CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLOGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS N° 93

Alumno:Cecilia Guadalupe Garcia Rodríguez

Trabajo:Manual De Tinciones

Materia:Submodulo III: Cuantifica microorganismo con base a normas.

Profesor:Julián Reyes Mejía

Especialidad:Laboratorista Químico

Grado: 4 Grupo: A

Turno: Vespertino

Fecha: 26 De Mayo De 2015

Introducción

En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición, estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscópico el facilita notablemente la observación; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación de ciertas estructuras celulares.Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. En este manual veremos algunas de ellas y se explicara para que sirven.

Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.

En microbiología el microscopio se utiliza de formarutinaria, ya que proporciona importante información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos.En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y

de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos.

Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser

aplicadas dentro del campo de la microbiología.

De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales. En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos. Diferentes tipos de tinciones biológicas son utilizadas también para marcar células en citometría de flujo y para marcar proteínas ó ácidos nucleicos en electroforesis en gel. Las tinciones no están limitadas a su uso en materiales biológicos, también pueden ser utilizadas para estudiar la morfología de otros materiales (por ejemplo, las estructuras lamelares de polímeros semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques de copolímeros).

¿Qué es tinción?

Se denomina tinción al proceso y el resultado de teñir (otorgar un color a una cosa). El concepto deriva del vocablo latino tinctĭo.

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales. Con la tinción, es posible mejorar la definición de grupos de células o de fragmentos de tejido. También, mediante tinturas especiales, se puede medir la presencia de ciertas sustancias o elementos en un compuesto.En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos.Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología.

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes

naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango de espectro visible. Los cromóforos se pueden presentar en dos formas fundamentales: en sistemas conjugados o complejos metálicos. Los cromóforos son principalmente grupos funcionales con dobles y triples enlaces carbono-carbono, anillos aromáticos, grupos carbonilos, imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un átomo con pares libres).Los auxócromos son grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensificar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados; su función es desplazar a los cromóforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la intensidad. Los siguientes grupos funcionales son considerados auxócromos: grupo metilo, halógenos. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes. 2. . Revelan su forma y tamaño.

3 Muestran la presencia de estructuras internas y externas. 4. Producen .reacciones químicas específicas. Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico). El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se asegura que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica, la tinción de un agente infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual funcionará como un control positivo. Algunas técnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes de su proceso la fijación de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura estructural y química de las células. Existen dos tipos de fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de fijación físicos se tienen los siguientes:

desecación, calor seco, calor húmedo, ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de fijación químicos se pueden clasificar como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades químicas. Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico, ácido acético, ácido pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes químicos reductores son: formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, paraldehído, etcétera.8 Quizá el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las células y los microorganismos. Sin embargo, la sobreexposición, o la exposición en una zona incorrecta de la fl ama (zona fría, zona caliente y zona de fusión) repercutirá en el efecto deseado; es muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción celular. Este método preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se recomienda utilizar un método químico, que precipite proteínas, antes de teñir. Los métodos químicos ofrecen mejores resultados para la fijación, ya que son líquidos con potencial alto de difusión intracelular y detienen procesos enzimáticos que provocan autolisis. Los reactivos poseen la capacidad de interactuar con biomoléculas como proteínas, glicoproteínas, peptidoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pépticos y nucleicos. El metanol es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de tal manera, coagula proteínas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se preserva la arquitectura de la pared celular y evita la sobrecoloración. El metanol tiene un potencial reductor mayor que el etanol. La concentración ideal es 99%. El metanol preserva la integridad de los ácidos nucleicos, por lo que también es ideal para inmunohistoquímica e hibridación in situ.3,8,9 A continuación se mencionarán las principales técnicas de tinción utilizadas en microbiología, así como su fundamento e interpretación para realizar la correcta identificación de los microorganismos.

Colorantes histológicos más comunes

Los diferentes colorantes reaccionan o se concentran en diferentes partes de las células o tejidos, y estas propiedades son utilizadas como una ventaja para revelar partes o áreas específicas. Algunos de los colorantes biológicos más comunes se listan más abajo. A menos que se indique lo contrario la mayoría de estos colorantes se utilizan con células y tejidos fijados. Las tinciones vitales (que pueden ser utilizadas con organismos vivos) se encuentran destacadas.

Azul brillante de Coomassie

Azul de Coomassie (también conocido como Coomassie blue) es un colorante que tiñe en forma no específica a todas las proteínas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente para teñir las corridas de proteínas en las electroforesis en gel.

Azul de metileno

El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.

Azul Nilo

El Nile Blue o Nile blue A, es decir, azul Nilo, tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.

Bismarck brown

Bismarck brown (Marrón Bismarck, también conocido como Bismarck brown Y o Manchester brown) imparte un color amarillo a las mucinas ácidas. Se puede utilizar con células vivas.

Bromuro de etidio

El bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teñir células vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar células que se encuentran en las

etapas finales de la apoptosis, ya que tales células poseen unas membranas mucho más permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las bandas de ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante puede ser utilizado en combinación con naranja de acridina (NA) en el conteo de células viables. Esta tinción combinada BE/NA le otorga a las células vivas un color verde fluorescente mientras que las células apoptóticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja.

Carmín

El carmín es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que se adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.

Cristal violeta

El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.

DAPI

El DAPI es un colorante nuclear (tiñe el núcleo) fosforescente, se excita con luz ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido al ADN. El DAPI se une a las regiones de alta repetición A=T en los cromosomas. Además no es visible cuando se utiliza con un microscopio de transmisión corriente. Puede ser utilizado en células vivas o fijadas. La técnica de tinción con DAPI es especialmente adecuada para el recuento celular.[6]

Eosina

La eosina se utiliza más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción. De hecho existen dos compuestos muy estrechamente relacionados (aunque no iguales) conocidos como eosina. El más frecuentemente utilizado es la eosina Y (también conocida como eosina amarillenta) ya que posee una tonalidad amarillenta muy suave. El otro compuesto conocido como eosina es la eosina B, también conocida como eosina azulada o rojo imperial, la cual posee una suave tonalidad azul. Los dos colorantes son intercambiables, y el la utilización de uno u otro es más una cuestión de preferencia y tradición.

Fucsina ácida

La fucsina ácida puede ser utilizada para colorear colágeno, músculo liso o mitocondrias. Forma parte de la coloración tricrómica de Mallory donde se utiliza para colorear núcleo y citoplasma. En la tinción de Van Gieson (picrofucsina), la fucsina es la responsable de dar el color rojo a las fibras de colágeno. También es una coloración tradicional para colorear mitocondrias (método de Altmann).

Hematoxilina

La hematoxilina es un colorante nuclear. Utilizado con un mordiente, la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de color azul violeta a negro. Con gran frecuencia se utiliza en combinación con eosina en la coloración H&E (hematoxilina y eosina), una de las más comunes utilizadas en histología.

Hoechst

Hoechst es un compuesto derivado bis-benzimidazol que se une al surco menor del ADN. Se utiliza con frecuencia en microscopía de fluorescencia para colorear el ADN. Hoechst tiene color amarillo cuando se encuentra disuelto en agua, y emite luz azul cuando recibe luz ultravioleta. Hay dos tipos principales de colorantes Hoechst. Hoechst 33258 y Hoechst 33342. Ambos compuestos son funcionalmente similares, aunque poseen pequeñas diferencias en su estructura. El Hoechst 33258 contiene un hidroxilo terminal, y por lo tanto es más soluble en solventes acuosos, aunque esta característica disminuye su habilidad para penetrar la membrana plasmática. El Hoechst 33342 contiene un grupo etilo en sustitución del grupo hidroxilo terminal (un grupo etileter), lo que lo hace más hidrofóbico, y con mejor penetración en la membrana plasmática.

Lugol

El yodo se utiliza en química analítica como indicador para el almidón. Cuando se mezcla almidón con una solución de yodo, se desarrolla un color intensamente azul, representando la formación del complejo de inclusión yodo/almidón. El almidón es una sustancia muy común en la mayor parte de las células vegetales, de modo que una solución diluida de yodo puede colorear el almidón presente en las células. El yodo también es componente de la coloración de Gram utilizada en microbiología. La solución de Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solución de color marrón que se torna negra en presencia de almidones y puede ser utilizada para colorear células, haciendo más visible el núcleo. En la coloración de gram el yoduro se utiliza como mordiente, aumentando la capacidad del colorante para entrar en las células a través de los poros presentes en la membrana o pared celular.

Naranja de acridina

El naranja de acridina es un colorante fluorescente, catiónico y selectivo para ácidos nucleicos útil para demostraciones sobre el ciclo celular. Es capaz de atravesar la membrana celular e interactúa con el ADN y el ARN por intercalación o interacciones electrostáticas. Cuando se une al ADN presenta un espectro muy similar al de la fluoresceína. Al igual que la fluoresceína, se puede utilizar también como una tinción inespecífica para dar un trasfondo fluorescente (contraste) a tinciones convencionales en la superficie de muestras sólidas de tejidos (coloración de contraste fluorescente).[7]

Plata

Una tinción argéntica es el uso de plata para colorear preparados histológicos. Este tipo de coloración es especialmente importante para demostrar proteínas (por ejemplo el colágeno tipo III) y ADN. Se utiliza para facilitar la visualización de ambas sustancias tanto dentro como fuera de las células. También se utiliza la tinción argéntica en la electroforesis en gel en gradiente de temperatura.

Algunas células argentafines reducen las soluciones de plata a plata metálica, luego de la fijación con formalina. Este método fue descubierto por el fisiólogo italiano Camillo Golgi, utilizando una reacción entre el nitrato de plata y el dicromato de potasio, para precipitar cromato de plata en algunas células (método de Golgi). Otras células son argirofílicas: reducen la plata a su forma metálica luego de ser expuestas a una tinción que contiene un agente reductor como la hidroxiquinona o formalina.

Rodamina

La rodamina es una tinción fluorescente específica para proteínas utilizada comúnmente en microscopía fluorescente.

Rojo neutro

El rojo neutro (toluylene red) colorea de rojo a la substancia de Nissl. Con frecuencia se utiliza como contracoloración en otras técnicas de tinción.

Rojo Nilo

El Rojo Nilo (también conocido como oxazona del azul nilo) se produce hirviendo el Azul Nilo con ácido sulfúrico. Este tratamiento produce una mezcla de Rojo y Azul Nilo. El Rojo Nilo es una coloración lipofílica, y se acumula en los glóbulos lipídicos en el interior de las células, y los colorea de rojo. El Rojo Nilo puede utilizarse con células vivas. Fluoresce fuertemente cuando se encuentra particionado en lípidos, pero prácticamente no presenta fluorescencia en soluciones acuosas.

Safranina

La safranina (o safranina O) es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración amarilla al colágeno.

Sudan

La coloración de Sudán se utiliza para destacar sustancias "sudanofílicas", por lo común, lípidos. También se utiliza para determinar los niveles de grasa en materia fecal para diagnosticar esteatorrea. Hay varios colorantes de la familia sudan, por ejemplo: Sudan III, Sudan IV, Oil Red O, y Sudan Black B.

Tetróxido de osmio

El tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para colorear lípidos. Se disuelve con facilidad en las grasas y se reduce a osmio metálico al interactuar con material orgánico, dejando un color marrón o negro característico.

Verde de metilo

El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro, para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.

Verde malaquita

El verde malaquita (conocido también como diamond green B o victoria green B) puede ser utilizado como contracoloración azul-verdosa en combinación con la safranina un ejemplo es la coloración de Gimenez para bacterias. También se puede utilizar directamente para colorear endosporas.

En microscopía electrónica

Al igual que en la microscopía óptica, se puede hacer uso de sustancias que aumentan el contraste en la microscopía de transmisión electrónica. Por lo general se utilizan sustancias electrondensas, o metales pesados.

Ácido fosfotúngstico

El ácido fosfotúngstico es un colorante negativo común utilizado para resaltar virus, nervios, polisacáridos, y otros tejidos y materiales biológicos.

Tetróxido de osmio

El tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para teñir lípidos. Se disuelve en grasas y se reduce por la presencia de materiales orgánicos a osmio metálico, dejando un residuo negro fácilmente visible. Debido a que es un metal pesado, que absorbe los electrones, es quizá la coloración más común para resaltar morfologías en la microscopía electrónica. También se utiliza para la tinción de varios polímeros para el estudio de los mismos por TEM. El OsO4 es muy volátil y extremadamente tóxico. Es un agente oxidante fuerte, ya que en él el osmio tiene un estado de oxidación +8. Oxida agresivamente muchos materiales, dejando un depósito de osmio no volátil en un estado de oxidación bajo.

Tetróxido de rutenio

El tetróxido de rutenio es igualmente volátil e incluso más agresivo que el tetróxido de osmio, lo que permite colorear materiales que se resisten a la coloración con osmio. Por ejemplo el polietileno.

Otros

Otros compuestos químicos utilizados en microscopía electrónica: molibdato de amonio, yoduro de cadmio, carbohidrázida, cloruro férrico, hexamina tricloruro de indio, nitrato de lantano, acetato de plomo (II), citrato de plomo, nitrato de plomo (II), ácido peryódico, ácido fosfomolíbdico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata, cloroaurato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbázida, acetato de uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo.[

Tinción de Gram.

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM Descripta en

forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%- 90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2 ; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2 -cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también

puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Tinción De Esporas (Wirtz-Conklin)Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

Objetivos: Observar las endosporas y su disposición en las formas vegetativas, Comparar las distintas morfologías y disposiciones que adoptan las endosporas en las especies empleadas.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Tinción  de  flagelos o Leifson

Es una tinción para lograr observar flagelos de bacterias, Los flagelos, largos y finos apéndices de las cúlulas bacterianas que les permiten moverse, son tan delgados que resultan invisibles al microscopio óptico, si no se realiza una técnica especial para su tinción. Los distintos métodos de tinción utilizan combinaciones de mordientes y metales para engrosar los flagelos, así como colorantes para teñirlos. Es usada en laboratorios, pero no de rutina. Los pasos que sigue son el de usar rosanilina sirve como tinción principal, y ácido tánico es agregado a la solución como mordiente.Los Reactivos correspondientes para esta tinción son:Fucsina básica en Alcohol etílico. Ácido tánico en agua destilada.Cloruro de sodio en agua destilada.Método de KodakaFlagelosÓrganos de locomoción.Filamentos simples químicamente compuestos de proteína conocida como flagelina. 

Tienen su origen en el protoplasma de la célula bacteriana y su espesor es alrededor de 0.01 micrones. Algunos Tipos de flagelos son: monotricas, lofotricas, anfitricas y peritricas.

Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B, y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas.Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual previamente fue sumergido en mezcla crómica durante 24 horas, lavado 

posteriormente con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces. 

Colocar dentro del círculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensión bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra, luego Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se hace usando la flama del mechero se pueden destruir los flagelos.

Humedecer la preparación con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo frío, por ultimo lavar con agua destilada & observar resultados

Visión al microscopio de una tinción de flagelos, se observan bacilos curvos, algunos prácticamente en forma de media luna. La punta de flecha muestra la inserción de los flagelos.

Tinción azul de metileno de Loeffler

El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos. El azul de metileno, cuyo nombre científico es cloruro de metiltionina, es un colorante orgánico que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia.

Es un compuesto químico heterocíclico aromático, La empresa farmacéutica TauRx Therapeutics ha comprobado que el uso del azul de metileno retrasa el deterioro de las funciones cognitivas de los enfermos de Alzheimer. De cualquier manera, la formulación empleada en los ensayos clínicos no es la utilizada para teñir las células y, por tanto, no debe utilizarse.

Tinción de Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) , como M. tuberculosis o el género Api complexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) , como M. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue descrita por primera vez por

dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.

Resultados: BAAR: rojo. Amarillo, Núcleos: azul semiamarillo.

Usando la tinción de Ziehl-Neelsen.

Fundamento

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía

cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Técnica

Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.

Variante histológica

Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:

1. ácido peryódico  58%

2. carbol fucsina de Ziehl culina(fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:

1. 0,5 g fucsina básica

2. 50 ml agua destilada

3. 5 ml etanol absoluto

4. 28,5 g cristales de fenol derretidos

3. hematoxilina

4. alcohol ácido 1%:

1. alcohol de 35º

2. ácido clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. desparafinar e hidratar los cortes

2. ácido periódico 5%, 10 min

3. lavar con agua destilada

4. fucsina fenicada, 15 min

5. decolorar en alcohol ácido al 50%

6. lavar con agua destilada

7. hematoxilina, 10 min

8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio

9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

Resultados

BAAR: rojo.amarillo

Núcleos: azul semiamarillo.

Variante clásica o "en caliente"=

1. Hacer un frotis de la muestra.

1. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba.

2. Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

3. Aplicar fucsina-fenicada.

1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período,

4. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

5. Decolorar con alcohol-ácido.

1. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

6. Aplicar azul de metileno (1 minuto).

1. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

7. Enjuagar con agua

1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

8. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 100 x 100

o en "frío" (Tinción de Kinyoun)

1. Hacer un frotis.

2. Dejarlo en el puente de tinción.

3. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).

4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.

5. Decolorar con alcohol ácido.

6. Lavar con agua del grifo.

7. Contrastar con azul de metileno

Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes

Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.

Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.

Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].

Tincion Masson o Azul de Anilina

La tinción tricrómica de Masson, al igual que otras tinciones tricrómicas, es una técnica de coloración especial que permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseñados para dar resistencia; también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular, el citoplasma y las fibras de colágeno. En primer lugar, se tiñen las secciones con un tinte ácido tal como escarlata de Biebrich. Todos los elementos acidófilos del tejido tales como el citoplasma, el músculo y el colágeno se unirán a los tintes ácidos. Las secciones entonces se tratan con ácido fosfotúngstico y/o fosfomolíbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colágeno pero no del citoplasma. Los

ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos tienen numerosos grupos ácidos que probablemente actúen como medio de unión entre el colágeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colágeno. Probablemente, el pH de la solución fosfotúngstico/fosfomolíbdico también aumente la coloración y ayude al colágeno en la difusión o el retiro de los colorantes. Análisis de resultadosFibras de colágeno = Azul, Por tanto, el tejido conjuntivo se teñirá de dicho color.Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo. Se teñirán de rojo la queratina, los glóbulos rojos y el tejido muscular. Núcleo celular = Lila, marrón.

Naranja De Acridina El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos. Es capaz de atravesar la membrana celular e interactúa con el ADN y el ARN por intercalación o interacciones electrostáticas. Cuando se une al ADN presenta un espectro muy similar al de la fluoresceína. Al igual que la fluoresceína, se puede utilizar también como una tinción inespecífica para dar un trasfondo fluorescente (contraste) a tinciones convencionales en la superficie de muestras sólidas de tejidos (coloración de contraste fluorescente

Tinción Negativa o Tinta China

Tinción negativa es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre

un campo de fondo oscuro.1 En caso de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo molibdato de amonio. Al electrónico, esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamaño.

Tinción de Giemsa

La tinción de Giemsa (pr. guímsa), ideada por el alemán Gustav Giemsa, es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de Giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se pueden emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el Plasmodium falciparum; también se emplea la tinción de Wright. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos químicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrón de bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificación de cromosomas marcadores. Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno, Azure A y Azure B como tintes básicos, y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno y el Azure son colorantes metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9. Para muestras histológicas, los mejores resultados se obtienen en muestras fijadas con formol, incluidas en parafina y cortadas entre 3 y 6 micras. Los términos colorante metacromático y su propiedad denominada metacromasia se refieren a un colorante que al entrar en contacto con la muestra a teñir cambia su propio color original; los ejemplos clásicos de esta característica son el azul de

metileno -como bien dice la bibliografía- y el azul de tolouidina. Su aspecto en el corte histológico da un púrpura-rojizo. Es usado, además de los extendidos de sangre, en los cortes de cartílago hialino debido a la gran carga de glucosaminoglucanos ácidos.

1. Se aplica giemsa en la muestra y encima bufer(solución amortiguadora) Por 30 minutos, luego secar.

Resultados:

1. Citoplasma: morado2. Núcleos: azul3. Eritrocitos: rosa - naranja4. Gránulos de las células cebadas: púrpura5. Bacterias: azul6. Parásitos: azul

Tincion de Blanco De Calcoflúor

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

Tinción hematoxilina- eosinaLa tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es el método de tinción de rutina utilizado en histología y medicina diagnóstica.

El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul ypúrpura,como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

Procedimiento: Sumergir los preparados histológicos en xilol para eliminar los excesos de parafina. El xilol es un alcohol tóxico pero existen reactivos (como el Hemo-D) que ejercen la misma función aclarante de parafina sin la toxicidad del xilol.

Luego pasan por una serie de alcoholes en concentración decreciente para rehidratar la muestra (100°, 95° y 70°).

Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para

eliminar excesos y se pasa rápidamente por alcohol ácido. Se lava nuevamente Se sumerge 30 segundos en eosina. Se pasa por otra serie de alcoholes, esta vez en orden

creciente (70°, 95° y 100°) para deshidratar la muestra y que se pueda realizar el montaje con un pegamento no soluble en agua.

Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

Resultados:

Núcleo celular: violeta Citoplasma: Rosa Musculatura: Rojo , rosa o fucsia Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado Fibrina: Rosa

Tinción De Rodamina-AuraminaLos ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

Tinción de AlbertUna mezcla acidificada de colorantes azul de toluidina y verde de metilo en solución hidroalcoholica, en donde el azul de toluidina tiñe los granulos metacromaticos y el verde de metilo tiñe preferencialmente el citoplasma, luego el colorante se fija con una solución de yodo/yoduro (Lugol). Esto facilita diferenciar el bacilo diftérico por su contenido de granulos de Polimeta-fosfato, compuesto que se colorea metacromaticamente con el colorante de Albert, quedando los gránulos de color azul oscuro y el cuerpo del bacilo de color verde claro.

Tinción de AbbottLa preparación se cubre con azul de metileno, se calienta a ebullición y se lava con agua y alcohol con 0.2 a 3% de ácido clorhídrico. Se lava nuevamente con agua y se tiñen durante 8 a 10 segundos con una solución de anilina-fucsina. Las esporas se tiñen de azul y las bacterias de rojo.

Tinción de GromoriLa tinción de Gromori es utilizada para la demostración de enzimas, especialmente fosfatasas y lipasas. También evidencia fibras de tejido conjuntivo y gránulos de secreción. En un paso es un método idóneo para teñir fibrina, tejido muscular y citoplasmas, donde destaca esencialmente el condrioma como un fino granulado rojizo. Sin embargo, por su pH ácido, que se encuentra entre 2.5 y 2.7 (ligeramente por encima del óptimo para la tinción del colágeno), se presenta como una tinción incompleta y difusa del componente fibrilar más fino (membrana basal y finas fibras reticulares). Esta técnica combina un colorante plasmático (cromotropo 2R) y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido acético glacial. El tratamiento previo de las secciones con solución de Bouin caliente intensifica la tinción. El ácido fosfotúngstico favorece la coloración roja de músculo y citoplasmas. Las fibras de colágeno toman los iones detungstato formando un complejo al que se une el verde luz. El baño de ácido acético hace los colores más trasparentes pero no altera el balance de color.

Tinción de Grocott

La plata metanamina de Grocott es un método de tinción especial más empleado para hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina (o metenamina) produciendo una coloración de café a negra, debido al depósito de platareducida en los lugares de localización de los aldehídos.

También se utiliza para la identificación de la melanina. Este pigmento es producido en la piel por los melanocitos. En los humanos la melanina se encuentra en piel, cabello, en el recubrimiento de laretina. Aunque los seres humanos generalmente poseen una concentración similar de melanocitos en su piel, estos expresan en algunos individuos y en algunas etnias más frecuentemente el genproductor de melanina, por lo que se confiere una mayor concentración de melanina en la piel.

Tinción de LeeAzul de metileno y fucsina básica. Se utiliza a menudo como una tinción general, siendo mejor que la H&E para los tejidos musculares. Los núcleos tiñen de azul, las mitocondrias, los cilios y algunos gránulos tiñen de rojo o rosa. Los cartílagos y la mayor parte de las inclusiones celulares tiñen de azul a púrpura.

Tinción de Loeffler Es (para bacilos del muermo, en cortes). Se tiñen los cortes de parafina durante 20 min en la solución de azul de metileno de Löffler o en partes iguales de una solución de Koch al 1:10.000 y violeta de genciana; se colocan durante 5 min en 10 ml de agua destilada que contenga 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado y 1 gota de ácido oxálico al5 %. 11 (para flagelos). Colocación de la preparación durante 1 min en una solución recientemente filtrada de 10 9 de ácido tánico en 50 ml de agua, 2,5 ml de solución fría saturada de sulfato ferroso y 0,5 ml de solución acuosa o alcohólica de fucsina o violeta de genciana. Se calienta 1 min en el portaobjeto sin hervir; se lava la preparación y se tiñe con una solución recientemente preparada y filtrada de violeta de genciana o fucsina-anilina.

Tinción de Mallory Una técnica para el estudio del tejido conjuntico. Los cortes se tiñen con fucsina ácida, solución de azul-naranja G de anilina y ácido fosfotungstico. Las fibras de colágeno aparecen en azul, la fibroglia, neuroglia y fibras musculares aparecen en

rojo y las fibrillas de elastina en naranja. También llamada tinción tricrómica de Mallory. Es utilizada para el estudio del tejido conectivo, glándulas, hongos, piel, lengua, etc. Desarrollada por Frank B. Mallory está constituida por tres colorantes:

1. Fucsina ácida.2. Orange G3. Azul de anilina.

Tinción de May- Grunwald Giemsa

La tinción de May Grünwald-Giemsa (MGG) es una técnica de tinción derivada del método de Romanowsky que se utiliza principalmente para el coloreo de muestras de frotis sanguíneos o extendidos de médula ósea. Como el resto de las coloraciones basadas en la técnica de Romanowsky, la técnica MGG permite diferenciar cualitativa y cuantitativamente los principales elementos formes de la sangre.

En los laboratorios clínicos de hematología resulta especialmente útil para la demostración de alteraciones en el número, proporción y morfología de las células sanguíneas. También puede ser adaptada para su utilización como una técnica de tinción clásica para cortes histológicos.

Como su nombre lo indica, la técnica combina las técnicas de coloración desarrolladas por May-Grünwald y Giemsa. Estas técnicas a su vez se basan en el empleo de dos soluciones colorantes:

La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol

La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidación de este último tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo.

Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se unen selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles.

Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son llamados basófilos: (ADN,mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en ARN).

Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen selectivamente al tinte ácido eosina, tiñéndose en variados tonos de naranja y rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos eosinófilos.

Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta.

Cabe destacar que las coloraciones finales obtenidas son muy dependientes del pH de las soluciones de tinción y de las soluciones de lavado, por lo que los tonos pueden variar bastante, teniendo un aspecto más verdoso cuando el pH final obtenido es cercano a 5 y un tono rojizo cuando el pH final es cercano a 9. Para evitar estos efectos se suelen utilizar soluciones amortiguadoras de pH neutro para preparar las soluciones de tinción y las soluciones de lavado.

Tinción de Nissl

La tinción de Nissl es una tinción usada comúnmente en secciones de tejido nervioso, aunque puede usarse para teñir ácido nucleicos en cualquier tejido. El colorante en el que se basa la tinción es normalmente el azul de toluidina o el violeta de cresilo. El más usado es el violeta de cresilo, que es el que se describe más abajo. En el citoplasma de las neuronas aparecen unas estructuras fuertemente teñidas con esta tinción. Se denominan cuerpos de Nissl y se corresponden con cúmulos de retículo endoplásmico rugoso. Este orgánulo celular se tiñe con los colorantes básicos puesto que contiene una gran concentración de ribosomas y por tanto de ARNr y ARNm en proceso de traducción, siendo ambas moléculas ácidos nucleicos. La calidad de la tinción depende del tiempo de diferenciación durante la deshidratación final, luego los tiempos en estos alcoholes afectarán al resultado final.

Si se quiere que las gotas de lípidos o la mielina no interfieran con la tinción de los cuerpos celulares se pueden deshidratar en etanol creciente y volver a hidratar para eliminar tales lípidos.

Tinción de Romanowsky

La tinción de Romanowsky es una técnica de tinción prototípica que fue predecesora de varios métodos distintos la preparación de calienta a 110ºC durante 30 min o más y tiñen con una mezcla recién preparada de azul de metileno saturada (una parte) y de eosina al 1% (dos partes) en un vidrio de reloj. Los parásitos se tiñen de azul y los núcleos de violeta. Las células sanguíneas se

tiñen de rojo. Se utiliza para identificar plasmodios. Esta basado en principios similares entre los que se incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner, Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar diferentes tipos de células en especímenes patológicos. Para este propósito Paul Ehrlich en 1879 había comenzado utilizando una mezcla de colorantes ácidos y básicos, por ejemplo fucsina (colorante ácido) y azul de metileno (colorante básico).2 En 1891 Ernst Malachowski3 4 5 y Dmitry Leonidovich Romanowsky6 7 8 desarrollaron de manera independiente sendas técnicas haciendo uso de una mezcla de Eosina y azul de metileno modificado que produjo un sorprendente tono imposible de atribuir a ninguno de los componentes de tinción: un hermoso, distintivo color púrpura9 10 Los requerimientos para que ocurra el efecto Malachowski-Romanowsky-Giemsa son:

1. Un colorante catiónico: el mejor colorante es el Azur B y, a pesar de que el colorante Azur A es el responsable del color púrpura del núcleo, el azul que confiere al citoplasma es inferior. Ningún otro colorante catiónico que no sea el azul de metileno resulta adecuado.

2. Un colorante aniónico: El más comúnmente utilizado es la Eosina Y.11

Debido a que las soluciones acuosas de colorantes eran inestables, se introdujo metanol como un disolvente, y William Boog Leishman12 y James Homer Wright13abogaron también por el uso de metanol como fijador antes de la tinción. Gustav Giemsa mejoró esta técnica mediante la estandarización de las soluciones de colorantes y la adición de glicerol para aumentar su estabilidad.14La demetilación del azul de metileno en solución acuosa utilizando calor y un álcali produce una mezcla de Azur A, Azur B, violeta de metileno y azul de metileno. Luego se añade Eosina Y para producir un colorante "neutro". El precipitado formado se disuelve después en una mezcla de glicerol y metanol, para formar una solución de almacenaje (de stock); luego esta solución de stock se disuelve con agua o una solución acuosa tamponada para formar la solución de trabajo que es utilizada para teñir las muestras patológicas. La solución de trabajo es estable por tres horas.15Los procedimientos de captura inmunocromatográfica (malaria antigen detection test) son una alternativa de diagnóstico no microscópico para aquellos laboratorios que no pueden disponer de un microscopista experto.

Tinción de Perls

Esta tinción es utilizada para identificar en los extendidos del material aspiro de médula ósea la presencia de hemosiderina. 

Para realizar la tinción es necesario ferrocianuro de potasio al 4%, ácido clorhídrico al 4%, colorante rojo rápido nuclear y formol.

La técnica de tinción es la siguiente:

1. Preparación solución de Perls: colocar en un vaso de precipitado: 25 ml de ferrocianuro de potasio y 25ml de HCl al 4% (debe prepararse la solución al momento de usar, es una solución muy tóxica, venenosa)

2. Fijar los frotis con formol por 5 minutos (aproximadamente de 6 a 8 gotas) o metanol.

3. Dejar secar al aire.

4. Vaciar la mezcla de Perls precalentada a 56 ºC en un vaso de Copplin, inmediatamente colocar los frotis (previamente fijados) y tapar.

5. Incubar por 30 minutos.

6. Lavar con agua de la canilla.

7. Dejar secar al aire.

8. Contrateñir con solución de rojo rápido nuclear por 5 minutos. También se puede contrateñir con hematoxilina-eosina.

9. Lavar con agua de la canilla.

10.Secar al aire.

11.Cubrir con resina sintética y un cubreobjetos.

Los depósitos de hemosiderina se observarán teñidos de tono azulado, hay que cuidarlo de no confundirlos con los granulocitos eosinófilos.

Tinción de Pappenheim:

Para la diferenciación entre las granulaciones basófilas de los hematiés y los fragmentos nucleares:

Colorante I: ácido fénico: 0.35 ml; verde de metilo: 1 g; agua destilada: 100 ml

Colorante II: ácido fénico: 0.25 ml; pironina: 1 ml; agua destilada; 100 ml.

Se mezclan 15 ml de I con 35 ml. de II y se filtra. La preparación se sangre se fija por calor y se tiñe con el filtrado. Los granos basófilos tiñen de rojo y los fragmentos nucleares de azul oscuro

Tinción de Pfeiffer:

 La preparación se sumerge durante 30 min en solución de Ziehl; se traslada a alcohol absoluto acidificado con acético. Tan pronto como el corte se tiñe de rojo, se aclara con xilol y se monta en bálsamo

Tinción de Unna-Pappenheim

Un medio de contraste a base de verde de metileno-pironina, utilizada para identificar células plasmáticas cuyo citoplasma es teñido de rojo por su alto contenido en RNA. La preparación se fija durante 3 minutos en May-Grünwald, se diluye con agua destilada y se tiñe durante 3 minutos y se tiñe nuevamente con Giemsa durante 15-20 minutos.

Tincion de Van Gieson

La Tinción de Van Gieson corresponde a la mezcla de ácido pícrico-fucsina ácida y hematoxilina férrica de Weigert.

Es el método más simple mediante tinción para diferenciar colágeno de otros tejidos conectivos. Esta técnica fue desarrollada por el neuropsiquiatra y patólogo Ira Van Gieson.

Un método de tinción del tejido conjuntivo. No se utiliza tan a menudo como la tinción de Mallory porque se difumina con el tiempo. El colágeno tiñe de rojo y el músculo y el citoplasma de amarillo. En combinación con la tinción de Verhoeff es una las tinciones más interesantes para el estudio de los vasos sanguíneos

Técnica de tinción: Los preparados histológicos son sumergidos en agua por unos 5 minutos.

Se sumergen 5 minutos en hematoxilina férrica de Weigert. Se lavan en agua corriente (hasta que no suelte mas colorante). Se lavan en agua destilada. Se sumerge en ácido pícrico-fucsina ácida por 5 minutos. se sumerge en alcohol al 95° por 10 minutos Se sumerge en alcohol al 100° por 5 minutos Se sumerge dos veces diferentes frascos de xilol 5 minutos en cada ocasión.

Resultados: Núcleos celulares: Color marrón a negro.

Colágeno (tejido conectivo fibroso): Color rosa o rojo.

Músculo y Citoplasma: Color amarillo.

. Tincion de Verhoeff

La tinción de Verhoeff o también de Verhoeff-Van Gieson (VVG) es una técnica1 utilizada en histología. Fue desarrollada por el cirujano, oftalmólogo y patólogo estadounidense Frederick Verhoeff en 1908.2 3 Se utiliza para evidenciar las fibras elásticas en un tejido biológico y en especial las enfermedades que lo afectan.4

Forma enlaces catiónicos, aniónicos y no iónicos con la elastina, el constituyente principal del tejido elástico fibroso.2 La elastina tiene una afinidad fuerte por el complejo hierro-hematoxilina formado por los reactivos en la tinción y por lo tanto la retendrá mucho más tiempo que otros componentes del tejido, por lo que aparecerá teñida, mientras los otros elementos aparecen poco coloreados. El uso de tiosulfato de sodio remueve el exceso de iodo y se utiliza una contratinción (mayoritariamente tinción de Van Gieson) para dar contraste a la tinción principal. Las fibras elásticas y los núcleos celulares se tiñen de negro, las fibras de colágeno de rojo y otros elementos del tejido incluyendo el citoplasma se tiñen de amarillo.

La tinción de Verhoeff es una combinación de los siguientes reactivos:

Hematoxilina Cloruro de hierro (III) Lugol tinción de Van Gieson Fucsina ácida Ácido pícrico tiosulfato de sodio

Tincion de Weigert

La hematoxilina (del griedo haimatus: sangre y xilon: madera) es un componente natural obtenido de una planta leguminosa (Haematoxylum campechianum). La hematoxilina tiene que ser oxidada a hemateína antes de ser usada como colorante y combinada con un metal quel actuará como mordiente. La oxidación puede ser química o por el oxígeno mediane el envejecimiento de la solución. Es el producto oxidado de la hematoxilina, la hemateína, la que realmente se adhiere a las sustancias ácidas del tejido. Fundamentalmente tiñe el núcleo. La hematoxilina, la hemateína como colorante, es un componente de la tinción hematoxilina y eosina, probablemente la tinción general más usada en tinciones histológicas, pero también de otras tinciones como las tricrómicas donde se precisa teñir núcleos. Hematoxilina de Weigert o hematoxilina férrica; se utiliza para la tinción de núcleos cuando se usa a continuación una sustancia ácida. La hematoxilina se aplica junto con un mordiente que contiene aluminio potásico o aluminio amónico y por ello no se elimina en la solución ácida posterior. La hematoxilina y el mordiente se almacenan por separado y se aplican al tejido conjuntamente. El color resultante es negro o púrpura muy oscuro. Se emplea en soluciones tricrómicas como el van Gieson.

Tincion de Wright

La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades.

Lleva el nombre James Homer Wright, su inventor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902.

Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha deinfecciones.

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.

La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos

neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La tinción de Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes ácidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición con metanol)

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Tincion de Sudan Black B

El sistema de tinción Sudan Black B de Sigma-Aldrich se utiliza en la demostración  histoquímica de gránulos neutrófilos en frotis de sangre o médula ósea. El sistema de tinción Sudan Black B es para uso diagnóstico in vitro. Varios lípidos, incluyendo los fosfolípidos, las grasas neutras y los esteroles, se tiñen intensamente con Sudan Black B. La reacción de los gránulos neutrófilos con el tinte fue descrita por Sheehan y Storey en 19471. Generalmente, el patrón de tinción leucocitaria de Sudan Black B es parecido al de la mieloperoxidasa2. Las células que se encuentran a lo largo de las vías linfáticas muestran una tinción negativa, mientras que las formas mieloides y monocitoides muestran las reacciones positivas características. Por lo tanto,

Sudan Black B está considerado como un auxiliar útil en la identificación de las leucemias mielocíticas y mielomonocíticas2.Los métodos antiguos utilizaban una fijación de vapor de formaldehído en los frotis de sangre2, técnica que puede dar como resultado una pérdida celular y artefactos de tinción. El procedimiento de Sigma-Aldrich utiliza un fijador de glutaraldehído tamponado y un tiempo de incubación más corto, lo que da como resultado una excelente tinción sin pérdida celular ni distorsión.

Tincion de Sudan III

La técnica del sudán III es un método utilizado generalmente para demostrar la presencia de grasas mediante tinción de triglicéridos, aunque también tiñe otros lípidos. Pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que

no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante, éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua. El tejido diana para esta técnica es el tejido adiposo y lípidos en general. El fijador ideal es el formol 10%, y el grosor óptimo de corte es de 4 a 6 micras.

Tincion de Sudan IVLas técnicas de coloración para la identificación de lípidos sirven para determinar principalmente lípidos homofásicos. El Sudán IV, llamado Escarlata R, se basa en que el colorante es más soluble en lípidos que en el propio disolvente en el que va contenido. Se consideran lípidos todas aquellas sustancias orgánicas insolubles en agua total o parcialmente, pero solubles en acetona, alcohol, cloroformo, éter, etc... y que en general son untuosas al tacto.

Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.

El Sudán IV es una coloración progresiva, es decir, que a más tiempo de exposición al colorante mayor es la intensidad de tinción.

La inestabilidad de las soluciones colorantes es el principal problema de esta técnica, pues la evaporación de parte del disolvente provoca la precipitación del colorante sobre el tejido e induce a error de interpretación (falsos positivos). Para evitar estos falsos positivos deben seguirse los siguientes consejos:

1. Almacenar el reactivo en un lugar fresco y en recipientes cerrados herméticamente.

2. Emplear, si es posible, soluciones diluidas filtradas, aunque estas soluciones no pueden emplearse en muchas técnicas que requieren soluciones saturadas de colorante.

3. Teñir los cortes flotantes antes de rescatarlos del agua, lo cual no es difícil porque su espesor oscila entre 15 y 20 micras.

4. No prolongar la tinción más de 10 minutos.

5. Agitar con cierta frecuencia durante la coloración.

Los resultados serán en los lípidos un color rojo intenso y en los núcleos un color azul.

Tincion ArgenticaLa tinción argéntica es el uso de plata (en latín, Argentum) para modificar selectivamente el color o la apariencia de un objeto. Es una técnica frecuente de tinción en histología donde se utiliza para revelar detalles extremadamente finos. Es utilizada para teñir cortes histológicos. Este tipo de tinción es importante especialmente para revelar la ubicación de proteínas (por ejemplo colágeno tipo III) y ADN. Es utilizada para demostrar ambos tipos de sustancia tanto dentro como fuera de las células. La tinción argéntica es utilizada también en las electroforesis en gel con gradiente de temperatura en geles de poliacrilamida.

Algunas células son argentafines. Estas reducen las soluciones del catión plata (Ag+) a plata metálica luego de ser fijadas con formalina. Otras células sonargirofílicas. Estas reducen las soluciones del catión plata a plata metálica luego de ser expuestas a un colorante que contengan un agente reductor, por ejemplohidroquinona o formalina. El nitrato de plata forma fosfato de plata insoluble en presencia de iones fosfato; este método es conocido como tinción de Von Kossa. Cuando se somete a un agente reductor, por lo general hidroquinona, se forma plata elemental de color negro. Este método se utiliza para el estudio de la formación de partículas defosfato de calcio durante el crecimiento óseo. La tinción argéntica se utiliza en microscopía óptica. Las partículas de plata metálica se depositan en las fibras de reticulina sensibilizadas y son fácilmente observables en los preparados microscópicos. La tinción argéntica tiene utilidad ayudando a revelar las fibras reticulares. La tinción argéntica es además utilizada en el análisis de cariotipo. El nitrato de plata tiñe la Región organizadora nucleolar (NOR por sus siglas en inglés) asociada a proteínas. Esto provoca una región oscura donde la plata se deposita, denotando la actividad de los genes de ARNr dentro de la NOR. Los cromosomas 13, 14, 15, 21, y 22 poseen NORs. Además, las NORs aumentan la actividad de la tinción argéntica más de 50 veces. Esta proteína fue descubierta por Watson y Crick.

Tinción Rojo CongoRojo Congo es una sal de sodio, Es un secundario del Azoderivado. El Rojo Congo es soluble en agua, conformando una solución roja coloidal; su solubilidad

es mucho mejor en solventes orgánicos como el etanol.Tiene una gran afinidad, aunque aparentemente, por las fibras de celulosa. Sin embargo, el uso de rojo congo en la industria de la celulosa(algodón textil, pulpa de árbol y papel) ha desaparecido, en parte por su tendencia a cambiar de color una vez que se toca con los dedos manchados de sudor, al correr, y por su toxicidad.

En bioquímica e histología, el rojo congo se usa para teñir preparaciones microscópicas, especialmente en tinciones para el citoplasma y loseritrocitos. Verde manzana por birrefringencia de tinciones de rojo congo bajo luz polarizada es indicativo de presencia de fibras amiloides.2Además, el rojo congo se usa en bacteriología para determinar rápidamente la presencia del serotipo 2a de Shigella flexneri, donde el colorante se une a una estructura tipo lipopolisacárido (LPS) única en este tipo de bacteria.

Tincion de Bromuro de etidioEl bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teñir células vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar células que se encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales células poseen unas membranas mucho más permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las bandas de ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante puede ser utilizado en combinación connaranja de acridina (NA) en el conteo de células viables. Esta tinción combinada BE/NA le otorga a las células vivas un color verde fluorescente mientras que las células apoptóticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja.

Tincion con Carmín El carmín es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que se adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.

 

Tincion de DAPIEl DAPI es un colorante nuclear (tiñe el núcleo) fosforescente, se excita con luz ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido

al ADN. El DAPI se une a las regiones de alta repetición A=T en los cromosomas. Además no es visible cuando se utiliza con un microscopio de transmisión corriente. Puede ser utilizado en células vivas o fijadas. La técnica de tinción con DAPI es especialmente adecuada para el recuento celular.

 

Tincion de EosinaLa eosina se utiliza más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción. De hecho existen dos compuestos muy estrechamente relacionados (aunque no iguales) conocidos como eosina. El más frecuentemente utilizado es la eosina Y (también conocida como eosina amarillenta) ya que posee una tonalidad amarillenta muy suave. El otro compuesto conocido como eosina es la eosina B, también conocida como eosina azulada o rojo imperial, la cual posee una suave tonalidad azul. Los dos colorantes son intercambiables, y el la utilización de uno u otro es más una cuestión de preferencia y tradición.

Tincion de Papanicolaou

La tinción de Papanicolaou es un examen basado en la coloración de smears* en general (vaginal, cervical, prostático) o para fluídos corporales (peritoneal, pleural, gástrico, urinario, espinal,etc)

Colorantes empleados:  Existen varias soluciones de Papanicolaou, pero todas son variantes de los siguientes colorantes

Hematoxilina de Harris (EA50, EA65,EA36)

Naranja G

Eosina

Resultado de las tinciones celulares:

Núcleos---------------------------------------en azulcélulas acidófilas--------------------------rojo a naranjacélulas basófilas---------------------------verde o azul verdoso

células o fragmentos de tejido impregnados de sangre----naranja o naranja verdoso

Como prueba para la detección del cáncer cervico-uterino, se toma una muestra de células del epitelio del cuello uterino y se extienden en una lámina de vidrio que es la que se colorea con Papanicolaou.La tinción de Papanicolaou es una prueba fiable. Requiere de experiencia en la interpretación de los resultados, pero en los smears cervicales, el porcentaje de aciertos es muy elevado. Esta prueba  ha ayudado a disminuir drásticamente el número de mujeres que mueren por causa de cáncer cervical. En nuestro país el Programa de detección de cáncer cervico-uterino con las pruebas citológicas periódicas ha ayudado extraordinariamente a reducir esta enfermedad.

Tincion de HoechstHoechst es un compuesto derivado bis-benzimidazol que se une al surco menor del ADN. Se utiliza con frecuencia en microscopía de fluorescencia para colorear el ADN. Hoechst tiene color amarillo cuando se encuentra disuelto en agua, y emite luz azul cuando recibe luz ultravioleta. Hay dos tipos principales de colorantes Hoechst. Hoechst 33258 y Hoechst 33342. Ambos compuestos son funcionalmente similares, aunque poseen pequeñas diferencias en su estructura. El Hoechst 33258 contiene un hidroxilo terminal, y por lo tanto es más soluble en solventes acuosos, aunque esta característica disminuye su habilidad para penetrar la membrana plasmática. El Hoechst 33342 contiene un grupo etilo en sustitución del grupo hidroxilo terminal (un grupo etileter), lo que lo hace máshidrofóbico, y con mejor penetración en la membrana plasmática.

Tincion LugolEl yodo se utiliza en química analítica como indicador para el almidón. Cuando se mezcla almidón con una solución de yodo, se desarrolla un color intensamente azul, representando la formación del complejo de inclusión yodo/almidón. El almidón es una sustancia muy común en la mayor parte de las células vegetales, de modo que una solución diluida de yodo puede colorear el almidón presente en las células. El yodo también es componente de la coloración de Gram utilizada en microbiología. La solución de Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solución de color marrón que se torna negra en presencia de almidones y puede ser utilizada para colorear células, haciendo más visible el núcleo. En la coloración de gram el yoduro se utiliza como mordiente, aumentando la capacidad del colorante para entrar en las células a través de los poros presentes en la membrana o pared celular.

Tincion Rojo Nilo

El Rojo Nilo (también conocido como oxazona del azul nilo) se produce hirviendo el Azul Nilo con ácido sulfúrico. Este tratamiento produce una mezcla de Rojo y Azul Nilo. El Rojo Nilo es una coloración lipofílica, y se acumula en los glóbulos lipídicos en el interior de las células, y los colorea de rojo. El Rojo Nilo puede utilizarse con células vivas. Fluoresce fuertemente cuando se encuentra particionado en lípidos, pero prácticamente no presenta fluorescencia en soluciones acuosas.

Tincion de Golgi

La técnica de Golgi es un sencillo procedimiento histológico que revela la morfología neuronal completa en tres dimensiones. Este método se fundamenta en la formación de depósitos opacos intracelulares de cromato argéntico, producto de la reacción entre el bicromato de potasio y el nitrato de plata (reacción negra). Camillo Golgi, su descubridor, y Santiago Ramón y Cajal, su principal exponente, recibieron el premio nobel de Medicina y Fisiología en 1906por su contribución al conocimiento de la estructura del sistema nervioso. Gran parte de sus logros se obtuvieron a través de la aplicación del método de impregnación argéntica. Sin embargo, Golgi y Cajal tenían interpretaciones diferentes sobre la estructura del tejido nervioso. Golgi era defensor de la teoría reticular, la cual proponía que el sistema nervioso estaba conformado por una red de células fusionadas a través de los axones a manera de un sin sitio. Por el contrario, la doctrina neuronal, defendida por Cajal, sostenía que las neuronas eran células independientes. El descubrimiento del organelo celular conocido como ‘aparato de Golgi’. La microscopía electrónica confirmó de la doctrina neuronal, así como la existencia del complejo de Golgi, y contribuyó al resurgimiento de la técnica de impregnación argéntica. Aunque existen métodos modernos de tinción intracelular que revelan imágenes excelentes de la morfología neuronal, la técnica de Golgi se mantiene vigente por ser un método más práctico y menos costoso para el estudio de la morfología normal y patológica de las neuronas

Tincion de Field

La coloración Field es una coloración acuosa basada en la coloración de Romanovsky que consiste en dos soluciones (Solución A y solución B) y una

solución tampón (Amortiguadora). La coloración de Field es una coloración rápida para la identificación de hemoparasitos.

El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente rojo purpura, se basa en la interacción molecular entre eosina y un complejo Azur A- ADN. La intensidad de la coloración depende del contenido de Azur A y de la relación entre Azur A y eosina amarilla. El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores como el valor de pH de la solución y de la solución tampón, las sustancias tampón (amortiguadores), el tiempo de tinción y la fijación.

Tincion Verde malaquita

El verde de malaquita es un colorante verde activo frente a una gran variedad de parásitos externos y agentes patógenos como hongos, bacterias, etc. Su principal aplicación es para el tratamiento contra parásitos protozoos de agua dulce. En comprimidos de 25 y 100 mg, como sal de oxalato, el verde de malaquita se utiliza como tinción de esporas bacterianas. También se utiliza como contratinción con colorantes rojos.

Tinción de Feulgen

La tinción de Feulgen es una técnica de tinción descubierta por Robert Feulgen y usada en histología para identificar material cromosómico o ADN en células. Depende de la hidrólisis ácida del ADN. El material es sometido a una hidrólisis con ácido clorhídrico 1N a 60 °C, o 5N a temperatura ambiente, y luego al reactivo de Schiff. La reacción Feulgen es una técnica semicuantitativa. Si el único aldehído que queda en la célula son los producidos de la hidrólisis del ADN, ahí la técnica es cuantitativa para el DNA. Es posible usar un instrumento, conocido como microdensitómetro o microespectrofotómetro para medir la intensidad de la reacción Feulgen para un orgánulo. Usando este proceso, se determinó que en interfase, las células estaban compuestas de dos grupos de cromosomas. Uno con un grupo diploide y otro con un grupo tetraploide (dos grupos genómicos completos). El núcleo se observaba idéntico, pero uno de ambos poseía el doble de ADN. Esto dio a la división del periodo que conocemos como interfase en el ciclo celular a G1, S y G2 basados en la síntesis de ADN.

Tincion de MowryEl método de Mowry es una técnica de tinción descrita por Mowrys para la demostración de la presencia de mucopolisacáridos. Ciertas mucinas del tejido conjuntivo son capaces de absorber el hidróxido férrico coloidal, poniendo el hierro de manifiesto por medio del azul de Prusia. Esta técnica se combina en la actualidad con el PAS. Se deben realizar secciones dobles, puesto que en determinadas ocasiones esta tinción se ve dificultada debido a otras sustancias diferentes como los mucopolisacáridos, que se ven atraídos por las partículas metálicas, perdiendo su utilidad histoquímica.

Se utiliza extensivamente en el estudio de neoplasias epiteliales renales, así como granulomas en la piel. El resultado o color final de los mucopolisacaridos ácidos es azul, los núcleos rojos y el citoplasma amarillo.

Tincion hematoxilina acida fosfotungsticaEl método de la hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory o PTAH (siglas inglesas de Mallory's phosphotungstic acid haematoxylin), es una técnica histológica para la demostración, principalmente, de la presencia de fibrina, de estriaciones musculares y de muchas estructuras del sistema nervioso central.

Este método fue introducido por Mallory en el año 1900 para colorear selectivamente las estriaciones musculares y la fibrina. A pesar de la antigüedad de la técnica aún no se ha descubierto el mecanismo químico de su funcionamiento, del cual resulta una tinción diferencial polícroma entre las dos estructuras.

Consiste en la reacción entre la hemateína y el ácido fosfotúngstico, produciendo una solución ácida fuerte que contiene tanto iones azules (más estables) como rojos. La coloración de las partículas rojas PTA, más grandes que las azules, estaría limitada a las estructuras más permeables, como son las fibras de colágeno. Las menos permeables se tiñen con las partículas azules.

Tinción de Método De Cajal Con Oro Sublimado

El sublimado de oro es una solución mezcla de cloruro de mercurio y cloruro de oro que precipita sobre los gliofilamentos.Resultado: los astrocitos y sus prolongaciones aparecen impregnados de color negro. El fondo es habitualmente incoloro o marrón, algunas veces se observa de color púrpura.

Tinción de Método De Del Río Hortega

Empleado para astrocitos. Utiliza nitrato de plata y carbonato de litio, formando un precipitado de carbonato de plata;éste se reduce con formol y vira con cloruro de oro.Resultado: los astrocitos se observan de color negro y bien delimitado, con sus prolongaciones de color negro y fondo amarillo.Existen además, variantes de esta técnica para la demostración de oligodendroglía y microglía (carbonato de platadébil).

Técnica De Kluver Barrera

Utiliza dos colorantes: violeta de cresilo (básico) y luxol fast blue (con afinidad por los lípidos de la vaina de mielina).Resultado: se tiñe la mielina de azul y los núcleos y la sustancia de Nissl de violeta.

Método Del Tetróxido De Osmio

El osmio reacciona con los lípidos a nivel de sus enlaces insaturados.Resultado: La vaina de mielina se tiñe de negro por su alto contenido de lípidos insaturados.