Embed Size (px)
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
LUKA ŠIATKUTĖ
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L.
MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Vadovė:
prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
KAUNAS, 2015
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis,
Data
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L.
MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
Data
Recenzentas
...................................................
...................................................
Data
Darbo vadovė
prof. dr. Nijolė Savickienė
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Luka Šiatkutė
Data
KAUNAS, 2015
3
TURINYS
SANTRAUKA .............................................................................................................................................................. 5
SUMMARY .................................................................................................................................................................. 7
SANTRUMPOS .......................................................................................................................................................... 10
ĮVADAS ...................................................................................................................................................................... 11
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ......................................................................................................................... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................................... 14
1.1. Augalų baltymai ir jų funkcijos ........................................................................................................................ 14
1.2. Augalų baltymų antioksidantinis aktyvumas.................................................................................................... 14
1.3. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminė sudėtis ................................................................................................ 15
1.4. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymai ............................................................................................................ 16
1.5. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas ........................................... 17
1.6. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų kokybinė – kiekybinė analizė ....................................................................... 18
1.6.1. Baltymų frakcionavimas ............................................................................................................................ 18
1.6.2. Kokybinis baltymų nustatymas ................................................................................................................. 20
1.6.3. Baltymų kiekybinis nustatymas ................................................................................................................. 22
1.7. Vaisto formos su baltymais .............................................................................................................................. 23
1.8. Kietųjų kapsulių gamyba .................................................................................................................................. 24
1.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas ......................................................................................................................... 26
2. TYRIMO METODIKA ........................................................................................................................................... 28
2.1. Tyrimo medžiagos ............................................................................................................................................ 28
2.1.1. Reagentai ................................................................................................................................................... 28
2.1.2. Reagentų paruošimas ................................................................................................................................. 29
2.1.3. Įranga ......................................................................................................................................................... 31
2.2. Tyrimo metodai ................................................................................................................................................ 31
2.2.1. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas ....................................................................................... 31
2.2.2. Baltymų frakcionavimas ............................................................................................................................ 32
2.2.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas ....................................................................................................... 33
2.2.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas ................................................................................................... 35
2.2.5. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų gamyba ir kapsulių masės
vienodumo nustatymas ........................................................................................................................................ 36
4
2.2.6. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas ............................................................................................ 37
2.2.7. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais antioksidantinio aktyvumo nustatymas ................ 38
2.2.8. Statistinis duomenų vertinimas................................................................................................................. 39
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ..................................................................................................... 40
3.1. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas .......................................................................... 40
3.2. Baltymų frakcionavimas ................................................................................................................................... 41
3.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas.............................................................................................................. 42
3.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas NaDS-PAGE metodu ....................................................................... 43
3.5. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais gamyba ir atsipalaidavimas ......................................... 44
3.6. Kietųjų kapsulių antioksidantinio aktyvumo nustatymas ................................................................................. 45
4. IŠVADOS ................................................................................................................................................................ 46
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS TOLIMESNIEMS TYRIMAMS ................................................................. 47
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ................................................................................................................................... 48
7. PRIEDAI ................................................................................................................................................................. 54
5
SANTRAUKA
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA
PURPUREA L. MOENCH) ŠAKNŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS
TYRIMAS, KAPSULIAVIMAS BEI ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO NUSTATYMAS
Lukos Šiatkutės magistro baigiamasis darbas. Darbo vadovė – prof. dr. Nijolė Savickienė1.
Konsultantas – prof. Arūnas Savickas2.
1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra, Kaunas.
2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės
farmacijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas: Kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių
šaknų, pagaminti kietąsias kapsules su šiais baltymais ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti, ar baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pasižymi
antioksidantiniu aktyvumu. 2. Išskirstyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, į atskiras
frakcijas pagal molekulių dydį. 3. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, koncentraciją. 4.
Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, molekulinę masę. 5. Pagaminti kietąsias kapsules su
baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, bei įvertinti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų
kapsulių. 6. Įvertinti kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų,
antioksidantinį aktyvumą.
Darbo metodai: 1. Baltymų antioksidantinis aktyvumas nustatytas 2,2-azino-bis-(3-
etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalų-katijonų surišimo metodu. 2. Baltymai išskirstyti,
naudojantis gelchromatografijos metodu. 3. Kiekybiškai baltymų koncentracija frakcijose nustatyta
spektrofotometriniu Bradford metodu. 4. Baltymų molekulių dydis nustatytas natrio dodecilsulfato
poliakrilamido gelio elektroforezės (NaDS-PAGE) metodu. 5. Kietosios kapsulės gamintos, naudojant
rankomis pildomą kapsuliavimo mašinėlę. Atliktas kietųjų vaisto formų tirpimo testas krepšelio metodu.
6. Kietųjų kapsulių antioksidantinis aktyvumas įvertintas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu.
Tyrimo rezultatai: 1. 100 µl baltymų, išskirtų iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, tirpalo suriša
53,59 ± 2,65 proc. ABTS radikalų-katijonų. 2. Baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pagal
molekulių dydį suskirstyti į 38 frakcijas. 3. Gelchromatografijos metodu išskirstytose baltymų frakcijose
nustatytas baltymų kiekis svyravo nuo 1,259 ± 0,097 µg/ml iki 6,068 ± 0,417 µg/ml. 4. Daugiausiai
6
baltymų turinčiose frakcijose nustatytos 14, 25, 30, 35, 36 ir 120 kDa baltymų molekulinės masės. 5.
Didžiausias baltymų atsipalaidavimas iš pagamintų kietųjų kapsulių stebimas po 60 min (25,73 ± 0,793
proc). 6. Didžiausias baltymų antioksidantinis aktyvumas – 22,00 ± 1,56 proc., stebėtas, praėjus 15 min
nuo kietųjų kapsulių tirpimo pradžios.
Išvados: 1. Baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, geba surišti ABTS radikalus-
katijonus. 2. Gelchromatografijos metodas nebuvo selektyvus, atskiriant visus baltymus, nes dalis baltymų
atsiskyrė tik dalinai. 3. Didžiausia baltymų koncentracija nustatyta keturiose gelchromatografijos
pradžioje atsiskyrusių baltymų frakcijose, atitinkamai 6,068 ± 0,417 µg/ml, 5,956 ± 0,317 µg/ml, 5,083 ±
0,709 µg/ml ir 4,663 ± 0,094 µg/ml. 4. Frakcijose, kuriose nustatytas didžiausias baltymų kiekis,
identifikuoti nuo 14 iki 35 kDa baltymai. Taip pat aptiktas nedidelis kiekis 120 kDa molekulinės masės
baltymo. 5. Rausvažiedžių ežiuolių baltymai iš kietųjų kapsulių atsipalaiduoja tik dalinai, iki 25,73 ±
0,793 proc. baltymų. 6. Kapsuliuotų rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas
susilpnėja.
Reikšminiai žodžiai: Echinacea purpurea L. Moench, ABTS, augalų baltymai,
gelchromatografija, Bradford, NaDS-PAGE.
7
SUMMARY
QUANTITATIVE AND QUALITATIVE ANALYSIS, CAPSULATION
AND DETERMINATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF
PROTEINS FROM ECHINACEA PURPUREA L. MOENCH ROOTS
Master thesis of Luka Šiatkutė. Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė,
Professor, Ph. D1.
Consultant: Arūnas Savickas, Professor, Ph. D2.
1Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences,
Kaunas, Lithuania.
2Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian
University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania.
Aim of experiment: To analyse proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots by quantity
and quality, prepare hard capsules and determine antioxidant activity.
Experiment tasks: 1. To determine antioxidant activity of proteins from Echinacea purpurea L.
Moench roots. 2. To separate proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots into fractions according
to their molecular size. 3. To measure the amount of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots
in prepared fractions. 4. To determine the molecular mass of proteins from Echinacea purpurea L.
Moench roots. 5. To prepare hard capsules of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots and
evaluate protein release from prepared hard capsules. 6. To determine antioxidant activity of prepared
hard capsules with proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots.
Methods: 1. The antioxidant activity of proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots was
determined with ABTS radical scavenging assay. 2. Proteins were fractionated by gel filtration
chromatography. 3. The amount of proteins was measured with Bradford Microassay. 4. The molecular
mass of proteins was determined with sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. 5. Hard
capsules were prepared using hand-operated filling machine. Protein release from hard capsules was
evaluated by in vitro dissolution test. 6. The antioxidant activity of hard capsules with proteins was
determined using ABTS radical scavenging assay.
Results: 1. 100 µL of protein fraction from Echinacea purpurea L. Moench roots scavenges
53.59 ± 2,65 percent of ABTS free radicals. 2. Proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots were
separated into 38 fractions according to their size. 3. The amount of proteins in fractions was 1.259 ±
8
0.097 µg/mL – 6.068 ± 0.417 µg/mL. 4. The molecular mass of proteins in prepared fractions was 14, 25,
30, 35, 36 and 120 kDa. 5. The highest amount of proteins (25.73 ± 0.793 percent) released from hard
capsules obtained after 60 minutes of in vitro dissolution experiment. 6. The highest antioxidant activity
of hard capsules with proteins (22.00 ± 1.56 percent) obtained after 15 minutes of in vitro dissolution
experiment.
Conclusions: 1. Proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots possess antioxidant activity.
2. Gel filtration chromatography is not selective enough to fractionate proteins from Echinacea purpurea
L. Moench roots, because not all proteins fractionated thoroughly due to their similarity of molecular size.
3. The highest amount of proteins was measured in the first four fractions: 6.068 ± 0.417 µg/mL, 5.956 ±
0.317 µg/mL, 5.083 ± 0.709 µg/m and 4.663 ± 0.094 µg/mL. 4. Proteins with molecular mass from 14 to
35 kDa were estimated in fractions with the highest amounts of proteins. Traces of 120 kDa protein were
determined as well. 5. Proteins release from hard capsules is poor (only 25.73 ± 0.793 percent). 6.
Encapsulated proteins from Echinacea purpurea L. Moench roots lose their antioxidant activity.
Key words: Echinacea purpurea L. Moench, proteins of plants, Size Exclution Chromatography,
Braford Microassay, SDS-PAGE.
9
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju mokslinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei bei prof. habil. dr.
Arūnui Savickui už visokeriopą pagalbą, patarimus bei neišsenkančią kantrybę magistrinio darbo rengimo
metu.
Taip pat noriu padėkoti Vilniaus Biotechnologijų Instituto mokslininkams, ypatingai Gitanai
Mickienei ir Editai Mištinienei, už bendradarbiavimą, konsultacijas ir suteiktas galimybes atlikti
mokslinius tyrimus.
10
SANTRUMPOS
ABTS●+ 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (angl. 2,2'- azino-bis(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) katijoninis radikalas
Akrilamido-BIS N,N′-Metilen – bis - akrilamidas
AGB Arabinogalaktano baltymas
BCR Bicinchoninė rūgštis (angl. Bicinchoninic acid)
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (angl. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
Ph. Eur. Europos Farmakopėja
JSA Jaučio serumo albuminas
HPC Hidroksipropilceliuliozė
MS Masių spektroskopija
m/z Masės – krūvio santykis
NaDS Natrio dodecilsulfatas
NaDS-PAGE Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (angl. Sodium dodecyl
sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
PBS Fosfatinis buferis (angl. Phosphate-buffered saline)
SN Standartinis nuokrypis
TMEDA N,N,N',N'-Tetrametiletan-1,2-diaminas (angl. N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-
diamine)
TRIS Tris(hidroksimetil)aminometanas (angl. Tris (hydroxymethyl)aminomethane)
TRIS-HCl Tris(hidroksimetil)aminometano ir druskos rūgšties buferis
11
ĮVADAS
Šio tyrimo objektas – iš rausvažiedžių ežiuolių (Echinacea purpurea L. Moench) šaknų išskirti
baltymai. Echinacea purpurea L. Moench yra astrinių (lot. Asteraceae) šeimos augalas, tradiciškai
vartojamas įvairių viršutinių kvėpavimo takų infekcijų pagalbiniam gydymui ar profilaktikai. Augalas
pasižymi imunomoduliuojančiu, antimikrobiniu, antivirusiniu, priešuždegiminiu bei antioksidantiniu
poveikiais. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės žaliavos – šaknų, farmakologinius poveikius apsprendžia
biologiškai aktyvūs junginai - alkamidai, įvairūs kavos rūgšties dariniai, polisacharidai ir glikoproteinai
[1].
Baltymai yra pirminiai augalų metabolitai, atliekantys gyvybiškai svarbias funkcijas. Nustatyta,
jog rausvažiedžių ežiuolių baltymai ir glikoproteinai turi įtakos imunostimuliaciniam ir priešvirusiniam
aktyvumui [2, 3, 4]. Pastaruoju metu išaugo susidomėjimas augalų baltymų antioksidantinėmis savybėmis.
Būtent, ši priežastis paskatino atlikti rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinio aktyvumo tyrimus.
Antioksidantinis aktyvumas ir farmakologiniai augalinio ekstrakto poveikiai priklauso nuo vaisto
formos. Kietosios kapsulės yra viena populiariausių vaistų formų. Jas lengva pagaminti, o gamyba
nereikalauja daug pagalbinių medžiagų, sudėtingų įrengimų ir neužima daug laiko. Kietosios kapsulės
pasižymi geru biopasisavinimu, be to, sukapsuliuoti galima net ir tokias medžiagas, su kuriomis sudėtinga
pagaminti tabletes. Taip pat kietosios kapsulės yra viena tinkamiausių vaisto formų klinikiniams tyrimams
atlikti [5].
Magistrinio darbo tyrimas yra dalis bendro Lietuvos – Baltarusijos projekto „Naujų augalinės
kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius imunomoduliatorius
ir citostatikus“ (Nr. TAP-LB-12-006), atlikto bendradarbiaujant su Baltarusijos Valstybinės mokslų
akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu. Tyrimo metu tirta Baltarusijos
mokslininkų paruošto rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymų tirpalo kokybinė bei kiekybinė
sudėtis. Pirmą kartą tirtas baltymų, išskirtų iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, antioksidantinis aktyvumas.
Taip pat pirmą kartą rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymams pritaikyta farmacinė forma. Magistrinio
darbo tikslas pasiektas, atliekant baltymų tirpalo kiekybinę ir kokybinę analizę spektrofotometriniu
Bradford metodu bei natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforeze. Baltymų antioksidantiniam
aktyvumui nustatyti naudotasmodelinio ABTS radikalo-katijono surišimo metodas. Taip pat buvo
pagamintos kietosios kapsulės, praturtintos rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymais. Tirtas
baltymų atsipalaidavimas iš kapsulių krepšelio metodu bei atliktas kapsulių antioksidantinio aktyvumo
nustatymas ABTS metodu.
12
Magistrinio darbo tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Farmakognozijos
katedroje, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje bei Vilniaus Biotechnologijų institute.
Šiuo metu tęsiami kapsuliuotų rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymų biologinio
aktyvumo tyrimai.
Tyrimo metu buvo paruošta publikacija žurnalui Acta Pharmaceutica tema „Fractionation and
determination of proteins in Echinacea purpurea (L.) Moench roots“ (Gabriele Balčiūnaitė, Jovita
Juodsnukytė, Arūnas Savickas, Ona Ragažinskienė, Luka Šiatkutė, Gitana Žvirblytė, Edita Mištinienė,
Nijolė Savickienė).
Tyrimo rezultatai žodiniu pranešimu pristatyti 2014 metais vykusioje Studentų Mokslininkų
Draugijos organizuotoje Jaunųjų Mokslininkų ir Tyrėjų Konferencijoje, tema „Baltymų frakcijų,
praturtintų lektinais, išskirtų iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus
L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Be to, 2014 metais vykusioje
tarptautinėje konferencijoje “The 5th
International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy
Practice“ buvo pristatytas stendinis pranešimas „Determination of antioxidant activity of capsules with
proteins isolated from Echinacea purpurea (L.) Moench roots and rhizomes“.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: Rausvažiedžių ežiuolių baltymų, išskirtų iš džiovintų šaknų, tirpalas, kurį
paruošė Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos
instituto mokslininkai.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Nors yra vykdyti rausvažiedžių ežiuolių sultyse
esančių baltymų kokybinės – kiekybinės sudėties tyrimai, tačiau trūksta mokslinės informacijos apie
augalo džiovintų šaknų baltymus. Taip pat nėra tirtas rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymų
antioksidantinis aktyvumas. Be to, iki šiol nėra pagaminta jokia vaisto forma su rausvažiedžių ežiuolių
baltymais.
Darbo tikslas: Kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių
šaknų, pagaminti kietąsias kapsules su šiais baltymais ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti, ar baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, pasižymi antioksidantiniu
aktyvumu.
13
2. Išskirstyti baltymus, išskirtus iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, į atskiras frakcijas pagal
molekulių dydį.
3. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, koncentraciją.
4. Nustatyti baltymų, esančių atskirose frakcijose, molekulinę masę.
5. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, bei
įvertinti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
6. Įvertinti kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų,
antioksidantinį aktyvumą.
14
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Augalų baltymai ir jų funkcijos
Baltymai yra vieni svarbiausių junginių visuose gyvuose organizmuose, atliekantys daug įvairių
funkcijų. Augalų baltymai priskiriami pirminiams metabolitams, kurie yra būtini ląstelių veiklai [6]. Taip
pat yra žinoma, jog baltymai svarbūs augalų apsauginiams mechanizmams bei dalyvauja fotosintezėje.
Pavyzdžiui, nuo kalcio priklausomos baltyminės kinazės padeda augalui reaguoti į įvairius vidinius ir
išorinius pavojus bei stresines būkles, tokias kaip šaltis, druskos ar sausros [7, 8]. Nustatytas augalų
atsparumo baltymas (anlg. resistance protein), kuris atpažįsta ligos sukelėją ir aktyvuoja tolimesnius
augalo apsauginius mechanizmus. Jis ypatingas tuo, jog geba atpažinti specifiškas patogeno išskiriamas
molekules, kurių neatpažįsta transmembraniniai receptoriai, turintys tą pačią funkciją [9, 10].
Baltymai dalyvauja augalų vykdomoje fotosintezėje. Tilakoidų membranose randami baltymai,
kurie prisijungia chlorofilą ir yra susiję su fotosistemomis I ir II. Be to, nustatyta, jog chlorofilą
prijungiantis baltymas pasižymi fotoapsauginėmis savybėmis ir apsaugo chlorofilą sausrų metu nuo
oksidacijos [11]. Taip pat baltyminiai fermentai dalyvauja vandens skaidyme ir ATP gamyboje [12].
1.2. Augalų baltymų antioksidantinis aktyvumas
Antioksidantai apibūdinami kaip medžiagos, gebančios apsaugoti kitas lengvai
besioksiduojančias medžiagas nuo laisvųjų radikalų žalingo poveikio [13]. Antioksidantai skirstomi į
pirminius, antrinius, sinergistinius ir mišrius. Pirminiai antioksidantai stabilizuoja laisvuosius radikalus,
perduodami jiems vandenilio joną arba laisvą elektroną. Antriniai antioksidantai stabilizuoja lipidų
peroksidus. Tuo tarpu sinergistiniai antioksidantai gali regeneruoti pirminius ir taip sustiprinti jų poveikį
arba gali veikti kaip chelatoriai bei inaktyvuoti laisvą deguonį [14].
Nustatyta, jog baltymai, peptidai, amino rūgštys ir baltymų hidrolizatai pasižymi
antioksidantinėmis savybėmis ir geba apsaugoti lipidus nuo oksiduojančių medžiagų poveikio [14, 15].
Baltyminiai antioksidantai gali veikti tiek kaip metalų chelatoriai, tai yra sinergistiniai antioksidantai, tiek
kaip laisvųjų radikalų stabilizatoriai – pirminiai antioksidantai [16, 17].
15
Baltymų antioksidantinį aktyvumą lemia amino rūgštys, tiksliau, jų šoniniai radikalai. Visos
amino rūgštys geba sąveikauti su laisvaisiais radikalais, priklausomai nuo jų energijos, tačiau svarbiausios
yra tos, kurios turi arba nukleofilinį sieros atomą, arba aromatinį radikalą [15].
Tyrimų metu įrodyta, jog baltymas, išskirtas iš Solanum torvum Sw. sėklų, pasižymi
antioksidantiniu aktyvumu. Nustatyta, kad šis baltymas geba surišti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH)
radikalus 76 proc., taip pat įvertintos redukcinės ir chelatinės savybės [18]. Tuo tarpu baltymo, išskirto iš
Phyllanthus niruri L. žolės, antioksidantinis aktyvumas įrodytas, pasitelkiant ketvirtinio butilo
hidroperoksidą, kurio pagalba laboratorinių pelių kepenų ląstelėms buvo sukeltas oksidacinis stresas.
Nustatyta, jog prieš oksidaciją paveikus hepatocitus baltymu, išskirtu iš Phyllanthus niruri L. žolės,
hepatocitų gyvybingumas išlieka 97 proc., o nepaveiktų – mažiau nei 50 proc. Taip pat įrodytas šio
baltymo apsauginis poveikis ląstelėms bei gebėjimas slopinti reaktyvių deguonies formų susidarymą [19].
Geranium sibiricum Linne glikoproteinas taip pat pasižymėjo savybe slopinti reaktyvias deguonies formas
[20].
Aptarti tyrimai rodo, jog baltymai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu ir geba apsaugoti audinius
nuo oksidacinio streso.
1.3. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminė sudėtis
Rausvažiedžių ežiuolių šaknys yra farmakopėjinė žaliava, aprašyta straipsnyje Ph. Eur.
01/2008:1824. Tai yra sudžiovinta, vientisa arba susmulkinta požeminė Echinacea purpurea L. Moench
augalo dalis. Kokybiškoje žaliavoje kaftarino ir cikoro rūgščių suma turi būti ne mažesnė nei 0,5 proc.
[21]. Kiti rausvažiedžių ežiuolių šaknų cheminiai junginiai bei jų procentinė dalis vaistinėje žaliavoje
surašyti 1 lentelėje.
1 lentelė. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai [1, 2, 21,
22].
Junginių grupė Pagrindiniai
biologiškai aktyvūs junginiai Kiekis procentais
Kavos rūgšties dariniai Cikoro rūgštis, kaftaro rūgštis,
echinakozidas ir kt. 2,0 – 2,8 proc.
Alkamidai Izobutilamidai 0,01 – 0,7 proc.
Polisacharidai Arabinogalaktanas, inulinas Nėra tirta.
16
Baltymai ir glikoproteinai Arabinogalaktaną
prijungiantis baltymas (AGB) Nėra tirta.
Eteriniai aliejai Kariofilenas, limonenas,
kamfenas 0,1 proc.
Polifenoliniai junginiai –
flavonoidai Kvercetinas, rutinas 0,48 proc.
Pirolizidiniai alkaloidai Tusilaginas, izotusilaginas 0,006 proc.
Poliacetilenai trideka-1-en-3,5,7,9,10-
pentaienas, pontikaepoksidas Nėra tirta.
1.4. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymai
Literatūros šaltiniuose galima rasti duomenų apie rausvažiedžių ežiuolių šaknyse nustatytus 17,
21, 30 bei 120 kDa molekulinės masės glikoproteinus. Pirmus tris glikoproteinus sudaro apie 3 proc.
baltymų su vyraujančiomis aspartato, glicino, glutamino ir alanino amino rūgštimis. Pagrindiniai šių
glikoproteinų cukrūs yra arabinozė, galaktozė ir gliukozaminas [2]. Tuo tarpu 120 kDa molekulinės masės
glikoproteinas yra vadinamas arabinogalaktaną prijungiančiu baltymu (AGB), kadangi apie 90 proc.
molekulės sudaro labai šakota polisacharidų grandinė, susidedanti iš galaktozės ir arabinozės (santykiu
1,8:1). Likusius 10 proc. sudaro baltymas, kuriame dominuoja glutaminas, asparaginas, hidroksiprolinas,
serinas, treoninas bei alaninas [2, 3, 23]. AGB atsakingas už augalo ląstelių augimą, dalijimąsi bei
apoptozę [3].
Rausvažiedžių ežiuolių glikoproteinai yra siejami su augalo imunomoduliacinėmis savybėmis
[2]. Vandeniniai rausvažiedžių ežiuolių ekstraktai, praturtinti glikoproteinais, aktyvina B ląsteles (B
limfocitus) bei skatina interleukino-1, auglio nekrozės faktoriaus α ir interferono αB išsiskyrimą
makrofaguose [1, 24, 25]. Tyrimais in vitro įrodytas AGB gebėjimas aktyvuoti komplemento sistemą bei
jungtis prie žmogaus leukocitų. Vis dėlto lyginant AGB, išskirtus iš Baptisia tinctoria ir Echinacea
pallida šaknų bei Echinacea purpurea ląstelių kultūros, nustatyta, jog Echinacea purpurea AGB
silpniausiai skatina imunoglobulino M ir interleukino-6 gamybą bei pelių limfocitų proliferaciją [3].
Tyrimų metu išaiškinta, jog AGB imunostimuliaciniam aktyvumui labai svarbios arabinozės šoninės
grandinės. Panaikinus šias molekulės dalis, AGB glikoproteinas praranda gebėjimą aktyvuoti
komplemento sistemą [3, 26].
17
Echinacea purpurea L. Moench šaknyse esantys glikoproteinai pasižymėjo netiesioginiu
antivirusiniu aktyvumu. Eksperimentai atlikti su pelių blužnies ląstelių kultūromis, tiriant interferonų α ir
β priešvirusinį aktyvumą [4].
1.5. Rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas
Yra žinoma, jog ežiuolės genties augalų, tokių kaip Echinacea angustifolia (DC.) Hell.,
Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. bei Echinacea purpurea (L.) Moench šaknų ekstraktai pasižymi stipriu
antioksidantiniu aktyvumu [27, 28]. Mokslinės literatūros duomenimis pagrindiniai Echinacea purpurea
L. Moench šaknų biologiškai aktyvūs junginiai, nulemiantys antioksidantinį aktyvumą, yra fenoliniai
junginiai, tokie kaip cikoro bei kavos rūgštys, taip pat flavonoidai, alkamidai bei kai kurie polisacharidai
[2, 29]. Vykdyti tyrimai su metanoliniais ežiuolės genties augalų šaknų ekstraktais įrodė šių ekstraktų
gebėjimą surišti laisvuosius DPPH ir ABTS radikalus bei dvivalenčio vario jonus [28].
Kitų tyrimų autoriai teigia, jog Echinacea purpurea L. Moench ekstrakto antioksidantinis
aktyvumas tolygus askorbo rūgšties aktyvumui. Tyrimui išdžiovintos visos augalo dalys. Gautoje sausoje
masėje buvo nustatyta 11,0 ± 1,0 mg/g fenolinių junginių ir 159,8 ± 12,4 mg/g polisacharidų. Pagamintas
ekstraktas gebėjo surišti 91,4 proc. DPPH radikalų bei 70 proc. geležies jonų, lyginant su EDTA [29].
Siekiant išaiškinti Echinacea purpurea L. Moench antioksidantinio aktyvumo mechanizmą,
atliktas tyrimas, kuriame lyginamas augalo ekstrakto bei išgrynintų cikoro rūgšties ir alkamidų deguonies
sunaudojimo bei laisvųjų radikalų surišimo efektyvumas. Tyrimas atliktas su augalo stiebų, lapų bei
šaknų ekstraktais. Ekstraktų gebėjimas surišti laisvuosius DPPH radikalus buvo proporcingas cikoro
rūgšties koncentracijai juose. Taip pat nustatyta, jog išgryninta cikoro rūgštis pasižymi antioksidantiniu
aktyvumu, tuo tarpu išgryninti alkamidai – nepasižymėjo. Tačiau veikdami mišinyje alkamidai padidina
cikoro rūgšties antioksidantinį aktyvumą. Sprendžiant iš struktūros, alkamidai neturėtų pasižymėti stipriu
antioksidantiniu aktyvumu, kadangi neturi hidroksilo grupių ar aromatinių žiedų. Tyrimo autoriai spėja,
jog alkamidai padidina cikoro rūgšties antioksidantinį aktyvumą ne dėl sinergistinio poveikio, o greičiau
dėl paviršiaus aktyvumo savybių, tokiu būdu palengvina polinės cikoro rūgšties patekimą prie lipidų ir
galimybę sustabdyti lipidų oksidaciją [30]. Pastarasis tyrimas rodo, kad yra svarbu toliau tirti
rausvažiedžių ežiuolių vaistinės augalinės žaliavos biologiškai aktyvius junginius bei jų įtaką augalo
biologiniams poveikiams.
18
1.6. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų kokybinė – kiekybinė analizė
Baltymų mišinio kokybinę – kiekybinę analizę sudaro baltymų frakcionavimas, išskirstytų
baltymų identifikavimas ir kiekio įvertinimas.
1.6.1. Baltymų frakcionavimas
Išgrynintų baltymų frakcionavimas būtinas tolimesnei baltymų kiekybinei – kokybinei analizei.
Baltymai frakcionuojami, atsižvelgiant į skirtingas savybes, tokias kaip molekulių dydis, krūvis bei
giminingumas įvairiems ligandams. Atitinkamai baltymų frakcionavimui naudojamos gelchromatografija,
jonų mainų chromatografija bei giminingumo chromatografija [31, 32]. Nežinomų baltymų pilotiniam
frakcionavimui tinkamiausia yra gelchromatografija, kadangi šis metodas nereikalauja specifinių žinių
apie tiriamą baltymą. Jonų mainų chromatografijai svarbu žinoti baltymų izoelektrinius taškus, o
giminingumo chromatografijai reikalinga informacija apie tiriamų baltymų gebėjimą jungtis su
specifinėmis medžiagomis [31].
1.6.1.1. Gelchromatografija
Gelchromatografija gali būti taikoma didelės molekulinės masės medžiagų atskyrimui nuo mažos
molekulinės masės medžiagų arba daugiakomponenčių mišinių išskirstymui pagal molekulinę masę [33].
Dažnai gelchromatografija naudojama baltymų frakcionavimui pagal molekulių dydį ir formą. Baltymų
tirpalas įleidžiamas į kolonėlę su įvairaus dydžio poromis, kuriose pasiskirsto skirtingo dydžio baltymų
molekulės. Baltymai iš kolonėlės išplaunami vandeniniais buferiais. Gelchromatografijos metu
surenkamos atskiros frakcijos su skirtingo dydžio baltymų molekulėmis. Iš kolonėlės pirmiausiai išsiskiria
didesnės molekulinės masės baltymai, o mažesnės molekulinės masės baltymai išsiskiria paskutiniai,
kadangi kuo mažesnė molekulė, tuo giliau prasiskverbia pro gelio poras [34, 35]. Kolonėlės, naudojamos
gelchromatografijoje, dažniausiai būna užpildytos netirpiu polisacharidu, tokiu kaip dekstranas ar agarozė,
arba poliakrilamidu [31].
19
Literatūroje aprašytas Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. AGB ir arabinano molekulinės masės
nustatymas, naudojant gelchromatografiją. Naudota Sephacryl-S400 kolonėlė, lazerio šviesą sklaidantis
detektorius bei žinomos molekulinės masės polisacharidų standartai arabinano masei nustatyti [36].
1.6.1.2. Jonų mainų chromatografija
Jonų mainų chromatografija yra vienas pagrindinių metodų baltymų atskyrimui ir gryninimui.
Metodas remiasi elektrostatine sąveika tarp baltymo ir jonizuotų grupių, esančių nejudančiojoje fazėje.
Sąveika priklauso ne tik nuo krūvių, bet ir nuo terpės dielektrinės konstantos bei konkurencijos su kitais
jonais. Didelė konkuruojančių jonų koncentracija naudojama baltymams atplauti nuo sorbento [37].
Terpės pH parenkamas pagal tikslinio baltymo izoelektrinį tašką taip, kad baltymas pasirinktoje terpėje
įgytų elektros krūvį. Teigiamą krūvį turintiems baltymams gryninti naudojamos neigiamai įkrautos
karboksimetilceliuliozės kolonėlės, o neigiamai įkrautiems – dietilaminoetilceliuliozės kolonėlės [31].
Vis dėlto šis metodas nėra pakankamai selektyvus, todėl dažnai jo vieno neužtenka visiškam
baltymo išgryninimui. Siekiant pagerinti baltymo išgryninimą jonų mainų chromatografija, gali būti
taikomi įvairūs papildomi metodai, tokie kaip atgalinės tėkmės metodas, kurio principas yra leisti mėginį
atvirkštine kryptimi nei eliuentą. Tokiu būdu susiaurinamos chromatogramos smailės bei išvengiama
negrįžtamų baltymo jonų mainų [38].
1.6.1.3. Giminingumo chromatografija
Metodas grindžiamas grįžtamu baltymų jungimusi nekovalentinėmis jungtimis su specifinėmis
medžiagomis, vadinamomis ligandais [39]. Ligandai, tokie kaip antikūnai, fermentai, lektinai,
polisacharidai, metalai, įvairūs aptamerai, įtvirtinami kietoje, chemiškai intertiškoje matricoje.
Imobilizuojant ligandą matricoje, svarbu išsaugoti nepakitusią jungimosi centro struktūrą [32]. Matricos
dažniausiai gaminamos iš polimerų ir gelių, pavyzdžiui, agarozės, dekstrano, celiuliozės, poliakrilamido,
polistireno-divinilbenzeno ir kt. [39, 40]. Injekavus baltymų tirpalą, tikslinis baltymas prisijungs prie
kietoje fazėje imobilizuoto ligando, o neprisijungusios molekulės išplaunamos [32]. Baltymų ir ligandų
jungimuisi svarbus terpės pH ir joninė jėga [40]. Baltymo – ligando jungtis gali būti išardoma specialiais
tirpalais arba nutraukiama konkurentiškai, stipriau su ligandu besijungiančiomis medžiagomis [32]. Taip
20
pat baltymai gali būti išplaunami keičiant terpės pH ar joninę jėgą. Tai ypač tinka, kai baltymas su ligandu
jungiasi elektrostatinėmis sąveikomis [40].
Giminingumo chromatografija tinkama frakcionuoti baltymus pagal jų amino rūgštis, pavyzdžiui,
histidino turintys peptidai jungiasi prie ligando nikelio. Taip pat baltymus, turinčius nebaltymines dalis.
Pavyzdžiui, glikoproteinai jungiasi prie lektinų per cukrinę molekulės dalį [32]. Tuo tarpu lektinams
frakcionuoti naudojami polisacharidai [34].
1.6.2. Kokybinis baltymų nustatymas
Kokybinė augalų baltymų mišinio analizė reikalinga siekiant plačiau nagrinėti baltymų įtaką
augalo biologiniam aktyvumui. Pagrindiniai naudojami metodai yra natrio dodecilsulfato poliakrilamido
gelio elektroforezė (NaDS-PAGE) bei masių spektroskopija (MS). Masių spektroskopija yra tikslesnis
metodas, tinkamas visoms baltyminėms medžiagoms tirti, tačiau šis metodas yra brangesnis ir
sudėtingesnis. Todėl pilotiniam baltymų tirpalo tyrimui tinkamesnė NaDS-PAGE. Dažnai MS taikoma po
atliktos elektroforezės [41].
1.6.2.1. Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė
Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (angl. sodium dodecyl-sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) yra populiarus identifikavimo metodas, kurio principas
yra krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke ir išsiskirstymas pagal molekulinę masę [31].
Natrio dodecilsulfatas (NaDS) (angl. sodium dodecyl-sulfate - SDS) „išlanksto“ baltymų
molekules ir prisijungia prie jų proporcingai molekulės masei, santykiu 1,4 g NaDS: 1 g baltymo. Tokiu
būdu baltymai įgauna pastovų krūvį, kuris priklauso nuo molekulinės masės. NaDS-PAGE metu baltymai
juda poliakrilamido geliu: kuo mažesnė baltymo molekulė, tuo greičiau juda per gelio poras. Gali būti
naudojami įvairios koncentracijos poliakrilamido geliai. Dažniausi yra 10 – 15 proc. geliai, kurie gali
išskirstyti 10 – 150 kDa dydžio baltymų molekules. Siekiant pagerinti gelių gebėjimą skirstyti baltymus,
naudojami linijinio arba nelinijinio gradiento geliai. Pavyzdžiui, linijinio 5 – 20 proc. koncentracijos
gradiento gelis geba išskirstyti 8 – 200 kDa ir didesnės molekulinės masės baltymus [41].
Siekiant išryškinti rezultatus, atliekamas gelių dažymas Coomasie briliantiniu mėlynuoju
dažikliu, taip pat sidabru arba fluorescuojančiais dažikliais, tokiais kaip salicilaldehido azinas.
21
Populiariausi yra Coomasie briliantinis mėlynasis ir sidabro dažiklis. Coomasie briliantinis mėlynasis
dažiklis pasižymi sąlyginai mažu jautrumu, tačiau yra lengvai suderinamas su masių spektroskopija,
palyginus nebrangus ir gero atsikartojamumo. Tuo tarpu sidabro dažiklis yra apie 100 kartų jautresnis už
Coomasie briliantinį mėlynąjį dažiklį, tačiau yra prastesnio atkartojamumo, nesuderinamas su masių
spektroskopija, be to, nekoreliuoja su baltymų koncentracija [42].
1.6.2.2. Masių spektrometrija
Masių spektrometrija remiasi tiriamos medžiagos jonizavimu ir pavertimu į dujinės fazės jonus,
susidariusių jonų atskyrimu ir masės-krūvio santykio (m/z) nustatymu [43]. Metodas gali būti taikomas ne
tik baltymų tapatybės ir kiekybiniam nustatymui, bet ir baltymų bei juos koduojančių genų sekos, baltymų
metabolitų nustatymui ir nekovalentinių baltymų junginių aptikimui [44, 45].
Į jonizatorių baltymų mėginiai patenka tirpalo arba kietų medžiagų pavidalu. Baltymų pavertimui
į dujinės formos jonus taikoma elektropurkštuvinė arba lazerinės desorbcijos jonizacija, naudojant
matricą. Taikant lazerinės desorbcijos jonizaciją, gaunamas didelis baltymų m/z santykis, nes šios
jonizacijos metu susidaro +1 krūvio jonai. Tuo tarpu elektropurkštuvinės jonizacijos metu susidaro
didesnio krūvio jonai ir atitinkamai gaunamas mažesnis baltymų m/z santykis. Susidarę baltymų jonai
atskiriami pagal jų m/z santykį, naudojant kvadrupolinį, jonų gaudyklės ar lėkio trukmės masės
analizatorius. Lėkio trukmės analizatoriai matuoja laiką, per kurį susidarę jonai pasiekia detektorių. Šie
analizatoriai tinka natyviniams baltymams tirti. Jonų gaudyklės surenka jonus pagal jų m/z santykį
elektrinio arba magnetinio lauko pagalba. Jos yra mažiau tinkamos baltymų kiekybiniam nustatymui už
kvadrupolinį analizatorių. Kvadrupolinis masių analizatorius sudarytas iš dviejų skirtingai įkrautų porų
strypelių, tarp kurių atsižvelgiant į kintamąjį magnetinį lauką, vienu metu išėjimo link juda tik tam tikrą
m/z santykį turinčios molekulės [45, 46, 47].
Kadangi natrio dodecilsulfatas nesijungia prie nebaltyminės molekulės dalies (dėl šios priežasties
sulėtėja molėkulės judėjimas elektroforezės metu ir gaunama didesnė molekulinė masė nei yra iš tikrųjų),
todėl masių spektroskopijos metodas yra tikslesnis lyginant su natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio
elektroforeze, atliekant glikoproteinų ir lipoproteinų analizę [41, 48].
22
1.6.3. Baltymų kiekybinis nustatymas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymai apsprendžia augalo farmakologinį poveikį, todėl svarbu
kiekybiškai išanalizuoti vaistinės žaliavos baltymų sudėtį. Baltymų kiekybinei analizei naudojami
anksčiau aptarti NaDS-PAGE ir MS metodai (1.6.2.1 ir 1.6.2.2. skyreliai). Taip pat dažnai taikomi
spektrofotometriniai analizės metodai, tokie kaip Biuret metodas, bicinchoninės rūgšties ir Bradford
metodas [47, 49].
1.6.3.1. Biuret metodas
Biuret kiekybinis nustatymas baltymų analizėje pradėtas taikyti nuo 1964 metų. Metodas remiasi
violetinės spalvos komplekso susidarymu, sąveikaujant baltymų amino grupėms su dvivalenčiu variu.
Reakcijai reikalinga šarminė aplinka. Susidariusio mišinio spalvos intensyvumas priklauso nuo baltymų
kiekio tiriamajame tirpale. Tiriamojo tirpalo koncentracija nustatoma iš prieš tai sudarytos žinomų
koncentracijų tirpalų kalibracinės kreivės, matuojant absorbciją esant 540 nm bangos ilgiui. Tyrime
naudojamas Biuret reagentas, sudarytas iš vario sulfato, kalio-natrio tartrato bei kalio jodido, ištirpintų 0,2
N natrio šarme. Metodas mažai jautrus [49, 50].
1.6.3.2. Bicinchoninės rūgšties metodas
Bicinchoninės rūgšties (BCR) metodas, pradėtas taikyti 1985 metais, yra Lowry metodo
modifikacija, kadangi vietoje Folin-Ciocalteau reagento (Lowry metodo reagentas) naudojama BCR. Dėl
to išaugo metodo jautrumas bei suderinamumas su įvairiomis medžiagomis. Reakcijai naudojamas
dvivalentis varis, kurį baltymai redukuoja iki vienvalenčio. BCR reaguoja su vienvalenčiu variu,
sudarydama violetinės spalvos kompleksą. Gauto tirpalo absorbcija ties 652 nm tiesiogiai proporcinga
baltymų kiekiui. Mėginio baltymų koncentracija nustatoma iš prieš taip sudarytos žinomų koncentracijų
standartinių baltymų kalibracinės kreivės [49, 51].
23
1.6.3.3. Bradford metodas
Bradford metodas pradėtas taikyti baltymų koncentracijos nustatymui nuo 1976 metų. Šiuo
metodu galima nustatyti nuo 0 iki 200 µg/ml baltymų koncentracijas. Metodas remiasi rūgštinio
Coomassie briliantinio mėlynojo G 250 dažiklio sąveika su baltymais. Susidarius mėlynos spalvos
kompleksui, tirpalų absorbcija matuojama esant 595 nm bangos ilgiui. Absorbcija tiesiogiai proporcinga
baltymų koncentracijai, kuri nustatoma iš prieš tai sudarytos žinomų koncentracijų baltymų kalibracinės
kreivės. Bradford metodas dažnai naudojamas dėl gero jautrumo, atkartojamumo ir paprastumo. Reakcija
įvyksta per kelias minutes. Šiuo metodu galima nustatyti baltymus nuo 4 kDa molekulinės masės [49, 52,
53].
1.7. Vaisto formos su baltymais
Medicinoje baltymai gali būti naudojami endokrininių bei metabolinių sutrikimų gydymui
(pavyzdžiui, insulinas cukrinio diabeto gydymui, virškinimo fermentai), kaip vakcinos (rekombinantinės
vakcinos nuo hepatito B, Laimo ligos). Baltymai gali jungtis prie specifinių molekulių ir slopinti jų
funkcijas (pavyzdžiui, monokloniniai antikūnai, interleukinai), taip pat naudojami infekcinių, endokrininių
bei onkologinių ligų diagnostikoje [54].
Baltymai yra neatsparūs rūgščių ir virškinimo fermentų poveikiui, todėl šiuo metu pagrinde yra
vartojami parenteraliai [55]. Tai gali būti injekciniai tirpalai arba milteliai injekciniams tirpalams ruošti.
Baltymai ganėtinai greitai šalinami iš organizmo, todėl reikalingos dažnos injekcijos. Šiai problemai
išspręsti gali būti vartojamos pagalbinės medžiagos, tokios kaip poliglicerolio ir riebiųjų rūgščių esteriai ar
tetraglicerolio dipalmitatas [55]. Baltymai pasižymi prastu stabilumu tirpaluose, todėl priimtinesnė yra
miltelių forma tirpalams ar suspensijoms ruošti prieš pat vartojimą. Milteliai gaunami baltymus
liofolizuojant [56]. Pagrindinė parenteralinių vaisto formų problema yra skausmingas ir nepatogus
vartojimas. Dėl šios priežasties vystomos neinvazinės baltymų vaistų formos. Baltyminiams vaistiniams
preparatams tinka inhaliacinės bei intranasalinės farmacinės formos. Inhialiacinės formoms gaminti tinka
molekulės, kurių diametras yra mažesnis nei 5 µm. Nustatyta, jog insulino inhaliacinės formos
pasisavinama 10 proc. lyginant su subkutaninėmis injekcijomis [57]. Be to, vartojant inhaliacinius
preparatus vaisto dozavimo tikslumas priklauso nuo vartojančiojo įgūdžių. Tuo tarpu intranasalinių
preparatų vartojimas yra paprastesnis. Baltyminių vaistų vartojimas per nosį ypatingai naudingas
neurologinių patologijų gydymui, kadangi palengvina baltymų perėjimą per hematoencefalinį barjerą bei
24
sumažina nepageidaujamą poveikį kitiems organams [58]. Tačiau nosies gleivinėje yra baltymus
skaidančių fermentų, dėl to reikalingos pagalbinės medžiagos, apsaugančios nuo baltymų suardymo [57].
Vartojimo atžvilgiu patogiausios yra geriamos vaistų formos. Baltymų vartojimą, sisteminiam
poveikiui pasiekti, per os apsunkina skaidymas žarnyne. Išeitis gali būti naudojami proteazių inhibitoriai
bei medžiagos, skatinančios baltymų absorbciją [59]. Šiam tikslui naudojamos įvairios paviršiui aktyvios
medžiagos ir kalcio chelatoriai. Kuriamos kapsulės su specialia, prie virškinamojo trakto limpančia
sistema, sudaryta iš skirtingų sluoksnių. Išorinis sluoksnis, kapsulei patekus į žarnyną, ištirpsta ir prilimpa
prie reikiamos virškinamojo trakto gleivinės dalies. Baltyminė vaistinė medžiaga, kartu su absorbciją
skatinančiomis pagalbinėmis medžiagomis yra viduriniame sluoksnyje, kuris, ištirpus išoriniam
sluoksniui, liečiasi su gleivine, taip sustiprindamas absorbciją skatinančių medžiagų poveikį ir baltymų
absorbciją [59]. Šiuo metu daug dėmesio skiriama baltymų kapsuliavimui.
1.8. Kietųjų kapsulių gamyba
Kapsulės yra kieta vaisto forma, skirta vartoti per os, turinti kietą arba minkštą apvalkalą ir
dažniausiai vienkartinę veikliosios medžiagos dozę [60]. Kietosios kapsulės yra sudarytos iš dviejų dalių –
dugno ir mažesnio dangtelio, tuo tarpu minkštosios kapsulės yra vientisos [61]. Dažniausiai kietų kapsulių
dangalai gaminami iš želatinos bei vandens. Taip pat gali būti pridedama įvairių dažiklių, paviršiui
aktyvių medžiagų, konservantų ir kitų pagalbinių medžiagų [60].
Gaminant kietųjų kapsulių apvalkalus, pirmiausia nerūdijančio plieno rezervuaruose ruošiamas
motininis želatinos tirpalas. Želatina tirpinama 60 – 70oC demineralizuotame vandenyje. Tirpale dažnai
atsiranda oro burbuliukų, tokiu atveju reikalingas vakuumas jiems nusiurbti. Želatinai tirpstant, mažėja jos
klampa, todėl norint užtikrinti reikiamas tirpalo fizikochemines savybes svarbu optimizuoti tirpinimo
trukmę. Pagaminus motininį tirpalą, į reikiamą jo tūrį įmaišomos reikalingos pagalbinės medžiagos.
Kietųjų kapsulių apvalkalas gaminamas, panardinant į želatinos tirpalą specialias nerūdijančio plieno
formas. Šios formos būna vienodo diametro, tik formos, skirtos kapsulės dugnui yra ilgesnės už skirtas
kapsulės dangteliui. Be to, liejimo formos yra tokios, kad pagaminti kapsulių dangteliai sandariai
užsimautų ant kapsulių dugnų. Ištraukus liejimo formas iš tirpalo jos yra sukamos horizontaliu paviršiumi,
siekiant tolygiai paskirstyti želatinos sluoksnį, bei paveikiamos šalto oro srove, kad želatina sustingtų.
Galiausiai formos yra džiovinamos specialiose krosnyse karšto oro srove. Išdžiovintos kapsulių apvalkalo
25
dalys nuimamos nuo formų ir nuvalomos [62, 63]. Kietosios kapsulės gali būti aštuonių dydžių – nuo
didžiausio „000“, iki mažiausio „5“ dydžio [61].
Dažniausiai kietosios kapsulės yra užpildomos milteliais arba granulėmis [60]. Pildant kapsules
milteliais, labai svarbus veiksnys yra dalelių dydis ir pasiskirstymas. Nevienodas dalelių dydis gali
apsunkinti kapsulių pildymo procesą, be to, tokios dalelės yra linkę susisluoksniuoti ir tokiu būdu turėti
neigiamos įtakos produkto kokybei. Jei kapsuliuojami milteliai pasižymi nevienodu dalelių dydžiu,
problemai išspręsti gali būti taikomas granuliavimas [62]. Skirtingo dydžio dalelės pasižymi skirtingu
birumu. Blogai byrantys milteliai apsunkina kapsulių pildymą. Geriausiai kapsulės pildomos milteliais,
kurių dalelių vidutinis dydis yra tarp 50 – 100 µm. Kitu atveju kapsulių pildymui palengvinti naudojamos
įvairios pagalbinės medžiagos. Birumui pagerinti dažnai dedami slydikliai, tokie kaip magnio stearatas,
silicio dioksidas, talkas. Slydikliai dažniausiai būna smulkios dalelės, kurios aplimpa kapsuliuojamų
miltelių daleles ir sumažina jų paviršiaus šiurkštumą, tarpusavio trauką, reguliuoja elektrostatinį krūvį
arba sugeria drėgmę, tokiu būdu pagerindamos miltelių birumą. Taip pat svarbus veiksnys yra
kapsuliuojamų miltelių dalelių forma. Esant labai netaisyklingai dalelių formai, galima pridėti to paties
dydžio, apvalios formos pagalbinių medžiagų, tokių kaip mikrokristalinė celiuliozė ar džiovintas kukurūzų
krakmolas, arba taikyti granuliavimą. Miltelių lipnumas gali apsunkinti kapsuliavimo procesą arba netgi
pažeisti kapsuliavimo mašiną. Lipnumas gali pasireikšti dėl mažų dalelių adhezijos, žemos lydymosi
temperatūros arba medžiagos higroskopiškumo. Jei medžiagos lydymosi temperatūra yra 70oC ir mažiau,
rekomenduotina pridėti tokių pagalbinių medžiagų kaip krakmolas ar mikroceliuliozė. Higroskopiškų
miltelių išvis nerekomenduotina kapsuliuoti želatinos kapsulėse, tačiau reikalui esant galima pridėti
manitolio ar bevandenės celiuliozės.
Jei kapsuliuojama miltelių masė yra per maža, naudojami užpildai, iš kurių populiariausi yra
krakmolas ir laktozė [5, 62].
Gaminant mažais kiekiais kapsules, galima pildyti ranka po vieną arba naudojant rankomis
pildomą kapsuliavimo mašinėlę. Pramoninėje gamyboje taikomas automatizuotas kapsuliavimas kapsulių
pildymo mašinomis [61]. Naudojantis rankomis pildoma kapsuliavimo mašinėle per valandą pagaminama
nuo 200 iki 2000 kapsulių. Tuščių kapsulių dugnai sudedami į apatinėje mašinėlės dalyje įtvirtintas
plastikines plokšteles su reikiamo dydžio skylutėmis, tuo tarpu kapsulių dangteliai sudedami į laisvos
viršutinės plokštelės skylutes. Kapsuliavimui paruošti milteliai yra išberiami ant plokštelės su įstatytais
kapsulių dugnais ir išskirstomi po atvirus kapsulių dugnus taip, kad jie vienodai užsipildytų. Po šios
procedūros ant plokštelės su užpildytais kapsulių dugnais uždedama plokštelė su kapsulių dangteliais ir
stipriai paspaudžiama žemyn, kad skirtingos kapsulių dalys susijungtų ir kapsulės užsidarytų [5, 61].
26
Pramonėje naudojamos įvairios kapsuliavimo mašinos, kurios visas prieš tai išvardintas
kapsuliavimo stadijas atlieka automatiškai arba pusiau automatiškai ir gali pagaminti apie 165000
kapsulių per valandą [61]. Skirtingos pramonėje naudojamos kapsuliavimo mašinos skiriasi pagal miltelių
dozavimo metodą. Yra trys pagrindiniai dozavimo būdai:
1. Pildymas sraigtu, kai tuščios atviros kapsulės įstatomos į besisukantį ratą, kuriam sukantis
užpildoma vis kita kapsulė;
2. Vibracinis pildymas, kai milteliai išberiami į atviras kapsules taikant vibraciją;
3. Pildymas stūmokliu, kai kapsuliuojami milteliai stūmokliais švelniai suspaudžiami į
cilindrines formeles, kurios įdedamos į kapsules.
Dauguma pramonėje gaminamų kietųjų kapsulių pildomos būtent pastaruoju metodu [5, 63].
1.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas
Vaistinės medžiagos atsipalaidavimui iš kietųjų kapsulių ir tirpimo greičiui įvertinti atliekamas
kietų vaisto formų tirpimo testas, remiantis Europos Farmakopėja 01/2010:20903. [64]
Kietųjų kapsulių veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas priklauso nuo kapsulės turinio ir apvalkalo
sudėties [62]. Dėl to tirpimo testas naudingas, siekiant parinkti optimaliausias pagalbines medžiagas ir
gamybos metodą [61]. Veikliosios medžiagos iš kapsulės pradeda atsipalaiduoti tuomet, kai paveikiamas
kapsulės apvalkalo sluoksnis, ir jis tampa pralaidus. Šis laiko tarpas nuo kapsulės patekimo į tirpinimo
terpę ir veikliųjų medžiagų skyrimosi iš kapsulės pradžios, vadinamas užlaikymu ir priklauso nuo
medžiagos, iš kurios pagamintas kapsulės apvalkalas, bei nuo apvalkalo storio. Lyginant želatinines,
polietilenoksido ir hidroksipropil-celiuliozės (HPC) kapsules, nustatyta, jog trumpiausiai veikliosios
medžiagos užlaikomos želatininėse, o ilgiausiai HPC kapsulese [65].
Terpės, kurioje tirpinamos kapsulės, temperatūra, judėjimas, tūris ir slėgis taip pat yra svarbūs
veiksniai, sąlygojantys veikliųjų medžiagų atsipalaidavimą [66]. Kietųjų kapsulių tirpimo testui atlikti
dažniausiai naudojama terpė – vanduo, taip pat gali būti naudojamas fosfatinis buferis (pH = 7,5), acetato
buferis (pH = 4,7) ar 0,1M HCl. Kapsulių suirimui vandeninėje terpėje pagerinti naudojami fermentai: jei
pH yra mažiau nei 4, rekomenduojama pridėti pepsino, jei pH yra tarp 4 ir 6,8 – papaino arba bromelaino,
o jei pH yra virš 6,8 – pankreatino [62, 67, 68]. Tyrimų metu nustatyta, jog kapsulių tirpinimui naudojant
fosfatinį buferį, veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas sulėtėja [62]. Želatina geriausiai tirpsta, esant
žmogaus kūno temperatūrai – 37oC. Mažėjant temperatūrai, tirpumas mažėja, o esant 30
oC ir mažesnei
27
temperatūrai želatina tampa nebetirpi. Todėl želatinines kapsules rekomenduotina užsigerti šiltu vandeniu.
Tuo tarpu hidroksipropil metilceliuliozės kapsulių tirpimui terpės temperatūra įtakos neturi [62]. Didėjant
tirpalo joninei jėgai, ypač esant Al3+
jonų, mažėja veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas iš želatininių ir
polietilenoksido kapsulių bei ilgėja HPC kapsulių užlaikymas. Dėl šios priežasties nerekomenduojama
kapsulių vartoti su maistu arba antacidiniais vaistais [65].
Kietų vaisto formų tirpimo testas gali būti atliekamas krepšelinio, mentiniu bei pratakios kameros
aparatais [64]. Krepšelinis ir mentinis aparatai sudaryti iš stiklinio ar kitos skaidrios medžiagos indo, kuris
gali būti uždengtas dangteliu, taip pat maišiklio, prijungto prie greitį reguliuojančio variklio, ir šildytuvo
temperatūrai palaikyti, pavyzdžiui, vandens vonios. Šie abu aparatai skiriasi tuo, kad krepšeliniame
aparate 25 ± 2 mm aukštyje nuo indo dugno prie maišiklio pritvirtintas iš tinklinio audinio pagamintas
krepšelis, o mentiniame – mentelė [64, 67]. Pratakios kameros aparatas sudarytas iš tirpinimo terpės
rezervuaro ir siurblio terpei pakelti, pratakios kameros, sudarytos iš dviejų kamerų, bei šildytuvo,
reikiamai temperatūrai palaikyti [64]. Nors kietųjų kapsulių tyrimams gali būti taikomi krepšelinis,
mentinis ir pratakios kameros metodai, dėl kapsulių savybės plūduriuoti tirpalo paviršiuje, priimtiniausias
yra krepšelinis metodas [62]. Atliekant kietųjų kapsulių tirpinimo tyrimą krepšeliniu aparatu viena kapsulė
įdedama į tinklinį krepšelį, kuris nardinamas į tirpinimo terpę. Tyrimui naudojamas cilindrinis plokščias,
dažniausiai vieno litro talpos indas su tirpinimo terpe, kurios temperatūra palaikoma 37 ± 0,5 oC.
Krepšelis su kapsule nardinamas į tirpinimo terpę ir paleidžiamas suktis reikiamu greičiu. Sukimosi metu
svarbu išvengti burbuliukų susidarymo. Nustatytais laiko tarpais paimamas tikslus tūris mėginio, kuris, jei
reikia, filtruojamas, ir nustatoma ištirpusio vaisto koncentracija. Mėginys imamas per vidurį tarp
besisukančio krepšelio ir indo sienelių. Paėmus tam tikrą tūrį mėginio, į indą pripilamas toks pats tūris
tirpinimo terpės.
Atliekant kietųjų kapsulių tirpinimo tyrimą mentiniu aparatu, tyrimo eiga analogiška
krepšeliniam aparatui, tačiau kapsulė dedama ant indo dugno. Jei reikia, naudojamas papildomas įtaisas
kapsulei išlaikyti ant dugno [64, 67].
Naudojant pratakios kameros aparatą, kapsulė dedama į vieną iš kamerų, prieš tai iš jos pašalinus
orą. Siurblys pumpuoja 37 ± 0,5 oC temperatūros tirpinimo terpę į pirmąją kamerą su kapsule. Šiai
kamerai prisipildžius, pradeda pildytis antroji kamera, susidaro pastovaus greičio srovė, ištirpusi vaistinė
medžiaga pasiskirsto terpėje. Nustatytu laiku specialioje vietoje prie kameros išėjimo imami mėginiai,
kuriuose matuojama ištirpusios vaistinės medžiagos koncentracija [64].
Rezultatų patikimumui užtikrinti reikalinga tirpimo testą atlikti bent su 6 kapsulėmis. Laiko
tarpai, tarp kurių imami mėginiai, pasirenkami pagal individualius reikalavimus [67].
28
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos
Rausvažiedių ežiuolių (Echinacea purpurea L. Moench) baltymų, išskirtų iš šaknų, tirpalas,
paruoštas Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos
institute.
2.1.1. Reagentai
ABTS reagentas (Sigma-Aldrich, JAV);
Kalio persulfatas (SIAL, Kanada);
PBS vandeninis tirpalas (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH = 7,4)
(Sigma-Aldrich, JAV);
Ultra švarus (I vandens kokybės lygio) vanduo (Vilniaus Biotechnologijų institutas);
Jaučio serumo albuminas, naudojamas kaip baltymų standartas (Sigma – Aldrich, JAV);
Bradford reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50 ml 95 proc.
etanolio, 100 ml 85 proc. fosforo rūgšties. Skiedžiama ultra švariu vandeniu iki 1 litro tūrio) (Sigma-
Aldrich, JAV);
Natrio fosfatas (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Natrio chloridas (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Dinatrio fosfatas (Sigma-Aldrich, JAV)
Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis (Sigma-Aldrich, JAV);
TRIS-HCl (Tris(hidroksimetil)aminometanas-HCl, pH 8,8 ir 6,8) buferis (Sigma-Aldrich, JAV);
Natrio dodecilsulfato milteliai (Sigma-Aldrich, JAV);
Amonio persulfato milteliai (Sigma-Aldrich, JAV);
30 proc. akrilamido/bisakrilamido tirpalas (Sigma-Aldrich, JAV);
Tetrametiletilendiaminas (Sigma-Aldrich, JAV);
29
LB buferis (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer), sudarytas iš 0,3M TRIS-HCl, 5 proc. SDS, 50
proc. glicerolio ir rožinio dažiklio. (Thermo Scientific, JAV);
TRIS – glicino – NaDS buferis (25 mM TRIS, 1,92 M glicino, 0,1 proc. NaDS pH = 8,3) (Sigma-Aldrich,
JAV);
PageRuler Prestained Protein Ladder baltymų standartas, dalelių dydis 10 – 170 kDa (Fermentas Life
Science, Lietuva);
Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Fisher Scientific, JAV);
96,3 proc. etanolis (reaktifikuotas spiritas) („Stumbras“, Lietuva);
99,8 proc. acto rūgštis (Standart, Lenkija);
Mikrokristalinė celiuliozė Prosolv®
SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija);
Bevandenis koloidinis silicio dioksidas – aerosilas (Degussa AG, Vokietija);
Kietos „0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV).
Natrio šarmas (NaOH) (Sigma-Aldrich, JAV)
2.1.2. Reagentų paruošimas
Paruošti reagentai: baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymui aktyvuotas ABTS katijonas-
radikalas, gelchromatografijai paruoštas fosfatinis buferis, poliakrilamido gelio elektroforezei paruošti
naudoti tirpalai bei pagamintas gelis.
2.1.2.1. ABTS radikalo-katijono tirpalo ruošimas
ABTS katijonas-radikalas (ABTS●+) aktyvuotas kalio persulfatu. Atsvertas tikslus kiekis ABTS
reagento (0,0548 g), ištirpintas 50 ml ultra švaraus vandens. Į gautą tirpalą įmaišytas tikslus kiekis (0,0095
g) kalio persulfato miltelių. Mišinys paliktas sausoje (santykinė drėgmė ne daugiau 60 proc.) patalpoje,
apsaugotoje nuo šviesos, 16 valandų, 20 ± 1 oC temperatūroje.
30
2.1.2.2 Fosfatinio buferio gamyba
Analitinėmis svarstyklėmis atsverti 17,91 g HNa2O4P·12H2O ir 8,77 g NaCl kiekiai, ištirpinti
995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų lygus 7,0. Gautas tirpalas
skiedžiamas ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Fosfatinio buferio tirpalas laikytas 4 ºC temperatūroje.
2.1.2.3. NaDS-PAGE elektroforezėje naudotų tirpalų ruošimas
1,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8,8. 18,15 g TRIS tirpinta 70 ml ultra švaraus vandens.
Tirpalo pH sureguliuotas iki 8,8, naudojant 4 M HCl. Gautas tirpalas praskiestas ultra švariu vandeniu iki
100 ml ir laikytas 4 ºC temperatūroje;
0,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6,8. 6,0 g TRIS ištirpintas 70 ml ultra švaraus vandens.
Įpilta 4 M HCl, kol pH pasiekia 6,8. Gautas tirpalas praskiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml ir laikytas
4 ºC temperatūroje;
10 proc. natrio dodecilsulfato (NaDS) tirpalas. 5,0 g NaDS ištirpinta ultra švariame vandenyje
ir praskiesta iki 50 ml;
10 proc. amonio persulfato tirpalas. 100 mg amonio persulfato ištirpinta 1 ml ultra švaraus
vandens.
Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS-glicino-NaDS elektroforezės
(10x) buferinio tirpalo, pagaminto iš 25 mM TRIS, 1,9 M glicino ir 35 mM NaDS, praskiesta ultra
švariu vandeniu iki 1 litro.
2.1.2.4. NaDS-PAGE elektroforezės gelio ruošimas
NaDS-PAGE elektroforezė atlikta, naudojant 4 proc. koncentruojantį ir 15 proc. frakcionuojantį
poliakrilamidinį gelį.
Pirmiausia paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas, naudojant 5 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2,5
ml 1,5 M TRIS (pH 8,8, esant 25 ˚C temperatūrai), 2,3 ml ultra švaraus vandens, 0,1 ml 10 proc. NaDS,
0,1 ml amonio persulfato bei 0,01 ml tetrametiletilendiamino (TMEDA). Koncentruojančio gelio tirpalas
sudarytas iš 1,3 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2,5 ml 0,5 M TRIS (pH 6,8, esant 25 ˚C temperatūrai), 6,1
ml ultra švaraus vandens, 0,1 ml 10 proc. NaDS, 0,05 ml amonio persulfato bei 0,01ml TMEDA.
31
Paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas atsargiai įleistas į specialią sukonstruotą formą,
paliekant maždaug 4 cm atstumą iki viršaus, ir atsargiai užpiltas ultra švariu vandeniu. Praėjus 40 min,
vandens likutis atsargiai nupiltas ir ant sustingusio frakcionuojančio gelio užpiltas koncentruojančio gelio
tirpalas bei įstatytos specialios gelio takelius formuojančios šukos. Po 40 minučių šukos išimtos ir ultra
švariu vandeniu praplauti susiformavę gelio takeliai.
2.1.3. Įranga
Automatiniai dozatoriai (Ependorf, JAV);
Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV);
Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Goettingen, Vokietija) (1 mg-220 g);
Ultra švaraus vandens aparatas EMD Millipore Synergy (Thermo Fisher Scientific, JAV);
AKTA Purifier 100 gelfiltracijos sistema (GE Healthcare, Švedija);
Centrifuga 5415R (Ependorf, JAV);
DB-2D termostatas (Techne, JK);
Superdex 200 10/300 GL kolnėlė (GE Healthcare life sciences, JK);
Spektrofotometras Infinite M200 (Tecan, Šveicarija);
Baltymų elektroforezės aparatas MP-300V (Cleaver Scientific LTD, JK);
2 mm sietas (Fisher Scientific, JAV);
Prietaisas miltelių birumui įvertinti Erweka AG (Erweka GmbH, Vokietija);
Kapsuliavimo mašinėlė „Capsuline-15“ (Capsuline, JAV);
Erweka DZT tirpinimo įrenginys (Erweka GmbH, Vokietija).
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymų, išskirtų iš šaknų, antioksidantinis aktyvumas nustatytas
ABTS●+ surišimo metodu [28]. Tyrimas vykdytas į skirtingus vandeninio PBS tirpalo tūrius įpilant
skirtingą rausvažiedžių ežiuolių baltymų tirpalo tūrį ir 50 µl aktyvuoto ABTS●+. Tirtų mišinių sudėtys
32
pateiktos 2 lentelėje. Įvykus reakcijai tarp baltymų ir ABTS●+, susidarė žalsvai melsvos spalvos tirpalas,
kurio absorbcija matuota spektrofotometru, esant 734 nm bangos ilgiui. Taip pat nustatyta kontrolinio
ABTS●+ tirpalo absorbcija. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas įvertintas,
palyginant mėginių absorbciją su kontrolinio tirpalo absorbcija ir apskaičiuotas, naudojant 1 formulę:
𝑝𝑟𝑜𝑐. = 100 − (𝐴∗100
𝐴𝑘) (1 formulė)
Čia: proc. - antioksidantinis aktyvumas procentais;
A – tiriamojo tirpalo absorbcijų vidurkis;
Ak – kontrolinio tirpalo absorbijų vidurkis.
2 lentelė. Antioksidantinio aktyvumo tyrimui naudotų mėginių ir kontrolinio mėginio sudėtys
Rausvažiedžių ežiuolių
baltymų tirpalo tūris (µl)
Baltymų kiekis
tirpale (µg)
ABTS●+ tirpalo
tūris (µl)
PBS tirpalo tūris
(µl)
50 1,35 50 900
75 2,025 50 875
100 2,7 50 850
Kontrolinis ABTS●+ tirpalas
0 0 50 950
2.2.2. Baltymų frakcionavimas
Rausvažiedžių ežiuolių baltymų išskirstymui atlikta gelchromatografija (molekulių išskyrimo
chromatografija) [34]. Naudota AKTA Purifier sistema ir Superdex 200 10/300 GL kolonėlė [69].
Kolonėlės sorbentas – agarozės ir dekstrano mišinys.
Prieš pradedant gelchromatografiją, 1,5 ml baltymų frakcijos centrifiguota +4 ± 1 oC
temperatūroje 15 minučių, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, naudojant Eppendorf Centrifiuge 5415R
centrifugą. Toliau tyrime naudotas atskirtas nuo nuosėdų supernatantas. Gelchromatografija atlikta, esant
4 – 16 oC temperatūrai. Kolonėlė pusiausvyrinama, leidžiant 50 ml ultra švaraus vandens, po to – 50 ml
eliuento – fosfatinio buferio, sudaryto iš 50 mM HNa2O4P * 12H2O ir 0,15M NaCl, kurio pH 7,0. Tėkmės
greitis – 0,5 ml/min, didžiausio slėgio riba – 1,4 MPa.
33
Prieš leidžiant mėginį sistemos kilpa užpildoma fosfatiniu buferiu, kad neliktų oro. Švirkšto
pagalba suleidžiamas 1 ml mėginio supernatanto. Mėginio tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Frakcijos
surenkamos į Ependorfo tipo mėgintuvėlius po 0,5 ml.
2.2.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas
Atskirų baltymų frakcijų koncentracija nustatyta kiekybiniu Bradford metodu, kuris pagrįstas
specifine baltymo sąveika su Bradford reagentu (briliantinio mėlynojo dažikliu G-250) ir susidariusio
komplekso absorbcijos matavimu spektrofotometru.
Kalibracinės kreivės sudarymui paimta po 10 µl 2, 1,5, 1, 0,5, 0,25 bei 0,125 mg/ml
koncentracijų pirminio baltymų standarto – jaučio serumo albumino (JSA) – tirpalų. 2 mg/ml tirpalai
naudoti du kartus. Pirmasis 2 mg/ml koncentracijos tirpalas praskiestas 790 µl ultra švaraus vandens, o
antrasis 2 mg/ml koncentracijos tirpalas ir kiti nurodytų koncentracijų tirpalai praskiesti 990 µl ultra
švaraus vandens. Be to, paruoštas tuščias kontrolinis mėginys - 1000 µl ultra švaraus vandens. Pirminio
standarto paruošimui naudotų tirpalų koncentracijos ir tūriai pateikti 3 lentelėje.
34
3 lentelė. Pirminio standarto paruošimui naudotų tirpalų koncentracijos ir tūriai
Eilės numeris
Pirminis standartas (jaučio serumo
albuminas) Ultra švaraus
vandens
tūris(µl)
Galutinio
standarto
tirpalo
koncentracija
(µg/ml)
Tirpalo
koncentracija
(mg/ml)
Tirpalo tūris(µl)
1 2 10 790 25
2 2 10 990 20
3 1,5 10 990 15
4 1 10 990 10
5 0,5 10 990 5
6 0,25 10 990 2,5
7 0,125 10 990 1,25
8 (tuščias
mėginys) - - 1000 0
Paimta po 120 µl paruošto skirtingų koncentracijų, standarto tirpalo (2 lentelė) ir gerai
sumaišoma su 120 µl Bradford reagento bei palaikoma kambario temperatūroje (20 ± 1 oC) 5 minutes.
Mišinių absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 595 nm bangos ilgiui. Gauta kalibracinė kreivė,
pavaizduota 1 paveiksle.
35
1 pav. Bradford metodo kalibracinė kreivė, skirta baltymų koncentracijai nustatyti.
Atitinkamai pamatuota tiriamųjų tirpalų absorbcija, sumaišius 120 µl tiriamo baltymų tirpalo ir
120 µl Bradford reagento bei palaikius 5 minutes, 20 ± 1 oC temperatūroje. Baltymų koncentracija
frakcijose apskaičiuota, naudojant 2 formulę:
𝑋 = 𝑌−0,0105
0,0205 (2 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml;
Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
2.2.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas
Siekiant nustatyti rausvažiedžių ežiuolių baltymų frakcijų dalelių molekulinę masę buvo atlikta
natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS-PAGE). Tirtos baltymų frakcijos, gautos
atlikus gelfiltraciją, Tyrimui sumaišyta 32 µl baltymų mėginio su 8 µl LB buferio. Gautas mišinys 5
minutes kaitintas 95 ºC, naudojant DB-2D termostatą.
NaDS-PAGE elektroforezei naudotas gelis, sudarytas iš 15 proc. frakcionuojančio (apatinio)
gelio ir 4 proc. koncentruojančio (viršutinio) gelio, bei 10 proc. TRIS – glicino – NaDS buferis. Į gelio
takelius įleista po 30 µl baltymų mėginių ir 0,5 µl PageRuler Prestained Protein Ladder standarto.
y = 0,0205x + 0,0105 R² = 0,9648
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 5 10 15 20 25 30
Ab
sorb
cija
Standarto koncentracija (µg/mL)
Kalibracinė kreivė
36
Elektroforezė atlikta, per gelį tekant 200 V, 25 mA elektros srovei. Tyrimas truko 90 minučių. Po
to baltymai gelio plokštelėje nustatyti, ryškinimui pasitelkus Thermo Scientific Pierce Silver dažymo
rinkinį. Pirmiausia gelis 2 kartus po 5 min praplaunamas ultra švariu vandeniu. Toliau gelis 15 min
fiksuojamas 30 proc. etanolio ir 10 proc. ledinės acto rūgšties tirpalu. Perplovus 10 proc. etanoliu bei ultra
švariu vandeniu, gelis aktyvinamas, naudojant jautrumą didinantį 0,2 proc. tirpalą „Silver Stain
Sensitizer“. Gelis pakartotinai perplaunamas ultra švariu vandeniu ir 30 min dažomas 2 proc. „Silver Stain
Enhancer“ ir „Silver Stain“ mišiniu. Po pusvalandžio gelis dar sykį perplaunamas ultra švariu vandeniu ir
ryškinamas 2 proc. „Silver Stain Enhancer“ bei „Silver Stain Developer“ mišiniu, iki atsiranda
pageidaujamo ryškumo juostos. Tuomet ryškinimas sustabdomas, gelį veikiant 5 proc. ledinės acto
rūgšties tirpalu 10 minučių. Gelis paliekamas ultra švariame vandenyje.
2.2.5. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų
gamyba ir kapsulių masės vienodumo nustatymas
Porcelianinėje lėkštelėje sumaišyta 3 dalys baltymų tirpalo su 10 dalių silicifikuotos
mikrokristalinės celiuliozės (Prosolv®
) bei 3 dalimis disperguoto silicio oksido (aerosilo). Susidariusi
masė tolygiai paskleista ant pergamentinio popieriaus ir palikta džiūti kambario temperatūroje (20 ± 1 oC)
24 valandas iki sauso likučio, sudarančio 10 proc. buvusios masės. Išdžiūvusi masė pertrinta per 2 mm
sietą. Įvertintas susidariusių miltelių birumas, matuojant miltelių byrėjimo greitį ir išbyrėjusių miltelių
kūgio kampą. Tyrimai atlikti naudojant prietaisą Erweka AG, Vokietija. Atsverta 50 g miltelių ir atsargiai
suberta į prietaiso piltuvėlį. Prietaisas įjungiamas kartu su chronometru, milteliai purtomi 20 sekundžių.
Po miltelių supurtymo atidaromas piltuvėlis, leidžiant išbyrėti visiems milteliams. Baigus byrėti
milteliams, sustabdomas chronometras. Miltelių birumas apskaičiuotas pagal 3 formulę:
20
t
mB (3 formulė)
Čia: B – miltelių birumas;
m – miltelių masė (50 g);
t – bandymo laikas.
Bandymas kartojamas 3 kartus ir išvedamas vidurkis.
37
Tuo pačiu prietaisu nustatomas išbyrėjusių miltelių kūgio kampas. Iš piltuvėlio išbyrėję milteliai
sudarė kūgio pavidalo kauburėlį. Specialiu matlankiu pamatuojamas kampas tarp susidariusio kūgio ir
horizontalaus paviršiaus.
Kad milteliai būtų kapsuliavimui tinkamo birumo, kūgio kampas turi būti kuo mažesnis (25o –
30 o), o byrėjimo greitis 4 – 5 g/sek [70].
Gauti birūs milteliai suberti į „0“ dydžio kapsulės didesnįjį cilindrą, naudojant rankomis pildomą
kapsuliavimo mašinėlę. Subėrus miltelius, kapsulės uždaromos, sujungiant mažesnįjį kapsulės cilindrą su
didžiuoju. Kapsulės laikomos tamsoje, vėsioje (4 ± 1 ˚C) patalpoje.
Kapsulių masės vienodumo tyrimas atliktas, remiantis Ph. Eur. 01/2008:20905. 20 atsitiktinai
pasirinktų kapsulių pasvertos, ir apskaičiuota vidutinė kiekvienos kapsulės masė. Pasvėrus nepažeistą
kapsulę, jos turinys išberiamas ir atskirai pasveriamas nepažeistas želatininis apvalkalas. Skirtumas tarp
kapsulės masės ir želatininio apvalkalo masės yra kapsulės turinio masė. 4 lentelėje nurodytas leistinas
svėrinių nuokrypis. Procentinis nuokrypis nuo svėrinių masės vidurkio gali būti ne daugiau kaip 2 proc.
didesnis nei nurodyta 4 lentelėje. Be to, nei vienas iš svėrinių negali viršyti leistinų vidutinės masės
nuokrypio ribų daugiau kaip 2 kartus.
4 lentelė. Leistinas svėrinių nuokrypis (proc.) pagal Ph. Eur.
Vaistinė forma Vidutinė masė Procentinis nuokrypis
Kapsulės Mažiau nei 300 mg 10 proc.
300 mg ir daugiau 7,5 proc.
2.2.6. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas
Atsipalaidavimo tyrimas atliekamas krepšelio metodu, naudojant ERWEKA DZT aparatą.
Kapsulė su rausvažiedžių ežiuolių baltymais dedama į krepšelį, kuris nardinamas į indą su 50 ml PBS
buferiu, pašarmintu NaOH tirpalu iki pH = 8,0. Palaikoma terpės temperatūra 37 ± 0,5 oC. Krepšelio
sukimosi greitis – 100 apsisukimų per minutę. Kas 15 min paimama po 10 ml mėginio, kiekvieną kartą
įpilant po 10 ml PBS buferio į indą, kuriame sukasi krepšelis su kapsule, taip siekiant palaikyti pastovų
tūrį (50 ml). Tai kartojama keturis kartus. Paimti mėginiai: po 15 min, 30 min, 45 min ir 60 min.
Mėginiai imami iš vietos, esančios viduryje tarp indo dugno ir tirpimo terpės paviršiaus, nutolusios bent
10 mm nuo indo sienelių.
38
Siekiant ištirti baltymų atsipalaidavimą iš kapsulių, nutatyta visuose keturiuose mėginiuose
esančių baltymų koncentracija, kuri palyginta su baltymų koncentracija, gauta ištirpinus vienos kapsulės
turinį. Šiam tikslui taikytas spektrofotometrinis Bradford metodas. Tyrimo eiga analogiška, aprašytai 2.2.3
skyriuje. Nustačius žinomų koncentracijų JSA tirpalų absorbcijas, gauta kalibracinė kreivė pavaizduota 2
paveiksle.
2 pav. Kalibracinė kreivė, skirta nustatyti baltymų koncentraciją kietose kapsulėse ir
atsipalaidavusių baltymų kiekį.
Baltymų koncentracija mėginiuose apskaičiuota, naudojantis 3 formule:
𝑋 = 𝑌+0,0154
0,0604 (3 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml;
Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
2.2.7. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais antioksidantinio
aktyvumo nustatymas
Kietųjų kapsulių su baltymais antioksidantinis aktyvumas nustatytas, remiantis ABTS●+
surišimo metodu, aprašytu 2.2.1 skyriuje. Tirti keturi mėginiai, gauti atlikus kapsulių turinio
atsipalaidavimo tyrimą. Tirpalų, sudarytų iš baltymų ir ABTS radikalų-katijonų PBS tirpale, absorbcija
y = 0,0604x - 0,0154 R² = 0,9709
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 5 10 15 20 25 30
Ab
sorb
cija
Standarto koncentracija (µg/ml)
Kalibracinė kreivė
39
lyginta su kontroline ABTS●+ tirpalo absorbcija. Baltymų kapsulių antioksidantinis aktyvumas
apskaičiuotas pagal 1 formulę.
2.2.8. Statistinis duomenų vertinimas
Statistinė analizė atlikta, naudojant programinį paketą MS Office Excel 2010 (Microsoft
Corporation, JAV). Tyrimai kartojami 3 kartus. Duomenys pateikti išraiška vidurkis ± standartinis
nuokrypis (SN).
40
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas
Remiantis literatūros duomenimis rausvažiedžių ežiuolių ekstraktai pasižymi antioksidantiniu
aktyvumu [27]. Ankstesnių tyrimų metu nustatyta, kad rausvažiedžių ežiuolių antioksidantinį aktyvumą
apsprendžia šaknyse esantys alkamidai, flavonoidai bei kavos rūgšties dariniai [27, 71]. Siekiant
išsiaiškinti, ar rausvažiedžių ežiuolių šaknų sudėtyje esantys baltymai taip pat pasižymi antioksidantiniu
aktyvumu, buvo atliktas ABTS●+ surišimo įvertinimas. Gauti rezultatai grafiškai pavaizduoti 3 paveiksle:
3 pav. Rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymų antioksidantinis aktyvumas
Gauti absorbcijos rezultatai buvo lyginami su kontroliniu tirpalu – ABTS●+ PBS tirpale.
Nustatyta, jog 50 µl baltymų frakcijos, turinčios 1,35 µg baltymų, ženkliai sumažina ABTS●+ tirpalo
absorbciją, surišdami 26,85 ± 2,63 proc. ABTS●+, 75 µl baltymų frakcijos (2,025 µg baltymų) – 49,89 ±
1,27 proc. ABTS●+, o 100 µl (2,7 µg) surišo 53,59 ± 2,65 proc. ABTS●+. Didinant baltymų frakcijos
kiekį absorbcija mažėjo. Mažėjanti absorbcija reiškia, jog tirpale mažėja ABTS●+, kurie suteikia tirpalui
tamsiai žalią spalvą. Todėl galima daryti prielaidą, jog rausvažiedžių ežiuolių baltymai pasižymi gebėjimu
surišti laisvuosius ABTS●+.
0
10
20
30
40
50
60
50µl 75µl 100µl
An
tio
ksid
anti
nis
akt
yvu
mas
, p
roc.
Baltymų frakcijos koncentracija μl/ml
41
3.2. Baltymų frakcionavimas
Šio tyrimo tikslas buvo frakcionuoti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų išskirtus baltymus, naudojant
gelchromatografijos metodą. Frakcionavimas atliktas pagal 2.2.2. skyriuje aprašytą metodiką.
Rausvažiedžių ežiuolių baltymai buvo išskirstyti į 38 frakcijas. Gauta chromatograma pavaizduota 4
paveiksle.
4 pav. Gelfiltracijos, atliktos su rausvažiedžių ežiuolių baltymais, chromatograma. Gautos
smailės prie 280nm (mėlyna spalva) ir 215nm (rožinė spalva) UV bangos ilgių.
Chromatogramoje vaizduojamos smailės, gautos esant skirtingam bangos ilgiui. Yra žinoma, jog
peptidinės jungtys absorbuoja UV šviesą, esant 215 – 230 nm bangos ilgiui, o aromatinių amino rūgščių,
tokių kaip triptofanas bei tirozinas, absorbcijos maksimumas yra prie 280 nm [72, 73]. Skirtingų UV
bangos ilgių smailės, gautos ties 29-30, 36, 40, 42-43, 48, 54, 58-59, 62-63 ir 65-66 frakcijomis, rodo,
kokių struktūrų junginiai gali būti atitinkamose frakcijose. Visose minėtose frakcijose yra peptidinių
jungčių ir visose, išskyrus 29-30 frakcijas, nustatytos aromatinės amino rūgštys. Smailės ties 40 – 45
42
frakcijomis yra persidengusios. Tai rodo, kad baltymai atsiskyrė ne iki galo. Atsižvelgiant į tai, jog
medžiagų atsiskyrimas priklauso nuo molekulės dydžio bei formos, kadangi skirtingos molekulės
nevienodai prasiskverbia pro gelio granulių poras ir skirtingu laiku išeina iš kolonėlės, tad galima teigti,
jog rausvažiedžių ežiuolių baltymų molekulės minėtose frakcijose yra panašaus dydžio [74].
Tolimesniems tyrimams buvo pasirinktos 29, 30, 36, 37, 40, 42, 48, 62 ir 65 frakcijos, kadangi stebimos
(4 paveikslas) šių baltymų frakcijų aukščiausios smailės.
3.3. Baltymų kiekio frakcijose nustatymas
Kiekybiškai ištirtos 29, 30, 36, 37, 40, 42, 48, 62 ir 65 baltymų frakcijos, pagal 2.2.3. skyriuje
aprašytą Bradford metodą. Baltymų koncentracija frakcijose apskaičiuota, naudojantis prieš tai sudaryta
kalibracine kreive (1 paveikslas). Gautos kalibracinės kreivės funkcija yra y = 0,0205x + 0,0105, o
koreliacijos koeficientas R2 = 0,9648. Kalibracinė kreivė yra patikima, kadangi R
2 yra artimas vienetui.
Gauti kiekybinio tyrimo rezultatai pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų koncentracija skirtingose frakcijose.
Frakcijos Nr. Koncentracija, µg/ml
29 6,068 ± 0,417
30 5,083 ± 0,709
36 4,663 ± 0,094
37 5,956 ± 0,317
40 4,010 ± 0,156
42 4,288 ± 0,207
48 2,044 ± 0,415
62 2,302 ± 0,151
65 1,259 ± 0,097
Didžiausios baltymų koncentracijos nustatytos 29, 30, 36 bei 37 frakcijose, todėl būtent šios
frakcijos pasirinktos baltymų molekulinės masės nustatymui NaDS-PAGE metodu.
43
3.4. Baltymų molekulinės masės nustatymas NaDS-PAGE metodu
Siekiant nustatyti rausvažiedžių ežiuolių baltymų molekulinę masę buvo atlikta NaDS-PAGE
elektroforezė, kurios metodika aprašyta 2.2.4. skyriuje. Gauti rezultatai vaizduojami 5 paveiksle.
5 pav. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų frakcijų NaDS-PAGE elektroforezės rezultatai. St. -
standartas
Frakcijoje Nr. 29 nustatytos 14, 30 ir 35 kDa dydžio dalelės. Frakcijoje Nr. 30 nustatytos 14, 25,
30 ir 35 kDa dydžio dalelės. Taip pat šiose frakcijose galima įžvelgti neryškias juostas ties 120 kDa.
Kadangi dėmės yra labai blyškios, galima manyti, jog šio baltymo kiekis frakcijose yra labai mažas. Tuo
tarpu frakcijose Nr. 36 ir 37 nustatytos 36 kDa dydžio dalelės.
Frakcijose Nr. 39 ir 30 matomos dvi juostos, išsidėsčiusios glaustai viena prie kitos, ties 30 kDa
žymėjimu. Toks junginys vadinamas dubletu ir žymi du baltymus, turinčius labai panašią amino rūgščių
seką arba to paties baltymo izoformas. Dažniausiai tokie baltymai būna izofermentai ir atlieka panašias
funkcijas. Ties 35 kDa žymėjimu esančios dėmės yra plačios, ryškiais kraštais, todėl tikėtina, jog šių
baltymų kiekis frakcijose yra didesnis. Ryškios ir siauros dėmės 36 ir 37-oje frakcijose žymi gerai
atsiskyrusius, tirpius baltymus. Tuo tarpu 120 kDa žyminčios dėmės 29-oje ir 30-oje frakcijose yra
neryškios, išsiliejusiais kraštais, kas būdinga baltymams, turintiems didelę hidrofobinę arba nebaltyminę
dalį. Dažnai tai būna transmembraniniai baltymai [75].
Literatūros duomenimis rausvažiedžių ežiuolių šaknyse aptinkami 17, 21 ir 30 kDa dydžio
glikoproteinai, taip pat arabinogalaktaną prijungiantis baltymas – glikoproteinas, kurio molekulinė masė
44
yra 120 kDa [2, 76]. Tai yra su augalų ląstelių membrana susijęs baltymas, ankstesnių tyrimų metu
nustatytas rausvažiedžių ežiuolių sultyse. Sprendžiant iš blyškios dėmės, galima įtarti, jog džiovintoje
žaliavoje 120 kDa baltymo yra tik labai nežymus kiekis. Literatūros duomenimis rausvažiedžių ežiuolių
ląstelių kultūroje AGB randama beveik 10 kartų daugiau nei džiovintose augalo dalyse [3]. Dėl šios
priežasties, norint ateityje tirti šį baltymą bei jo panaudojimo galimybes, vertėtų rinktis šviežią, o ne
džiovintą žaliavą [77, 78].
3.5. Kietųjų kapsulių su rausvažiedžių ežiuolių baltymais gamyba ir atsipalaidavimas
Nustatyta, jog kapsulių gamyboje naudotų miltelių mišinio birumas yra tinkamas kapsulių
gamybai. Pagaminus kapsules su rausvažiedžių ežiuolių šaknų baltymais ir atlikus masės vienodumo testą,
gauta vidutinė kapsulių masė 0,34 ± 0,026 g.
Siekiant ištirti kapsulių atsipalaidavimą, atliktas kietųjų kapsulių tirpimo testas, krepšelio
metodu. Spektrofotometriniu Bradford metodu nustatyta rausvažiedžių ežiuolių baltymų kiekis vienoje
kapsulėje ir po kapsulių tirpinimo (skirtingų laiko intervalų) bei apskaičiuotas atsipalaidavusių iš kietųjų
kapsulių baltymų kiekis procentais. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų kiekis prieš kapsuliavimą ir po atsipalaidavimo iš
kietųjų kapsulių.
Laikas
Baltymų kiekis,
atsipalaidavęs iš
kietųjų kapsulių (µg)
Baltymų kiekis
kapsulėje (µg)
Atsipalaidavimas
(proc.)
Po 15 min. 3,166±0,363
17,000±0.214
18,62±2,139
Po 30 min. 3,930±0,222 23,12±1,306
Po 45 min. 3,709±0,341 21,82±1,89
Po 60 min. 4,373±0,174 25,73±0,793
Iš rezultatų lentelėje galima matyti, jog rausvažiedžių ežiuolių baltymų atsipalaidavimas iš
kietųjų kapsulių yra sąlyginai nedidelis. Didžiausias baltymų kiekis atsipalaiduoja po 60 minučių (25,73
proc.). Galima daryti prielaidą, jog reikėtų ieškoti kito kapsuliavimo būdo, taikyti liofilizaciją arba kitas
pagalbines medžiagas, tinkamas rausvažiedžių ežiuolių baltymams kapsuliuoti, siekiant pagerinti baltymų
atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
45
3.6. Kietųjų kapsulių antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Kietųjų kapsulių antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS metodu, ištyrus keturis mėginius,
gautus tirpinant kapsules po 15, 30, 45, 60 min. Tyrimo eiga aprašyta 2.2.7. skyriuje, gauti rezultatai
vaizduojami 6 paveiksle.
6 pav. Rausvažiedžių ežiuolių baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis
aktyvumas.
Didžiausias baltymų antioksidantinis aktyvumas – 22 ± 1,56 proc. stebėtas, praėjus 15 min nuo
baltymų atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių pradžios. Įdomu tai, jog po ilgesnio laiko intervalo
antioksidantinis aktyvumas mažėja, nors atsipalaidavusių baltymų koncentracija didėja. Tai rodo, jog
rausvažiedžių ežiuolių baltymai, atsipalaiduodami iš kietųjų kapsulių, praranda savo aktyvumą. Tikėtina,
jog baltymai dėl gamybos etapų ar atsipalaidavimo tyrimų dalinai denatūravo, taip prarasdami
antioksidantinį aktyvumą. Įtakos antioksidantinio aktyvumo sumažėjimui galėjo turėti ir pagalbinės
medžiagos.
0
5
10
15
20
25
15 30 45 60
An
tio
ksid
anti
nis
akt
yvu
mas
, p
roc.
Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių laikas, min
Antioksidantinis aktyvumas, %
46
4. IŠVADOS
1. Baltymai, išskirti iš rausvažiedžių ežiuolių šaknų, geba surišti ABTS radikalus-katijonus.
2. Gelchromatografijos metodas nebuvo selektyvus, atskiriant visus baltymus, nes dalis baltymų
atsiskyrė tik dalinai.
3. Didžiausia baltymų koncentracija nustatyta keturiose gelchromatografijos pradžioje
atsiskyrusių baltymų frakcijose, atitinkamai 6,068 ± 0,417 µg/ml, 5,956 ± 0,317 µg/ml, 5,083 ± 0,709
µg/ml ir 4,663 ± 0,094 µg/ml.
4. Frakcijose, kuriose nustatytas didžiausias baltymų kiekis, identifikuoti nuo 14 iki 35 kDa
molekulinės masės baltymai. Taip pat aptiktas nedidelis kiekis 120 kDa molekulinės masės baltymo.
5. Rausvažiedžių ežiuolių baltymai iš kietųjų kapsulių atsipalaiduoja tik dalinai, iki 25,73 ± 0,793
proc. baltymų.
6. Kapsuliuotų rausvažiedžių ežiuolių baltymų antioksidantinis aktyvumas susilpnėja.
47
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS TOLIMESNIEMS TYRIMAMS
1. Nustatyti rausvažiedžių ežiuolių džiovintose šaknyse esančių baltymų struktūrą.
2. Palyginti kiekybinę – kokybinę rausvažiedžių ežiuolių baltymų sudėtį džiovintoje šaknų žaliavoje ir
augalo sultyse.
3. Toliau ieškoti optimalių sąlygų vaisto formai su rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymais
paruošti, pavyzdžiui, gaminant kapsules su liofilizuotų baltymų milteliais.
4. Toliau tirti rausvažiedžių ežiuolių džiovintų šaknų baltymų biologinį aktyvumą.
48
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. European medicines agency. Committee on Herbal Medicinal Products. Assessment report on
Echinacea purpurea (L.) Moench, radix. UK 2010; 3p. Prieiga per internetą: http://www.ema.europa.eu.
2. Miller SC editor. Echinacea: The genus Echinacea. Chicago: University of Chicago Press; 2004. p
61.
3. Classena B, Thudea S, Blascheka W, Wacka M, Bodinet C. Immunomodulatory effects of
arabinogalactan-proteins from Baptisia and Echinacea. Phytomedicine 2006;13:688–694.
4. Barnes J, Anderson L, Gibbons S, Phillipson JD. Echinacea species (Echinacea angustifolia (DC.)
Hell., Echinacea pallida (Nutt.) Nutt.,Echinacea purpurea (L.) Moench): a review of their chemistry,
pharmacology and clinical properties. J. Pharm. Pharmacol 2005; 57(8):929 – 954.
5. Augsburger LL. Hard and soft shell capsules. In: Banker GS, Rhodes CT, editors. Modern
Pharmaceutics. New York: Marcel Dekker Inc.; 2002. p. 338 – 374.
6. Ramanauskas A, Jonuškienė I. Antrinių metabolitų kitimo įvertinimas vaistiniuose augaluose ir
vaistinio šalavijo (Salvia officinalis L.) auginimo in vitro optimizavimas. Cheminė technologija
2013;2(64):28–34.
7. Cheng SH, Willmann MR, Chen HC, Sheen J. Calcium signaling through protein kinases. The
Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family. Plant Physiol 2002;192:469–485.
8. Ludwik AA, Romeis T, Jones JDG. CDPK-mediated signalling pathways: specificity and cross-
talk. J. Exp. Bot 2004;55:181–188.
9. Tameling WIL, Takken FLW. Resistance proteins: scouts of the plant innate immune system. Eur
J Plant Pathol 2008;121:243–255.
10. Jones JDG, Dangl JL. The plant immune system. Nature 2006;444:323-329.
11. Damaraju S, Schlede S, Eckhardt U, Lokstein H, Grimm B. Functions of the water soluble
chlorophyll-binding protein in plants. J Plant Physiol 2011;168:1444–1451.
12. Gutauskas A, Urbanavičienė R. Biologijos enciklopedija. Kaunas: Šviesa; 2006. p. 68–9.
13. Notas G, Koutroubakis IE, Kouroumalis EA. Oxidants and antioxidants ir liver disease. In:
Panglossi HV, editor. Antioxidants. New research. New York: Nova Science Publishers, Inc.; 2006. p. 9.
14. Halliwell B. Food-derived Antioxidants: How to Evaluate Their Importance in Food and In Vivo.
In: Cadenas E, Packer L, editors. Handbook of Antioxidants. Second edition. New York: Marcel Dekker
Inc.; 2002. p. 67–70.
49
15. Elias RJ, Kellerby SS, Decker E. Antioxidant activity of proteins and peptides. Crit Rev Food Sci
Nutr 2008;48(5):430-441.
16. Carrasco-Castilla J, Hernández-Álvarez AJ, Jiménez-Martínez C, Jacinto-Hernández C, Alaiz M,
Girón-Calle J, Vioque J, Dávila-Ortiz G. Antioxidant and metal chelating activities of Phaseolus vulgaris
L. var. Jamapa protein isolates, phaseolin and lectin hydrolysates. Food Chem 2012;131:1157–1164.
17. Kanner J. Metals and food oxidation. In: Decker AE, Elias RJ, McClements DJ, editors. Oxidation
in foods and beverages and antioxidant applications. Cambridge: Woodhead Publishing Limited; 2010. p.
44.
18. Sivapriya M, Srinivas L. Isolation and purification of a novel antioxidant protein from the water
extract of Sundakai (Solanum torvum) seeds. Food Chem 2007;104:510–517.
19. Sarkar MK, Kinter M, Mazumder B, Sil PC. Purification and characterisation of a novel
antioxidant protein molecule from Phyllanthus niruri. Food Chem 2009;114:1405–1412.
20. Shima J-U, Lim K-T. Anti-oxidative and anti-proliferative character of glycoprotein isolated from
Geranium sibiricum Linne in Chang liver cells. Environ Toxicol Pharmacol 2008;26:320–324.
21. European Pharmacopoeia 7th Edition. Purple coneflower root 01/2008:1824.
22. Mistrikova I, Vaverkova S. Echinacea – chemical composition, immunostimulatory activities and
uses. Thaiszia - J Bot Košice 2006;16:11–26.
23. Bossy A, Blaschek W, Classen B. Characterization and immunolocalization of arabinogalactan-
proteins in roots of Echinacea purpurea. Planta med 2009;75(14):1526-1533. [elektroninis išteklius].
2009 [žiūrėta 2015 vasario 10] Prieiga per internetą: http://europepmc.org/abstract/MED/19562658.
24. Jurkštienė V, Kondrotas AJ, Kėvelaitis E. Imuninės sistemos kompensacinės reakcijos ir
rausvažiedės ežiuolės (Echinacea purpurea (L.) Moench) preparatų poveikis. Medicina 2004; 40(7):657 –
662.
25. Fonseca FN, Papanicolaou G, Lin H, Lau CBS, Kennelly EJ, Cassileth BR. Echinacea purpurea
(L.) Moench modulates human T-cell cytokine response. Int Immunopharmacol 2014;19(1):94-102.
26. Alban S, Classen B, Brunner G, Blaschek W. Differentiation between the complement modulating
effects of an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea and heparin. Planta Med
2002;68(12):1118-24.
27. Kumar KM, Ramaiah S. Pharmacological importance of Echinacea purpurea. IJPBS
2011;2(4):304-314.
28. Hu C, Kitts D. Studies on the Antioxidant Activity of Echinacea Root Extract. J. Agric Food
Chem 2000;48(5):1466–1472.
50
29. Lee TT, Chen CL, Shieh ZH, Lin JC, Yu B. Study on antioxidant activity of Echinacea purpurea
L. extracts and its impact on cell viability. J Biotechnol 2009;8(19):5097-5105.
30. Thygesen L, Thulin J, Mortensen A, Skibsted LH, Molgaard P. Antioxidant activity of cichoric
acid and alkamides from Echinacea purpurea, alone and in combination. Food Chem 2006;101(1):74-81.
31. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. 5th edition. New York: W H Freeman; 2002.
[internetinis išteklius][žiūrėta 2015 kovo 20d] Prieiga per internetą:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22410/.
32. Isaaqu HJ, Conrads TP, Janini GM, Veenstra TD. Methods for fractionation, separation and
profiling of proteins and peptides. Electrophoresis 2002;(23):3048–3061.
33. Gel Filtration/Size Exclusion Chromatography. GE Healthcare Life Sciences. Prieiga per internetą:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?categoryId=11513&catalogId
=10101&productId=&top=Y&storeId=11771&langId=-1.
34. Hagel L. Gel filtration: size exclusion chromatography. In: Janson JC, editor. Protein purification.
Principles, high resolution methods and applications. 3nd ed. New Jersey: John Wiley & Sons; 2011. p.
51–87.
35. Protein Purification by Gel Filtration Chromatography. Institute of Molecular Development.
[elektroninis išteklius]. 2001 [žiūrėta 2015 kovo 28d.] Prieiga per internetą:
http://www.molecularinfo.com/MTM/G/G3/G3-1/G3-1-1.html.
36. Thude S, Classen B. High molecular weight constituents from roots of Echinacea pallida: An
arabinogalactan-protein and an arabinan. Phytochemistry 2005;66:1026–1032.
37. Karlsson E, Hirsh I. Ion exchange chromatography. In: Janson J C, editor. Protein purification.
Principles, high resolution methods and applications. 3nd ed. New Jersey: John Wiley & Sons; 2011. p.
96.
38. Chern MK, Shiah WJ, Chen JJ, Tsai TY, Lin HY, Liu CL. Single-step protein purification by back
flush in ion exchange chromatography. Anal Biochem 2009;392(2):174-6.
39. Pohleven J, Štrukelj B, Kos J. Affinity Chromatography of Lectins. In: Magdeldin S, Editor.
Affinity chromatography. Croatia: Intech; 2009. p. 49–74.
40. Wombacher H, Jacob L. Affinity Chromatography of Proteins. In: Kamp RM, Editor. Protein
Structure Analysis. Berlin: Springer-Verlag; 1997. p. 11–30.
41. Dunn MJ. Gel Electrophoresis of Peptides and Proteins. In: Reid R, editor. Peptide and Protein
Drug Analysis. New York: Marcel Dekker Inc.; 2000. p. 387-401.
51
42. Ni MW, Ye WJ, Cong WT, Hong GY, Zhu ZX, Duan YM, Zhou X, Jin LT. Fluorescent staining
of protein in SDS polyacrylamide gels by salicylaldehyde azine. Electrophoresis 2013;(34):3171-9.
43. Hoffmann E, Stroobant V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. Chichester: John
Wiley & Sons; 2007. p. 9-14.
44. Godovac-Zimmermann J, Brown LR. Perspectives for mass spectrometry and functional
proteomics. Mass Spectrom Rev 2001;20:1–57.
45. Baez NOD, Reisz JA, Frudui CM. Mass spectrometry in studies of protein thiol chemistry and
signaling: opportunities and caveats. Free Radical Biol Med 2015;80:191-211.
46. Faull KF, Dooley AN, Halgan F, Shoamaker LD, Norris AJ, Ryan CM, Laganowsky A, Johnson
JV, Katz JE. An Introduction to the Basic Principles and Consepts of Mass Spectometry. In: Whitelegge J,
editor. Protein Mass Spectrometry. Amsterdam: Elsevier; 2009. p. 1–47.
47. Hutanu D, Darie CC. Trends in Characterization of PEGylated Proteins by Mass Spectrometry.
MCA 2014;2:2.
48. Reichel C, Kulovics R, Jordan V, Watzinger M, Geisendorfer T. SDS-PAGE of recombinant and
endogenous erythropoietins: Benefits and limitations of the method for application in doping control.
Drug Testing and Anal 2009;1(1):43-50.
49. Jagow GV, Link TA, Schagger H. Purification strategies for membrane proteins. In: Jagow GV,
Schagger H, editors. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. California: Academic Press,
Inc.; 1994. p. 3-18.
50. Nigam A, Ayyagari A. Lab manual in biochemistry, immunology and biotechnology. New Delhi:
Tata McGraw-Hill Publishing Company Limited; 2007. p. 49.
51. Walker J. Protein structure, purification, characterisation and function analysis. In: Wilson K,
Walker J, editors. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. Cambridge:
Cambridge University Press; 2010. p. 310.
52. Rosenberg IM. Protein Analysis and Purification– Benchtop Techniques. Boston: Birkhauser;
1996. p.310.
53. Chang SKC. Protein analysis. In: Nielsen SS, editor. Food Analysis. New York: Springer Science
& Business Media; 2010. p. 141.
54. Leader B, Baca QJ, Golan DE. Protein therapeutics: a summary and pharmacological
classification. Nat Rev Drug Discov 2008;7(1):21-39.
55. Yamagata Y, Iga K, Ogawa Y. Novel sustained-release dosage forms of proteins using
polyglycerol esters of fatty acids. J Control Release 2000;63(3):319-329.
52
56. Akers MJ, Vasudevan V, Stickelmeyer M. Formulation Development of Protein Dosage Forms.
New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 2002. p. 47–55.
57. Sharma JPK, Bansal S, Banik A. Noninvasive Routes of Proteins and Peptides Drug Delivery.
Indian J Pharm Sci 2011;73(4):367–375.
58. Meredith ME, Salameh TS, Banks W. Intranasal Delivery of Proteins and Peptides in the
Treatment of Neurodegenerative Diseases. The AAPS Journal 2015. [elektroninis išteklius]. 2015 [žiūrėta
2015 05 12] Prieiga per internetą: http://link.springer.com/article/10.1208/s12248-015-9719-7#page-1.
59. Jessy Shaji J, Patole V. Protein and Peptide Drug Delivery: Oral Approaches. Indian J Pharm Sci
2008;70(3):269–277.
60. European Pharmacopoeia 7th Edition. Capsules 01/2008:0016.
61. Allen HV, Ansel HC. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia:
Lippincott Williams & Wilkins; 2014. p. 241–249.
62. Jones BE. Manufacture and properties of two-piece hard capsules. In: Podczeck F, Jones BE,
editors. Pharmaceutical Capsules. London: Pharmaceutical Press; 2004. p.79–89.
63. Rudnic EM, Schwartz JB. Oral Solid Dosage Forms. In: Troy DB, editor. Remington – The
Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006. p. 919-924.
64. European Pharmacopoeia 7th Edition. Dissolution test for solid dosage forms (01/2010:20903).
65. Lee CY, Chen GL, Sheu MT, Liu CH. Physical Characterization and Drug Release Profiling for
Hard Capsules Prepared with Hydroxypropylcellulose or Polyethylene Oxide. The Chin Pharm J
2006;58:75-84.
66. Garbacza G, Cadéc D, Benameurc H, Weitschies W. Bio-relevant dissolution testing of hard
capsules prepared from different shell materials using the dynamic open flow through test apparatus. Eur J
Pharm Sci 2014;57(16):264–272.
67. The International Pharmacopoeia. Fourth edition, 2014. World Health Organization. Methods of
Analysis: 5. Pharmaceutical technical procedures: 5.5 Dissolution test for solid oral dosage forms. Prieiga
per internetą: http://apps.who.int/phint/en/p/docf/.
68. Vivan A, Graya EC, Joan MD, Riva T, Luigi G, Jian-Hwa G, Jian-Hwa H, Feixue H et al. Testing
of Gelatin Capsules and Gelatin-Coated Tablets— Revisions to Dissolution. Dissolut Technol 2014; 6–19.
69. GE healthcare life sciences, Superdex 200 GL. Prieiga per internetą:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/lt/GELifeSciences/17517501.
53
70. Aleknavičienė B, Bernatonis D, Briedis V, Drakšienė G, Savickas A, Velžienė S, Vaičiulienė J.
Pramoninės vaistų technologijos laboratoriniai darbai. Kaunas: Kauno medicinos universiteto Spaudos ir
leidymos centro leidykla; 2002. p. 87–90.
71. Mishima S, Saito K, Maruyama H, Inoue M, Yamashita T, Ishida T, Gu Y. Antioxidant and
Immuno-Enhancing Effects of Echinacea purpurea. Biol Pharm Bull 2004;27(7):1004–1009.
72. Randall C S, Malefyt T R, Sternson L A. Approaches to the Analysis of Peptides. In: Vincent H L,
editor. Peptide and Protein Drug Delivery. New York: Marcel Dekker Inc. 1991. p. 226.
73. Uversky VN, Permi︠ a︡kov EA, editors. Methods in Protein Structure and Stability Analysis–
Luminescence Spectroscopy and Circular Dichroism. New York: Nova Science Publishers Inc. 2007. p.
56.
74. Gel Filtration. Principles and Methods. Handbook from Amersham Biosciences. [elektroninis
išteklius]. 2002 [žiūrėta 2014 gruodžio 21d] Prieiga per internetą:
http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_gelfiltration.pdf.
75. Analysis of Protein Gels (SDS-PAGE). Experimental Biosciences. Resources for introductory &
intermediate level laboratory courses. [elektroninis išteklius]. 2015 [žiūrėta 2014 sausio 20]. Prieiga per
internetą: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab3.html.
76. Thude S, Classen B. High molecular weight constituents from roots of Echinacea pallida: An
arabinogalactan-protein and an arabinan. Phytochemistry 2005;66:1026–1032.
77. Volk R-B, Blaschek W Classen B. Characterization of an arabinogalactan protein from the pressed
juice of Echinacea purpurea: investigations into the type of linkage between the protein and
polysaccharide moieties. J Nat Med 2007;61(4):397-401.
78. Ellis M, Egelund J, Schultz J, Bacic A. Arabinogalactan-Proteins: Key Regulators at the Cell
Surface. Plant Physiol 2010; 153(2) 403-419.
54
7. PRIEDAI
9.1. Publikacija, atiduota žurnalo „Acta Pharmaceutica“ redakcijai
Fractionation and determination of proteins in Echinacea purpurea (L.) Moench roots
Gabriele Balciunaite1, Jovita Juodsnukyte
1, Arunas Savickas
3, Ona Ragazinskiene
4, Luka Siatkute
1 Gitana
Zvirblyte2, Edita Mistiniene
2, Nijole Savickiene
1*
1Department of Pharmacognosy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania
2 Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
3Department of Social Pharmacy and Drug Technology, Lithuanian University of Health Sciences,
Kaunas, Lithuania
4Kaunas Botanical Garden of Vytautas Magnus University Kaunas, Lithuania
ABSTRACT
Echinacea purpurea (L.) Moench, a member of the Asteraceae family, is a plant rich in
flavonoids, essential oils, phenolic compounds, saponins, polysaccharides, and glycoproteins. The study
was aimed at evaluating the protein content in dried roots of Echinacea purpurea (L.) Moench after the
homogenization of the dried roots with liquid nitrogen, extraction in 0.01 mol L-1
phosphate-buffered saline
(PBS), and purification followed by fractionation of proteins using gel filtration chromatography. The total
protein concentration was measured using the Bradford method, and the evaluation of the molecular mass
of proteins was accomplished by applying the SDS-PAGE gel electrophoresis. The Bradford assay revealed
that these fractions had the highest concentration of proteins (4.66 - 6.07 mg mL-1
).
Glycoproteins, alkamides, and polysaccharides of Echinacea purpurea (L.) Moench roots are the
chemical compounds responsible for the immunomodulatory properties. However, there is a lack of
information about difference of protein content in E. purpurea fresh and dried roots material.
9.2. Tezės, pristatytos Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje 2014
Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių,
Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Luka Šiatkutė, Greta Kalvaitytė, Jovita Juodsnukytė
Farmakognozijos katedra, Neuromokslų institutas
Vadovas: Prof. N. Savickienė, prof. D. Majienė
55
Sparčiai augant lėtinėmis ligomis sergančių žmonių skaičiui, vis labiau domimasi natūraliomis
antioksidaciniu poveikiu pasižyminčiomis prevencinėmis priemonėmis. Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų
radikalų susidarymo ir antioksidantų apsaugos, patiriamas oksidacinis stresas, kuris gali inicijuoti tokias
lėtines ligas, kaip aterosklerozė, cukrinis diabetas, lėtinis inkstų nepakankamumas, reumatoidinis artritas
bei įvairios neurodegeneracinės ligos. Antioksidacinis aktyvumas – tai gebėjimas neutralizuoti laisvųjų
radikalų poveikį ir tokiu būdu sumažinti jų daromą žalą organizmui, sustiprinti ląstelės apsaugos sistemas
ir atkurti pažeistas struktūras. Antioksidaciniu aktyvumu pasižymi ir kai kuriuose augaluose aptinkami
biologiškai aktyvūs junginiai - lektinai. Tai neimuninės kilmės baltyminės medžiagos, atpažįstančios bei
gebančios jungtis prie įvairių angliavandenių. Lektinai geba sukelti eritrocitų bei kitų ląstelių agliutinaciją,
mitogeninę limfocitų stimuliaciją, inicijuoja supresinių ląstelių gamybą, histamino išsiskyrimą iš bazofilų
bei putliųjų ląstelių, sustiprina makrofagų fagocitozę, slopina auglio ląstelių bei grybelių augimą, pasižymi
imunomoduliuojančiu poveikiu in vivo, taip pat toksiškumu ląstelėms ir daugeliu kitų savybių.
Darbo tikslas:
Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių,
Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Baltymų, praturtintų lektinais, frakcijos paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos,
V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute, dalyvaujant bendrame Lietuvos – Baltarusijos
projekte „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant
potencialius immunomoduliatorius ir citostatikus“.
Uždaviniai:
1. Ištirti Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L. žolės,
Cetraria islandica L. gniužulų lektinų turinčių baltymų frakcijų antioksidacinį aktyvumą, panaudojant
ABTS (azinobisetilbenzotiazolinsulfo rūgšties) radikalus.
2. Palyginti tiriamų objektų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo metodika:
Taikytas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. Naudota spektrofotometrinė analizė, kai
absorbcijos maksimumas - 734 nm bangos ilgio. ABTS radikalas po aktyvavimo kalio persulfatu laikytas
tamsioje, vėsioje vietoje 16 valandų. Naudotas buferinis fosfato druskos tirpalas (PBS), užtikrinantis 7,4
pH reikšmę.
Tyrimas vykdytas į PBS tirpalą pilant skirtingus kiekius lektinų (mikrolitrais) ir pridedant
aktyvuoto kalio persulfatu ABTS mėlynos spalvos tirpalo. Sumaišius šiuos reagentus, vykdyta
56
spektrofotometrinė analizė. Gauti rezultatai lyginti su kontroliniu tirpalu – ABTS radikalu-katijonu PBS
tirpale.
Rezultatai:
1. Paveikus Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių baltymų frakciją, turinčią
lektinų, aktyvuotu ABTS tirpalu, absorbcija pradeda mažėti, esant 50µl baltymų 1ml tirpalo (absorbcija –
0,448±0,016 nm). Esant 75µl baltymų 1ml tirpalo, absorbcija sumažėjo beveik dvigubai ir toliau mažėjo
didinant baltymų, praturtintų lektinais, kiekį tirpale.
2. Paveikus Chelidonium majus L. žolės baltymų frakciją, turinčią lektinų, aktyvuotu ABTS
tirpalu, absorbcija mažėjo nuo 0,692±0,033 nm iki 0,216±0,034 nm. Mažiausia absorbcija (0,216) stebėta,
esant 7 µl didžiųjų ugniažolių žolės baltymų1 ml tirpalo.
3. Paveikus Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakciją, turinčia lektinų, aktyvuotu ABTS
tirpalu, absorbcija mažėjo nuo 0,706±0,009 nm iki 0,457±0,011 nm. Mažiausia absorbcija (0,457)
pasiekiama, esant 300 µl baltymų 1 ml tirpalo.
Išvados:
1. Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniasitiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria
islandica L. Ach. gniužulų baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, pasižymėjo antioksidaciniu aktyvumu,
surišant ABTS radikalą.
2. Lyginant baltymų frakcijas, praturtintas lektinais tarpusavyje stipriausiu antioksidaciniu
aktyvumu (71,29%) pasižymėjo Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcija.
3. Lyginant baltymų frakcijas, praturtintas lektinais tarpusavyje silpniausiu antioksidaciniu
aktyvumu (39,31%) pasižymėjo Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakcija.
9.3. Tezės, pristatytos tarptautinėje konferencijoje “The 5th
International Conference on Pharmaceutical
Sciences and Pharmacy Practice“
Determination of antioxidant activity of capsules with proteins isolated from Echinacea purpurea
(L.) Moench roots and rhizomes
Luka Šiatkutė1, Nijolė Savickienė
1, Arūnas Savickas
2, Gitana Žvirblytė
3, Olga Kandelinskaya
4, Helena
Grischenko4
1 Department of Pharmacognosy, Lithuanian University of Health Sciences, Lithuania;
2Department of
Drug Technology and Pharmaceutical Management, Lithuanian University of Health Sciences, Lithuania
57
3Department
of Eukaryote Gene Engineering, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Lithuania;
4V.F.Kuprevich Institute of Experimental Botany of Belarus Academy of Sciences, Belarus
Echinacea purpurea (L.) Moench (Asteraceae family) is a plant known not only for its
immunostimulant, but also for antioxidant activities (Kumar et al., 2000). E. purpurea roots and rhizomes
contain protein which binds arabinogalactan (Bossy et al., 2009). It is a protein with molecular weight of
30 kDa and dominating amino acids - hydroxyproline, asparagine/aspartic acid and glutamine/glutamic
acid (Blaschek et al., 2007). Other researches show that proteins, protein hydrolysates, peptides and amino
acids from some plants have antioxidant activity and are an important group of natural antioxidants
(Rajalakshmi et al., 1996, Elias et al., 2008).
Aim of experiment: to determine the antioxidant activity of capsules with proteins isolated from
Echinacea purpurea (L.) Moench roots and rhizomes.
Experiment tasks: 1. To evaluate antioxidant activity of proteins from E. purpurea roots and
rhizomes; 2. To prepare capsules with proteins from E. purpurea roots and rhizomes; 3. To determine
antioxidant activity of capsules with proteins from E. purpurea roots and rhizomes.
Materials and methods: 1. Protein fractions isolated from Echinacea. purpurea (L.) Moench
roots and rhizomes were obtained from V.F.Kuprevich Institute of Experimental Botany of Belarus
Academy of Sciences. 2. Antioxidant activity of proteins isolated from Echinacea purpurea was
determined using ABTS method. 50µl of ABTS solution was mixed with PBS buffer and various volume
of protein solution: 50µL, 75µL and 100µL. Also control solution - 50µl of ABTS and 950µl of PBS was
prepared. The light absorbance of control and sample solutions was measured at a wavelength of 734 nm.
3. Capsules were made form proteins with silicified microcrystalline cellulose (Prosolv®) and hydrophilic
fumed silica (Aerosil®). Mixture was left at 20˚ C temperature overnight for the drying process and then
sifted through 2mm sieve. Capsules size 0 were made using capsule filling machine. Each capsule weights
0.34±0.026g and contains 0.063±0.003g dry powder of proteins, 0.064±0.0019g of Aerosil® and
0.213±0.0053g of Prosolv®. 4. One of the prepared capsules was dissolved in 37oC distilled water and
samples were taken after 15, 30, 45 and 60 minutes (Ku et al., 2010). Antioxidant activity of those
samples was measured. 100µl of every sample was mixed with 65µl of ABTS and 835µl of PBS. The light
absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. Results were compared with control solution, made
from 65µl of ABTS and 935µl of PBS (Re et al., 1999). 5. The results were analyzed with MS Excel.
Results are statistically significant (p < 0.05).
58
Results: Results of antioxidant activity of proteins from E. purpurea before and after
encapsulation are shown in table 1 and table 2.
Table 1. Antioxidant activity of proteins isolated from Echinacea purpurea (L.) Moench roots and
rhizomes.
Volume of proteins
solution (µL) in
1mL of sample
solution with
ABTS and PBS
Amount of
proteins
(µg) Average of
absorption Antioxidant activity, %
50µL 1.35µg 0.448±0.016 26.852
75µL 2.025µg 0.307±0.008 49.891
100µL 2.7µg 0.284±0.016 53.595
Control solution 0 0.612±0.013 0
Table 2. Antioxidant activity of proteins from Echinacea purpurea (L.) Moench roots and rhizomes after
dissolution of capsules.
Release from capsules time Average of absorption Antioxidant activity, %
After 15 min. 0.7139±0.01 2.19
After 30 min. 0.6608±0.006 9.47
After 45 min. 0.6601±0.023 9.56
After 60 min. 0.6715±0.004 8.00
Control solution 0.7299±0.015 0
Antioxidant activity was measured using formula % = 100- (A*100/Ast), where A is an average of
samples absorption, Ast – an average of standard absorption.
Conclusion: proteins from E. purpurea roots and rhizomes have antioxidant activity, but it
decreases after encapsulation. To evaluate an influence of excipients on the depression of antioxidant
activity, further experiments should be done. Furthermore, it is important to determine the relation
between concentration of proteins and antioxidant activity.
59
