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. Éste consiste en agregar al biorreactor un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
producción de un metabolito. El medio después de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentación se inoculará con el microorganismo para permitir su
desarrollo y producción del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o más nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentación se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.
73
Ya vacío el biorreactor se limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente
fermentación. La determinación de los parámetros cinéticos de un cultivo por lote tiene
la finalidad de conocer, predecir y controlar la fermentación misma. El cultivo por lote
tiene la particularidad de que todos los parámetros cinéticos varían con el tiempo de
fermentación. Los valores obtenidos de estos parámetros son lo suficientemente
confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente durante el proceso de
fermentación.
OBJETIVO
El alumno determinará los parámetros cinéticos de la levadura Saccharomyces
cerevisiae creciendo en condiciones óptimas en un cultivo por lote.
MATERIALES Y MÉTODOS
EQUIPO
Autoclave (15 l de capacidad).
Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
Biorreactor de 2 L de volumen de operación..
Electrodo de pH esterilizable.
Medidor controlador de pH.
Bombas peristáltica (0 a 2 l/h).
Placas de calentamiento y agitación.
Espectrofotómetro (rango: visible y UV).
Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad).
Estufa.
Equipo de filtración con vacío.
74
MICROORGANISMO Saccharomyces cerevisiae
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 40C.
MEDIOS DE CULTIVO
Cuadro 5. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365
NaH2PO4 1.2637 1.2637
Extracto de levadura 0.990 0.990
FeSO4 7H2O * *
CuSO4 5H2O * *
ZnSO4 H2O * *
Na2MoO4 2H2O * *
MnSO4 H2O * *
Emplear agua destilada
*NOTA.- Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen
(en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).
75
MÉTODOS ANALÍTICOS
Determinación de la concentración celular (x)
Para determinar la concentración celular se empleará una curva tipo de As = f
(concentración celular), que fue obtenida de acuerdo al siguiente procedimiento: La
curva tipo se obtuvo de la siguiente forma: A suspensiones de levadura de diferentes
concentraciones se les midió la absorbancia. Después, en membranas puestas
previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtración se les
adiciona 5 mL de suspensión levaduras y se filtró al vacío. Se separó el filtrado y el
paquete celular se lavó con 5 mL de agua destilada y se filtró nuevamente (este
segundo filtrado no se mezcló con el primero). El paquete celular lavado se colocó en
una estufa a 600C durante 24 horas. La concentración celular se calcula por diferencia
de pesos (todas las pesadas se hicieron en balanza analítica). Con los datos de
absorbancia y concentración celular de cada una de las suspensiones de levadura, se
obtuvo la curva tipo de As = f (concentración celular).
Entonces, para conocer la concentración de levaduras durante el cultivo en lote, basta
con tomar una muestra y determinar la absorbancia, para que con la curva tipo obtenga
la concentración celular. Si la absorbancia de la muestra es mayor que la más alta de la
curva tipo, entonces deberá hacer diluciones de su muestra para que el valor de
absorbancia este dentro del intervalo de la curva tipo.
Determinación de azúcares reductores por DNS
Reactivos: Un gramo de ácido 3,5- dinitrosalicílico se disuelve en 20 mL de NaOH 2N,
se agregan después 50 mL de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo
se lleva a un volumen de 100 mililitros.
Procedimiento: A 0.1 mL de la dilución del filtrado (1:10) se le adiciona 0.1 mL del
reactivo DNS, se coloca en baño maría a ebullición durante cinco minutos.
76
Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 1 mL de agua destilada. Se leen los tubos
a 540 nm. Se emplean dos controles de concentraciones de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa y
con el blanco de reactivos se ajusta a cero el espectofotómetro.
Curva tipo de glucosa: Elaborar una curva tipo de glucosa con volúmenes de 0.1 a 1 mL
de solución patrón de 1.0 g/L de glucosa.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
(Considerando un volumen de operación de 2 L)
PREPARACIÓN DEL INOCULO
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora
(150 rpm) a una temperatura de 35ºC durante 18 horas.
CULTIVO POR LOTE
Se preparan 1620 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el
pH a 4.0. El medio se carga en el biorreactor, previamente preparado, y se
esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan,
conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el álcali.
El biorreactor con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación,
venteo, agua de enfriamiento, etcétera y después se inocula con los dos
matraces del inoculo en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo
las siguientes condiciones:
77
Velocidad de agitación : 500 rpm
Aireación : 1 vvm
Temperatura : 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) : 3.8
Antiespumante (PPG-10%) : “de acuerdo a la formación de espuma”
Se tomarán muestras cada hora para la determinación de la concentración
celular por absorbancia y azúcares residuales por el método del DNS. Las
determinaciones se harán por duplicado. El cultivo por lote durará
aproximadamente 10 horas.
Procesamiento de muestras.
Las muestras se tratarán bajo el esquema de la Figura 4.
(10mL)
(3 mL) (5 mL)
Figura 4. Procesamiento de las muestras.
MUESTRA
Medir absorbancia Centrifugación
Filtrado Paquete celular
Determinación de
glucosa residual
Determinación de
concentración celular
usando la curva tipo
correspondiente
78
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
Presentar los resultados en el Cuadro 5 del Anexo 2, que está al final de la
presente práctica.
Presentar la curva tipo de concentración de glucosa.
Elaborar los siguientes gráficos:
o Concentración celular (x) contra tiempo (identificar las fases del crecimiento).
o Concentración residual de glucosa (s) contra tiempo.
o Logaritmo natural de la concentración celular contra tiempo (sólo para la fase
o exponencial).
Determinar los siguientes conceptos:
o Velocidad específica de crecimiento () a cada tiempo de cultivo.
o Velocidad específica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de cultivo.
o Velocidad específica de crecimiento máxima (max).
o Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo de
cultivo.
o Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yxs(global)).
o Constante de afinidad por el sustrato (Ks).
o Productividad celular global (Rx global).
Al final el alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica y elaborará un
resumen de la misma.
BIBLIOGRAFÍA
Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), “Variable-volumen continuous cultivation” en Biotechnol.
Bioeng.,17: 1805-1822.
79
Pirt, S. J. (1975), “Principles of microbial and cell cultivation” en Black Well Scientific
Publications, London.
Whitaker, A. (1980), “Fed-batch culture” en Process Biochem., 15:10-15.
Yamané, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol., 55:156-165.
ANEXO 2
Cuadro 6. Resultados del cultivo por lote
Día Hora Tiempo de
reacción
(h)
Concentración celular
(por absorbancia)
Glucosa residual
No. de tubo As Dilución g/L Tubo Lectura Dilución g/L
Curva tipo de biomasa
pendiente (m) =
ordenada (b) =
Reunir todas las muestras y aplicar el
método DNS, empleando dos
controles de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa
0.4 g/L _________
0.8 g/L _________
80
ANEXO 3
CULTIVO POR LOTE
ACTIVIDADES
Curva tipo de glucosa.
Preparación del medio de cultivo para el inoculo / esterilización / enfriamiento /
inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado / incubación durante
18 horas.
Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del
biorreactor / esterilización del biorreactor con medio de cultivo y esterilización del
álcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculación con los matraces al
biorreactor / arranque de la fermentación.
Toma de muestra cada hora del cultivo por lote / procesamiento de las muestras.
Descarga y lavado del biorreactor.
81
PRÁCTICA 9
Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado
Producción de biomasa en
Cultivo por lote alimentado
INTRODUCCIÓN
Generalmente los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: Sistemas
cerrados, Sistemas abiertos y Sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el
cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo XIX, en el cual una vez iniciada
la fermentación ya no hay entrada ni salida de nutrientes.
Los cultivos continuos (principalmente simple etapa, con recirculación y múltiple etapa)
pertenecen al segundo grupo, donde existe entrada (nutrientes) y salida de materiales
(nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).
En los sistemas semicerrados sólo ocurre entrada de nutrientes, pero no salida de
materiales, por lo que también se les conoce como sistemas de volumen variable.
También a este tipo de sistemas se les denomina genéricamente como cultivos Feed
batch (término introducido por Yoshida en 1973) porque operativamente inician con un
cultivo por lote y al finalizar éste, se inicia la alimentación de nutrientes al biorreactor. A
82
su vez, por la forma de suministro de los nutrientes pueden clasificarse en cultivos con
alimentación a flujo variable o flujo constante. A este último pertenece el cultivo objeto
de esta práctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. (o Feed batch Lineal).
Hasta antes de la década de los setentas, el cultivo Feed batch Lineal venía
empleándose empíricamente, pero diseñado, en principio, para ser más productivo que
el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt(2) reportó un tratamiento matemático de este
sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que
describen a las velocidades volumétricas de acumulación de materiales en el
biorreactor, es decir, la aplicación de la ecuación general de balance para biomasa,
sustrato y producto (Acumulación = Entrada - Salida + Generación).
Como toda resolución de sistemas de ecuaciones, la resolución del sistema de
ecuaciones diferenciales que describen este cultivo, nos dará las funciones (x, s, p) =
f(t), es decir, podremos conocer, a cualquier tiempo del cultivo los valores de la
concentración de biomasa, sustrato residual y del metabolito de interés. Dado que todas
las variables son dependientes del tiempo no existe solución analítica al sistema de
ecuaciones diferenciales, por lo que debe resolverse utilizando algún método numérico
(el más usual es el de Runge-Kutta de cuarto orden).
Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:
El suministro del sustrato limitante es mayor que lo demandado por el
microorganismo.
El suministro del sustrato limitante es menor que lo demandado por el
microorganismo.
En el primer caso puede existir acumulación y desacumulación de la concentración del
sustrato residual durante el tiempo necesario para alcanzar el volumen final del
biorreactor, y dependiendo de los valores del flujo de alimentación y de la concentración
83
del sustrato limitante pueden calcularse las concentraciones celular y de producto a
cualquier tiempo. Debido a este exceso en el suministro del sustrato limitante el
microorganismo crecerá a su máxima velocidad de crecimiento.
Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentración del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condición el microorganismo ajusta su maquinaria metabólica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitación en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.
También el cálculo de la concentración celular y de producto podrán determinarse
resolviendo el sistema de ecuaciones bajo las condiciones de este segundo caso,
cuyos resultados dependerán de los valores del flujo de alimentación y concentración
del sustrato limitante.
OBJETIVO
El alumno conocerá y realizará un cultivo por lote con alimentación constante
empleando Saccharomyces cerevisiae y comprobará que este sistema fermentativo es
de mayor productividad y rendimiento que el cultivo por lote.
MATERIALES Y MÉTODOS
EQUIPO
Autoclave (15 l de capacidad).
Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
Biorreactor con ambiente controlado (de 2 o 6 litros).
Electrodo de pH esterilizable.
Medidor controlador de pH.
84
Electrodo de oxígeno disuelto.
Medidor de oxígeno disuelto.
Dos bombas peristálticas (0 a 2 l/h).
Dos placas de calentamiento y agitación.
Espectrofotómetro (intervalo: visible y UV).
Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad).
Estufa con vacío.
Equipo de filtración con vacío.
MICROORGANISMO UTILIZADO: Saccharomyces cerevisiae
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 4ºC.
MEDIOS DE CULTIVO
Cuadro 7. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE
(g/L)
MEDIO PARA LA
ALIMENTACIÓN
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 40.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365 3.64
NaH2PO4 1.2637 1.2637 3.37
Extracto de levadura 0.990 0.990 2.64
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua destilada
85
*NOTA.- Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen
(en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 x concentrado de glucosa (g/L) x volumen medio (l)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).
MÉTODOS ANALÍTICOS
Determinación de la concentración celular (x)
Igual que en la práctica de cultivo por lote.
Determinación de azúcares reductores
Igual que en la práctica de cultivo por lote.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Preparación del inoculo
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 minutos. Se enfría. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora
(150 rpm) a una temperatura de 350C durante 18 horas.
Cultivo por lote
Se preparan 810 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH
a 4.0. El medio se carga en el biorreactor, previamente preparado, y se esteriliza
en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los
recipientes que contienen el antiespumante y el álcali.
86
El biorreactor con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación,
venteo, agua de enfriamiento, etcétera. y después se inocula con un matraz del
inoculo en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes
condiciones:
Velocidad de agitación : 500 rpm
Aireación : 1 vvm
Temperatura : 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) : 3.8
Antiespumante (PPG-10%) : “de acuerdo a la formación de espuma”
Se tomarán muestras sólo al inicio y al final del cultivo por lote, el cual durará 12
horas. A las muestras se les determinará concentración celular y glucosa residual
por el método del DNS.
Cultivo por lote alimentado constantemente (Feed-batch Lineal)
Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Feed Batch Lineal y se ajusta el
pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de dos litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adición y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in2 durante 15 min.
B) Se calibra la bomba peristáltica, previamente al paso anterior, a un flujo de 180 mL/h,
que será el flujo de adición para el cultivo alimentado.
C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estéril a la bomba peristáltica y a la entrada del biorreactor en
condiciones asépticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentación del medio
de cultivo. Esta adición terminará cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.
87
Este cultivo operará bajos las mismas condiciones de operación del cultivo por lote:
velocidad de agitación, aireación, T, pH, etcétera.
Se tomarán muestras cada hora, las cuales serán procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.
(10mL)
(3 mL) (5 mL)
Figura 5. Procesamiento de las muestras
MUESTRA
Medir absorbancia Centrifugación
Filtrado Paquete celular
Determinación de
glucosa residual
Determinación de
concentración celular
usando la curva tipo
correspondiente
88
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
Determinar max, Yx/s (global) y Rx (global) de Saccharomyces cerevisiae en el
cultivo por lote.
Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes gráficas (teóricas y
experimentales):
o Concentración celular (x) contra tiempo.
o Volumen de medio de cultivo alimentado (V) contra tiempo.
o Biomasa total (X) contra tiempo; donde X = xV.
o Glucosa residual (s) contra tiempo.
o Velocidad específica de crecimiento () contra tiempo.
Estimar los valores de la productividad celular global (Rx global) y el rendimiento
celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s global) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.
Al final el alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica y elaborará un
resumen de la práctica.
89
BIBLIOGRAFÍA
Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), “Variable-volumen continuous cultivation” en Biotechnol.
Bioeng., 17: 1805-1822.
Pirt, S. J. (1975), “Principles of microbial and cell cultivation” en Black Well Scientific
Publications, London.
Whitaker, A. (1980), “Fed-batch culture” en Process Biochem., 15:10-15.
Yamané, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
ofsubstrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol. 55:156-165.
90
ANEXO 4
Cultivo por lote alimentado constantemente
Flujo = 180 mL / hora
Cuadro 8. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente
Hora Tiempo
(h)
Volumen
Líquido
(L)
Concentración celular
(por absorbancia)
Glucosa residual
No. de tubo As Dilución g/L Tubo Lectura Dilución g/L
Curva tipo de biomasa
pendiente (m) =
ordenada (b) =
Reunir todas las muestras y aplicar el
método DNS, empleando dos
controles de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa
0.4 g/L _________
0.8 g/L _________
91
ANEXO 5
FEED–BATCH LINEAL
ACTIVIDADES
1. Preparación del medio de cultivo para el inoculo /esterilización /enfriamiento /
inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
2. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del
biorreactor / esterilización del biorreactor con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculación con los matraces al biorreactor / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
3. Preparación del medio de cultivo para la alimentación / esterilización en matraz
junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentación
constante (a un flujo previamente determinado) del medio al biorreactor.
4. Toma de muestras (cada hora) del cultivo alimentado / determinación de
absorbancia / determinación de peso seco / determinación de glucosa residual.
5. Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado
(preparación de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta graduada, etcétera).
92
PRÁCTICA 10
Páctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo
Producción de biomasa en
Cultivo continuo
INTRODUCCIÓN
El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas
Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales:
suministro continuo de nutrientes y salida continua de biomasa, sustrato residual y
producto. Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida, por lo que el
volumen de operación del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.
Fue en la década de los sesenta cuando se iniciaron los primeros estudios
experimentales y teóricos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la
Teoría del Quimiostato, la cual, a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen
constante en cultivo continuo, y después de un determinado tiempo (el necesario para
realizar dos o tres recambios del volumen de trabajo), éste alcanza un estado de
equilibrio dinámico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto
93
permanecerán constantes en el tiempo. Esta teoría también predice que cuando se
cambien los flujos de alimentación y remoción de caldo (los cuales a su vez deben ser
iguales entre sí para mantener la condición de volumen constante), el sistema se
alterará y finalmente alcanzará un nuevo equilibrio dinámico donde las concentraciones
de biomasa, sustrato residual y producto ya no variarán en el tiempo, pero sus valores
serán más o menos los mismos independientemente de los flujos. Sin embargo,
también predice que cuando los flujos de trabajo son más elevados que el valor de la
velocidad específica máxima de crecimiento, el sistema se quedará sin células,
condición conocida como lavado del biorreactor, debido a que se ha rebasado la
capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados
a altas velocidades.
En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo), una vez que se ha
alcanzado el estado de equilibrio se crean ambientes constantes que permiten
mantener indefinidamente un determinado estado fisiológico del microorganismo y en
este estado la velocidad específica de crecimiento es constante y por ende lo son
también el resto de las velocidades específicas de consumo de sustrato, de producción
del metabolito, de consumo de oxígeno y de generación de calor.
Así, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterización cinética de la
producción de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un
determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.
Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella
velocidad específica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor
cantidad de aquel metabolito que se desea obtener, siendo ésta la principal
característica por la que fueron diseñados los sistemas de fermentación continuos.
94
OBJETIVO
El alumno determinará los parámetros cinéticos de Saccharomyces cerevisiae
creciendo en condiciones óptimas en un cultivo continuo.
MATERIALES Y MÉTODOS
EQUIPO
Autoclave (15 litros de capacidad).
Baño metabólico de temperatura controlada.
Biorreactor con panel de control (2 o 6 litros).
Electrodo de pH esterilizable.
Electrodo de oxígeno disuelto.
Tres bombas peristálticas (0 a 2 l/h).
Dos placas de calentamiento y agitación.
Espectrofotómetro (intervalo: 200 a 700 nm).
Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad).
Estufa con vacío.
Equipo de filtración con vacío.
MICROORGANISMO UTILIZADO: Saccharomyces cerevisiae
La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 40C.
95
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Cuadro 9. Medios de cultivo
COMPONENTE
MEDIO PARA
EL INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
POR LOTE
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO
CONTINUO
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 20.0
(NH4)2SO4 2.73 2.73 1.82
NaH2PO4 1.2637 1.2637 1.685
Extracto de levadura 0.990 0.990 1.32
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua destilada
*NOTA.- Todas las sales están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en
mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 [conc. de glucosa (g/L)] [volumen medio (l)]
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).
MÉTODOS ANALÍTICOS
Determinación de la concentración celular
Procedimiento: el mismo de la Práctica 8.
96
Determinación de azúcares reductores (DNS)
Reactivos: los mismos de la Práctica 8.
Procedimiento: el mismo de la Práctica 8.
Curva tipo de glucosa: la misma de la Práctica 8.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DEL INOCULO
Se preparan 200 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 100 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo de medio inclinado en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una
agitadora (110 golpes/minuto) a 350C durante 18 horas.
CULTIVO POR LOTE
Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH
a 4.0. El medio preparado se pasa al biorreactor (previamente preparado este
último) y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 minutos. También se
esterilizan los recipientes que contienen el álcali y el antiespumante.
El biorreactor cargado con el medio estéril se coloca en el sistema de agitación,
venteo, agua de enfriamiento, etcétera y después se inocula con un matraz del
inoculo en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las condiciones
descritas en el Cuadro 9.
97
Cuadro 10. Condiciones de cultivo
PARÁMETROS CONDICIONES
Velocidad de agitación 500 rpm
Aireación 1 vvm
Temperatura 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) 3.8
Antiespumante Polipropilenglicol al 10%
Se tomarán muestras al inicio y al final del cultivo por lote y éste durará 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentración celular por peso seco (por filtración) y
sustrato residual por el método del DNS.
CULTIVO CONTINUO
Se preparan 3.0 litros de medio de cultivo para el cultivo continuo y se ajusta el
pH a 3.8. El medio se prepara en un recipiente que lo contenga totalmente, y se
esteriliza junto con mangueras y conexiones a 15 lb/in2 durante 15 minutos. Esta
misma cantidad de medio de cultivo se prepara y esteriliza para cada velocidad
de dilución.
Previamente al paso anterior se calibra la bomba peristáltica, que adicionará el
medio de cultivo, a un flujo de 0.1 l/h para la 1ª velocidad de dilución.
Para las restantes velocidades de dilución (D) la bomba se calibrará a los
siguientes flujos:
D (h-1) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
F (L/h) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
98
Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del
recipiente que contiene el medio estéril a la bomba, y al puerto de suministro del
biorreactor en condiciones asépticas.
Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo
al biorreactor. El fluido de salida se recibe en otro recipiente, el cual es marcado
con la hora a la cual se inició el suministro de medio (el fluido de salida sale a
través del tubo capilar colocado previamente en el biorreactor).
El cultivo continuo operará en todas las velocidades de dilución bajo las mismas
condiciones de agitación (500 rpm), aireación (1 vvm), temperatura (35 ºC), pH
(3.8) y control de la espuma.
Se recomienda que cinco minutos antes de terminar la adición de todo el medio
de cultivo para la primera velocidad de dilución, se tome muestra para la
determinación de concentración celular y glucosa residual.
Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilución restantes.
También se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la
concentración de glucosa.
Al finalizar la adición de todo el medio del cultivo para la primera velocidad de
dilución, se inicia inmediatamente la adición del siguiente medio de cultivo
(preparado y esterilizado previamente) para la segunda velocidad de dilución y al
segundo flujo de adición. Esto mismo se repite para las velocidades de dilución
restantes.
En cada velocidad de dilución tomar una pequeña muestra para observarla al
microscopio y detectar cualquier contaminación. Si esto ocurre, detener la
fermentación y repetir la velocidad de dilución que se estaba trabajando.
99
FORMULACIÓN DE RESULTADOS
Determinar Yx/s (global) y Rx (global) de Saccharomyces cerevisiae en el cultivo
por lote.
Para el cultivo continuo elaborar lo siguiente:
o Tabular los valores de concentración celular (x), glucosa residual (s),
rendimiento celular en base al consumo de sustrato (Yx/s), velocidad
específica de consumo de sustrato (qs) y la productividad celular (Rx) en
función de la velocidad de dilución (D).
o Gráfica de la concentración celular (x) contra velocidad de dilución (D).
o Gráfica de la concentración de glucosa residual (s) contra velocidad de
dilución (D).
o Gráfica de la productividad celular (Rx ) contra velocidad de dilución (D).
o Gráfica de la velocidad específica de consumo de sustrato (qs) contra
velocidad de dilución (D):
Obtención de los valores de (m) y (Yg).
o Gráfica de la velocidad específica de consumo de oxígeno (qo2) contra
velocidad de dilución (D).
Determinación de (mos) y (Yog).
si Hglucosa = 3.74 kcal/g ; Hcelulas = 5.61 kcal/g
o Gráfica de la velocidad específica de genración de calor (qk) contra velocidad
de dilución (D).
Determinación de (mk) y (Ykg).
Al final el alumno discutirá los resultados obtenidos en la presente práctica y
elaborará un resumen de la presente práctica.
BIBLIOGRAFÍA
1. Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., et al. (1978), Fermentation and enzyme
technology, John Wiley and Sons.
100
2. Tempert, D. W. (1970), The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of
the Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2, Academic. Press.
3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. (1956), “The continuous culture of bacteria; a
theoretical and experimental study”, Journal of Microbiology, 14: 601-622.
ANEXO 7
CULTIVO CONTINUO
ACTIVIDADES
Preparación del medio de cultivo para el inoculo / esterilización / enfriamiento /
inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del
biorreactor / esterilización del biorreactor con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculación con los matraces a el biorreactor / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
Preparación del medio de cultivo para cada velocidad de dilución / esterilización
en matraz junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento /
alimentación (a un flujo previamente determinado) del medio al biorreactor.
Toma de muestras, 10 minutos antes de terminar la correspondiente velocidad
de dilución / determinación de absorbancia / determinación de peso seco /
determinación de glucosa residual.
Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado para cada
velocidad de dilución (preparación de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta
graduada, etcétera).
