Laboratorio 4: Tinción de mic lrios/3725/  · en base a las diferentes tinciones. Tinciones de microorganismos • Tinción Gram (práctica) • Tinción de Cápsulas -Tinción Negativa

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  • Laboratorio 4:

    Tincin de microorganismos

    Biol 3725L

  • Repaso de diluciones1 ml

    9 .9ml99 ml 9 ml

    0.1 ml 1 ml

    9 ml

    1 ml

    9 ml

    1 ml

    9 .9ml99 ml 9 ml

    0.1 ml

    1 / 100 10-3

    1 / 10 10-1

    0.1/ 101/ 100 10-5

    9 ml

    1/10 10-6

    9 ml

    1/10 10-7

    10-8

    25 UFC2 UFC

    1 ml

    10-7

    1 ml

    10-6

    265 UFC

    1 ml

    TMTC

    Cuntas colonias viables tengo?1. Escojo el plato que tenga

    entre 25 250 UFC.2. Utilizo la frmula de:

    UFC * (1/factor de dilucin)

  • Reportar datos:

    1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas

    2. Dilucin en serie: reporte UFC/mL para las tres placas utilizadas en su sub-grupo (incluya los clculos)

  • Objetivos

    Conocer el mecanismo bsico y ventajas de una tincin.

    Aprender conceptos bsicos relacionados a: Proceso de preparacin de un frotis Tincin Gram Tincin Gram Tincin cido-Resistente Tincin de Esporas Tincin de Cpsula (negativa).

    Identificar caractersticas en las bacterias en estudio en base a las diferentes tinciones.

  • Tinciones de microorganismos

    Tincin Gram (prctica)

    Tincin de Cpsulas - Tincin Negativa (prctica)

    Tincin de Esporas (prctica)

    Tincin cido-Resistente (teora)

    Tincin de flagelos (teora)

  • Morfologa y agrupacin de bacterias

    Ya se han discutido mtodos de clasificacin por morfologa y medios de cultivo.

    Ahora utilizaremos tinciones con el fin de poder seguir caracterizando a las bacterias.

    Espiroquetas

    CocoBacilo

  • Morfologa y agrupacin de bacterias: Tincin

    La tincin es una de las tcnicas ms utilizadas en los laboratorios de microbiologa para clasificar microorganismos.

    El tinte es un compuesto orgnico que le da contraste a la clula. clula.

    cromgeno (solvente orgnico que le provee las propiedades de color)

    auxcromo (grupo qumico que se ioniza con el cromgeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos).

    La adhesin del tinte va a depender de la carga que posea.

  • Tincin

  • Tipos de Tinciones

    Simple Tamao, arreglo

    y forma

    Un solo tinte

    Directa

    DiferencialSeparar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus caractersticas

    EspecficaPara identificar estructuras:

    Ejemplos: Tincin de flagelos,

    Tie bacteria Negativa

    tie el fondo pero no a la bacteria

    caractersticas

    Ms de un tinte

    Ejemplos: Tincin Gram y cido resistente

    de flagelos, cpsulas y esporas.

  • (-)

    (-)

    (-)(-)

    (-)(-)

    (-)

    (-)

    (-)(-)

    (-)

    (-)

    (+)

    methylene blue

    Tincin simple: un solo tinte , afinidad por carga c on componentes de la superficie de la clula

    Ejemplo : azul de metileno

    (-)

    (-)(-)

    (-)

    methylene blue

  • Tincin diferencial: permite detectar tipos distinto s de clulas

    Pasos de la Tincin Gram

    Cristal violeta (1 minuto)

    Lavar con aguaYodo (1 minuto)

    Azul-Violeta Rojo

    (Streptococcus sp.) (Escherichia coli)Yodo (1 minuto)Lavar con agua

    Alcohol etlico al 95% (20 segundos)

    Lavar con aguaSafranina (1 minuto)

    Lavar con agua Secar con bibolous

    paperGram+= azul-violeta, Gram = rojo

    (Streptococcus sp.) (Escherichia coli)

    Desventajas de tcnicas de tincin:

    requieren fijar la muestra con calor: (clulas mueren)

    calor + qumicos pueden distorsionar la forma original de las clulas

  • Tincin Gram

    Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tie la bacteria color violeta.

    Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a con CV. Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin.

    Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, sirve como solvente de lpidos y agente deshidratante de protenas. Remueve el cristal violeta.

    Contratinte- Safranina, tie de rojo la bacteria.

  • Resultados - Tincin Gram

    Gram Negativo Gram Positivo

  • Gram +

    Su pared celular contiene una capa gruesa de peptidoglicano

    Gram -

    Reaccin se basa en la diferencia en la composicin

    qumica de la pared bacteriana.

    Su pared celular contiene una capa fina de peptidoglicano

  • G M G M G M G M

    Peptidoglicano : polmero de dos azcares modificadas (N-acetil glucosaminay N-acetil cido murmico ) y tetrapptidos

    enlace , 1-4

    Pared celular procariota

    G M G M G M G MM

    G = N-acetil glucosaminaM = N-acetil cido murmico (murena)

    3 4

    tetrapptido (4 amino cidos)

  • Pared celular procariota

    G M G M G M G MG M G M G M G M

    G M G M G M G MM G M G M G M G MM

    G M G M G M G MG M G M G M G M

    G M G M G M G MM G M G M G M G MM

    G M G M G M G MG M G M G M G M

    G M G M G M G MM G M G M G M G MM

    G M G M G M G MG M G M G M G M

    G M G M G M G MM G M G M G M G MM

  • Tincin GramFundamento

    Membrana externa de las Gram es soluble en solventes orgnicos como el alcohol la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para

    retener el complejo cristal violeta/yodo que se form

    por lo que va perdindose el color azul-violeta. por lo que va perdindose el color azul-violeta.

    Las Gram + no tienen su capa susceptible a la accin de solventes orgnicos se deshidratan los poros y se cierran retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por

    consiguiente el color azul-violeta.

  • Preparacin de la muestra para proceso de TincinPreparacin de frotis:

    Limpiar la laminilla con papel de lentes.

    Prepara el frotis

    Medio lquido- solo se coloca una porcin del cultivo con el loop en porcin del cultivo con el loop en la laminilla.

    Medio slido- se coloca una gotitade agua destilada en la laminilla y se diluye la porcin de cultivo en ella. Se esparce bien.

    Secar a temperatura ambiente

    Fijacin por calor

  • Control positivo Control negativoDesconocido

    Tincin GramLaminilla

    Control positivo

    Gram + (Bacillus cereus)

    Control negativo

    Gram (E. coli)

    Desconocido

    1. Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).2. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.3. Cubrir frotis con yodo (1 minuto).4. Enjuague con agua destilada.5. Enjuague la laminilla con alcohol etlico 95% (no exceder los 30 seg).6. Enjuague la laminilla con agua destilada.7. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).8. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.9. Secar laminillas con papel bibulous para remover el exceso de agua.

  • Secuencia de reacciones

  • Tincin de Cpsulas Cpsula- estructura gelatinosa secretada por algunas

    bacterias capas de polisacridos o protenas que revisten el exteriorde un bacteria Funcin: adherencia y formacin de biopelculas (capas de

    crecimiento bacteriano) y proteccin contra fagocitosis (macrfagos, sistema inmunolgico)crecimiento bacteriano) y proteccin contra fagocitosis (macrfagos, sistema inmunolgico)

    La cpsula se compone de polisacridos, glicoprotenas y polipptidos.

    La mayora de las cpsulas estn compuestas de polisacridos, por lo que son solubles en agua.

  • Tincin de Cpsulas

    cpsula

  • Tincin de Cpsulas Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el frotis color oscuro

    Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario

    No se enjuaga con agua porque la cpsula es soluble en agua - No se enjuaga con agua porque la cpsula es soluble en agua -funcin de decolorante

    El CuSO4 es absorbido en el material de la cpsula que ha sido decolorada - funcin de contratinte.

    La cpsula aparece azul clara en un fondo oscuro.

  • Tincin de Cpsulas

    Preparacin de un frotis cargado (heavy).

    Dejar secar a temperatura ambiente.

    Cristal violeta 1% (5-7 minutos).

    Enjuagar con CuSO4

    Secar con bibulous paper

    Cryptococccus laurentii

  • Tincin simple-negativa

    La tincin se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria.

    El tinte utilizado es India Ink (Se puede utilizar tambin eosina o nigrosina).

    Tincin de Cpsulas

    eosina o nigrosina).

    Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

  • Efecto de Cielo estrellado

  • Tincin de CpsulasTincin simple-negativa

  • Clula vegetativa- forma metablicamente activa = bacterias.

    Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente resistente.

    Los miembros del gnero anaerobio Clostridium y del gneroaerobio Bacillus pueden existir metablicamente activos o inactivos.

  • Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

    En condiciones ambientales hostiles ocurre esporognesis la cual forma la endospora.cual forma la endospora.

    En condiciones ambientales favorables, ocurre germinacin, lo cual forma la clula vegetativa (bacteria).

  • Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

  • Endosporas

    La esporognesis y la germinacin no son medios de reproduccin, son mecanismos de supervivencia de

    la clula.

    La composicin qumica de la bacteria la hace resistente a:resistente a:

    Calor extremo o excesivo Congelacin Radiacin Desecacin Agentes qumicos

  • Tincin de Esporas

    Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la penetracin de este tinte.

    Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la clula vegetativa.clula vegetativa.

    Contratinte- Safranina, tie las clulas veg