Embed Size (px)
Citation preview
PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET SVEUČILIŠTA U ZAGREBU
Tihomir Kovač
MODULACIJA OKSIDATIVNOG STRESA PLIJESNI Aspergillus flavus NANOČESTICAMA FULERENA
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2017.
PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET
SVEUČILIŠTA U ZAGREBU
Tihomir Kovač
MODULACIJA OKSIDATIVNOG STRESA PLIJESNI Aspergillus flavus NANOČESTICAMA FULERENA
DOKTORSKI RAD
Mentor: izv. prof. dr. sc. Ivica Strelec
Zagreb, 2017.
FACULTY OF FOOD TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
UNIVERSITY OF ZAGREB
Tihomir Kovač
MODULATION OF OXIDATIVE STRESS OF
Aspergillus flavus BY FULLERENE NANOPARTICLES
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2017.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu Disertacija
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Sveučilišni poslijediplomski studij biotehnologije-bioprocesnog inženjerstva
UDK: 582.282:615.372:678.6(043.3)
Znanstveno područje: Biotehničke znanosti
Znanstveno polje: Biotehnologija
MODULACIJA OKSIDATIVNOG STRESA PLIJESNI Aspergillus flavus
NANOČESTICAMA FULERENA Tihomir Kovač, mag. ing.
Rad je izrađen na Prehrambeno-tehnološkom fakultetu Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku
Mentor: izv. prof. dr. sc. Ivica Strelec
Kratki sažetak: Cilj ovog doktorskog rada bio je utvrditi utjecaj nanočestica fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24
na modulaciju oksidativnog stresa, produkciju aflatoksina B1 i rast plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251. Uzgoj
plijesni je proveden submerzno u YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami ili uz izloženost VIS svjetlu u
režimu 12 sati svjetlo/12 sati tama, u prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica fulerena (10, 50 i 100 ng
mL-1) i fulerenola (10, 100 i 1000 ng mL-1). Rezultati su pokazali da obje vrste nanočestica moduliraju razine
oksidativnog stresa u miceliju plijesni ovisno o primijenjenoj koncentraciji i uvjetima uzgoja, na način da snižavaju
razine oksidativnog stresa tijekom uzgoja u tami, a povećavaju razine oksidativnog stresa tijekom uzgoja uz
izloženost VIS svjetlu. Sniženje razina oksidativnog stresa u stanicama plijesni nanočesticama fulerena i fulerenola
izazvalo je antiaflatoksikogeni učinak, a povećanje razina oksidativnog stresa aflatoksikogeni učinak. Modulacija
oksidativnog stresa nanočesticama fulerena i fulerenola nije dovela do značajnih promjena porasta mase micelija.
Broj stranica: 119
Broj slika: 61
Broj tablica: 17
Broj literaturnih navoda: 136
Broj priloga: 0
Jezik izvornika: hrvatski
Ključne riječi: Aspergillus flavus, oksidativni stres, nanočestice fulerena, aflatoksin B1
Datum obrane: 02.06.2017.
Stručno povjerenstvo za obranu:
1. izv. prof. dr. sc. Renata Teparić
2. red prof. dr. sc. Ksenija Markov
3. izv.prof. dr. sc. Slaven Zjalić
4. red. prof. dr. sc. Jagoda Šušković, (zamjena)
Rad je pohranjen u knjižnici Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta u Zagrebu, Kačićeva 23; Nacionalnoj
i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, Hrvatske bratske zajednice bb i Sveučilištu u Zagrebu, Trg maršala Tita
14;
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Ph.D. thesis
Faculty of Food Technology and Biotechnology
Postgraduate study in Biotechnology-Bioprocess Engineering
UDK: 582.282:615.372:678.6(043.3)
Scientific Area: Biotechnical Sciences
Scientific Field: Biotechnology
MODULATION OF OXIDATIVE STRESS OF Aspergillus flavus BY
FULLERENE NANOPARTICLES Tihomir Kovač, mag. ing.
Thesis was performed at the Faculty of Food Technology, Josip Juraj Strossmayer University of Osijek
Supervisor: izv. prof. dr. sc. Ivica Strelec
Short abstract: This disertation examined the effect of fullerene C60 and fullerenol C60(OH)24 nanoparticles on
A. flavus NRRL 3251 oxidative stress modulation, aflatoxin B1 production and mycelia biomass yield. Mycelia
were grown in YES media during 168 hours at 29 °C in the dark or upon 12 hours VIS light/12 hours dark regime,
containing different concentrations of fullerene (10, 50 i 100 ng mL-1) or fullerenol (10, 100 i 1000 ng mL-1)
nanoparticles. The results showed that A. flavus oxidative stress modulation is dependent on the nanoparticles
concentration, as well as light presence. VIS light exposure during the mycelia growth in the presence of fullerene
or fullerenol nanoparticles caused increased oxidative stress and subsequent aflatoxigenic effect, while growth in
the dark decreased oxidative stress and antiaflatoxigenic effect. However, nanoparticles did not affected mycelia
biomass yield.
Number of pages: 119
Number of figures: 61
Number of tables: 17
Number of references: 136
Number of appendices: 0
Original in: Croatian
Key words: Aspergillus flavus, oxidative stress, fullerene nanoparticles, aflatoxin B1
Date of thesis defence: June 2nd 2017
Reviewers:
1. Renata Teparić, PhD, associate professor
2. Ksenija Markov, PhD, full professor
3. Slaven Zjalić, PhD, associate professor
4. Jagoda Šušković, PhD, full professor (stand-in member)
Thesis has been deposited in: Library of Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23;
National and University Library, Hrvatske bratske zajednice bb and University of Zagreb, Trg maršala
Tita 14;
Tema doktorskog rada prihvaćena je na 8. redovnoj sjednici Fakultetskog vijeća Prehrambeno-
biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, održanoj 26. svibnja 2015. godine.
INFORMACIJE O MENTORU
Ivica Strelec rođen je 29. prosinca 1972. u Osijeku, gdje je maturirao 1991. Diplomirao je
1998. na Prehrambeno-tehnološkom fakultetu u Osijeku, magistrirao je na
Prirodoslovno-matematičkom fakultetu u Zagrebu 2004., te je 2007. doktorirao na
Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu u Zagrebu. U Institutu Saponije d.d. Osijek bio je
zaposlen od 1998. do 1999. godine. Na Prehrambeno-tehnološkom fakultetu u Osijeku je od
1999. asistent, od 2009. docent, te od 2013. izvanredni profesor. Na preddiplomskom studiju
nositelj je kolegija Biokemija, a na diplomskom studiju kolegija Interakcije hrane i gena, te
jedan od nositelja kolegija Prehrambena biokemija. Na Specijalističkom studiju Nutricionizma
sudjeluje u predavanjima iz kolegija Integrativne fiziologije i prehrambene biokemije te
Personalizirane i redukcijske dijete. Znanstveno se bavi proteinima, proteolitičkim i
oksido-reduktivnim enzimima, elektroforetskim metodama razdvajanja proteina, te
biokemijom hrane. Objavio je petnaest znanstvenih radova citiranih u WOS, sedam u ostalim
časopisima te osam u zbornicima radova. Urednik je jednog zbornika sažetaka i jedne
monografije. Aktivno je sudjelovao u radu pet znanstvenih projekata. Član je Hrvatskog društva
za biokemiju i molekularnu biologiju, Hrvatskog društva kemijskih inženjera i tehnologa te
Hrvatskog mikrobiološkog društva.
Sažetak
Cilj ovog doktorskog rada bio je utvrditi utjecaj nanočestica fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24
na modulaciju oksidativnog stresa, produkciju aflatoksina i rast plijesni Aspergillus flavus
NRRL 3251. Uzgoj plijesni je proveden submerzno u YES podlozi u tami ili uz izloženost VIS
svjetlu u režimu 12 sati svjetlo/12 sati tama, u prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica
fulerena (10, 50 i 100 ng mL-1) i fulerenola (10, 100 i 1000 ng mL-1). Rezultati su pokazali da
obje vrste nanočestica moduliraju razine oksidativnog stresa u miceliju plijesni ovisno o
primijenjenoj koncentraciji i uvjetima uzgoja na način da snižavaju razine oksidativnog stresa
tijekom uzgoja u tami, a povećavaju razine oksidativnog stresa tijekom uzgoja uz izloženost
VIS svjetlu. Pri tome se sniženje razine oksidativnog stresa u stanicama plijesni može pripisati
antioksidativnom, ili prooksidativnom djelovanju nanočestica fulerena, te prooksidativnom
djelovanju nanočestica fulerenola, dok se povećanje razine oksidativnog stresa može pripisati
oksidativnom djelovanju obje vrste nanočestica. Sniženje razina oksidativnog stresa u
stanicama plijesni nanočesticama fulerena i fulerenola izaziva antiaflatoksikogeni učinak, a
povećanje razina oksidativnog stresa aflatoksikogeni učinak. Modulacija oksidativnog stresa
nanočesticama fulerena i fulerenola ne dovodi do značajnih promjena porasta mase micelija.
Ključne riječi: Aspergillus flavus, oksidativni stres, nanočestice fulerena, aflatoksin B1
Summary
This disertation examined the effect of fullerene C60 and fullerenol C60(OH)24 nanoparticles on
A. flavus NRRL 3251 oxidative stress modulation, aflatoxin B1 production and mycelia
biomass yield. Mycelia were grown in YES media during 168 hours at 29 °C in the dark or
upon 12 hours VIS light/12 hours dark regime, containing different concentrations of fullerene
(10, 50 i 100 ng mL-1) or fullerenol (10, 100 i 1000 ng mL-1) nanoparticles. The results showed
that A. flavus oxidative stress modulation is dependent on the nanoparticles concentration, as
well as light presence. VIS light exposure during the mycelia growth in the presence of fullerene
or fullerenol nanoparticles caused increased oxidative stress and subsequent aflatoxigenic
effect, while growth in the dark decreased oxidative stress and antiaflatoxigenic effect.
Fullerene nanoparticles reduced oxidative stress levels in mycelia acting as antioxidants or
prooxidants, while fullerenol nanoparticles as prooxidants. Increased oxidative stress levels in
mycelia were probably caused by oxidant action of fullerene and fullerenol nanoparticles.
However, nanoparticles did not affected mycelia biomass yield.
Key words: Aspergillus flavus, oxidative stress, fullerene nanoparticles, aflatoxin B1
SADRŽAJ
1. UVOD ................................................................................................................................................. 1
2. OPĆI DIO .......................................................................................................................................... 3
2.1.Oksidativni stres ...................................................................................................................... 3
2.1.1.Reaktivne vrste kisika ................................................................................................... 3
2.1.2.Antioksidativna obrana ................................................................................................ 5
2.2. Aspergillus flavus ..................................................................................................................... 8
2.2.1.Morfologija i građa stanica A. flavus .......................................................................... 9
2.2.2.Životni ciklus plijesni A. flavus .................................................................................. 11
2.3. Biosinteza aflatoksina ........................................................................................................... 13
2.4. Fulereni .................................................................................................................................. 19
2.4.1. Fuleren C60 – struktura, svojstva i primjena ........................................................... 19
2.4.2. Pojavnost fulerena C60 u okolišu ............................................................................... 21
2.4.3. Antimikrobni učinak nanočestica fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24 ................. 22
3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................ 28
3.1. Uzorci i kemikalije ................................................................................................................ 28
3.2. Popis opreme ......................................................................................................................... 28
3.3. Priprema suspenzije spora plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251 .................................. 29
3.4. Priprema suspenzije nanočestica fulerena ......................................................................... 30
3.5.Priprema suspenzije nanočestica fulerenola ....................................................................... 31
3.6.Karakterizacija nanočestica ................................................................................................. 31
3.7.Uzgoj micelija plijesni ........................................................................................................... 31
3.8.Odvajanje micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 od podloge ........................................... 32
3.9.Određivanje udjela suhe tvari u miceliju plijesni ............................................................... 32
3.10.Određivanje koncentracije aflatoksina .............................................................................. 33
3.11. Priprema ekstrakata ........................................................................................................... 34
3.12. Određivanje koncentracije lipidnih peroksida (TBARS) ............................................... 35
3.13. Određivanje koncentracije reduciranog (GSH) i oksidiranog (GSSG) glutationa ....... 36
3.14. Određivanje koncentracije proteina ................................................................................. 37
3.15. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze ................................................................. 38
3.16. Određivanje aktivnosti katalaze ........................................................................................ 39
3.17. Određivanje aktivnosti glutation peroksidaze ................................................................. 39
3.18. Određivanje aktivnosti glutation reduktaze..................................................................... 40
3.19. Statistička analiza eksperimentalnih podataka ............................................................... 41
4.REZULTATI .................................................................................................................................... 42
4.1.Karakterizacija suspenzija nanočestica fulerena i fulerenola ........................................... 42
4.2. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja micelija plijesni u tami .................................................................................................... 44
4.2.1.Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni ............................................. 44
4.2.2.Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1 ................................... 45
4.2.3.Utjecaj nanočestica fulerena na lipidnu peroksidaciju ............................................ 47
4.2.4.Utjecaj nanočestica fulerena na koncentraciju glutationa ...................................... 48
4.2.5.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze ....... 50
4.2.6.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze ...... 51
4.2.7.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze ................................................. 52
4.2.8.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze ........................... 53
4.2.9.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze .............................. 54
4.3. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja micelija plijesni u tami .................................................................................................... 55
4.3.1.Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni .......................................... 55
4.3.2.Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1 ................................ 56
4.3.3.Utjecaj nanočestica fulerenola na lipidnu peroksidaciju ........................................ 57
4.3.4.Utjecaj nanočestica fulerenola na koncentraciju glutationa ................................... 58
4.3.5.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze ... 60
4.3.6.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid dismutaze ... 60
4.3.7.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze .............................................. 61
4.3.8.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze........................ 62
4.3.9.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze ........................... 63
4.4 Utjecaj izloženosti plijesni A. flavus VIS svjetlu tijekom uzgoja na porast mase micelija,
koncentraciju lipidnih peroksida i glutationa, te aktivnost antioksidativnih enzima ........... 65
4.4.1.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na rast micelija ........... 65
4.4.2.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na produkciju
aflatoksina B1 ....................................................................................................................... 66
4.4.3. Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na
lipidnu peroksidaciju ........................................................................................................... 67
4.4.4.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na
odnos reduciranog i oksidiranog glutationa ...................................................................... 67
4.4.5.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na aktivnost
bakar,cink-superoksid dismutaze ....................................................................................... 69
4.4.6. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost manganove superoksid dismutaze ..................... 70
4.4.7. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost katalaze ................................................................ 71
4.4.8.Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation peroksidaze ........................................... 72
4.4.9. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation reduktaze ............................................. 73
4.5. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja micelija plijesni izloženog VIS svjetlu ........................................................................... 75
4.5.1.Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni ............................................. 75
4.5.2.Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1 ................................... 76
4.5.3.Utjecaj nanočestica fulerena na lipidnu peroksidaciju ............................................ 77
4.5.4.Utjecaj nanočestica fulerena na koncentraciju glutationa ...................................... 78
4.5.5. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze ...... 79
4.5.6. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze ..... 80
4.5.7.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze ................................................. 81
4.5.8.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze ........................... 82
4.5.9.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze .............................. 83
4.6. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja micelija plijesni izloženog VIS svjetlu ........................................................................... 85
4.6.1. Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni ......................................... 85
4.6.2. Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1 ............................... 86
4.6.3. Utjecaj nanočestica fulerenola na lipidnu peroksidaciju ....................................... 87
4.6.4.Utjecaj nanočestica fulerenola na koncentraciju glutationa ................................... 88
4.6.5. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze... 90
4.6.6. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid dismutaze .. 90
4.6.7. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze ............................................. 91
4.6.8.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze........................ 92
4.6.9. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze .......................... 93
5. RASPRAVA ..................................................................................................................................... 95
5.1. Karakterizacija suspenzija nanočestica fulerena i fulerenola .......................................... 96
5.2. Usporedba uzgoja plijesni A. flavus u tami i uz izloženost VIS svjetlu na porast mase
micelija, koncentraciju lipidnih peroksida i glutationa, te aktivnost antioksidativnih enzima
97
5.3. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja u tami i uz izloženost VIS svjetlu ................................................................................... 99
5.4. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja u tami i uz izloženost VIS svjetlu ................................................................................. 102
6. ZAKLJUČCI ................................................................................................................................. 106
7. LITERATURA .............................................................................................................................. 108
1
1. UVOD
Istraživanje, razvoj i primjena nanotehnologije u zadnja dva desetljeća značajno je
uznapredovala. Fuleren C60 i njegovi hidroksilirani derivati su jedna od skupina nanomaterijala
koja nailazi na sve veću uporabu. Naime, zbog svojih specifičnih kemijskih, mehaničkih,
električnih i optičkih svojstava fulereni su naišli na široku primjenu u različitim granama
industrije pri proizvodnji širokog spektra komercijalnih proizvoda, a među inima i proizvoda
za osobnu njegu (Brar i sur., 2010; Benn i sur., 2012.; Chen i sur., 2008; Farre i sur., 2010;
Hadduck i sur., 2010; Huang i sur., 2014; Kubatova i sur., 2013; Marković i Trajković, 2008;
Nano-C Inc., 2015; Pycke i sur., 2012; Talbot, 1999). Budući da globalna proizvodnja fulerena
C60 i njihovih derivata raste po nekoliko tona godišnje (Lyon i sur., 2006; Michalitsch i sur.,
2008; Piccinno i sur., 2012) za očekivati je da će se ovi spojevi sve više gomilati u okolišu
tijekom proizvodnje, uporabe i odlaganja. Stoga se pojačana interakcija fulerena C60 i njihovih
derivata sa mikroorganizmima prisutnim u tlu i vodama čini neminovnom. Noviji podaci o
prisustvu fulerena u okolišu upravo potvrđuju gomilanje ovog nanomaterijala (Farre i sur.,
2010; Sanchis i sur., 2012; 2013). Upravo povećana koncentracija nanočestica fulerena i
fulerenola u okolišu izaziva zabrinutost zbog potencijalno negativnog utjecaja po mikrofloru
okoliša, a među ostalim i na plijesan Aspergillus flavus.
Istraživanja toksičnog utjecaja fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24 na mikroorganizme okoliša
provode se zadnjih 15-tak godina, i prvenstveno su ograničena na prokariote, te više orijentirana
ka proučavanju toksičnog utjecaja. Trenutno je poznato da fuleren C60 pokazuje različit utjecaj
na rast mikroorganizama, i to od inhibitornog do stimulativnog što ponajprije ovisi o: a) načinu
pripreme suspenzija nanočestica fulerena, b) veličini nanočestica, c) primijenjenoj
koncentraciji, d) vrsti i soju ispitivanog mikroorganizma te e) načinu i uvjetima uzgoja
(Aoshima i sur., 2009; Dinesh i sur., 2012; Hadduck i sur., 2010; Huang i sur., 2014; Lyon i
sur., 2006; Pycke i sur., 2012). Malobrojna istraživanja utjecaja nanočestica fulerenola
C60(OH)24 (FNP) na mikroorganizme pokazuju da FNP ovisno o primijenjenoj koncentraciji
mogu i ne moraju uzrokovati inhibiciju rasta, a u slučaju plijesni A. niger pokazuju čak i
stimulativni utjecaj (Aoshima i sur., 2009; Gao i sur., 2011; Panina i sur., 1997; Unković, 2015).
Saprofitna plijesan A. flavus pripada skupini mikotoksikogenih plijesni koje su prirodno
prisutne u tlu, a uzrokuje zagađenje usjeva aflatoksinima. Opće je poznato da pojačana razina
oksidativnog stresa u stanicama plijesni A. flavus (koja se događa pri nepovoljnim okolišnim
2
uvjetima) dovodi do pojačane produkcije, a snižena razina do smanjene produkcije aflatoksina
(Hedayati i sur, 2007; Jayashree i Subramanyam 2000; Reverberi i sur., 2010, 2012; Roze i sur.,
2013). Kako se inhibitorni ili stimulatorni učinak nanočestica fulerena C60 (nC60) i/ili FNP na
rast različitih mikroorganizama pripisuje prooksidativnom ili antioksidativnom učinku,
interakcija plijesni A. flavus i nanočestica mogla bi se odraziti na razinu oksidativnog stresa u
stanicama plijesni te utjecati na promjene u rastu plijesni i produkciji aflatoksina.
Budući da za A. flavus, kao i cijelu skupinu mikotoksikogenih plijesni u dostupnoj literaturi
postoji izuzetno ograničen broj podataka o utjecaju nC60 i FNP postoji potreba za
rasvjetljavanjem njihova utjecaja na rast ove plijesni i produkciju aflatoksina. Upravo je cilj
ove disertacije bio ispitati utjecaj nC60 i FNP na rast, produkciju aflatoksina i modulaciju
oksidativnog stresa plijesni A. flavus.
3
2. OPĆI DIO
2.1. Oksidativni stres
Oksidativni stres je fiziološko stanje u stanici koje karakterizira prekomjerno nakupljanje
reaktivnih vrsta kisika (ROS) koje stanični antioksidativni sustav nije u stanju učinkovito
ukloniti. ROS u stanicama nastaju spontano, kao nusprodukt enzimskih reakcija ili kao rezultat
okolišnog djelovanja poput različitih vrsta zračenja. Stanični antioksidativni sustav uključuje
niskomolekularne antioksidanse (glutation, askorbinsku kiselinu i vitamin E), antioksidativne
proteine (glutaredoksine, tioredoksine), antioksidativne enzime (superoksid dismutazu (SOD),
glutation peroksidazu (GPx) i katalazu (CAT)), reduktivnu snagu stanice (koenzim NADPH) i
enzime zadužene za održavanje reduciranog stanja u stanici poput glukoza-6-fosfat
dehidrogenaze i glutation-reduktaze (Dickinson i Chang, 2011; Luschchak, 2011; Oktyabrsky
i Smirnova, 2007; Vilamena, 2013).
Pri tome je ključno za naglasiti, da je redoks ravnoteža, odnosno dinamička ravnoteža između
nastanka i uklanjanja ROS, blago pomaknuta ka nastanku ROS. Naime, iako se ROS vrlo često
u brojnim izvorima prije svega spominju štetnima po stanicu, bitno je za naglasiti da je niska
koncentracija ROS u stanicama više nego poželjna, budući da ROS sudjeluju u brojnim
fiziološkim procesima u stanici. Tako pri koncentracijama nižim od 10-8 M, ROS između
ostalog sudjeluju u staničnoj signalizaciji, indukciji biosinteze antioksidativnih enzima
(antioksidativne obrane), regulaciji proliferacije stanica te apoptozi (Luschchak, 2011;
Oktyabrsky i Smirnova, 2007).
Negativni aspekt djelovanja ROS, prije svega se odnosi na slučajeve kada je njihova
koncentracija u stanicama znatno viša od fiziološke, što za posljedicu ima oksidativna oštećenja
sastavnih staničnih molekula: lipida, proteina i nukleinskih kiselina te slijedno oksidativni stres
(Breitenbach i sur., 2015; Luschchak, 2011; Oktyabrsky i Smirnova, 2007).
2.1.1. Reaktivne vrste kisika
Pod pojmom reaktivne vrste kisika (ROS) u širem smislu podrazumijevaju se tri skupine
reaktivnih vrsta: reaktivne vrsta kisika (ROS) u užem smislu, reaktivne vrste dušika (RNS) te
reaktivne vrsta klora (RCl). Reaktivnim vrstama kisika u užem smislu smatraju se singlet kisik
(1O2*), superoksidni anion (O2
•-), hidroksilni radikal (HO•), hidroperoksilni radikal (HO2•) te
4
vodikov peroksid (H2O2). U reaktivne vrste dušika ubrajaju se dušikov monoksid (NO·),
peroksinitrit (ONOO-), hiponitrit kation (NO+) ili nitrozij anion (NO-), dok se u reaktivne vrste
klora ubraja hipoklorasta kiselina (HOCl) (Dickinson i Chang, 2011; Fridovich, 1998;
Winterbourn, 2008).
Sve reaktivne vrste kisika u užem smislu, osim singlet kisika, nastaju jednovalentnom
redukcijom molekulskog kisika, O2 (Jednadžba 1).
O2
e-
→ O2∙ -
e-
→H2O2
e-
→OH∙e-
→H2O (1)
Singlet kisik (1O2•) je uključen među ROS zbog svoje reaktivnosti, iako nije radikalna molekula.
U biološkim sustavima nastaje izlaganjem molekulskog kisika UV ili vidljivoj svjetlosti, ili
oksidacijom H2O2 hipoklorastom kiselinom (HOCl) u fagocitima (Jednadžba 2, 3).
O2 ℎ∙𝜈→ 1O2
∙ (2)
HOCl + H2O2 → 1O2∙ +HCl+ H2O (3)
Singlet kisik je reaktivna molekula čije je vrijeme poluživota od 1 µs do 1 ms. U odnosu na
hidroksilni anion (HO•) je manje, a superoksidni anion (O2•-) više reaktivan (Bai i sur., 2003;
Foyer i Noctor, 2005; Villamena, 2013).
Superoksidni anion (O2•-) nastaje jednovalentnom redukcijom molekularnog kisika (Jednadžba
1). Glavnina O2•- nastaje u lancu prijenosa elektrona. Naime, zbog nesavršenosti sustava
prijenosa elektrona dolazi do curenja elektrona na molekulski kisik na ubikinonskim i
semikinonskim mjestima respiratornog niza. Pri normalnim fiziološkim uvjetima koncentracija
superoksidnog aniona u stanici prema Fridowichu (1998) iznosi 0,1%, a prema Bai i sur. (2003)
oko 2% od ukupno upotrjebljene količine O2. Vrijeme poluživota nastalog O2•- je oko 10 s, a
njegovom daljnom redukcijom nastaju hidroksilni radikal (HO•) i vodikov peroksid (H2O2)
(Bai i sur., 2003; Dickinson i Chang, 2011; Luschak, 2011; Vilamena, 2013).
Hidroksilni radikal (OH•) je izuzetno reaktivna vrsta ROS čije vrijeme poluživota iznosi svega
1 ns. Za razliku od O2•-, radi se o vrsti ROS ograničene difuznosti koja oštećuje stanične
komponente udaljene svega nekoliko nm od njegova mjesta nastanka. Fiziološka koncentracija
ovog pripadnika skupine ROS in vivo je gotovo jednaka nuli što se pripisuje njegovoj velikoj
reaktivnosti (Bai i sur., 2003; Li i sur., 2009). Hidroksilni radikal može nastati reakcijom
između H2O2 i O2•- (Haber-Weiss reakcija) ili H2O2 s ionima prijelaznih metala (Fentonova
reakcija) (Jednadžba 4, 5) (Bai i sur., 2003; Li i sur., 2009; Vilamena, 2013).
5
H2O2 + O2∙ -→ OH ∙+ OH -+O2 (4)
H2O2+Fe2+(Cu+) → Fe3+(Cu2+) + OH ∙+ OH - (5)
Vodikov peroksid (H2O2) pripada skupini ROS, a njegova se koncentracija pri fiziološkim
uvjetima u stanicama mikroorganizama kreće u rasponu od oko 1 do 100 nM (Bai i sur., 2003).
Pri tome su glavna mjesta nastanka vodikova peroksida peroksisomi i endoplazmatski
retikulum, ali se isto tako može pronaći u mitohondrijima i citoplazmi kao nusprodukt
enzimskih reakcija te kao rezultat jednovalentne redukcije superoksidnog aniona (Dickinson i
Chang, 2011). Jedna od značajnih fizioloških uloga H2O2 je sudjelovanje u staničnoj
signalizaciji.
Hidroperoksilni radikal (HO2•) može nastati protonacijom O2
•- pri kiselim uvjetima, a glavnina
ga nastaje kao produkt reakcije vodikovog peroksida hidroksilnim radikalom (Jednadžba 6, 7)
(Bai i sur., 2003;Vilamena, 2013).
O2∙ -+ H+ ↔ HO2
∙ (6)
OH ∙+ H2O2→ H2O+ HO2∙ (7)
Dušikov monoksid (NO·) je jedan od pripadnika skupine reaktivnih vrsta dušika. Nastaje u
metabolizmu arginina djelovanjem enzima dušik monoksid sintaze (NOS) (Jednadžba 8), a u
prisutnosti superoksidnog aniona prelazi u toksični peroksinitrit (ONOO-) (Jednadžba 9).
Peroksinitrit u prisutnosti iona prijelaznih metala može formirati reaktivne vrste, poput
hiponitrit kationa (NO+) ili nitrozij aniona (NO-) (Dickinson i Chang, 2011; Vilamena , 2013).
Arginin + 3NADPH + 3H++ O2→ Citrulin + 2NO-+ 3 NADP+ + H2O (8)
NO-+O2∙ - → ONOO- (9)
Hipoklorasta kiselina (HOCl) pripadnik je skupine reaktivnih vrsta klora, a nastaje u procesu
fagocitoze djelovanjem mijeloperoksidaze (MPO) na vodikov peroksid u prisutnosti iona klora
(Cl-) (Jednadžba 10) (Vilamena, 2013).
H2O2+ Cl-+ H++MPO → HOCl + H2O (10)
2.1.2. Antioksidativna obrana
Kako je prije navedeno stanica u stanju oksidativnog stresa, odnosno pri znatno povišenoj
koncentraciji ROS, više nije u stanju učinkovito ukloniti ili neutralizirati nastale ROS
djelovanjem staničnog antioksidativnog sustava što rezultira oksidativnim oštećenjima lipida,
6
proteina i nukleinskih kiselina. Stoga se postavlja pitanje što to sve sudjeluje u staničnom
antioksidativnom sustavu obrane.
Stanična antioksidativna obrana uključuje antioksidativne enzime, superoksid dismutazu
(SOD), katalazu (CAT), glutation peroksidazu (GPX), univerzalni stanični antioksidans
glutation (GSH), dodatne proteine obrane poput tioredoksina, glutaredoksina i
peroksiredoksina, reduktivnu snagu stanice - koenzim NADPH, te pomoćne enzime
antioksidativne obrane poput glukoza-6-fosfat-dehidrogenaze (G6PDH) i glutation-reduktaze
(GR) (Breitenbach i sur., 2015; Li i sur., 2009; Luschchak, 2011; Oktyabrsky i Smirnova,
2007).
Superoksid dismutaza (SOD) je enzim koji uklanja O2•- prevođenjem u H2O2 i O2 (Jednadžba
11). Postoji nekoliko dosada poznatih vrsta SOD, koje su klasificirane u skupine obzirom na
metalni/e ion/e u aktivnom središtu: Cu,Zn-SOD, Mn-SOD i Fe-SOD. Opće je prihvaćena
činjenica da su u stanicama plijesni prisutne Cu,Zn-SOD koja je prvenstveno smještena u
citoplazmi te Mn-SOD lokalizirana u matriksu mitohondrija. Sukladno lokalizaciji, Mn-SOD
ima ulogu u antioksidativnoj zaštiti mitohondrija, a Cu,Zn-SOD u zaštiti citoplazme (Bai i sur.,
2003; Li i sur., 2009; Vilamena, 2013).
2 O2⋅ -+ 2 H+
SOD→ H2O2+ O2 (11)
Katalaza (CAT) je antioksidativni enzim koji razgrađuje vodikov peroksid na vodu i kisik pri
čemu se jedna molekula H2O2 reducira do H2O, a druga se oksidira do O2 (Jednadžba 12)
(Bai i sur., 2003; Li i sur., 2009; Vilamena, 2013).
2 H2O2
CAT→ 2 H2O+ O2 (12)
Glutation peroksidaza (GPX) je enzim koji u prisutnosti reduciranog glutationa (GSH) kao
kofaktora katalizira redukciju H2O2 i/ili organskih hidroperoksida (LOOH) do H2O ili
odgovarajućeg alkohola (LOH), pri čemu se GSH oksidira u glutation disulfid (GSSG)
(Jednadžbe 13, 14) (Bai i sur., 2003; Li i sur., 2008; Li i sur., 2009; Vilamena, 2013).
H2O2 + 2 GSHGPX→ 2 H2O+ GSSG (13)
LOOH + 2 GSHGPX→ LOH + GSSG+ H2O
(14)
Osim GPX, u uklanjanju organskih peroksida sudjeluje i skupina enzima peroksidaza koje se u
novije vrijeme često nazivaju peroksiredoksinima (Prx). Prema trenutačnim saznanjima Prx
uklanjaju oko 90% organskih peroksida u stanici (Breitenbach i sur., 2015; Perkins i sur., 2015).
7
Glutation reduktaza (GR) je enzim koji reducira GSSG u GSH uz utrošak NADPH kao
koenzima, te je zaslužna za održavanje visoke koncentracije GSH, a time i omjera GSH/GSSG
unutar stanice (Jednadžba 15) (Huang i sur., 2009; Li i sur., 2009).
GSSG + NADPH + H+GR→ 2 GSH+ NADP+ (15)
Glutation je tripeptid, γ-glutamil-L-cisteinil-glicin koji je također uključen u antioksidativnu
obranu stanice. Pri tome samostalno djeluje kao antioksidans neutralizirajući ROS u stanici ili
mu se antioksidativna aktivnost ogleda u djelovanju kao koenzima GPX. U stanici se nalazi u
reduciranom (GSH) i oksidiranom obliku (GSSG), pri čemu GSSG katalitičkim djelovanjem
GR prelazi u GSH (Jednadžba 15). Pri normalnim fiziološkim uvjetima u stanici plijesni
koncentracija reduciranog glutationa je oko 20 puta veća nego koncentracija oksidiranog
glutationa (GSH/GSSG omjer). U slučaju oksidativnog stresa omjer GSH/GSSG kreće se od
0,5 do 10 (Jayashree and Subramanyam 2000; Li i sur., 2008; Li i sur., 2009; Narasaiah i sur.,
2006).
Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH) je sekundarni dionik antioksidativne obrane. Naime,
G6PDH je enzim oksidativnog dijela puta pentoza fosfata koji oksidira glukoza-6-fosfat u
ribuloza-5-fosfat pri čemu nastaju 2 molekule nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfata
(NADPH). Važnost ovog enzima za antioksidativnu obranu stanice upravo se veže uz nastajanje
NADPH koji je neophodan kao koenzim GR za regeneraciju glutationa (Jednadžba 16)
(Li i sur., 2009; Lushchak, 2012).
Glukoza-6-fosfat + NADP+G6PDH→ 6-fosfoglukolakton + NADPH + H+ (16)
Tioredoksini (Trxs) su skupina proteina molekulske mase od 11 do 12 kDa koji sudjeluju u
staničnoj antioksidativnoj obrani. Naime, ovi proteini sadrže dvije tiolne skupine u svom
aktivnom mjestu koje im omogućuju antioksidativno djelovanje reduciranjem disulfida
proteina. Pri tome se oksidirani Trx regeneriraju djelovanjem tioredoksin reduktaze (TR) uz
NADPH kao koenzim (Jednadžba 16, 17) (Korge i sur., 2015; Oktyabrsky i Smirnova, 2007).
Trx-(SH)2 + protein-S
2→ Trx-S2 + protein-(SH)
2 (17)
Trx-S2+NADPH+ H+TR→ Trx-(SH)
2+NADP+ (18)
Osim u antioksidativnoj obrani Trx imaju značajan utjecaj i na fiziološke procese plijesni poput
sporulacije (Thon i sur., 2007).
Glutaredoksini (Grxs) su proteini koji također imaju značajnu ulogu u antioksidativnoj obrani
stanice plijesni. Slični su Trx, no postoje skupine Grx koje sadrže dvije tiolne skupine kao i Trx
8
te Grx koje sadrže samo jednu tiolnu skupinu. Uz protein-disulfide, Grx reduciraju i miješane
disulfide (GSH-protein). Oksidirani oblici Grx najčešće se reduciraju djelovanjem GR
(Jednadžba 19 do 21) (Brendt i sur., 2008; Herreo i sur., 2006; Oktyabrsky i Smirnova, 2007).
Grx-(SH)2 + protein-S
2→ Grx-S2 + protein-(SH)
2 (19)
Grx-(SH)2 + protein-S-SG → Grx-S2 + protein-(SH)
2+GSH (20)
Grx-S2 + NADPH + H+GR→ Grx-(SH)2 + NADP+ (21)
2.2. Aspergillus flavus
Plijesan Aspergillus flavus jedan je od 250 pripadnika roda Aspergillus. Svi pripadnici ovoga
roda okarakterizirani su prepoznatljivim strukturama koje nose spore (Slika 1) po kojima je rod
nazvan (Klich, 2007; Heydati i sur., 2007). Naime, talijanski svećenik i botaničar Pietro A.
Micheli je ime rodu Aspergillus dao po škropilici za raspršivanje svete vode, nakon što je pod
mikroskopom uočio strukturu koja sadrži nespolne spore karakteristične za sve plijesni roda
Aspergillus (Bennett, 2010; Gibbons, 2012).
Najvažnija karakteristika plijesni ovog roda je sposobnost produkcije toksičnih sekundarnih
metabolita aflatoksina. Producenti aflatoksina su svrstani u tri sekcije roda Aspergillus: Flavi,
Nidulantes te Ochraceorosei. Sekciji Flavi pripadaju plijesni A. arachidicola, A. bombycis,
A. flavus, A. minisclerotigenes, A. nomius, A. parasiticus, A. parvisclerotigenus,
A. pseudocaelatus, A. pseudonomius, A. pseudotamarii i A. togoensis (Varga i sur., 2009; Varga
i sur., 2011). Pri tome je A. flavus jedan od najznačajnijih producenata aflatoksina.
Taksonomski gledano, A. flavus Link. pripada carstvu Gljiva (Fungi), odjeljku Ascomycota,
razredu Eurotiomycetes, redu Eurotiales, porodici Trichocomaceae, rodu Aspergillus, vrsti
Flavus.
A. flavus je plijesan čije je prirodno stanište tlo, u kojem je prisutna u obliku micelija, spora ili
sklerocija. Ova saprofitna plijesan ima važnu ulogu u biodegradaciji jer živi na biljnim i
životinjskim ostacima u obliku micelija. Osim pozitivne uloge, ova plijesan ima i negativan
utjecaj budući da izaziva bolesti na klipu kukuruza, sjemenkama kikirikija i glavicama pamuka
što rezultira širenjem spora zrakom (Amaike i Keller, 2011; Heydati i sur., 2007; Klich, 2007).
9
Slika 1. Škropilica ili aspergillum koji se upotrebljava pri obredima rimokatoličke crkve (a)
(Bennett, 2010; Gibbons, 2012) i mikrofotografija konidiofora i vezikule A. cretensis (b)
(Frisvad i sur., 2004)
2.2.1. Morfologija i građa stanica A. flavus
Ovisno o okolišnim uvjetima saprofitna plijesan A. flavus može se pronaći u obliku micelija,
sklerocija i spora. Najčešći prirodni oblik ove plijesni je micelij, dok se pri nepovoljnim
okolišnim uvjetima pronalazi u obliku sklerocija i spora. Pri tome se pod micelijem smatra gusti
sustav isprepletenih cjevastih stanica (hifa) koje tvore pahuljastu ili paučinastu nakupinu, dok
se sklerocijem naziva gusto zbijeni micelij okružen slojem diferenciranih stanica i čvrstom
ovojnicom. U obliku sklerocija plijesan je postojana dugi niz godina, a promjenom okolišnih
uvjeta sklerocij klija te dolazi do nastavljanja rasta, razvoja i razmnožavanja plijesni (Amaike i
Keller, 2011; Heydati i sur., 2007; Klich, 2007).
Plijesan A. flavus je višestanični mikroorganizam, čiji micelij čini isprepletena mreža cjevastih
stanica hifa koja se kao pahuljasta ili paučinasta nakupina rasprostire po čvrstoj podlozi, dok u
uvjetima submerznog uzgoja tvori okruglastu nakupinu zvanu peletom (Slika 2).
Slika 2. Plijesan A. flavus uzgojena a) na čvrstoj podlozi i b) u tekućoj podlozi
Hife (grč. hyphe – tkanje) plijesni su izdužene cjevaste stanice promjera oko 2 do 5 µm i dužine
oko 5 do 50 µm. Ove cjevaste stanice mogu biti pregrađene nitima zvanim septe, uslijed čega
10
su hife podjeljene u pojedinačne stanične dijelove (septume). Pri tome je ključno naglasiti da
septe ne dijele u potpunosti hifu na zasebne stanične dijelove, već imaju otvore što omogućuje
strujanje citoplazme i organela. Većina hifa su vegetativne te oblikuju tijelo (talus) plijesni, dok
zračne hife nose strukture za razmnožavanje (konidiospore) i sudjeluju u tvorbi paučinastog
izgleda kolonije plijesni (Slika 2 i 3) (Bennett, 2010; Free, 2013; Klich, 2007).
Slika 3. Morfologija plijesni pri različitim uvjetima rasta. A) cjevasta stanica plijesni s
organelama, podijeljena septama te okružena staničnom stijenkom, B) nakupina micelija –
peleta prilikom submerznog uzgoja, C) kolonije plijesni koje rastu na čvrstoj podlozi poput
agara, sa vegetativnim i zračnim hifama te strukturama koje nose spore (de Bekker i sur.,
2011; Riquelme i sur., 2011; Wösten i sur., 2013); D) građa septirane hife (Tariq, 2010)
Konidiofori su specijalizirane zračne hife koji nose strukture za razmnožavanje (nespolne
spore). Hrapave su površine, bezbojne su ili blijedo smeđe te duljine oko 0,4 do 1 mm. Sastoje
se od izdužene drške (stipe) na čijem je kraju proširenje (vezikula) koja nosi niz sporonosnih
stanica (fijalida ili sekundarne sterigme). Dijeljenjem fijalida nastaju nespolne spore
(konidiospore ili konidije). Spore plijesni su ovalne ili okrugle stanice promjera oko 2 do 7 µm
(Slika 4).
11
Slika 4. Građa konidiofora plijesni roda Aspergillus koja nosi spore (Klich, 2007)
2.2.2. Životni ciklus plijesni A. flavus
Životni ciklus plijesni A. flavus započinje klijanjem spora ili sklerocija pri pogodnim okolišnim
uvjetima, koji osim dostupnosti hranjivih tvari uključuju temperaturni raspon od 10 do 48,8 °C,
aktivitet vode od 0,73 do 0,99, te pH vrijednost medija od 3,4 do 10. Klijanjem spora i sklerocija
formiraju se hife, nastaje razgranati micelij, koji vremenom stvara nove spore, a u određenim
slučajevima klijanjem sklerocija može nastati micelij koji nema sposobnost stvaranja spora
(Battilani i sur., 2012; Coley-Smith i Cook, 1971; Duraković i Duraković, 2000; Heydati, 2007;
Horn, 2007; Klich, 2007).
Proces klijanja spora započinje upijanjem hranjivih tvari u sporu, pri čemu dolazi do hidratacije
i bubrenja spora. Istovremeno s ovim procesima događa se aktivacija brojnih signalizacijskih
puteva poput Ras/MAP i cAMP/PKA signalizacijskog puta, koji dovode do međusobnog
povezivanja spora i adhezije na supstrat. Nadalje, mitozom započinje rast hifa (Slika 5 i 6)
(Osherov i May, 2000; 2001). Prema literaturnim podacima, klijanje spora plijesni A. flavus na
čvrstoj podlozi traje od 6 do 8 sati, dok je za ponovnu produkciju spora potrebno od 8 do 16
dana ovisno o okolišnim uvjetima (Battiliani i sur., 2012; Osherov i May, 2001).
12
Slika 5. Pretpostavljeni model klijanja spora (prilagođeno iz Osherov i May, 2000)
Slika 6. Životni ciklus plijesni A. nidulans (prilagođeno iz Osherov i May, 2001)
Životni ciklus plijesni A. flavus na poljoprivrednim dobrima (Slika 7) se može podijeliti na
kolonizaciju biljnih ostataka u tlu te na infekciju biljnog tkiva iznad površine tla. Naime,
A. flavus je prirodno prisutna u tlu te za rast može iskoristiti biljne ostatke poput stabljike, lista,
komušine i klipa kukuruza. Nakon sjetve, kada se stvore povoljni uvjeti dolazi do klijanja
sklerocija ili spora, formira se micelij i producira veliki broj spora koje se otpuštaju u zrak te
nošene vjetrom ili insektima dovode do zaraze biljaka poput kukuruza, pamuka, kikirikija te
ostalih orašastih plodova (Battiliani i sur., 2012; 2016).
13
Slika 7. Ciklusa zaraze kukuruza plijesni A. flavus (prilagođeno iz Battilani i sur., 2012)
2.3. Biosinteza aflatoksina
Aflatoksini su vrlo toksični sekundarni metaboliti određenih plijesni roda Aspergillus koji se i
pri vrlo niskim koncentracijama smatraju štetnim po zdravlje ljudi i životinja (primati, ptice,
ribe i crvi) (Yu i sur., 2012). Prvi put su otkriveni u ranim 60-tim godinama prošlog stoljeća
kada je došlo do pomora više od 100 000 pura u Engleskoj kao posljedica hranjenja brašnom
kikirikija zaraženim aflatoksinima. Navedeno je rezultiralo velikim znanstvenim interesom za
ovu skupinu mikotoksina, a među inima i interesom za rasvjetljavanje molekularnog
mehanizma njihove biosinteze. Biosinteza aflatoksina se prema trenutnim spoznajama odvija
stupnjevito u organelama. Prvi dio biosinteze do stabilnog međuprodukta norsolorinske kiseline
(NOR) se odvija u peroksisomima, a nastavak u aflatoksisomima (Slika 8) (Chanda i sur., 2009;
2010; Fountain i sur., 2016).
Proces biosinteze aflatoksina se dijeli na tri dijela: i) stvaranje osnovne strukture aflatoksina,
norsolorinske kiseline (NOR) koja je prvi stabilni metabolit, ii) prevođenje NOR do
versikolorina B (VERB) te iii) transformacija VERB u aflatoksine B1, B2, G1 i G2 (Slika 9 do
11) (Cleveland i sur., 2009).
14
Slika 8. Pretpostavljeni model biosinteze aflatoksina, transport međuprodukata te izlučivanje
aflatoksina (prilagođeno iz Roze i sur., 2011)
Kratice: Nor-1 - norsolorinska kiselina reduktaza, Ver-1 – veriskolorin A dehidrogenaza, OmtA - dihidro-
sterigmatocistin O-metiltransferaza, Vbs – verikolorin B sintaza; Cvt - transportna vezikula za unos u vakuolu;
pune linije (-) označavaju poznate stanične putove, a iscrtane linije (- -) pretpostavljene.
Biosinteza aflatoksina započinje u peroksisomima gdje iz acetil-CoA (Ac-CoA) i malonil-CoA
(Ma-CoA) djelovanjem enzimskog kompleksa norsolorinska kiselina sintaza nastaje NOR.
Enzimski kompleks NOR sintaza sadrži kompleks sintazu masnih kiselina te poliketidnu
sintazu (Cox i sur., 2007; Korman i sur., 2010). Acetil-CoA nastaje β-oksidacijom dugolančanih
masnih kiselina u peroksisomima, dok se jedan dio Ac-CoA doprema iz mitohondrija u kojima
nastaje kao rezultat β-oksidacije kratkolančanih masnih kiselina (Cleveland i sur., 2009;
Reverberi i sur., 2012; Yabe i Nakajima, 2004). Naime, prema trenutačnim spoznajama proces
β-oksidacije u stanicama plijesni odvija se glavninom u peroksisomima (Slika 9) te jednim
dijelom u mitohondrijima (Gabriel i sur., 2014; Maggio-Hall i Keller, 2004; Poiriuer i sur.,
2006; Reverberi i sur., 2012). Sintetizirani NOR se iz peroksisoma pupanjem vezikule
koncentrira u takozvane endosome te fuzioniranjem sa endosomima iz mitohondrija,
endoplazmatskog retikuluma te vakuola tvori aflatoksisome u kojima se odvijaju ostale reakcije
biosinteze aflatoksina (Chanda i sur., 2009; Keller, 2015; Kistler i Broz; 2015).
15
Slika 9. Prvi dio procesa biosinteze aflatoksina: nastanak norsorolinske kiseline u
peroksisomima iz acetil-CoA i malonil-CoA djelovanjem enzimskog kompleksa
norsolorinska kiselina sintaza (HEX A i HEX B – sintaza masnih kiselina; PKS-poliketid
sintaza)
NOR se prevodi do averantina (AVN) djelovanjem NOR reduktaze (Slika 10) (Cleveland i sur.,
2009). Slijedi reakcija hidroksilacije AVN u 5'-hidroksiaverantin (HAVN) uz djelovanje P450
dehidrogenaze. HAVN se oksidacijom 5'-hidroksilne skupine djelovanjem 5'-hidroksiaverantin
reduktaze prevodi u oksoaveratin (OAVN). Iz OAVN može nastati averufanin (AVNN) ili
averufin (AVN), pri čemu je AVNN rezultat dehidratacije OAVN dok djelovanjem OAVN
ciklaze dolazi do transformacije OAVN u AVF. Nastali AVF se djelovanjem averufin
monooksigenaze prevodi u versikonal hemiacetal acetat (VHA). VHA se djelovanjem esteraze
prevodi u versikonol (VOH), versikonol acetat (VOAc) i versikoloron (VONE). Nestabilni
VOH se reakcijom spontane dehidratacije prevodi u versikolorin C (VERC). VER se uz
djelovanje enzima versikonal ciklaza sintaze prevodi u versikolorin B (VERB). Ovime završava
drugi dio sinteze aflatoksina, a slijedi transformacija VERB u aflatoksine
B1, B2, G1 i G2 (Slika 11) (Cleveland i sur., 2009; Yabe i Nakajima, 2004; Yu i sur., 2012).
VERB je međuprodukt za sintezu aflatoksina B2 i G2, dok međuprodukt za biosintezu
aflatoksina B1 i G1 nastaje dehidrogenacijom VERB u VERA koju provodi enzim desaturaza.
Konverzijom VERA i VERB nastaju dimetilsterigmatocistin (DMST) i
dihidrodimetilsterigmatocistin (DHDMST), djelovanjem kompleksa demetilsterigmastocistin
sintaza. Metilacijom slobodnih hidroksilnih skupina DMST i DHMST djelovanjem enzima
O-metiltransferaze I i II nastaju sterigmatocistin (ST) i dihidrosterigmatocistin (DHST),
odnosno O-metilsterigmatocistin (OMST) i dihidro-O-metilsterigmatocistin (DHOMST).
16
Slika 10. Drugi dio procesa biosinteze aflatoksina: prevođenje norsolorinske kiseline do
versikolorina B u aflatoksisomima
17
Slika 11. Treći dio procesa biosinteze aflatoksina: transformacija versikolorina B u
aflatoksine B1, B2, G1 i G2 u aflatoksisomima
Kratice: SAM – S-adenozil metionin; SAHC – S-adenozil homocistein
Zadnji dio biosinteze aflatoksina uključuje prevođenje OMST u aflatoksine B1 i G1, te
DHOMST u aflatoksine B2 i G2 pri čemu u reakcijama sudjeluju oksidoreduktaza,
P450 monooksigenaza i NADH oksidaza (Cleveland i sur., 2009; Yabe i Nakajima, 2004).
Aflatoksini se nakon biosinteze izlučuju iz stanica plijesni egzocitozom
(Chanda i sur., 2009; 2010).
Biosinteza aflatoksina je energetski zahtjevna za stanicu plijesni. Prema Yabe i Nakajimi (2004)
za sintezu jedne molekule aflatoksina potrebna je 1 molekula acetil-CoA, 9 malonil-CoA, više
od 10 molekula NADPH te 2 molekule S-adenozil metionina. Uz navedeno, u sintezi je
minimalno potrebno 9 molekula ATP neophodnih za karboksilaciju acetil-CoA u malonil-CoA.
Na biosintezu aflatoksina utječu okolišni i nutritivni čimbenici. Pri tome pod okolišnim
čimbenicima podrazumijevamo temperaturu, aktivitet vode (aw), pH medija, dostupnost kisika
i prisutnost svjetla, a pod nutritivnim izvore ugljika i dušika. Maksimalna produkcija aflatoksina
18
se odvija u temperaturnom rasponu od 28 do 35 °C, dok je optimalna temperatura oko 30 °C,
što ovisi o mediju za uzgoj te vrsti plijesni roda Aspergillus. Minimalni aw za biosintezu
aflatoksina kreće se u rasponu 0,95 do 0,99. Biosinteza aflatoksina je moguća u rasponu pH
vrijednosti od 3,5 do 8. Međutim, pojačana je u kiselom području, a optimalne vrijednosti se
razlikuju od autora do autora te kreću u rasponu pH od 4 do 6 (Keller i sur., 2005; Reverberi i
sur; 2010; Ritter i sur., 2011; Sweeney i Dobson, 1998). Obzirom na izvor ugljika, jednostavni
ugljikohidrati poput glukoze, saharoze, maltoze i fruktoze potiču biosintezu aflatoksina, dok
pepton, sorboza i laktoza ne potiču (Yu i sur., 2012). Lipidi su također izvor ugljika koji potiču
biosintezu aflatoksina na dva načina: a) masne kiseline služe kao izvor Ac-CoA, a b) produkti
oksigenacije polinezasićenih masnih kiselina - oksilipini su signalne molekule koje potiču
biosintezu aflatoksina (Reverberi i sur., 2012; Yu i sur., 2008). Kao izvor dušika značajan za
biosintezu aflatoksina u literaturi se spominju amonijev nitrat, amonijev sulfat, te aminokiseline
asparagin, aspartat, alanin, glutaminska kiselina, glutamin i prolin (Reverberi i sur., 2012; Yu i
sur., 2008). Svjetlo (ultraljubičasti – UV i vidljivi dio spektra - VIS) je također jedan od
okolišnih faktora koji regulira biosintezu aflatoksina plijesni roda Aspergillus. Tako Joffe i
Lisker (1969) navode kako je produkcija aflatoksina plijesni A. flavus niža, a Aziz i Mousa
(1997) viša prilikom uzgoja plijesni u prisutnosti svjetla u odnosu na količinu aflatoksina
produciranu prilikom uzgoja u tami. Obzirom na najnovija saznanja, izloženost plijesni svjetlu
trebala bi dovesti do snižene produkcije aflatoksina. Naime, u stanicama plijesni postoji Velvet
kompleks koji se povezuje sa regulacijom sekundarnog metabolizma plijesni i sporulacije pod
utjecajem svjetla. Ovaj kompleks čine najmanje tri transkripcijska faktora: VeA (velvet A),
VelB i LeaA (loss of aflR expression-A). Pri tome su VeA i VelB lokalizirani u citoplazmi, a
LeaA u jezgri. Tijekom rasta plijesni u tami, VeA se u citoplazmi povezuje s VelB što dovodi
do konformacijske promjene, izlaganja nuklearnog lokalizacijskog signala i transporta ovog
kompleksa u jezgru pomoću importina KapA. U jezgri kompleks VeA/VelB stupa u interakciju
s LeaA, protein-metiltransferazom koja dekondenzira kromatin i omogućuje pojačanu
ekspresiju gena za sekundarni metabolizam i sporulaciju. Tijekom rasta plijesni u prisutnosti
svjetla djelomično je onemogućena interakcija VeA i VelB prema do sada još nerazjašnjenom
mehanizmu uslijed čega je razina VeA/VelB kompleksa u jezgri smanjena što rezultira
sniženom biosintezom sekundarnih metabolita (Bok i Keller, 2004; Calvo i Cary, 2016; Roze i
sur., 2011;Yin i Keller, 2011). Osim VeA na biosintezu sekundarnih metabolita, odnosno
aflatoksina, značajan utjecaj ima transkripcijski faktor AflR koji zajedno transkripcijskim
faktorima AflS i AftB regulira klaster gena odgovoran za biosintezu aflatoksina. Ovaj
transkripcijski faktor se pri uvjetima pojačanog oksidativnog stresa oksidira, prelazi u jezgru i
19
regulira ekspresiju gore navedenog klastera gena (Fountain i sur., 2015; 2016; Reverberi i sur.,
2008).
2.4. Fulereni
Fulereni su treća alotropska modifikacija ugljika. To su zatvoreni šuplji sferični oblici čistog
ugljika s različitim brojem ugljikovih atoma (C20, C60, C70, C80, C90). Pri tome je fuleren C60 u
današnje vrijeme najviše istraživan i primjenjivan pripadnik ove skupine molekula, koji je
našao široku primjenu u različitim granama industrije.
2.4.1. Fuleren C60 – struktura, svojstva i primjena
Fuleren C60 je zatvorene sferične strukture šupljeg kaveza koja podsjeća na oblik nogometne
lopte, odnosno okrnjeni ikozaedar (Slika 12). Radi se o simetričnoj i sferičnoj strukturi
promjera 0,7 nm koja sadrži 60 sp2 hibridiziranih ugljikovih atoma raspoređenih u mrežu
sastavljenu od 20 šesteročlanih prstena te 12 peteročlanih prstena, pri čemu peteročlani prsteni
ne dijele rubove. Svaki ugljikov atom se povezuje sa tri susjedna atoma pri čemu se u
peteročlanim prstenima nalaze sve jednostruke veze, a u šesteročlanima naizmjenično
jednostruke i dvostruke veze.
Slika 12. Struktura molekule a) fulerena C60 i b) fulerenola C60(OH)24
Upravo zbog prisustva dvostrukih veza prisutna je delokalizacija π elektrona koja se povezuje
i sa zakrivljenosti molekule. Takva struktura omogućuje specifična svojstva poput
hidrofobnosti, antioksidativne aktivnosti te fotoosjetljivosti zbog kojih se fuleren C60 široko
primjenjuje u različitim granama industrije poput kemijske, kozmetičke, tekstilne, pri
proizvodnji poluvodiča i senzora te u medicini (Barky i sur., 2007; Brar i sur., 2010; Chen i
sur., 2008; Farre i sur., 2010; Hadduck i sur., 2010; Huang i sur., 2014; Kubatova i sur., 2013;
Marković i Trajković, 2008; Pycke i sur., 2012; Talbot, 1999).
20
Tablica 1. Patenti s područja Europe vezani za fuleren i njegovu uporabu (Mihalitsch i Huebner, 2008)
Prijavitelj patenta Zemlja Vrsta ustanove Tehnološko usmjerenje
Sanofi-Aventis Francuska/Njemačka Tvrtka Proizvodnja fulerena u industrijskom mjerilu
Konarka Technologies and Konarka
Austria Research and Development SAD Tvrtka Fleksibilne fotonaponske ćelije
Hahn-Meitner Institut Njemačka Javna istraživačka ustanova Molekularna elektronika, memorija, FE tranzistori, proizvodnja endofulerena
Asea Brown Boveri (ABB) Švicarska Tvrtka
Punjenje kolona materijalima za separaciju, kablovi visoke mehaničke čvrstoće i temperaturne
otpornosti, nanostrukturni vodiči visoke električne vodljivosti, zaštitni omotači visokonaponskih
instalacija, razgradnja i zaštita organskih materijala
Centre National de la Recherche
Scientifique (CNRS) Francuska Javna istraživačka ustanova Nano-mješavine, materijali nalik dijamantima
Technische Universität of Dresden Njemačka Akademska institucija Organski poluvodički materijali, organske solarne ćelije, temperaturno osjetljivi nuklearno
magnetski rezonantni (NMR) materijali
Cinvention Njemačka Tvrtka Biokompatibilni materijali te površine za implantantne omotače i dostupnost lijekova, porozni
materijali (npr. za razdvajanje plinova)
Bosch Njemačka Tvrtka Temperaturno stabilni lubrikanti, navoji za plinske senzore
Commissariat d’Energie
Atomique Francuska Javna istraživačka ustanova
Temperaturno stabilni materijali za učvršćenje, fotoaktivni materijali (za solarne ćelije),
fikcionalizirane površine
Artur Fischer Werke Njemačka Tvrtka Polimerni dijelovi za učvrščivačke elemente, neobrađeni utikači
Koninkl Philips Electronics Nizozemska Tvrtka Solarne ćelije, organske diode za emitiranje svjetla (OLEDs), zasloni, materijali nalik dijamantima
L’Oreal Francuska Tvrtka Kozmetika za njegu kose, šminka, kreme za sunčanje
Bayer Njemačka Tvrtka Hidrogenacijski katalizatori, katalitički aktivne elektrode za gorive ćelije
BASF Njemačka Tvrtka Polimerni materijali, termoplastični materijali otporni na habanje, čvrste poliuretanske pjene
Patterning Technologies Ujedinjeno Kraljevstvo Tvrtka Tintni materijali za ispis obrazaca elektroničkih uređaja
Alcatel Francuska Tvrtka Polimerni materijali za omatanje optičkih vlakana
Degussa Njemačka Tvrtka Materijali za tinte otporne na otapala, vodootporne tinte, inkjet tinte, kserografski toneri i omotači
Armines Francuska Javna istraživačka ustanova Sinteza fulerena
Till Keesmann (Argus Holding) Njemačka Tvrtka Sinteza endofulerena
Fraunhofer Gesellschaft Njemačka Javna istraživačka ustanova Fleksibilni integrirani polimerni čipovi, polimerni elektrovodljivi materijali
21
Tako se primjerice fulereni koriste u industriji proizvodnje organskih polimernih poluvodiča,
organskih solarnih ćelija, polimernih premaza i čvrstih polimernih termostabilnih materijala u
autoindustriji, nosača lijekova u farmaceutskoj industriji, tinti za pisače (Tablica 1) te u
proizvodnji kozmetičkih proizvoda poput „anti-age“ tinktura i krema te krema za sunčanje
(Tablica 2) (Benn i sur., 2011).
Tablica 2. Komercijalni kozmetički proizvodi koji u svom sastavu sadrže fuleren C60 (Chen i
sur., 2008)
Naziv proizvoda Vrsta proizvoda Proizvođač Zemlja podrijetla
Radical Sponge ® kapi/tinktura Vitamin C60 BioResearch Japan
BioFullerene ™ kapi/tinktura Vitamin C60 BioResearch Japan
Sircuite ® White Out krema Sircuit Cosmeceuticals SAD
Sircuit O.M.G. ™ Serum kapi/tinktura Sircuit Cosmeceuticals SAD
Sircuit Sircuit ™ Addict kapi/tinktura Sircuit Cosmeceuticals SAD
Zelense ® Fullerene C-60 Day and Night Cream krema Zelens GB
2.4.2. Pojavnost fulerena C60 u okolišu
Fuleren C60 je u okolišu prisutan kao rezultat prirodnih procesa te kao posljedica
industrijalizacije (Sanchis i sur., 2013). Prirodno prisutan fuleren C60 posljedica je udara munja,
vulkanske aktivnosti, šumskih požara te udara meteora. Međutim, prirodno prisutni fulereni C60
u okolišu čine tek manji dio od ukupno prisutne količine koja je prije svega rezultat ljudskog
djelovanja. Naime, porast industrijalizacije doveo je i do porasta koncentracije fulerena C60 u
okolišu. Pri tome se porast može pripisati izgaranju benzinskih i dizelskih goriva u motorima s
unutrašnjim izgaranjem, kako vozila tako i u tvorničkim postrojenjima, nenamjernom
ispuštanju u procesima proizvodnje kao i otpuštanju nastalom kao rezultat upotrebe proizvoda
koji sadrže C60 (Daly i sur., 1993; Jehlička i sur., 2000; Malezhik i sur., 2004; Sanchis i sur.,
2011; 2012; Talbot, 1999).
Nanočestice fulerena C60 (nC60) su pronađene u tlu, sedimentima rijeka, otpadnim i površinskim
vodama te atmosferi (Tablica 3). U vodama rijeka s područja Španjolske nC60 su prisutne u
koncentraciji 0-7,8 ng/L (Sanchis i sur., 2012), a otpadnim vodama njihova koncentracija iznosi
0-19100 ng/L (Farre i sur., 2010). U sedimentima rijeka s područja Katalonije (Španjolska)
prisutne su u koncentraciji 0,13 i 0,7 µg/kg te tlu Saudijske Arabije u koncentraciji 0-6,83
µg/kg. U atmosferi Mediterana koncentracija nC60 iznosi do 0,06 ng/m3 (Science for
Environment Policy, 2012).
22
Tablica 3. Pojavnost fulerena C60 okolišu
Vrsta uzorka Koncentracija Izvor
Otpadna voda 4-19100 ng/L Farre i sur., 2010; Pycke i sur., 2012
Riječne vode 0,9 – 7,8 ng/L Sanchis i sur., 2013
Tlo 6,83 µg/kg Sanchis i sur., 2013
Sedimenti rijeka 0,13 i 0,7 ng/g Sanchis i sur., 2013
Atmosfera Mediterana 0,06 ng/m3 Sanchis i sur., 2012
Nanočestice fulerena prisutne u okolišu podliježu kemijskim transformacijama i
biotransformacijama. Naime, nanočestice fulerena C60 u okolišu su podložne oksidaciji u
prisutnosti sunčevog svjetla (UV i vidljivog dijela spektra) što rezultira nastankom epoksi i
hidroksi derivata nC60. Također, takvi derivati nastaju i kemijskim transformacijama u
prisutnosti ozona. Daljnjom transformacijom dio nastalih derivata prelazi u fulerenole koji
najčešće sadrže 20-24 hidroksilne skupine. Prema trenutačnim pretpostavkama (Pycke i sur.,
2012) fulerenoli bi također trebali biti podložni kemijskim transformacijama u prisutnosti
svjetla što može dovesti do mineralizacije fulerenola u topljivi anorganski i organski ugljik.
Međutim, navedeni procesi transformacija mogu trajati od nekoliko tjedana do nekoliko godina
(Avanasi i sur.; 2014; Pycke i sur., 2012).
2.4.3. Antimikrobni učinak nanočestica fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24
Dosadašnje spoznaje o antimikrobnom učinku nanočestica fulerena i fulerenola sažeto su
prikazane u Tablici 4. Ustanovljeno je da nC60 i FNP imaju različit utjecaj na rast prokariotskih
i eukariotskih mikroorganizama i to od inhibitornog do stimulativnog (Huang i sur., 2014;
Aoshima i sur., 2009; Hadduck i sur., 2010; Lyon i sur., 2006; Fortner i sur., 2005; Unković i
sur., 2015; Gao i sur., 2011). Pri tome se antimikrobni/toksični učinak ovih nanočestica
pripisuje: a) načinu pripreme suspenzija nanočestica fulerena C60, b) veličini nanočestica,
c) primijenjenoj koncentraciji, d) vrsti ispitivanog mikroorganizma te e) načinu i uvjetima
uzgoja.
Naime, poznato je kako je fuleren C60 hidrofobna molekula te je najbolje topljiv u benzenu,
naftalenima i alkenima (Marković i Trajković, 2008), dok je u vodi slabo topljiv, tek oko
10-9 µg/mL (Fortner i sur., 2006; Lyon i sur., 2006). Stoga su za ispitivanje toksičnog utjecaja
nanočestica fulerena na mikroorganizme korištene različite metode priprave nanočestica pri
kojima se vodilo računa o potencijalnoj primjeni fulerena u različitim komercijalnim
proizvodima te eventualnom obliku ispuštanja u okoliš. Najčešće metode priprave uključivale
su: i) pripremu nanočestica uz izmjenu organskog otapala, ii) pripremu nanočestica dugotrajnim
23
miješanjem u vodi te iii) enkapsulaciju fulerena polivinolpirilidonom (Fortner i sur., 2005;
Hadduck i sur., 2010; Lyon i sur., 2006; Marković i sur., 2007).
Da se način pripreme suspenzija nanočestica odražava na antimikrobni/citotoksični učinak
pokazuju istraživanja Lyon i sur. (2006) te Markovića i sur. (2007). Tako je pronađeno da
najjači antimikrobni učinak pokazuju nanočestice pripremljene uz izmjenu organskog otapala,
i to slijedom tetrahidroksifuran (THF), toluen (Tol), etanol (EtOH), potom slijede nanočestice
pripremljene dugotrajnim miješanjem u vodi, a najslabiji antimikrobni učinak pokazuju fulereni
enkapsulirani polivinilpirolidonom (Lyon i sur., 2006; Marković i sur., 2007). Pri tome je, u
slučaju nanočestica pripremljenih izmjenom organskog otapala potrebno naglasiti da pojačani
antimikrobni učinak može biti i posljedica zaostatka otapala zarobljenog u strukturi aglomerata
nanočestica (Hadduck i sur., 2010).
Da je antimikrobni učinak ovisan o veličini nanočestica pokazuju istraživanja Lyon i sur.
(2006). Naime, navedeni autori su pokazali da manje za razliku od većih nanočestica pokazuju
jači antimikrobni učinak na Bacillus subtilis.
Ovisnost antimikrobnog učinka o primijenjenoj koncentraciji fulerena pokazuju istraživanja
Lyon i sur. (2005; 2006), Fortner i sur. (2005), pri kojima je ustanovljeno da nanočestice
fulerena potpuno inhibiraju rast B. subtillisa ili E. coli najčešće u rasponu od
400 do 800 ng mL-1. Nasuprot tome Aoshima i sur. (2009) ispitujući ista dva mikroorganizma
nisu ustanovili inhibiciju nanočesticama fulerena, ali su pronašli da inhibicijski učinak
nanočestica fulerenola ovisi kako o vrsti tako i o soju mikroorganizma (Tablica 4). Jedan od
potencijalnih razloga zašto se rezultati istraživanja antimikrobnog učinka Aoshime i sur. (2009)
i Lyon i sur. (2006) međusobno razlikuju je primijenjeni način uzgoja B. subtilisa i E.coli.
Naime, Aoshima i sur. (2009) su ispitivali antimikrobni učinak nanočestica fulerena uzgojem
na krutoj podlozi, a Lyon i sur. (2006) uzgojem u tekućoj podlozi. Da način i uvjeti uzgoja
značajno utječu na rezultate antimikrobnog učinka pokazuje i istraživanje Unkovića i sur.
(2015). Naime, autori su prilikom uzgoja plijesni A. flavus, A. parasiticus i A. ochracheus u
tekućoj podlozi u prisutnosti nanočestica fulerenola pronašli da nanočestice izazivaju
antimkrobni učinak, dok je isti prilikom uzgoja plijesni na krutoj podlozi u prisutnosti
nanočestica fulerenola izostao (Unković i sur., 2015).
Prema dosadašnjim spoznajama antimikrobni učinak nanočestica fulerena i fulerenola može se
pripisati: i) interakciji sa staničnom membranom, ii) nakupljanju nanočestica unutar stanica i/ili
lokalizaciji unutar organela (Chen i sur., 2010; Grebowski i sur., 2013; Monticelli i sur., 2009;
Quiao, 2007) te iii) oksidativnom djelovanju u tami ili uz fotoekscitaciju (Baddiredy i sur.,
2007; Marković i Trajković, 2008; Yamakoshi i sur., 2003). Pri tome se pod interakcijom
24
nanočestica sa membranama podrazumijeva adhezija nanočestica fulerena i fulerenola na
površinu membrana ili nakupljanje unutar fosfolipidnog dvosloja te slijedno uplitanje u
fluidnost membrana i membranski transport. Naime, prema računalnim simulacijama Qiao i
sur. (2007) te Monticelli i sur. (2008) nanočestice fulerenola bi se trebale nakupljati na površini
stanične membrane, a nanočestice fulerena unutar fosfolipidnog dvosloja (Slika 13). Navedeno
su potvrdila istraživanja Chena i sur. (2010) koji su pokazali da se nanočestice fulerena i
fulerenola nakupljaju na površini ili unutar stanične membrane biljnih stanica te ovisno o
primijenjenoj koncentraciji tvore aglomerate koji uslijed agregacije izazivaju mehaničko
oštećenje stanične membrane i povećanu propusnost fosfolipidnog dvosloja, ali isto tako se
uslijed aglomeriranja uglavljuju u pore stanične stijenke onemogućavajući unos hranjivih tvari
u stanicu. Zbog nakupljanja na površini membrana nanočestice mogu stupiti u interakciju s
membranskim proteinima poput kanala, transportera i crpki te na takav način dodatno ometati
membranski transport. To potvrđuju istraživanja Grebowskog i sur. (2013) koji su pokazali da
izlaganje eritrocita visokim koncentracijama fulerenola izaziva inhibiciju membranskih
ATP-aza (Na/K crpka, Ca-ATP-aza, Mg-ATP-aza), a time i otežan transport iona.
Slika 13. Pretpostavljena lokalizacija nanočestica: a) fulerena unutar fosfolipidnog dvosloja i
b) fulerenola na površini fosfolipidnog dvosloja (Qiao i sur., 2007).
Iako trenutno ne postoje čvrsti dokazi da nanočestice fulerena i fulerenola mogu slobodno
difundirati kroz staničnu membranu, istraživanja Johnson-Lyles i sur. (2010) te Ratnikove i sur.
(2011), koja pokazuju da nanočestice fulerenola razaraju stanični citoskelet, upućuju da bi se
barem jedan dio nanočestica mogao nalaziti u citoplazmi stanica. U prilog tome ide istraživanje
Isaacson i sur. (2007), koji su pokazali da stanice embrija ribe zebrice (Danio rerio) apsorbiraju
do 1% nanočestica fulerena, te istraživanje Foley i sur. (2002) koji su ustanovili da se nakon
izlaganja stanica staničnih linija CRL-1635 i CRL-1651 nanočesticama karboksiliranog
fulerena C61(CO2H)2 ove nanočestice nalaze manjim dijelom u citoplazmi, a većim dijelom u
membranama stanica, mikrosomima i mitohondrijima. Na potencijalno nakupljanje nanočestica
25
fulerenola u mitohondrijima upućuju istraživanja Johnson-Lyles i sur. (2010) koji su pokazali
da izlaganje nanočesticama fulerenola dovodi do gubitka membranskog potencijala
mitohondrijske membrane te snižene produkcije ATP.
Da se antimikrobni učinak nanočestica fulerena i fulerenola može pripisati njihovom
oksidativnom djelovanju pokazuju istraživanja Lyon i sur. (2008a; 2008b) koji su ustanovili da
izlaganje E. coli i B. subtillis nanočesticama fulerena uzrokuje oksidaciju proteina, promjene
membranskog potencijala i prekid staničnog disanja. U prilog tome govore i istraživanja
Oberdorstera (2004) koji je pokazao da nanočestice fulerena povećavaju lipidnu peroksidaciju
u stanicama mozga te izazivaju sniženje ukupnog glutationa u stanicama jetre i mozga
pastrvskog grgeča (Micropterus salmoides). Pri tome se oksidativni učinak nanočestica fulerena
i fulerenola može pripisati njihovu djelovanju kao direktnih oksidanasa građevnih molekula
stanice (Lyon i sur; 2008a; 2008b) ili kao rezultat njihove sposobnosti generiranja reaktivnih
vrsta kisika u vodenim otopinama (Kamat i sur., 1998;2000; Kasermann i Kempf, 1997;
Marković i sur., 2007; Sayes i sur., 2004). Pojačano generiranje reaktivnih vrsta kisika
nanočesticama fulerena i fulerenola postiže se u prisutnosti reducenasa poput NADPH i NADH
(Baddiredy i sur., 2007; Yamakoshi i sur., 2003) što je dodatno potaknuto fotoekscitacijom u
UV i/ili VIS području, a rezultira tvorbom singlet kisika, superoksidnog aniona i/ili
hidroksilnog radikala (Baddiredy i sur., 2007; Hotze i sur., 2008; Isaković i sur., 2006; Kong i
Zepp, 2012).
26
Tablica 4. Antimikrobni učinak nanočestica fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24
Mikroorganizam Vrsta nanočestice Ispitivani raspon koncentracija Veličina nanočestica (nm) Prisutnost svjetla Antimikrobni učinak
Izvor podataka Inhibicija rasta MIC (µg mL-1)
Prokariotski mikroorganizmi
Bacillus subtilis
THF/nC60 0,04-4 µg mL-1 > 220 -/+ DA < 0,4 Fotner i sur., 2005
aqua/nC60
nije naveden
142,3
2 - DA
0,6-0,8
0,1-0,23
Lyon i sur., 2006 THF/nC60 97,4
39,1 - DA
0,008-0,01
0,6-0,8
Tol/nC60 2 - DA 0,4-0,6
PVP/nC60 2 - DA 0,6-1
THF/nC60 nije naveden > 220 Nije poznato NE - Aoshima i sur., 2009
THF-aqua/nC60 4,8 µg mL-1 > 220 - DA 1,5-3 Lyon i sur., 2005
Escherichia coli
THF/nC60 0,04-4 µg mL-1 > 220 -/+ DA > 0,4 Fotner i sur., 2005
THF/nC60 nije naveden > 220 Nije poznato NE - Aoshima i sur., 2009
aqua/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
Hadduck i sur., 2010 THF/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
Tol/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
THF-aqua/nC60 1 µg mL-1 > 200 - DA - Aquino i sur., 2010.
THF-aqua/nC60 4,8 µg mL-1 > 220 - DA 0,5-1 Lyon i sur., 2005
Staphylococcus
epidermis
aqua/nC60(OH)36
aqua/nC60(OH)44 nije naveden nije naveden
Nije poznato DA 2000
Aoshima i sur., 2009 Staphylococcus aureus
MRSA; MSSA aqua/nC60(OH)44 nije naveden nije naveden
Nije poznato DA 2000
P. acnes ATCC 6919
P. acnes Cl-9 aqua/nC60(OH)44 nije naveden nije naveden
Nije poznato DA
1000
2000
Bacillus cereus Tol/nC60 0,1-9 µg mL-1 < 220 - NE - Huang i sur., 2014
Cupriavidus sp.
Vibrio sp.
Vibrio sp.
Listonella anguillarum
Listonella anguillarum
Vibrio sp.
aqua/nC60 0.01; 0.10; and 1.00 mg/L >100 - NE - Cordeiro i sur., 2014
27
Nastavak Tablice 4.
Mikroorganizam Vrsta nanočestice Ispitivani raspon koncentracija Veličina nanočestica (nm) Prisutnost svjetla Antimikrobni učinak
Izvor podataka Inhibicija rasta MIC (µg mL-1)
Eukariotski mikroorganizmi
Saccharomyces
cerevisiae
aqua/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
Hadduck i sur., 2010 THF/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
Tol/nC60 26 µg mL-1 > 450 - NE -
Aspergillus niger aqua/nC60(OH)24 2-200 µg mL-1 nije naveden + NE - Gao i sur., 2011
Aspergillus spp aqua/nC60(OH)24 5,2 µg mL-1 6-16 - DA* - Unković i sur., 2015
Trametes versicolor
MAD697-R
C60OxHy s 19-27 kisikovih atoma; nije nano
oblik 35mg/350 mm drveta - - NE -
Schreiner i sur.,
2009. Phlebia tremellosa PRL
2845
C60OxHy s 19-27 kisikovih atoma; nije nano
oblik 35mg/350 mm drveta - - NE -
C albicans NBRC 1594
aqua/nC60(OH)12
aqua/nC60(OH)36
aqua/nC60(OH)44
nije naveden nije naveden
Nije poznato DA
120
60
120
Aoshima i sur., 2009
C albicans Cl-11
50
60
120
C albicans Cl-9
250
60
120
M. furfur NBRC 10987 aqua/nC60(OH)12
aqua/nC60(OH)36
aqua/nC60(OH)44
nije naveden nije naveden Nije poznato DA
250
120
60
M. furfur NBRC 10988
500
250
120
*antimikrobni učinak utvrđen tijekom uzgoja u tekućoj podlozi
28
3. MATERIJALI I METODE
3.1.Uzorci i kemikalije
Istraživanje modulacije oksidativnog stresa nanočesticama fulerena i fulerenola provedeno je
na aflatoksikogenoj plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251 iz zbirke plijesni Katedre za
biokemiju i toksikologiju Prehrambeno-tehnološkog fakulteta Sveučilišta u Osijeku.
Fuleren C60 (99,9% čistoće, sublimirani) je dobavljen od tvrtke Mer Corporation (SAD), a
fulerenol C60(OH)24 je dobiven od prof. dr. sc. Aleksandra Đorđevića, (Sveučilište u Novom
Sadu, Prirodno-matematički fakultet, Srbija). Kvaščev ekstrakt dobavljen je od tvrtke Biolife
(Italija), a saharoza, di-kalijev hidrogen fosfat (K2HPO4), kalijev di-hidrogen fosfat (KH2PO4),
natrijev karbonat (Na2CO3), natrijev hidrogenkarbonat (NaHCO3) i acetonitril od tvrtke BDH
Prolabo (Engleska). Tetranatrijeva sol reduciranog ß-nikotinamid-adenin-dinukleotid-2'-fosfata
(NADPH) dobavljena je od tvrtke Serva (Njemačka), dinatrijeva sol etilendiaminotetraoctene
kiseline (EDTA-2Na) od tvrtke Pharmacia Biotech (Švedska), a stabilizirana 3% otopina
vodikova peroksida (H2O2) i o-ftaldialdehid (OPA) od tvrtke Fluka (Njemačka). Natrijev azid
i klorovodična kiselina dobavljeni su od tvrtke Merck (Njemačka), trikloroctena kiselina (TCA)
i askorbinska kiselina od tvrtke Kemika (Hrvatska), Aldesol+ od tvrtke Pliva, apsolutni etanol
od tvrtke Panreac (Španjolska), a butilirani hidroksitoluen (BHT) i tiobarbiturna kiselina (TBA)
od tvrtke Acros Organics (SAD). Superoksid dismutaza (SOD) iz goveđih eritrocita (3000 U
mg-1 proteina), ksantin oksidaza iz kravljeg mlijeka (0,4-1,0 U mg-1 proteina), glutation
reduktaza (GR) iz pekarskog kvasca (100-300 U mg-1 proteina), dinatrijeva sol oksidiranog
glutationa (GSSG), L-glutation reducirani (GSH), ksantin, nitro-plavi tetrazolium klorid
(NBT), dietilentetraaminopenta octena kiselina (DTPA), tetranatrijeva sol
etilendiaminotetraoctene kiseline (EDTA-4Na), N-etilmaleimid (NEM), natrijev hidrosulfit
(DT) i kalijev cijanid (KCN) dobavljeni su od tvrtke Sigma Aldrich (Njemačka). Standard
aflatoksina (B1, G1, B2, G2) dobavljen je od tvrke Biopure (Austrija), a acetonitril od tvrke
J.T. Baker (Italija).
3.2. Popis opreme
Prilikom istraživanja je korištena sljedeća oprema: svjetlosni mikroskop (Krűss, Tip MBL
2100, Njemačka), ultrazvučna kupelj (Bandelin, Sanorex Super RK 100 H; frekvencija 35 kHz),
29
mikrobiološki laminar B2 klase (Airstream AC2-4E1, Esco, Singapur), LED žarulje (50 W,
2250 Lux, Stella), termostat Aqualytic AL 500-8 (Aqualitic, Njemačka), spektrofotometar
Helios γ, (ThermoSpectronic, UK), Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Inc., UK),
orbitalne tresilice (IKA, KS 260 basic), autoklav (Varioklav®, Dampfsterilisator Typ 500;
Labortechnik GmbH, Njemačka), Acquity UPLC H-Class-Xevo TQD sustav (Waters, USA),
kuglični mlin (Bead Bug Microtube homogenizer, Benchmark Scientific, SAD), rashladna
centrifuga (Heraeus, Njemačka), centrifuga Centric 150 (Tehtnica, Slovenija) te
spektrofluorimetar Cary Eclipse (Varian, SAD).
3.3. Priprema suspenzije spora plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251
Priprema suspenzije spora plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251 provedena je prema Šarkanju
(2014). Na kulturu plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251 poraslu na kosom PDA
(krumpirovom glukoznom agaru (eng. potato dextrose agar)) nakon sedmodnevne inkubacije
je dodano 5 mL sterilne fiziološke otopine (0,9 % otopina NaCl u destiliranoj vodi). Potom su
mikrobiološkom ušicom odvojene spore s micelija plijesni i suspenzija je promiješana
vorteksiranjem tijekom 30 s. Suspenzija spora je potom prenesena u drugu epruvetu s kulturom
plijesni i postupak odvajanja spora od micelija je ponovljen. Tako pripremljenoj suspenziji
određen je broj spora, i potom je suspenzija podešena na željeni broj spora dodatkom određenog
volumena fiziološke otopine.
Broj spora u suspenziji određen je direktnim brojanjem pod svjetlosnim mikroskopom (Krűss,
Tip MBL 2100, Njemačka) pri povećanju od 400x uz primjenu Bϋrker-Turkove komorice.
Spore su prebrojane u četiri kvadranta, a broj spora preračunat prema Jednadžbi 22:
broj spora = ((A+B+C+D)∙ 2500 )
x (22)
gdje je:
A+B+C+D - broj spora po kvadrantima,
2500 - faktor preračunavanja kod brojanja 4 kvadrata,
x - razrjeđenje (u ovom slučaju 10-1).
Potom je koncentracija spora podešena na željenu pomoću fiziološke otopine i to prema
sljedećoj Jednadžbi 23:
y = 10 x∙V
broj spora (23)
30
gdje je:
y - volumen pripremljene suspenzije koji se dodaje za pripremu željene koncentracije spora,
10 x - koncentracija spora koja se želi dobiti,
V - volumen suspenzije sa željenom koncentracijom spora,
broj spora - broj spora izračunat prema Jednadžbi 22.
Nakon što je podešen broj spora provjerena je gustoća suspenzije spora nacjepljivanjem
razrjeđene suspenzije na površinu PDA agara te je određen broj kolonija (CFU mL-1) poraslih
pri 25°C nakon 5 dana inkubacije.
3.4.Priprema suspenzije nanočestica fulerena
Suspenzija nanočestica fulerena C60 pripremljena je modificiranom metodom dugotrajnog
miješanja u vodi prema Lyon i sur. (2006). U laboratorijsku bocu s navojem i čepom volumena
1 L koja je sadržavala 200 mg fulerena naliveno je 500 mL ultračiste vode brzinom od
1 L min-1. Suspenzija je kratko (10 min) promiješana na elektromagnetskoj miješalici pri
550 o min-1 i potom podvrgnuta ultrazvučnoj obradi u ultrazvučnoj kupelji (Bandelin, Sanorex
Super RK 100 H; frekvencija 35 kHz) tijekom dva ciklusa po 60 minuta uz 30 minutno hlađenje
između ciklusa. Nakon ultrazvučne obrade suspenzija fulerena u vodi miješana je na
elektromagnetnoj miješalici pri 550 o min-1 tijekom 30 dana. Po isteku miješanja suspenzija
nanočestica je podvrgnuta ultrazvuku tijekom 60 minuta u svrhu razbijanja aglomerata.
Nanočestice prisutne u suspenziji odvojene su od većih aglomerata filtracijom u dva stupnja.
Prvo su veliki aglomerati odvojeni od suspenzije nanočestica vakuum filtracijom kroz filter
papir Whatman No. 1 (veličina pora 11 m), a zatim su iz filtrata uklonjene sve nanočestice
veće od 450 nm propuštanjem filtrata kroz 0,45 m injekcijski filter (Chromafil Xtra PA 45/25,
proizvođač). Postupak filtriranja kroz 0,45 m injekcijski filter proveden je u sterilnim uvjetima
mikrobiološkog laminara B2 klase (Airstream AC2-4E1, Esco, Singapur), te je na takav način
ujedno provedena i sterilizacija suspenzije nanočestica. Tako pripremljena sterilna suspenzija
nanočestica fulerena korištena je za ispitivanja.
Masena koncentracija nanočestica fulerena određena je spektrofotometrijski, mjerenjem
apsorbancije otopine fulerena pri 336 nm, prema Lyon i sur. (2006) uz primjenu baždarnog
dijagrama pripravljenog sa različitim koncentracijama fulerena u toluenu.
31
3.5. Priprema suspenzije nanočestica fulerenola
Suspenzija nanočestica fulerenola pripremljena je prema Markoviću i sur. (2007) otapanjem
5 mg fulerenola C60(OH)24 u 500 mL ultračiste vode uz primjenu ultrazvuka u četiri ciklusa od
30 minuta uz 15 minuta hlađenja između ciklusa. Tako pripremljena suspenzija nanočestica
fulerenola koncentracije od 10 µg mL-1 sterilizirana je propuštanjem kroz injekcijski filter (od
poliamida PA) s veličinom pora 0,45 µm u sterilnim uvjetima laminara.
3.6. Karakterizacija nanočestica
Metoda dinamičkog raspršenja svjetlosti (engl. Dynamic Light Scattering, DLS) je korištena s
ciljem određivanja hidrodinamičkog promjera nanočestica u vodenim suspenzijama
nanočestica fulerena i fulerenola, dok je za određivanje naboja površine nanočestica (zeta
potencijala) korištena metoda elektroforetskog rasipanja svjetlosti (engl. Electrophoretic Light
Scattering, ELS). Za izvođenje analiza korišten je uređaj Zetasizer Nano ZS (Malvern
Instruments Inc., UK). Sva DLS mjerenja su izvedena u triplikatu, pri valnoj duljini od 633 nm,
kutu mjerenja od 173 o (tzv. backscatter detection) i pri sobnoj temperaturi. Mjerenja zeta
potencijala su izvedena u duplikatu.
3.7.Uzgoj micelija plijesni
Submerzni uzgoj micelija plijesni A. flavus proveden je u mikrobiološkoj YES (eng. Yeast
Extract Sucrose; hrv. ekstrakt kvasca - saharoza) podlozi prema Gandomiju i sur. (2009). Svi
uzgoji su provedeni sa inokulumom iste generacije plijesni. Plijesan je uzgajana aerobno pri
29 °C na orbitalnoj tresilici (IKA, KS 260 basic) uz miješanje od 200 o min-1, u prisustvu
nanočestica fulerena (0, 10, 50 i 100 ng mL-1) i fulerenola (0, 10, 100 i 1000 ng mL-1) tijekom
sedam dana (168 h). Uzgoj plijesni je proveden u mraku i uz primjenu fotoindukcije. Uzgoj uz
fotoindukciju proveden je izlaganjem plijesni vidljivom dijelu spektra primjenom LED žarulje
(50 W, 2250 Lux, Stella) u režimu 12 h tama, 12 h svjetlo. Pri svim navedenim uvjetima
provedena su tri neovisna uzgoja, a svaki od neovisnih uzgoja u triplikatu.
Postupak uzgoja uključivao je sljedeće korake: a) pripremu sterilne YES podloge, b)
inokulaciju podloge sporama plijesni, te c) izuzimanje micelija plijesni za analize.
a) Hranjiva YES podloga pripremljena je otapanjem 2 g ekstrakta kvasca i 6 g saharoze u
100 mL destilirane vode. Potom je u laboratorijske boce s navojem i čepom volumena
250 mL dodano 50 mL pripremljene podloge i podloga je sterilizirana pri 121 °C tijekom
32
20 min (Varioklav®, Dampfsterilisator Typ 500; Labortechnik GmbH, Germany). Za
podloge u koje je dodavan određeni volumen suspenzije nanočestica fulerena ili fulerenola,
volumen dodane vode tijekom pripreme podloge je nešto smanjen kako bi završna
koncentracija ekstrakta kvasca i saharoze nakon dodatka određenog volumena suspenzije
nanočestica fulerena i fulerenola bila identična onoj u kontrolnom uzgoju. Smanjenje
volumena vode nije iznosilo više od 5 mL (10 %).
b) Inokulacija ohlađenih i sterilnih podloga provedena je pri sterilnim uvjetima
mikrobiološkog laminara B2 klase (Esco, Airstream AC2-4E1, Singapur) prethodno
dezinficiranim 3%-tnom otopinom Aldesola+, 70%-tnim etanolom te UV germicidnim
zračenjem (260 nm). U bočice sa sterilnom podlogom je prvo dodan određeni volumen
suspenzije nanočestica fulerena ili fulerenola, i potom su podloge nacijepljene s 20 µL
inokuluma A. flavus NRRL 3251, koncentracije 2,5·106 CFU mL-1.
c) Izuzimanje micelija plijesni i pripadajućih podloga submerznog uzgoja za analize
provođeno je svaka 24 sata između 48 i 168 sati uzgoja. Izuzeti sustav (micelij u podlozi)
podvrgnut je odvajanju micelija od tekuće podloge za daljnje analize.
3.8.Odvajanje micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 od podloge
Nakon isteka određenog vremena inkubacije, micelij plijesni je odvojen od mikrobiološke
podloge filtracijom kroz nabrani filter papir. Micelij zaostao na filter papiru dodatno je ocijeđen
od podloge te izvagan na analitičkoj vagi. Nakon vaganja micelij je usitnjen u tarioniku pomoću
tučka u homogenu smjesu, potom razdijeljen u alikvote određene mase i u plastičnim
epruveticama volumena 1,5 mL čuvan pri -80 °C do provedbe analize. Tekuća podloga
preostala nakon filtracije korištena je za određivanje koncentracije aflatoksina tekućinskom
kromatografijom ultravisoke djelotvornosti u sprezi s tandemskom masenom spektrometrijom
(UHPLC-MS/MS).
3.9.Određivanje udjela suhe tvari u miceliju plijesni
Udio suhe tvari u miceliju određen je sušenjem do konstantne mase pri 105 °C prema Martin-
u (1992). Vlažni micelij je u aluminijskoj posudici pomiješan s 5 g kvarcnog pijeska i sušen do
konstante mase. Udio suhe tvari u miceliju izračunat je prema Jednadžbi 24.
33
Udio vode (%) = 100 (a-b)
c
Udio suhe tvari (%) = 100% - Količina vode (%) (24)
gdje je:
a – masa posudice s micelijem prije sušenja (g),
b – masa posudice s micelijem nakon sušenja (g) i
c - odvagana masa vlažnog micelija (g).
3.10. Određivanje koncentracije aflatoksina
Aflatoksini prisutni u tekućoj podlozi određeni su LC-MS/MS metodom (sprega tekućinske
kromatografije i tandemske spektrometrije mase) primjenom tehnike „dilute and shoot“
(razrijedi i mjeri).
Postupak pripreme uzorka za „dilute and shoot“ metodu sastojao se od filtracije podloge kroz
0,22 µm injekcijski filter (Najlon, Labex Ltd., Mađarska ), te razrijeđivanja filtrata s 20%-tnom
vodenom otopinom acetonitrila. Volumni omjer razrjeđenja iznosio je 1:9.
U svrhu provjere iskorištenja metode (eng. recovery) čista tekuća podloga obogaćena je
otopinom standarda aflatoksina (smjesa B1, B2, G1, G2) u koncentraciji 10 ng mL-1 i
pripremljena na isti način kako je prije opisano.
Pripremljeni uzorci su bez daljnjeg pročišćavanja injektirani u UHPLC-MS/MS sustav.
Razdvajanje aflatoksina provedeno je na uređaju Acquity UPLC H-Class sustav (Waters, MA,
SAD) uz Acquity BEH C18 kolonu (2,1 x 100 mm, 1,7 µm) (Waters, SAD) termostatiranu pri
40 °C, u gradijentu pokretne faze voda:acetonitril:mravlja kiselina (Tablica 5), uz protok od
0,5 mL min-1.
Tablica 5. Gradijent pokretne faze
Vrijeme analize (min) H2O + 0,1% HCOOH ACN + 0,1% HCOOH
0 98 2
0,5 98 2
4,0 10 90
4,5 10 90
4,6 98 2
6,0 98 2
34
Detekcija i kvantifikacija aflatoksina provedena je Xevo TQD spektrometrom masa (Waters,
MA, SAD). Ionizacija je provedena pomoću elektrosprejnog izvora u pozitivnom modu (ESI+)
(Tablica 6). Odvajanje iona je provedeno uz MRM (engl. multiple reaction monitoring)
akviziciju te su praćene dvije individualne tranzicije iona svakog aflatoksina. Svi odabrani
početni ioni su bili [M+H]+ oblika. Tranzicije i pripadajući MS/MS uvjeti za analizu aflatoksina
su navedeni u Tablici 7.
Tablica 6. Uvjeti ionizacije aflatoksina na ESI izvoru
Kapilarni napon: 3,5 kV
Plin za otparavanje: dušik, 650 L Hr-1, 400 °C
Deklasterirajući plin: dušik, 10 L Hr-1
Temperatura izvora: 150 °C
Akvizicija: MRM način, praćenje višestrukih reakcija
Kolizijski plin: argon pri 3,7·10-3 mBar
Nakon integriranja kvantitativnih kromatograma, valjanost podataka provjerena je usporedbom
odnosa s kvalitativnim kromatogramom u odnosu na aflatoksine iz standarda aflatoksina. Po
preračunavanju su sve vrijednosti aflatoksina izražene u ng mL-1.
Tablica 7. Tranzicije i pripadajući MS/MS uvjeti za analizu aflatoksina
Spoj Tranzicije iona (m/z) Zadržavanje
uvjeta (ms)
Potencijal
deklasteriranja (V) Energija kolizije (V)
AFB1 313>285
313 >241
5
5
60
60
23
38
AFB2 315 >259
315 >287
5
5
60
60
30
25
AFG1 329 >243
329 >259
5
5
60
60
28
24
AFG2 331 >313
331 >245
5
5
60
60
24
28
3.11. Priprema ekstrakata
Masi od 100 mg micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u epruvetici za razbijanje dodan je 1 g
prethodno ohlađenih staklenih kuglica promjera 0,5 mm (Sigma Aldrich, Njemačka) i 1 mL
hladnog pufera za ekstrakciju. Razbijanje micelija plijesni i slijedna ekstrakcija provedena je
homogenizacijom u kugličnom mlinu (Bead Bug Microtube homogenizer, Benchmark
Scientific, USA) u tri ciklusa homogenizacije po 2 minute uz dvominutno hlađenje epruveta na
ledu između ciklusa.
35
Sastav pufera za ekstrakciju se razlikovao obzirom na željenu analizu. Za pripremu ekstrakta
za određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima: katalaze (CAT), superoksid dismutaze
(SOD), glutation reduktaze (GR) i glutation peroksidaze (GPx), korišten je 50 mmol L-1 kalijev
fosfatni pufer pH 7,0 koji je sadržavao 1 mmol L-1 EDTA-2Na. U pripremi ekstrakta za
određivanje koncentracije lipidnih peroksida korišten je 50 mmol L-1 kalijev fosfatni pufer koji
je sadržavao 1 mmol L-1 EDTA-2Na i 100 mg mL-1 TCA, dok je slučaju ekstrakta za
određivanje koncentracije reduciranog (GSH) i oksidiranog (GSSG) glutationa homogenizacija
provedena u puferu koji je sadržavao 20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA,
10 mmol L-1 askorbinske kiseline te 50 mg mL-1 TCA. Nakon provedene homogenizacije
ekstrakti su izbistreni centrifugiranjem pri 15 000 g tijekom 20 min pri 4°C u centrifugi
(Heraeus, Njemačka), te odmah korišteni za analize.
3.12. Određivanje koncentracije lipidnih peroksida (TBARS)
Određivanje koncentracije lipidnih peroksida (reaktivnih spojeva tiobarbiturne kiseline -
TBARS) provedeno je spektrofotometrijskim mjerenjem apsorbancije pri 535 nm metodom
prema Lushchaku i Gospodaryovu (2005). Metoda se temelji na reakciji malondialdehida s
2-tiobarbiturnom kiselinom pri čemu nastaje obojeni kompleks sa maksimumom apsorbancije
pri 535 nm.
Volumenu ekstrakta od 500 L dodano je 1000 L TBA reagensa (tiobarbiturna kiselina
( = 0,67 mg mL-1) u 0,1 mol L-1 HCl, sa 10 mmol L-1 BHT, pH 2,5) i uzorak je inkubiran pri
95 °C tijekom 60 minuta. Po isteku vremena uzorak je ohlađen u ledenoj vodenoj kupelji,
pomiješan sa n-butanolom u volumnom omjeru 1:1, te snažno promiješan tijekom 30 sekundi
na vortex miješalici, u svrhu prelaska TBA reaktivnih spojeva u butanolni sloj. Slojevi
(butanol/voda) razdvojeni su centrifugiranjem (2795 g, 10 min, 25 °C) u centrifugi Centric 150
(Tehtnica, Slovenija), i potom je gornji butanolni sloj koji je sadržavao TBA reaktivne spojeve
uz pomoć mikropipete prenesen u kivetu te je otopini izmjerena apsorbancija pri 535 nm, uz
slijepu probu. Slijepa proba je sadržavala sve gore navedene komponente, izuzev ekstrakta koji
je zamijenjen ultračistom vodom.
Koncentracija TBARS izračunata je prema Jednadžbi 25:
TBARS (nmol L-1) = A535 nm∙V∙R∙1000
ε535 nm∙ Ve
(25)
36
gdje je:
V - volumen n-butanola (1,5 mL),
R - faktor razrjeđenja,
ε535 nm malondialdehida = 156 x 103 L cm-1 mol -1,
Ve - volumen ekstrakta (0,5 mL).
3.13. Određivanje koncentracije reduciranog (GSH) i oksidiranog (GSSG)
glutationa
Određivanje koncentracije reduciranog i oksidiranog glutationa provedeno je
spektrofluorimetrijskom metodom prema Senftu i sur. (2000). Metoda se temelji na reakciji
primarnih amina s o-ftaldialdehidom (OPA) u prisutnosti tiola pri čemu nastaje fluorescentni
spoj izoindol s maksimumom fluorescencije pri 365/430 nm.
Postupak određivanja reduciranog i oksidiranog glutationa u uzorcima je radi lakšeg
razumijevanja prikazan Tablicama 8 i 9.
Tablica 8. Postupak određivanja reduciranog glutationa
Komponente reakcijske smjese
Slijepa
proba
(µL)
Glavna
proba
(µL)
Ekstrakt - 20
20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPAa, 10 mmol L-1 AAb, 50 mg mL-1 TCA 150 130
7,5 mmol L-1 NEMc u 20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA,
10 mmol L-1 AA
20 -
20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA, 10 mmol L-1 AA - 20
1 mol L-1 kalijev fosfatni pufer pH 7,0 250 250
Promućkati i inkubirati 5 minuta na sobnoj temperaturi
100 mmol L-1 kalijev fosfatni pufer pH 6,9 1000 1000
o-ftaldialdehid u metanolu ( = 5 mg mL-1) 150 150
Promućkati i inkubirati 30 minuta na sobnoj temperaturi
a DTPA - dietilentetraaminopenta octena kiselina; b AA – askorbinska kiselina; c NEM – N-etilmaleimid
Po isteku inkubacije fluorescencija otopina mjerena je pri 365/430 nm uz ekscitacijski zazor od
5 nm i emisijski zazor od 20 nm na spektrofluorimetru Cary Eclipse (Varian, SAD). Intenzitet
fluorescencije uzorka korigiran je za intenzitet slijepe probe, i potom preračunat u količinu tvari
37
izraženu u nanomolima na osnovu baždarnog dijagrama pripravljenog sa poznatim
koncentracijama reduciranog ili oksidiranog glutationa (0 - 1 nmol).
Tablica 9. Postupak određivanja oksidiranog glutationa
Komponente reakcijske smjese
Slijepa
proba
(µL)
Glavna
proba
(µL)
Ekstrakt - 100
20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPAa, 10 mmol L-1 AAb, 50 mg mL-1 TCA 150 50
7,5 mmol L-1 NEMc u 20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA,
10 mmol L-1 AA 20 20
20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA, 10 mmol L-1 AA 30 -
1 mol L-1 kalijev fosfatni pufer pH 7,0 250 250
100 mmol L-1 DT d u 20 mmol L-1 HCl, 5 mmol L-1 DTPA, 10 mmol L-1 AA - 30
Promućkati i inkubirati 60 minuta na sobnoj temperaturi
100 mmol L-1 kalijev fosfatni pufer pH 6,9 1000 1000
o-ftaldialdehid u metanolu ( = 5 mg mL-1) 150 150
Promućkati i inkubirati 30 minuta na sobnoj temperaturi
a DTPA - dietilentetraaminopenta octena kiselina; b AA – askorbinska kiselina; c NEM – N-etilmaleimid; d DT –
natrijev hidrosulfit
3.14. Određivanje koncentracije proteina
Koncentracija proteina u ekstraktima micelija plijesni A. flavus određena je metodom po
Bradfordici (1976). Metoda se temelji na nespecifičnom vezanju anionskog oblika boje
Coomassie Briliant Blue G-250 za bazične i aromatske bočne ogranke proteina, uslijed čega
dolazi do stvaranja kompleksa protein-boja, koji u kiselom mediju pokazuje apsorpcijski
maksimum pri 595 nm.
U kivetu sa 100 µL ekstrakta dodano je 2 mL Bradford reagensa te je nakon zadrške od 5 minuta
otopini određena apsorbancija pri 595 nm, uz slijepu probu koja je umjesto ekstrakta sadržavala
100 µL pufera za razbijanje. Intenzitet apsorbancije preračunat je u koncentraciju proteina na
osnovi baždarnog dijagrama pripravljenog sa poznatim koncentracijama goveđeg serumskog
albumina (BSA).
38
3.15. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze
Aktivnost ukupne, bakar,cink i manganove superoksid dismutaze (SOD; EC 1.15.1.1) u
ekstraktima plijesni određena je indirektnim kontinuiranim spektrofotometrijskim
ksantin/ksantin oksidaza/NBT testom pri 25°C prema Angelovoj i sur. (2005). Metoda se
temelji na mjerenju promjene apsorbancije reakcijske smjese pri 505 nm nastale zbog oksidacije
nitro-plave tetrazolijumske soli (NBT) superoksidnim radikalom kojeg u reakcijskog smjesi
stvara sustav ksantin/ksantin oksidaza, a superoksidaza ne uspijeva u potpunosti ukloniti.
Mjerenjem aktivnosti SOD bez dodatka kalijevog cijanida određena je ukupna SOD, uz dodatak
kalijevog cijanida aktivnost manganove SOD (Mn-SOD), a iz razlike aktivnosti ukupne i Mn-
SOD, izračunata je aktivnost bakar, cink SOD (Cu,Zn-SOD).
Reakcijska smjesa pri određivanju ukupne SOD sadržavala je 700 µL otopine A
(200 mmol L-1 karbonatni pufer pH 10,0 sa 0,12 mmol L-1 EDTA-2Na, 0,24 mmol L-1
ksantinom i 0,05 mmol L-1 NBT), x µL ekstrakta micelija plijesni, 250-x µL ultračiste vode te
50 µL otopine B (otopina ksantin oksidaze 0,1 U mL-1 u ultračistoj vodi ). Reakcija je započeta
dodatkom otopine B, i promjena apsorbancije pri 505 nm je praćena tijekom 5 minuta.
Neinhibirana reakcija priređena je zamjenom ekstrakta sa istim volumenom ultračiste vode.
Reakcijska smjesa pri određivanju Mn-SOD sadržavala je 700 µL otopine A (200 mmol L-1
karbonatni pufer pH 10,0; 0,12 mmol L-1 EDTA-2Na; 0,24 mmol L-1 ksantin; 0,05 mmol L-1
NBT), x µL ekstrakta micelija plijesni, 200-x µL ultračiste vode, 50 µL 40 mmol L-1 otopine
KCN te 50 µL otopine B (otopina ksantin oksidaze 0,1 U mL-1 u ultračistoj vodi). Reakcija je
pokrenuta dodatkom otopine B, i promjena apsorbancije pri 505 nm je praćena tijekom 5
minuta. Neinhibirana reakcija priređena je zamjenom ekstrakta sa istim volumenom ultračiste
vode.
U oba slučaja određivanja aktivnosti SOD, bilo je potrebno podesiti volumen dodanog ekstrakta
kako bi se dobio postotak inhibicije oksidacije NBT u rasponu od 40 do 60% (Jednadžba 26).
Aktivnost SOD izražena je u U mL-1 pri čemu 1 U predstavlja onu količinu enzima koja izaziva
50% inhibiciju oksidacije NBT (Jednadžba 27).
% inhibicije = (∆A(neinhibirane reakcije)-∆A(inhibirane reakcije))
100 (26)
U mL-1 SOD = % inhibicije ∙ R
50%∙V (27)
gdje je:
V-volumen uzorka
R-razrjeđenje.
39
Aktivnost superoksid dismutaze u miceliju je izražena specifičnom aktivnosti. Pri tome je
specifična aktivnost SOD definirana kao masa (mg) enzima koji izaziva 50% inhibiciju
oksidacije NBT.
3.16. Određivanje aktivnosti katalaze
Aktivnost katalaze (CAT; EC 1.11.1.6) u ekstraktima određena je kontinuiranim
spektrofotometrijskim testom pri 25°C koji se temelji na mjerenju promjene apsorbancije
reakcijske smjese pri 240 nm nastale kao rezultat razgradnje H2O2 (Aebi, 1984; Reverberi i sur.,
2005).
Reakcijska smjesa se sastojala od 20 µL ekstrakta i 1 mL 11 mmol L-1 H2O2 u 50 mmol L-1
kalijevom fosfatnom puferu pH 7,0 koji je sadržavao 1 mmol L-1 EDTA-2Na. Reakcija je
započeta dodatkom ekstrakta i nakon početne zadrške od 30 sekundi, promjena apsorbancije
pri 240 nm mjerena je svakih 10 sekundi tijekom 100 sekundi uz kontrolu raspada supstrata kao
slijepu probu. Kontrola raspada supstrata priređena je zamjenom volumena ekstrakta iz
reakcijske smjese sa istim volumenom 50 mmol L-1 KH2PO4 pufera pH 7,0 sa 1 mmol L-1
EDTA-2Na.
Aktivnost katalaze (ΔA240 nm min-1 mL-1) određena je iz nagiba linearnog dijela krivulje te
preračunata u μmol min-1 mL-1 (U mL-1) pomoću molarnog apsorpcijskog koeficijenta H2O2
(ε = 0,0436 L cm-1 mmol -1).
Aktivnost katalaze u miceliju je izražena specifičnom aktivnosti. Pri tome je specifična
aktivnost katalaze definirana kao količina (μmol) H2O2 koju u jednoj minuti razgradi jedan
miligram proteina ekstrakta.
3.17. Određivanje aktivnosti glutation peroksidaze
Aktivnost glutation peroksidaze (GPX; EC 1.11.1.9) određena je prema Esworthyju i sur.
(2005) indirektnim kontinuiranim spektrofotometrijskim testom pri sobnoj temperaturi. Metoda
se temelji na praćenju promjene apsorbancije reakcijske smjese pri 340 nm nastale kao rezultat
oksidacije NADPH u NADP+ zbog redukcije oksidiranog (GSSG) u reducirani oblik glutationa
(GSH) uzrokovan djelovanjem egzogeno dodane glutation reduktaze, pri čemu GSSG nastaje
djelovanjem glutation peroksidaze.
Reakcijska smjesa za određivanje aktivnosti GPX sastojala se od 730 μL pufera za određivanje
aktivnosti (235,2 mmol L-1 fosfatni pufer pH 7,0 sa 0,5 mmol L-1 natrijeva azida i
0,68 mmol L-1 tetranatrijeve soli etilendiaminotetraoctene kiseline), 50 μL 20 mmol L-1 GSH,
40
50 μL 0,24 U mL-1 glutation reduktaze iz S. cerevisiae, 100 μL ekstrakta micelija plijesni,
50 μL 10 mmol L-1 NADPH te 20 μL 7,5 mmol L-1 H2O2. Enzimska reakcija pokrenuta je
dodatkom 7,5 mmol L-1 H2O2 i promjena apsorbancije pri 340 nm je mjerena tijekom 5 minuta
uz kontrolu raspada supstrata. Kontrola raspada supstrata priređena je ispuštanjem ekstrakta iz
reakcijske smjese zamjenom sa 100 μL pufera za razbijanje.
Aktivnost GPX (ΔA340nm min-1 mL-1) određena je iz nagiba linearnog dijela krivulje te
preračunata u μmol NADPH min-1 mL-1 pomoću molarnog apsorpcijskog koeficijenta NADPH
(ε = 6,22 L cm-1 mmol -1).
Aktivnost enzima u miceliju izražena je specifičnom aktivnošću. Specifična aktivnost GPX
definirana je kao količina (μmol) oksidiranog NADPH koji tijekom jedne minute nastane
djelovanjem jednog miligrama proteina ekstrakta.
3.18. Određivanje aktivnosti glutation reduktaze
Aktivnost glutation reduktaze (GR; EC 1.8.1.7) određena je kontinuiranim
spektrofotometrijskim testom prema Reverberiju i sur. (2005) pri sobnoj temperaturi. Metoda
se temelji na promjeni apsorbancije reakcijske smjese pri 340 nm, nastale kao rezultat
oksidacije NADPH u NADP+ tijekom redukcije oksidiranog glutationa.
Reakcijska smjesa za određivanje aktivnosti se sastojala od 500 μL 2 mmol L-1 GSSG u
100 mmol L-1 kalijevom fosfatnom puferu pH 7,5 sa 1 mmol L-1 EDTA-2Na; 350 μL
100 mmol L-1 kalijevog fosfatnog pufera pH 7,5 sa 1 mmol L-1 EDTA-2Na; 100 μL ekstrakta i
50 μL 2 mmol L-1 NADPH u 100 mmol L-1 kalijevom fosfatnom puferu pH 7,5 s 1 mmol L-1
EDTA-2Na. Enzimska reakcija je započeta dodatkom NADPH, i nakon početne zadrške od
30 s praćena je promjena apsorbancije pri 340 nm svakih 10 s tijekom 100 s, uz kontrolu raspada
supstrata. Kontrola raspada supstrata priređena je ispuštanjem ekstrakta iz reakcijske smjese,
koji je zamijenjen s 100 mmol L-1 kalijevim fosfatnim puferom pH 7,5 s
1 mmol L-1 EDTA-2Na.
Aktivnost GR (ΔA340nm min-1 mL-1) određena je iz nagiba linearnog dijela krivulje te
preračunata u μmol NADPH min-1 mL-1 pomoću molarnog apsorpcijskog koeficijenta NADPH
(ε = 6,22 L cm-1 mmol -1).
Aktivnost enzima u miceliju izražena je specifičnom aktivnosti. Specifična aktivnost GR
definirana je kao količina (μmol) oksidiranog NADPH koji tijekom jedne minute nastane
djelovanjem jednog miligrama proteina u ekstraktu.
41
3.19. Statistička analiza eksperimentalnih podataka
Statistička analiza eksperimentalnih podataka provedena je primjenom programskog paketa
Dell Statistica 12.0 (Dell Inc., 2015). Promjene praćenih parametara tijekom uzgoja plijesni
analizirane su primjenom neparametrijskih statističkih metoda (Friedman ANOVA i Kendallov
koeficijent konkordancije). Razlike između pojedinih uvjeta uzgoja
(svjetlo/mrak; kontrola/fulereni/fulerenoli) i/ili vremena uzgoja (48, 72, 96, 120, 144 i 168 h)
određene su primjenom Kruskal-Wallis ANOVA. Statistički značajno različitima smatrani su
podatci s vrijednostima p < 0,05.
42
4.REZULTATI
Cilj ovog doktorskog rada bio je utvrditi utjecaj nanočestica fulerena C60 (nC60) i fulerenola
C60(OH)24 (FNP) na modulaciju oksidativnog stresa, produkciju aflatoksina i rast plijesni
Aspergillus flavus NRRL 3251.
Osnovne pretpostavke bile su da će nC60 i FNP modulirati oksidativni stres plijesni A. flavus
NRRL 3251 ovisno o primijenjenoj koncentraciji i uvjetima uzgoja (sa i bez izloženosti
vidljivom svjetlu). Očekivano je da će smanjena razina oksidativnog stresa uzrokovati
antiaflatoksikogeni učinak, povišena razina pojačanu produkciju aflatoksina i/ili potencijalno
antifungalni učinak, a oksidativni stres kvazistacionarne razine povećani rast micelija plijesni i
povećanu produkciju aflatoksina.
Rezultati disertacije se mogu podijeliti na šest osnovnih dijelova. Prvi dio obuhvaća
karakterizaciju suspenzija nC60 i FNP, dok je modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus
s nC60 i FNP podjeljena na pet dijelova:
a) modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom uzgoja
micelija plijesni u tami,
b) modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom uzgoja
micelija plijesni u tami,
c) utjecaj izloženosti plijesni A. flavus VIS svjetlu tijekom submerznog uzgoja na porast
mase micelija, produkciju aflatoksina, koncentraciju lipidnih peroksida i glutationa, te
aktivnost antioksidativnih enzima,
d) modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom uzgoja
micelija plijesni uz izloženost vidljivoj svjetlosti te
e) modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom uzgoja
micelija plijesni uz izloženost vidljivoj svjetlosti.
4.1. Karakterizacija suspenzija nanočestica fulerena i fulerenola
Rezultati određivanja prosječne veličine nC60 koje je provedeno DLS-om (Slika 14a) pokazuju
kako u suspenziji nC60 koncentracije 1,36 µg mL-1 srednja vrijednost hidrodinamičkog promjera
nanočestica po broju iznosi 78 nm, pri čemu su čestice veličine 50 nm zastupljene 3%,
58 nm 12%, 68 nm 20%, 78 nm 21%, 91 nm 16%, 105 nm 19%, 122 nm 6% a one od 190 nm
43
1,7%. Zeta potencijal istih nanočestica iznosi -24,5 mV (Slika 14b). Rezultati analize neovisno
pripremljenih suspenzija nanočestica pokazali su ujednačenost pripreme s obzirom na veličinu
i zeta potencijal.
Rezultati određivanja prosječne veličine FNP (Slika 15a) koje je također provedeno DLS-om
pokazuju kako u suspenziji FNP koncentracije 10 µg mL-1 srednja vrijednost hidrodinamičkog
promjera nanočestica iznosi 10 nm, pri čemu su čestice veličine 6,5 nm zastupljene 0,4%,
7,5 nm 8,2%, 8,7 nm 23,4%, 10 nm 28,8%, 11,7 nm 21%, 13,5 nm 11,2%, 15,7 nm 4,8%,
18,2 nm 1,6% a one od 21 nm 0,4%. Zeta potencijal istih nanočestica iznosi -34,9 mV (Slika
15b). Rezultati analize neovisno pripremljenih suspenzija FNP pokazali su ujednačenost
pripreme s obzirom na veličinu i zeta potencijal.
Slika 14. Karakterizacija nanočestica fulerena metodom dinamičkog raspršenja svjetlosti na
uređaju Zetasizer Nano ZS. Slika: a) prosječna veličina nanočestica i b) zeta potencijal
44
Slika 15. Karakterizacija nanočestica fulerenola metodom dinamičkog raspršenja svjetlosti na
uređaju Zetasizer Nano ZS. Slika: a) prosječna veličina nanočestica i b) zeta potencijal
4.2. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja micelija plijesni u tami
4.2.1.Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni
Slika 16. prikazuje rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u tekućoj YES podlozi tijekom
168 sati pri 29 °C u tami, u prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica fulerena (10, 50 i
100 ng mL-1). Masa micelija je određivana u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata.
Glavni razlog zašto masa micelija nije određena nakon 24 sata uzgoja je činjenica da je u tom
satu uzgoja zabilježena masa niža od 1 mg. Iz slike je vidljivo kako krivulja porasta micelija
bez prisutnosti nanočestica fulerena (nC60) pokazuje lag fazu rasta tijekom prvih 48 sati,
trofofazu od 48 do 72 sata, dok nakon 96 sati rasta ulazi u idiofazu, odnosno stacionarnu fazu
rasta. Ukoliko se navedeno usporedi s krivuljom porasta micelija u prisutnosti koncentracija
nC60 od 10 i 100 ng mL-1 vidljiv je sličan trend porasta mase micelija kao i u kontrolnom uzgoju.
45
Izuzetak čini primijenjena koncentracija nanočestica fulerena od
50 ng mL-1. Pri navedenoj koncentraciji porast mase micelija je viši u odnosu na porast mase
micelija pri kontrolnom uzgoju i pri koncentracijama nC60 od 10 i 100 ng mL-1 nakon 48 sati
uzgoja, dok je u između 72 i 120 sati uzgoja nešto niži. Navedene razlike potvrđene su
statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 16. Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u tekućoj
YES podlozi tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.2.2.Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1
Produkcija aflatoksina B1, B2, G1 i G2 plijesni A. flavus NRRL 3251 je određena u tekućoj
YES podlozi za uzgoj plijesni. U svim uzorcima je utvrđena prisutnost aflatoksina B1, dok su
utvrđene koncentracije aflatoksina B2, G1 i G2 ispod limita detekcije (LOD). Treba napomenuti
kako prisutnost aflatoksina G1 i G2 nije očekivana u ispitivanim uzorcima, budući da
produkcija aflatoksina G1 i G2 nije karakteristična za plijesan A. flavus (Bennet, 1987).
46
Slika 17. Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 u tekućoj YES podlozi tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Utjecaj ispitivanih koncentracija nC60 na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 u YES podlozi tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C prikazuje Slika 17. Produkcija
aflatoksina je određena u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je vidljivo da
nanočestice fulerena značajno utječu na produkciju aflatoksina, pri čemu koncentracije nC60 od
10 i 100 ng mL-1 uzrokuju značajno sniženu produkciju aflatoksina u odnosu na kontrolni uzgoj,
odnosno pokazuju antiaflatoksikogeni učinak. Najbolji antiaflatoksikogeni učinak postignut je
pri koncentraciji nanočestica fulerena od 100 ng mL-1, pri kojoj tijekom 72 sata uzgoja plijesni
dolazi do potpune inhibicije produkcije aflatoksina, a u vremenu od 96 do 168 sati uzgoja
inhibicija produkcije aflatoksina iznosi od 65 do 99 % u odnosu na kontrolni uzgoj. Nešto slabiji
antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri koncentraciji nC60 od 10 ng mL-1, pri čemu je uočena
potpuna inhibicija produkcije aflatoksina tijekom 72 sata uzgoja dok u vremenu od 96 do 168
sati uzgoja inhibicija produkcije aflatoksina iznosi između 26 i 83 %. Ove varijacije u postoku
inhibicije dijelom se mogu pripisati i varijacijama u količini produciranih aflatoksina u
kontrolnom uzgoju. Naime, vidljivo je da se u kontrolnom uzgoju maksimalna količina
produciranih aflatoksina postiže nakon 72 sata, a potom količina blago opada do 168 sati
inkubacije. Svakako najzanimljiviji utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina je
47
utjecaj koncentracije nC60 od 50 ng mL-1. Pri navedenoj koncentraciji uočava se da je količina
produciranih aflatoksina podjednaka ili nešto malo viša od količine producirane u kontrolnom
uzgoju. Pri tome je ključno navesti, da se u vremenu od 144 do 168 sati uzgoja pri navedenoj
koncentraciji nC60 postiže i značajno viša količina produciranih aflatoksina u odnosu na
kontrolni uzgoj. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
4.2.3.Utjecaj nanočestica fulerena na lipidnu peroksidaciju
Slika 18. Promjena koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
izloženom različitim koncentracijama nanočestica fulerena tijekom 168 sati uzgoja u tami pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Slika 18. prikazuje utjecaj nC60 na koncentraciju lipidnih peroksida izraženih kao reaktivni
spojevi tiobarbiturne kiseline (TBARS) u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168
sati uzgoja u tami pri 29 °C. Sadržaj reaktivnih spojeva tiobarbiturne kiseline je određivan u
periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo da se koncentracija lipidnih peroksida
u miceliju plijesni A. flavus izloženom nC60 tijekom 168 sati uzgoja blago mijenja u odnosu na
kontrolni uzgoj. Najveći utjecaj na koncentraciju TBARS vidljiv je u slučaju izloženosti plijesni
koncentraciji nC60 od 10 ng mL-1, pri kojoj se uočava snižena koncentracija lipidnih peroksida
tijekom 120 sati uzgoja u odnosu na kontrolni uzgoj. U slučaju ostalih primijenjenih
48
koncentracija nanočestica fulerena vrijednosti koncentracije lipidnih peroksida su slične
vrijednostima određenim u kontrolnom uzgoju. Navedene razlike potvrđene su statističkom
analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.2.4.Utjecaj nanočestica fulerena na koncentraciju glutationa
Rezultati određivanja koncentracija reduciranog (GSH) i oksidiranog glutationa (GSSG) u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C u prisutnosti
nanočestica fulerena prikazani su u Tablicama 10. i 11. Koncentracije GSH i GSSG u miceliju
plijesni su određene svaka 24 sata u vremenskom periodu uzgoja od 48 do 168 sati te je vidljivo
da se mijenjaju s vremenom uzgoja. Isto tako, može se zamijetiti da ukoliko koncentracija GSH
u miceliju plijesni raste, koncentracija GSSG opada. Pri tome se može uočiti da se znatno
povećana koncentracija GSH, odnosno znatno snižena koncentracija GSSG u odnosu na
kontrolni uzgoj postiže pri koncentracijama nC60 od 50 i 100 ng mL-1. Za razliku od toga pri
koncentraciji nC60 od 10 ng mL-1 uočava se snižena koncentracija GSH i povišena koncentracija
GSSG u odnosu na kontrolni uzgoj.
Tablica 10. Koncentracija reduciranog glutationa (GSH) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ±
SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSH [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj nC60 (10 ng mL-1) nC60 (50 ng mL-1) nC60 (100 ng mL-1)
48 434,02 ± 6,10 434,83 ± 4,76 949,01 ± 121,26 886,62 ± 34,45
72 335,81 ± 14,58 276,34 ± 22,60 968,02 ± 93,09 426,73 ± 13,20
96 651,99 ± 15,63 224,38 ± 12,35 776,78 ± 112,87 556,24 ± 30,56
120 355,46 ± 20,44 217,51 ± 4,48 517,32 ± 23,75 615,45 ± 53,59
144 229,21 ± 16,03 254,39 ± 26,33 178,05 ± 17,51 387,48 ± 46,68
168 403,30 ± 44,67 234,59 ± 16,63 523,89 ± 75,67 246,46 ± 28,99
49
Tablica 11. Koncentracija oksidiranog glutationa (GSSG) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ±
SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSSG [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj nC60 (10 ng mL-1) nC60 (50 ng mL-1) nC60 (100 ng mL-1)
48 896,42 ± 19,93 1239,6 ± 52,66 74,36 ± 18,17 295,26 ± 28,43
72 566,65 ± 14,45 801,74 ± 31,50 185,3 ± 47,04 409,43 ± 32,73
96 39,77 ± 3,96 451,42 ± 3,07 447,38 ± 57,13 127,03 ± 13,86
120 286,12 ± 25,23 432,56 ± 9,30 56,23 ± 2,52 74,73 ± 11,08
144 410,04 ± 17,67 343,95 ± 5,95 57,67 ± 4,49 51,92 ± 4,29
168 595,92 ± 70,21 328,69 ± 8,17 357,50 ± 15,51 300,16 ± 7,89
Iz koncentracija GSH i GSSG izračunat je omjer GSH i GSSG (GSH/GSSG) koji je jedan od
biljega oksidativnog stresa u stanici plijesni. Slika 19. prikazuje utjecaj nC60 na omjer
GSH/GSSG u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C.
Slika 19. Utjecaj nanočestica fulerena na omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Vidljiv je značajan utjecaj nC60 u koncentraciji od 50 i 100 ng mL-1 na povećanje omjera
GSH/GSSG, dok u slučaju najniže koncentracije nC60 ovaj učinak izostaje. Pri navedenim
koncentracijama najveći omjer GSH/GSSG se postiže između 120 i 144 sati inkubacije.
Značajna promjena omjera GSH/GSSG pri gore navedenim vremenima inkubacije može se
50
zamijetiti i u kontrolnom uzgoju pri kojem su vrijednosti omjera GSH/GSSG niže. Štoviše, ova
promjena omjera u kontrolnim uzorcima se poklapa sa ulaskom u idiofazu (Slika 16), kao i
vremenom inkubacije nakon kojeg je zabilježena maksimalna produkcija aflatoksina (Slika 17).
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
4.2.5.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze
Utjecaj nC60 na aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja u tami pri 29 °C prikazuje Slika 20. Aktivnost Cu,Zn-SOD je određena u vremenskom
periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata.
Slika 20. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Vidljivo je da izloženost plijesni koncentracijama nC60 od 10 i 100 ng mL-1 tijekom 96 sati
inkubacije izaziva sniženu aktivnost Cu,Zn-SOD u odnosu na kontrolni uzgoj, dok primjena
koncentracije nC60 od 50 ng mL-1 dovodi do povećanja aktivnosti Cu,Zn-SOD. Svakako je
zanimljivo zamijetiti da aktivnosti Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni uzgojenom bez i u prisutnosti
nC60 koncentracija od 10 i 100 ng mL-1 značajno opadaju između 48 i 96 sati inkubacije, nakon
čega se ustaljuju. To može ukazivati na značajnu ulogu ovog enzima u ranim fazama rasta
51
plijesni do ulaska u idiofazu. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom
na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.2.6.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze
Utjecaj nC60 na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja u tami pri 29 °C prikazuje Slika 21. Aktivnost Mn-SOD je određena u periodu od 48 do
168 sati uzgoja svaka 24 sata.
Slika 21. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerena dovodi do promjena aktivnosti
Mn-SOD u odnosu na kontrolni uzgoj. Tako, koncentracije nC60 od 10 i 100 ng mL-1 dovode
do sniženih aktivnosti Mn-SOD tijekom gotovo cijelog vremena inkubacije, a koncentracija od
50 ng mL-1 do povećane aktivnosti Mn-SOD do ulaska u idiofazu (od 48 do 72 sata inkubacije).
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
52
4.2.7.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze
Slika 22. prikazuje utjecaj nC60 na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Aktivnost CAT je određena u periodu od 48 do 168
sati uzgoja svaka 24 sata. Značajan porast aktivnosti CAT u miceliju kontrolnog uzgoja može
se uočiti između 48 i 72 sata. Nakon tog vremena aktivnosti CAT se ustaljuju, a na kraju
vremenskog perioda uzgoja ponovno je vidljivo povećanje aktivnosti. Izloženost micelija
plijesni nanočesticama fulerena tijekom uzgoja dovodi do promjena aktivnosti katalaze u
odnosu na kontrolni uzgoj. Koncentracije nC60 od 10 i 50 ng mL-1 uglavnom izazivaju smanjene
aktivnosti CAT u odnosu na kontrolni uzgoj, dok su u slučaju primijenjene koncentracije od
100 ng mL-1 razine aktivnosti slične kontrolnom uzgoju. Navedene razlike potvrđene su
statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 22. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
53
4.2.8.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze
Utjecaj nC60 na aktivnost GPX u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
u tami pri 29 °C prikazuje Slika 23. Aktivnost GPX je određena u periodu od 48 do 168 sati
uzgoja svaka 24 sata.
Slika 23. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni A.
flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerena dovodi do značajnih promjena
aktivnosti GPx u miceliju plijesni u odnosu na kontrolni uzgoj. Pri tome se kod primjene
koncentracije nC60 od 10 ng mL-1 može uočiti prosječno desetorostruko snižena aktivnost GPx
do 72 sata uzgoja, pri koncentraciji fulerena od 50 ng mL-1 prosječno trostruko snižena
aktivnost GPx u odnosu na kontrolni uzgoj tijekom svih 168 sati uzgoja, dok je u slučaju
koncentracije od 100 ng mL-1 prosječno trostruko snižena razina GPX zabilježena između 48 i
96 sati uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
54
4.2.9.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze
Utjecaj nC60 na aktivnost GR u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
u tami pri 29 °C prikazuje Slika 24. Aktivnost GR je određena u periodu od 48 do 168 sati
uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da primjena 50 i 100 ng mL-1 nC60 izaziva povišenu aktivnost
GR u odnosu na kontrolni uzgoj nakon 96 i 120 sati uzgoja. U slučaju primjene 10 ng mL-1
nC60 vidljivo je dvostruko sniženje aktivnosti GR do 144 sata uzgoja. Navedene razlike
potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 24. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze u miceliju plijesni A.
flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Na temelju svih gore navedenih rezultata može se zaključiti da nanočestice fulerena utječu na
modulaciju oksidativnog stresa u stanicama plijesni A. flavus NRRL 3251, ovisno o
primijenjenoj koncentraciji. Pri tome bi se modulacija oksidativnog stresa mogla pripisati
antioksidativnom djelovanju kod najniže primjenjene koncentracije nC60 (10 ng mL-1) ili
prooksidativnom djelovanju kod primjene ostale dvije ispitivane koncentracije nC60 (50 i 100
ng mL-1). Snižene aktivnosti antioksidativnih enzima (CAT, GPX i GR) (Slika 22 do 24) te
snižena koncentracija TBARS (Slika 18) upućuju na antioksidativni učinak. Povećana
55
koncentracija TBARS (50 i 100 ng mL-1 nC60) (Slika 18), te povišene aktivnosti Cu,Zn-SOD
(50 ng mL-1 nC60) (Slika 20) i Mn-SOD te CAT (50 i 100 ng mL-1 nC60) (Slika 21 i 22) upućuju
na prooksidativni učinak.
4.3. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja micelija plijesni u tami
4.3.1.Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni
Rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami, u
prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica fulerenola (10, 100 i 1000 ng mL-1) prikazan
je na Slici 25.
Slika 25. Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna
uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Masa micelija je određena u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Kako je već
prethodno navedeno, glavni razlog zašto masa micelija nije određena nakon 24 sata uzgoja je
činjenica da je u tom satu uzgoja zabilježena masa niža od 1 mg. Iz slike je vidljivo da izloženost
plijesni nanočesticama fulerenola koncentracije 10 i 100 ng mL-1 tijekom prvih 72 sata uzgoja
ne uzrokuje promjene porasta mase micelija u odnosu na kontrolni uzgoj, nakon čega se pod
56
utjecajem FNP uočava nešto snižena masa poraslog micelija. Najviši antifungalni učinak
postiže se pri koncentraciji FPN od 1000 ng mL-1. Pri navedenoj koncentraciji porast mase
micelija je od 20 do 40 % niži u odnosu na porast mase micelija pri kontrolnom uzgoju i pri
koncentracijama FNP od 10 i 100 ng mL-1 do 120 sati uzgoja, dok su nakon tog vremena razlike
manje izražene. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
4.3.2.Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1
Produkcija aflatoksina B1, B2, G1 i G2 plijesni A. flavus NRRL 3251 je određena u tekućoj
YES podlozi za uzgoj plijesni. U svim uzorcima je utvrđena prisutnost aflatoksina B1, dok su
ostali aflatoksini (B2, G1, G2) bili ispod limita detekcije (LOD).
Slika 26. Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ±
SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Slika 26. prikazuje utjecaj FNP na produkciju aflatoksina B1 u YES podlozi tijekom 168 sati
uzgoja u tami pri 29 °C u prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica fulerenola (10, 100
i 1000 ng mL-1). Produkcija aflatoksina je određena je u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka
24 sata. Iz slike je vidljivo da nanočestice fulerena značajno utječu na produkciju aflatoksina.
Sve ispitivane koncentracije FNP uzrokuju značajno sniženu produkciju aflatoksina B1 u
57
odnosu na kontrolni uzgoj, odnosno pokazuju antiaflatoksikogeni učinak. Najbolji
antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri koncentraciji FNP od 100 ng mL-1, pri kojoj tijekom
72 sata uzgoja plijesni dolazi do potpune inhibicije produkcije aflatoksina, a u vremenu od 96
do 168 sati uzgoja inhibicija produkcije aflatoksina iznosi od 72 do 96 % u odnosu na kontrolni
uzgoj. Nešto slabiji antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri koncentraciji FNP od
10 ng mL-1, pri čemu je uočena potpuna inhibicija produkcije aflatoksina tijekom 48 sata
uzgoja, dok u vremenu od 72 do 168 sati uzgoja inhibicija produkcije aflatoksina iznosi između
67 i 93 %. Najslabiji, ali također značajan antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri
koncentraciji FNP od 1000 ng mL-1 kada inhibicija produkcije aflatoksina iznosi između 51 i
62 % tijekom cijelog vremena uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.3.3.Utjecaj nanočestica fulerenola na lipidnu peroksidaciju
Utjecaj FNP na koncentraciju lipidnih peroksida izraženih kao reaktivni spojevi tiobarbiturne
kiseline (TBARS) u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri
29 °C prikazan je na Slici 27.
Slika 27. Promjena koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni A.flavus NRRL 3251
izloženom različitim koncentracijama nanočestica fulerenola tijekom 168 sati uzgoja u tami
pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
58
Sadržaj reaktivnih spojeva tiobarbiturne kiseline je određivan u periodu od 48 do 168 sati
uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola
tijekom 168 sati uzgoja dovodi do snižene koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni
u odnosu na kontrolni uzgoj. U prisutnosti 100 i 1000 ng mL-1 FNP sniženje koncentracije
TBARS u odnosu na kontrolni uzgoj iznosi od 2 do 4 puta, dok je koncentracija TBARS u
miceliju uzgojenom uz 10 ng mL-1 FNP za četvrtinu niža u odnosu na kontrolni uzgoj do 96
sata, a nakon 120 sati uzgoja slična koncentraciji u kontrolnom uzorku. Navedene razlike
potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.3.4.Utjecaj nanočestica fulerenola na koncentraciju glutationa
Rezultati određivanja koncentracija reduciranog (GSH) i oksidiranog glutationa (GSSG) u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C u prisutnosti
nanočestica fulerenola prikazani su u Tablicama 12 i 13. Koncentracije GSH i GSSG u miceliju
plijesni određene su svaka 24 sata u vremenskom periodu uzgoja od 48 do 168 sati te je vidljivo
da se mijenjaju s vremenom uzgoja. Kada se usporede vrijednosti za kontrolni uzgoj te uzgoj u
prisutnosti FNP, može se uočiti da koncentracije FNP od 10 i 100 ng mL-1 neznatno utječu na
promjene reduciranog i oksidiranog glutationa, dok koncentracija FNP od 1000 ng mL-1 dovodi
do značajno povišene koncentracije GSH, odnosno do značajno snižene koncentracije GSSG u
miceliju plijesni.
Tablica 12. Koncentracija reduciranog glutationa (GSH) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C u prisutnosti nanočestica fulerenola. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSH [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj FNP (10 ng mL-1) FNP (100 ng mL-1) FNP (1000 ng mL-1)
48 434,02 ± 6,10 574,91 ± 81,73 587,61 ± 16,50 418,04 ± 20,67
72 335,81 ± 14,58 486,76 ± 51,30 470,18 ± 10,08 684,99 ± 86,20
96 651,99 ± 15,63 232,32 ± 31,85 381,56 ± 26,93 751,4 ± 105,77
120 355,46 ± 20,44 59,29 ± 53,40 291,81 ± 5,44 932,07 ± 83,39
144 229,21 ± 16,03 274,96 ± 8,57 284,25 ± 17,51 973,26 ± 82,46
168 403,30 ± 44,67 335,78 ± 17,10 328,21 ± 8,29 641,05 ± 68,40
59
Tablica 13. Koncentracija oksidiranog glutationa (GSSG) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C prisutnosti nanočestica fulerenola. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSSG [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj FNP (10 ng mL-1) FNP (100 ng mL-1) FNP (1000 ng mL-1)
48 896,42 ± 19,93 954,98 ± 26,71 680,65 ± 17,19 552,95 ± 20,97
72 566,65 ± 14,45 671,97 ± 4,31 602,41 ± 12,47 39,25 ± 7,21
96 39,77 ± 3,96 315,90 ± 4,03 616,47 ± 27,62 98,77 ± 9,48
120 286,12 ± 25,23 296,39 ± 5,50 419,13 ± 5,98 28,12 ± 4,77
144 410,04 ± 17,67 433,17 ± 4,30 427,49 ± 13,87 19,74 ± 3,30
168 287,63 ± 10,92 256,97 ± 4,75 897,34 ± 16,18 815,34 ± 23,53
Iz koncentracija GSH i GSSG izračunat je omjer GSH i GSSG (GSH/GSSG). Slika 28.
prikazuje utjecaj FNP na omjer GSH/GSSG u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Vidljivo je da FNP u koncentracijama od 10 i 100 ng mL-1 ne
utječu značajno na omjer GSH/GSSG u odnosu na kontrolni uzgoj, dok FNP u koncentraciji od
1000 ng mL-1 dovodi do značajnog povećanja omjera GSH/GSSG u usporedbi s kontrolnim
uzgojem. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u
Poglavlju 3.18.
Slika 28. Utjecaj nanočestica fulerenola na omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
60
4.3.5.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze
Slika 29. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Slika 29. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost citoplazmatske Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Aktivnost Cu,Zn-SOD je
određena u vremenskom periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da aktivnost
Cu,Zn-SOD opada između 48 i 72 sata inkubacije kod kontrolnog uzgoja i uzgoja u prisutnosti
FNP koncentracija 10 i 100 ng mL-1 nakon čega se više-manje ustaljuje na određenu vrijednost.
U slučaju najviše koncentracije FNP od 1000 ng mL-1 može se uočiti da je Cu,Zn-SOD još vrlo
aktivna nakon 72 sata uzgoja, a značajno opada nakon 96 sati uzgoja. Osim navedenog, može
se uočiti da plijesni pod utjecajem sve tri koncentracije FNP u ranoj fazi rasta (48 sati) pokazuju
veću aktivnost Cu,Zn-SOD od kontrolnog uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom
analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.3.6.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid dismutaze
Utjecaj FNP na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja u tami pri 29 °C prikazan je na Slici 30. Aktivnost Mn-SOD je određena u periodu od
48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerenola
61
u koncentraciji od 10 i 1000 ng mL-1 dovodi do promjena aktivnosti Mn-SOD tijekom uzgoja
koje su različite od promjena aktivnosti u kontrolnom uzgoju. Tako se u prisutnosti
10 ng mL-1 FNP može uočiti povišena aktivnost Mn-SOD tijekom 72 sata, te snižena od 96 do
120 sati uzgoja, dok u prisutnosti 1000 ng mL-1 FNP povišena aktivnost od 96 do 120 sati
uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u
Poglavlju 3.18.
Slika 30. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.3.7.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze
Slika 31. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Aktivnost CAT je određena u periodu od 48 do 168
sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja dovodi do snižene aktivnosti katalaze u miceliju. Pri tome su u prisutnosti FNP od 10 i
100 ng mL-1 aktivnosti CAT u odnosu na kontrolni uzgoj prosječno manje za četvrtinu, a u
slučaju primijenjene koncentracije FNP od 1000 ng mL-1 prosječno dvostruko niže od
62
kontrolnog uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 31. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.3.8.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze
Utjecaj FNP na aktivnost GPX u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
u tami pri 29 °C prikazuje Slika 32. Aktivnost GPX je određena u periodu od 48 do 168 sati
uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerenola modulira
aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni. Primjena FNP u koncentraciji od
1000 ng mL-1 dovodi do trostrukog sniženja aktivnosti GPx u odnosu na kontrolni uzgoj tijekom
čitavog vremena uzgoja, dok se u prisutnosti FNP od 10 i 100 ng mL-1 snižena aktivnost GPX
uočava do 72, odnosno 96 sati uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
63
Slika 32. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.3.9.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze
Slika 33. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost GR u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Aktivnost GR je određena u periodu od 48 do 168 sati
uzgoja svaka 24 sata. Izloženost plijesni tijekom uzgoja koncentracijama FNP od
10 i 1000 ng mL-1 uzrokuje blago povećanje aktivnosti GR tijekom 48 i 72 sata uzgoja, dok se
u slučaju koncentracije FNP od 100 ng mL-1 ovo povećanje ne uočava. Ulaskom u idiofazu
(96 sati uzgoja) razlike između kontrolnog uzgoja i uzgoja u prisutnosti FNP nestaju, da bi
potom nakon 144 sata uzgoja aktivnost GR bila povećana u slučaju primjene svih ispitivanih
koncentracija FNP u odnosu na kontrolni uzgoj. Navedene razlike potvrđene su statističkom
analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
64
Slika 33. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja u tami pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Temeljem gore navedenih rezultata, može se zaključiti da nanočestice fulerenola utječu na
modulaciju oksidativnog statusa plijesni A. flavus NRRL 3251, ovisno o primijenjenoj
koncentraciji. Najvjerojatniji razlog tomu je prooksidativno djelovanje nanočestica fulerenola
u podlozi za uzgoj plijesni, što se uočava prema povišenoj aktivnosti Cu,Zn-SOD (Slika 29) u
ranim fazama rasta micelija (do 72 sata). Usljed povećane aktivnosti Cu,Zn-SOD snižena je
razina ROS što za posljedicu ima sniženu koncentraciju TBARS (Slika 27) te snižene razine
aktivnosti antioksidativnih enzima (Cu,Zn-SOD, Mn-SOD, CAT i GPX) (Slika 29 do 32) te
sljedno tome i sniženu produkciju aflatoksina B1 (Slika 26).
65
4.4.Utjecaj izloženosti plijesni A. flavus VIS svjetlu tijekom uzgoja na porast mase
micelija, koncentraciju lipidnih peroksida i glutationa, te aktivnost
antioksidativnih enzima
Obzirom da je ispitivanje utjecaja nanočestica fulerena i fulerenola na modulaciju oksidativnog
stresa plijesni A. flavus tijekom uzgoja bilo predviđeno osim uzgoja u tami i na režim 12 h tama/
12 sati izloženosti VIS svjetlu, bilo je potrebno ispitati utječe li uzgoj bez dodatka nanočestica
u navedenom režimu na ispitivane parametre u ovoj disertaciji.
Uočene razlike između uzgoja plijesni A. flavus u tami i uz izloženost VIS svjetlu u režimu 12
h tama/ 12 sati VIS svjetlo prikazani su u narednim podpoglavljima.
4.4.1.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na rast micelija
Slika 34. prikazuje rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u YES podlozi tijekom 168 sati
pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu. Masa micelija je određivana u periodu od 48 do
168 sati uzgoja svaka 24 sata.
Slika 34. Utjecaj VIS svjetla na rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
Vidljivo je da uzgoj plijesni uz izloženost VIS svjetlu dovodi do sniženog porasta mase micelija
u odnosu na uzgoj u tami. Pri tome se 3,5 puta manja masa postiže nakon 48 sati uzgoja, da bi
nakon 168 sati sniženje mase iznosilo 1,2 puta. Međutim, neovisno o uočenim razlikama može
66
se zamjetiti da su krivulje porasta mase micelija sličnog trenda. Navedene razlike potvrđene su
statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.4.2.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na produkciju
aflatoksina B1
Utjecaj VIS svjetla na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL 3251 u YES podlozi
tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu prikazuje Slika 35.
Produkcija aflatoksina je određena u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je
vidljivo da izloženost plijesni VIS svjetlu tijekom submerznog uzgoja dovodi do značajno
snižene produkcije aflatoksina. Tako je nakon 48 sati uzgoja plijesni u režimu 12 h tama/12 sati
VIS svjetlo produkcija aflatoksina potpuno inhibirana, a od 72 do 168 sati uzgoja količina
produciranih aflatoksina niža je za 56 do 84 %, u odnosu na uzgoj u tami. Navedene razlike
potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 35. Utjecaj VIS svjetla na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL 3251 u
tekućoj mikrobiološkoj YES podlozi tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
67
4.4.3. Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na lipidnu
peroksidaciju
Utjecaj VIS svjetla na koncentraciju lipidnih peroksida izraženih kao TBARS u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu
prikazan je Slikom 36. Sadržaj TBARS je određen je u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka
24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni VIS svjetlu u režimu 12 sati tama/12 sati VIS svjetlo
uzrokuje značajno sniženje koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni tijekom 168 sati
uzgoja. Tako je koncentracija TBARS uz izloženost VIS svjetlu 5 puta niža od koncentracije
pri uzgoju u tami nakon 48 sati uzgoja, a u narednim satima uzgoja varira od 2,7 – 1,8 puta.
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
Slika 36. Utjecaj VIS svjetla na promjenu koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni
A.flavus NRRL 3251 tijekom 168 pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM
tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.4.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na odnos
reduciranog i oksidiranog glutationa
Slika 37. prikazuje utjecaj VIS svjetla na koncentraciju reduciranog (GSH) i oksidiranog
(GSSG) glutationa u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 prilikom uzgoja u tekućoj
mikrobiološkoj YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu.
68
Iz slike je vidljivo da je tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu koncentracija
reduciranog glutationa u miceliju plijesni povećana u odnosu na uzgoj u tami prosječno za 6
puta, a oksidiranog glutationa do 120 sati uzgoja prosječno za 3,6 puta. Navedeno upućuje da
je uz izloženost VIS svjetlu koncentracija glutationa u miceliju plijesni znatno viša u odnosu na
uzgoj u tami.
Slika 37. Utjecaj VIS svjetla na omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: GSH ( - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla); GSSG (- -- - uzgoj u tami, - - - -
uzgoj pod utjecajem VIS svjetla)
Kada se promatra utjecaj VIS svjetla na omjer GSH i GSSG vidljivo je kako izloženost VIS
svjetlu utječe na povećanje omjera GSH/GSSG. Pri tome je omjer GSH/GSSG veći za
prosječno 7 puta pri uzgoju uz izloženost VIS svjetlu u odnosu na uzgoj u tami (Slika 38).
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
69
Slika 38. Utjecaj VIS svjetla na omjer omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u miceliju
plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.5.Utjecaj uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost VIS svjetlu na aktivnost
bakar,cink-superoksid dismutaze
Slika 39. prikazuje utjecaj VIS svjetla na aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu. Iz slike je
vidljivo da su tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu u miceliju plijesni povećane
razine aktivnosti Cu,Zn-SOD u odnosu na uzgoj u tami. Pri tome su razine aktivnosti Cu,Zn-
SOD veće za prosječno 1,5 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
70
Slika 39. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri
neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.6. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost manganove superoksid dismutaze
Utjecaj VIS svjetla na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu prikazan je Slikom 40. Iz slike je
vidljivo da su tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu u miceliju razine aktivnosti Mn-
SOD prosječno smanjene u odnosu na uzgoj u tami za 2,6 puta. Navedene razlike potvrđene su
statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
71
Slika 40. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri
neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.7. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost katalaze
Slika 41. prikazuje utjecaj VIS svjetla na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom uzgoja u YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS
svjetlu. Iz slike je vidljivo da su tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu u miceliju
plijesni smanjene razine aktivnosti CAT u odnosu na uzgoj u tami. Pri tome su razine aktivnosti
prosječno smanjene za 3,3 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
72
Slika 41. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri
neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.8.Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation peroksidaze
Slika 42. prikazuje utjecaj VIS svjetla na aktivnost GPX u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom uzgoja u YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS
svjetlu. Iz slike je vidljivo da su tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu razine
aktivnosti GPX u miceliju plijesni prosječno smanjene za 2,3 puta u odnosu na uzgoj u tami.
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
73
Slika 42. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ±
SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
4.4.9. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation reduktaze
Utjecaj VIS svjetla na aktivnost GR u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom uzgoja u
YES podlozi tijekom 168 sati pri 29 °C u tami te uz izloženost VIS svjetlu prikazuje Slika 43.
Iz slike je vidljivo da su tijekom uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu razine aktivnosti GR
u miceliju plijesni smanjene prosječno za 1,2 puta u odnosu na uzgoj u tami tijekom prvih 72
sata uzgoja. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan
u Poglavlju 3.18.
74
Slika 43. Utjecaj VIS svjetla na aktivnost glutation reduktaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - uzgoj u tami, - uzgoj pod utjecajem VIS svjetla
Na temelju svih gore navedenih rezultata može se zaključiti da postoji značajna razlika u
ispitivanim parametrima između uzgoja plijesni uz izloženost VIS svjetlu i uzgoja u tami.
Sniženi porast mase micelija, snižena produkcija aflatoksina B1, smanjena koncentracija
TBARS, povećan omjer GSH/GSSG te snižene aktivnosti Mn-SOD, CAT, GPX i GR uz
istovremeno povećanu aktivnost Cu,Zn-SOD bilježe se pri uzgoju plijesni uz izloženost VIS
svjetlu.
75
4.5.Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja micelija plijesni izloženog VIS svjetlu
4.5.1.Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni
Rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u YES podlozi tijekom
168 sati uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C u prisutnosti tri različite koncentracije nanočestica
fulerena (10, 50 i 100 ng mL-1) prikazan je Slikom 44. Masa micelija je određivana u periodu
od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je vidljivo kako krivulja porasta micelija
kontrolnog uzgoja pokazuje lag fazu rasta tijekom prvih 48 sati, trofofazu od 48 do 72 sata, dok
nakon 96 sati rasta ulazi u idiofazu, odnosno stacionarnu fazu rasta. Kada se navedeno usporedi
s krivuljama porasta micelija u prisutnosti različitih koncentracija nC60, vidljiv je sličan trend
porasta mase micelija. Isto tako se može uočiti da izloženost plijesni koncentracijama nC60 od
10, 50 i 100 ng mL-1 dovodi do većeg porasta mase micelija do 120 sati uzgoja. U slučaju
koncentracija nC60 od 50 i 100 ng mL-1 veća masa micelija zabilježena i nakon 144 sata uzgoja.
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
Slika 44. Utjecaj nanočestica fulerena na rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost
± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
76
4.5.2.Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1
Produkcija aflatoksina B1, B2, G1 i G2 plijesni A. flavus NRRL 3251 je određena u tekućoj
YES podlozi za uzgoj plijesni. U svim uzorcima je utvrđena prisutnost aflatoksina B1, dok su
ostali aflatoksini (B2, G1, G2) bili ispod limita detekcije (LOD).
Slika 45. Utjecaj nanočestica fulerena na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Slika 45. prikazuje utjecaj ispitivanih koncentracija nC60 na produkciju aflatoksina B1 u tekućoj
mikrobiološkoj YES podlozi inokuliranoj s plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Produkcija aflatoksina je određena u periodu od 48
do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da nanočestice fulerena utječu na produkciju
aflatoksina ovisno o primijenjenoj koncentraciji. Tako se u slučaju izloženost plijesni
nanočesticama fulerena koncentracije 10 i 50 ng mL-1 uočava znatno povišena produkcija
aflatoksina B1 u odnosu na kontrolni uzgoj, dok je slučaju izloženosti koncentraciji od
100 ng mL-1 produkcija aflatoksina B1 podjednaka onoj u kontrolnom uzgoju. Pri koncentraciji
nC60 od 10 ng mL-1 produkcija aflatoksina je prosječno povećana 8,2 puta, a pri koncentraciji
od 50 ng mL-1 povećanje se kreće oko 4,8 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom
analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
77
4.5.3.Utjecaj nanočestica fulerena na lipidnu peroksidaciju
Utjecaj nC60 na sadržaj TBARS u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C prikazuje Slika 46. Sadržaj reaktivnih spojeva tiobarbiturne
kiseline je određivan u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata.
Slika 46. Promjena koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni A.flavus NRRL 3251
izloženom različitim koncentracijama nanočestica fulerena tijekom 168 sati uzgoja uz
izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna
uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Iz slike je vidljivo da koncentracija lipidnih peroksida u kontrolnom uzgoju raste između 48 i
96 sati, da bi se potom relativno ustalila na određenu vrijednost do kraja uzgoja. U slučaju
izloženost plijesni nanočesticama fulerena zamjetan je drugačiji trend promjena koncentracija
TBARS. Nakon 48 sati uzgoja plijesni u prisutnosti nanočestica fulerena koncentracija lipidnih
peroksida u miceliju plijesni je viša od kontrolnog uzgoja, a potom se snižava na razine slične
onima u kontrolnom uzgoju. Pri tome je ključno naglasiti da je intenzitet koncentracije TBARS
nakon 48 sati uzgoja obrnutno proporcionalan koncentraciji fulerena. Tako najviše TBARS
nastaje pri koncentraciji nC60 od 10 ng mL-1, a najmanje pri 100 ng mL-1. Navedene razlike
potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
78
4.5.4.Utjecaj nanočestica fulerena na koncentraciju glutationa
Rezultati određivanja koncentracija reduciranog (GSH) i oksidiranog glutationa (GSSG) u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu
pri 29 °C u prisutnosti nanočestica fulerena prikazani su u Tablicama 14 i 15. Koncentracije
GSH i GSSG u miceliju plijesni su određene svaka 24 sata u vremenskom periodu uzgoja od
48 do 168 sati te je vidljivo da se mijenjaju s vremenom uzgoja. Može se uočiti da je
koncentracija GSH u miceliju plijesni izloženom djelovanju nanočestica fulerena znatno niža
od koncentracije GSH u kontrolnom uzgoju, te da je obrnutno proporcionalna primijenjenoj
koncentraciji nC60. Sukladno tome koncentracija oksidiranog glutationa (GSSG) je u miceliju
plijesni izloženih nC60 veća od kontrolnog uzgoja.
Tablica 14. Koncentracija reduciranog glutationa (GSH) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSH [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj nC60 (10 ng mL-1) nC60 (50 ng mL-1) nC60 (100 ng mL-1)
48 2165,40 ± 10,84 169,99 ± 19,92 651,92 ± 18,14 647,43 ± 107,78
72 2166,58 ± 31,24 168,38 ± 34,11 341,00 ± 24,60 1271,79 ± 80,97
96 1933,38 ± 22,08 185,07 ± 11,61 341,01 ± 11,54 685,48 ± 61,60
120 2155,68 ± 24,05 273,81 ± 42,72 303,14 ± 35,21 770,71 ± 61,80
144 2108,10 ± 68,84 146,78 ± 27,95 423,00 ± 25,37 320,54 ± 43,29
168 2448,54 ± 78,98 2,73 ± 0,00 307,63 ± 19,29 417,29 ± 54,93
Tablica 15. Koncentracija oksidiranog glutationa (GSSG) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSSG [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj nC60 (10 ng mL-1) nC60 (50 ng mL-1) nC60 (100 ng mL-1)
48 848,51 ± 33,69 1007,40 ± 17,90 1175,76 ± 14,44 1362,75 ± 34,48
72 675,05 ± 28,80 568,90 ± 20,28 1083,60 ± 13,76 1287,56 ± 18,20
96 443,36 ± 10,05 311,38 ± 11,02 731,95 ± 11,01 897,53 ± 13,18
120 416,45 ± 8,18 297,55 ± 6,09 842,6 ± 34,03 901,89 ± 13,69
144 313,12 ± 22,07 250,39 ± 9,47 920,93 ± 18,01 788,82 ± 8,26
168 287,63 ± 10,92 256,97 ± 4,75 897,34 ± 16,18 815,34 ± 23,53
79
Iz koncentracija GSH i GSSG izračunat je omjer GSH i GSSG (Slika 47). Vidljiv je značajan
utjecaj nC60 na sniženje omjera GSH/GSSG u odnosu na kontrolni uzgoj pri svim ispitivanim
koncentracijama. Pri tome, u odnosu na kontrolni uzgoj, omjer GSH/GSSG tijekom vremena
opada u rasponu od tri do osam puta i to u slučaju svih ispitivanih koncentracija nC60. Navedene
razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 47. Utjecaj nanočestica fulerena na omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.5.5. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze
Slika 48. prikazuje utjecaj nC60 na aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost Cu,Zn-SOD je
određena u vremenskom periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je vidljiv trend
porasta aktivnosti Cu,Zn-SOD tijekom 168 sati inkubacije kontrolnog uzgoja, kao i uzgoja u
prisutnosti svih ispitivanih koncentracija nanočestica fulerena. Izloženost plijesni
koncentracijama nC60 od 10 i 50 ng mL-1 tijekom 120 sati inkubacije izaziva povećanu aktivnost
Cu,Zn-SOD u odnosu na kontrolni uzgoj, dok primjena koncentracije nC60 od 100 ng mL-1
dovodi do snižene aktivnosti Cu,Zn-SOD tijekom svih 168 sati uzgoja, i to prosječno
dvostrukog od 48 do 120 sata uzgoja, odnosno četvrostrukog od 120 do 144 sata uzgoja.
80
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
Slika 48. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.5.6. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze
Utjecaj nC60 na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C prikazan je Slikom 49. Aktivnost Mn-SOD je
određena u vremenskom periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je vidljivo da
izloženost plijesni nC60 dovodi do povećanja aktivnosti Mn-SOD u odnosu na kontrolni uzgoj.
Pri tome je ovo povećanje obrnuto proporcionalno primijenjenoj koncentraciji fulerena. Tako
izloženost koncentraciji od 10 ng mL-1 izaziva najveće povećanje aktivnosti Mn-SOD,
koncentraciji od 50 ng mL-1 u manjoj mjeri, dok je pod utjecajem 100 ng mL-1 nC60 aktivnost
Mn-SOD neznatno viša od aktivnosti kontrolnog uzgoja. Navedene razlike potvrđene su
statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
81
Slika 49. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost manganove superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.5.7.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze
Slika 50. prikazuje utjecaj nC60 na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost CAT je određena u
periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike je vidljivo da aktivnost katalaze u
miceliju plijesni kontrolnog uzgoja raste do 72 sata, da bi se nakon toga više-manje ustalila na
određenu vrijednost sve do 168 sati. Nasuprot tome, u miceliju plijesni izloženom djelovanju
nC60 od 10 i 50 ng mL-1 može se uočiti stalni porast aktivnosti katalaze između 48 i 168 sati. U
slučaju najviše koncentracije nC60 od 100 ng mL-1 aktivnost katalaze opada između 48 i 72 sata,
nakon čega se više-manje ustaljuje. Uz navedeno, bitno je za naglasiti su razine aktivnosti
katalaze u miceliju plijesni izloženog djelovanju nC60 od 50 ng mL-1 više od aktivnosti
kontrolnog uzgoja, a u slučaju nC60 od 100 ng mL-1 prosječno upola smanjene od 72 do 168
sati. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u
Poglavlju 3.18.
82
Slika 50. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost katalaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.5.8.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze
Slika 51. prikazuje utjecaj nC60 na aktivnost GPX u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost GPX je određena u
periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Izloženost plijesni nanočesticama fulerena
koncentracije 50 i 100 ng mL-1 dovodi do značajnih promjena aktivnosti GPx u miceliju plijesni
u odnosu na kontrolni uzgoj. Pri tome je vidljivo značajno sniženje aktivnosti GPX tijekom svih
168 sati uzgoja uz izloženost koncentracijama nC60 od 50 i 100 ng mL-1. Za razliku od toga u
prisutnosti 10 ng mL-1 nC60 značajno niže razine aktivnosti GPX mogu se uočiti samo između
48 i 72 sata. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan
u Poglavlju 3.18.
83
Slika 51. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni A.
flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
4.5.9.Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze
Utjecaj nC60 na aktivnost GR u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C prikazuje Slika 52. Aktivnost GR je određena u periodu od
48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni koncentracijama nC60 od
50 i 100 ng mL-1 nC60 izaziva snižene aktivnosti GR u odnosu na kontrolni uzgoj. Pri tome su
u slučaju koncentracije fulerena od 50 ng mL-1 aktivnosti GR niže tijekom svih 168 sati uzgoja.
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
84
Slika 52. Utjecaj nanočestica fulerena na aktivnost glutation reduktaze u miceliju plijesni A.
flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 50 ng mL-1, - 100 ng mL-1
Na temelju svih gore navedenih rezultata može se zaključiti da nanočestice fulerena utječu na
modulaciju oksidativnog statusa plijesni A. flavus NRRL 3251. Modulacija oksidativnog
statusa može se pripisati oksidativnom djelovanju nanočestica fulerena u kombinaciji s VIS
svjetlom i to pri koncentracijama od 10 i 50 ng mL-1. Biljezi modulacije oksidativnog stresa u
stanicama plijesni koji ukazuju na oksidativni učinak nanočestica su povećana produkcija
AFB1 (Slika 45), povećana koncentracija TBARS do 48 sati uzgoja (Slika 46), snižen omjer
GSH/GSSG (Slika 47) te povećana aktivnosti antioksidativnih enzima (Cu,Zn-SOD, Mn-SOD,
CAT) (Slika 48 do 50).
85
4.6. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola
tijekom uzgoja micelija plijesni izloženog VIS svjetlu
4.6.1. Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni
Slika 53. prikazuje rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 u YES podlozi tijekom 168 sati
uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C, u prisutnosti tri različite koncentracije FNP (10, 100 i 1000
ng mL-1). Masa micelija je određivana u periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Iz slike
je vidljiv sličan trend porasta mase micelija u prisutnosti 10 i 1000 ng mL-1 FNP kao i
kontrolnog uzgoja. Međutim, izloženost plijesni koncentraciji FNP od 100 ng mL-1 izaziva
nešto drugačiji trend porasta, produženje trofofaze do 96 sati, a potom nešto niže vrijednosti
mase produciranog micelija u odnosu na kontrolni uzgoj kao i koncentracije nC60 od 10 i 1000
ng mL-1. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u
Poglavlju 3.18.
Slika 53. Utjecaj nanočestica fulerenola na rast micelija plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju
vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
86
4.6.2. Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1
Produkcija aflatoksina B1, B2, G1 i G2 plijesni A. flavus NRRL 3251 je određena u tekućoj
YES podlozi za uzgoj plijesni. U svim uzorcima je utvrđena prisutnost aflatoksina B1, dok su
ostali aflatoksini (B2, G1, G2) bili ispod limita detekcije (LOD).
Slika 54. Utjecaj nanočestica fulerenola na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Utjecaj ispitivanih koncentracija FNP na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus NRRL
3251 u YES podlozi tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C, ispitivan je u
periodu od 48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata (Slika 54). Vidljivo je da nanočestice fulerenola
utječu na povećanu produkciju aflatoksina B1 u trofofazi i ranoj idiofazi u odnosu na kontrolni
uzgoj. U trofofazi i ranoj idiofazi (48 do 96 sati) produkcija aflatoksina B1 je povećana za
prosječno 3,1 puta pri koncentraciji FNP od 10 ng mL-1, za 3,9 puta pri 100 ng mL-1 FNP te 2,7
puta pri 1000 ng mL-1 FNP. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom
na način opisan u Poglavlju 3.18.
87
4.6.3. Utjecaj nanočestica fulerenola na lipidnu peroksidaciju
Slika 55. Promjena koncentracije lipidnih peroksida u miceliju plijesni A.flavus NRRL 3251 u
prisustvu različitih koncentracija nanočestica fulerenola tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost
VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Slika 55. prikazuje utjecaj FNP na koncentraciju lipidnih peroksida izraženih kao reaktivni
spojevi tiobarbiturne kiseline (TBARS) u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom
168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Sadržaj TBARS je određivan u periodu od
48 do 168 sati uzgoja svaka 24 sata. Vidljivo je da je koncentracija lipidnih peroksida u miceliju
plijesni A. flavus izloženom FNP viša od koncentracije u kontrolnom uzgoju tijekom 168 sati.
Najveći utjecaj na koncentraciju TBARS uočava se u slučaju izloženosti plijesni FNP u
koncentracijama od 10 i 100 ng mL-1. Pri tome je vidljiva povišena koncentracija TBARS za
1,5 puta (10 ng mL-1 FNP), odnosno za 1,7 puta (100 ng mL-1 FNP). U slučaju 1000 ng mL-1
FNP koncentracija lipidnih peroksida je povećana u odnosu na kontrolni uzgoj u ranim fazama
rasta micelija (48 i 72 sata uzgoja), a nakon toga poprima vrijednosti podjednake onima u
kontrolnom uzgoju. Navedene razlike su potvrđene statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
88
4.6.4.Utjecaj nanočestica fulerenola na koncentraciju glutationa
Rezultati određivanja koncentracija reduciranog (GSH) i oksidiranog glutationa (GSSG) u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu
pri 29 °C u prisutnosti nanočestica fulerenola prikazani su u Tablicama 16 i 17. Koncentracije
GSH i GSSG u miceliju plijesni su određene svakih 24 sata u vremenskom periodu od 48 do
168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do 168 sati za uzgoj u prisutnosti nanočestica
fulerenola. Glavni razlog zbog kojeg u uzgoju plijesni izloženom djelovanju FNP nisu određene
koncentracije GSH i GSSG nakon 48 sati uzgoja je nedovoljno proizvedena masa micelija
nephodna za analize. Iz tablice je vidljivo je da sniženu koncentraciju GSH u odnosu na
kontrolni uzgoj izazivaju sve ispitivane koncentracije FNP, dok se pri koncentracijama FNP od
10 i 100 ng mL-1 uočava povišena koncentracija GSSG u odnosu na kontrolni uzgoj. Za razliku
od toga, koncentracija FNP od 1000 ng mL-1 izaziva sniženu koncentraciju GSSG u odnosu na
kontrolni uzgoj.
Tablica 16. Koncentracija reduciranog glutationa (GSH) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSH [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj FNP (10 ng mL-1) FNP (100 ng mL-1) FNP (1000 ng mL-1)
48 2165,40 ± 10,84
72 2166,58 ± 31,24 458,76 ± 48,33 849,90 ± 62,60 781,37 ± 52,00
96 1933,38 ± 22,08 348,23 ± 53,36 334,41 ± 33,44 578,19 ± 48,28
120 2155,68 ± 24,05 835,35 ± 63,01 543,31 ± 70,23 617,15 ± 78,69
144 2108,10 ± 68,84 271,65 ± 47,55 916,18 ± 70,23 417,50 ± 52,87
168 2448,54 ± 78,98 85,76 ± 68,43 430,32 ± 48,97 682,59 ± 53,50
Tablica 17. Koncentracija oksidiranog glutationa (GSSG) u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati predstavljaju
srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Vrijeme [h] GSSG [nmol g(s.t.)
-1]
Kontrolni uzgoj FNP (10 ng mL-1) FNP (100 ng mL-1) FNP (1000 ng mL-1)
48 848,51 ± 33,69
72 675,05 ± 28,80 1082,85 ± 30,68 1108,93 ± 29,17 364,14 ± 28,96
96 443,36 ± 10,05 505,23 ± 11,32 469,48 ± 13,53 161,82 ± 17,40
120 416,45 ± 8,18 523,10 ± 13,62 480,59 ± 8,14 208,03 ± 22,01
144 313,12 ± 22,07 544,22 ± 5,02 556,89 ± 10,40 132,38 ± 20,97
168 287,63 ± 10,92 472,31 ± 19,26 335,90 ± 6,35 133,87 ± 12,57
89
Slika 56. Utjecaj nanočestica fulerenola na omjer reduciranog i oksidiranog glutationa u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Iz koncentracija GSH i GSSG izračunat je omjer prikazan na Slici 56. Vidljiv je značajan utjecaj
10 i 100 ng mL-1 FNP na sniženje omjera GSH/GSSG, dok je u slučaju najviše koncentracije
FNP ovaj učinak nešto slabiji. Primjenom 10 i 100 ng mL-1 FNP postiže se smanjenje omjera
GSH/GSSG tijekom vremena uzgoja za prosječno 7,6 te 5,1 puta. Štoviše, kod istih
koncentracija FNP je zamijećena i najveća produkcija aflatoksina B1 (Slika 54). U slučaju
1000 ng mL-1 FNP postiže se smanjenje omjera GSH/GSSG tijekom vremena uzgoja za
prosječno 1,5 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
90
4.6.5. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid
dismutaze
Slika 57. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost bakar,cink-superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Slika 57. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL
3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost Cu,Zn-SOD je
određena u vremenskom periodu od 48 do 168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do
168 sati za uzgoj u prisutnosti nanočestica fulerenola svaka 24 sata. Nedovoljna masa
produciranog micelija nakon 48 sati uzgoja u prisutnosti FNP, glavni je razlog zašto nakon 48
sati nije određena aktivnost Cu,Zn-SOD u miceliju. Iz slike je vidljivo da izloženost plijesni
nanočesticama fulerenola uzrokuje snižene razine aktivnosti Cu,Zn-SOD tijekom 168
inkubacije u odnosu na kontrolni uzgoj. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
4.6.6. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid
dismutaze
Utjecaj FNP na aktivnost Mn-SOD u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati
uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C prikazana je Slikom 58. Aktivnost Mn-SOD je
određena u periodu od 48 do 168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do 168 sati za uzgoj
91
u prisutnosti nanočestica fulerenola svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni FNP dovodi
do povećanja aktivnosti Mn-SOD u odnosu na kontrolni uzgoj. Tako su pri koncentraciji FNP
od 1000 ng mL-1 razine aktivnosti Mn-SOD nešto više ili podjednake razinama aktivnosti
zabilježenim u miceliju kontrolnog uzgoja. U slučaju FNP koncentracije od 100 ng mL-1
aktivnosti Mn-SOD su prosječno 1,5 puta više, a pri koncentraciji FNP od 10 ng mL-1 prosječno
više za 1,3 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način
opisan u Poglavlju 3.18.
Slika 58. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost manganove superoksid dismutaze u
miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri
29 °C. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.6.7. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze
Slika 59. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost CAT u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost CAT je određena u
periodu od 48 do 168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do 168 sati za uzgoj u prisutnosti
nanočestica fulerenola svaka 24 sata. Iz slike je vidljivo da su razine aktivnosti katalaze u
miceliju plijesni izloženom djelovanju FNP snižene ili podjednake razinama aktivnosti u
miceliju kontrolnog uzgoja. Pri tome se može zamijetiti da se najviše sniženje razina aktivnosti
CAT uočava u miceliju plijesni izloženog djelovanju FNP koncentracije 100 ng mL-1.
92
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
Slika 59. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost katalaze u miceliju plijesni A. flavus
NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.6.8.Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze
Utjecaj FNP na aktivnost GPX u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja
uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C prikazan je Slikom 60. Aktivnost GPX je određena u periodu
od 48 do 168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do 168 sati za uzgoj u prisutnosti
nanočestica fulerenola svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni nanočesticama fulerenola
koncentracije 10 i 100 ng mL-1 izaziva sniženu aktivnost GPX nakon 72 sata uzgoja, da bi
potom aktivnosti GPX bile podjednake aktivnostima u kontrolnom uzgoju. Za razliku od toga
izloženost plijesni koncentraciji FNP od 1000 ng mL-1 izaziva povećanu aktivnost GPX nakon
72 sata uzgoja, da bi potom od 96 do 168 sati razina aktivnosti GPX bila niža od kontrolnog
uzgoja za prosječno 3,7 puta. Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom
provedenom na način opisan u Poglavlju 3.18.
93
Slika 60. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation peroksidaze u miceliju plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
4.6.9. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze
Slika 61. prikazuje utjecaj FNP na aktivnost GR u miceliju plijesni A. flavus NRRL 3251
tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Aktivnost GR je određena u periodu
od 48 do 168 sati za kontrolni uzgoj, te u periodu od 72 do 168 sati za uzgoj u prisutnosti
nanočestica fulerenola svaka 24 sata. Vidljivo je da izloženost plijesni koncentracijama
fulerenola od 100 i 1000 ng mL-1 izaziva sniženu aktivnost GR u odnosu na kontrolni uzgoj.
Navedene razlike potvrđene su statističkom analizom provedenom na način opisan u Poglavlju
3.18.
94
Slika 61. Utjecaj nanočestica fulerenola na aktivnost glutation reduktaze u miceliju plijesni A.
flavus NRRL 3251 tijekom 168 sati uzgoja uz izloženost VIS svjetlu pri 29 °C. Rezultati
predstavljaju srednju vrijednost ± SEM tri neovisna uzgoja.
Legenda: - kontrolni uzgoj, - 10 ng mL-1, - 100 ng mL-1, - 1000 ng mL-1
Na temelju svih gore navedenih rezultata može se zaključiti da nanočestice fulerenola utječu na
modulaciju oksidativnog statusa plijesni A. flavus NRRL 3251. Pri tome bi se modulacija
oksidativnog stresa mogla pripisati oksidativnom djelovanju FNP koji u miceliju plijesni
dovode do povećane koncentracije TBARS (Slika 55), sniženju omjera GSH/GSSG (Slika 56),
te povećanoj aktivnosti Mn-SOD (Slika 58). Sve ovo dovodi do povećane produkcije
aflatoksina B1 u trofofazi i počeku idiofaze (Slika 54).
95
5. RASPRAVA
Nanočestice fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24 jedna su od skupina nanomaterijala na bazi
ugljika koja je zbog svojih specifičnih kemijskih, mehaničkih, električnih i optičkih svojstava
nailazi na sve veću primjenu u različitim granama industrije. Shodno tome, uslijed porasta
globalne proizvodnje fulerena postoji sve veća opasnost od njihova gomilanja u okolišu. Pri
tome, gomilanje u okolišu može biti rezultat: a) otpuštanja u okoliš tijekom procesa proizvodnje
kako čistih fulerena i fulerenola tako i komercijalnih proizvoda koji u svom sastavu sadrže iste,
b) izgaranja fosilnih goriva u motorima s unutrašnjim izgaranjem, bilo u vozilima ili motora u
tvorničkim postrojenjima, c) uporabe proizvoda koji sadrže fuleren ili fulerenol te d) odlaganja
proizvoda koji sadrže iste (Fortner i sur., 2005; Hotze i sur., 2008; Piccinio i sur., 2012; Sanchis
i sur., 2014; 2016). U prilog tomu govore istraživanja o prisutnosti fulerena u atmosferi, tlu i
vodama. Naime, u atmosferi na području Mediterana pronađeno i do 49,31 ng m-3 fulerena C60
te do 233,8 ng m-3 fulerena C70 (Sanchis i sur., 2012), u otpadnim vodama s područja Španjolske
do 19,1 µg L-1, riječnim vodama do 7,8 ng L-1 fulerena C60, u sedimentima rijeka s istog
područja 0,7 µg kg-1, a tlu na područje Španjolske i Saudijske Arabije do 6,83 µg kg-1 fulerena
C60 (Sanchis i sur., 2013). Upravo iz razloga povećane prisutnosti nanočestica fulerena u
okolišu provode se različita istraživanja njihova utjecaja na mikroorganizme, vodene organizme
i kulture stanica i tkiva (Aoshima i sur., 2009; Avanasi i sur., 2014; Foley i sur., 2002; Fortner
i sur., 2005; Gao i sur., 2011; Hadduck i sur., 2010; Huang i sur., 2014; Isaacson i sur. 2007;
Johnson-Lyles i sur., 2010; Kamat i sur., 1998; 2000; Lyon i sur., 2006; Oberdorster, 2004;
Ratnikova i sur., 2011; Sayes i sur., 2004; Unković i sur., 2015). K tome, vodeći računa o
kemijskoj transformaciji fulerena u okolišu, te potencijalnom nastanku fulerenola, istraživanja
su proširena i na utjecaj ove vrste nanočestica. Antimikrobni/toksični učinak ponajprije se
pripisuje načinu pripreme suspenzija nanočestica fulerena C60, veličini nanočestica,
primijenjenoj koncentraciji, vrsti ispitivanog mikroorganizma te načinu i uvjetima uzgoja.
Ustanovljeno je da: i) nanočestice fulerena C60 potpuno inhibiraju rast B. subtillisa ili E. coli
(Fortner i sur., 2005; Lyon i sur., 2005; 2006), ii) da nanočestice fulerena uzrokuju oksidaciju
proteina, promjene membranskog potencijala i prekid staničnog disanja (Lyon i sur., 2008a;
2008b), iii) nanočestice fulerenola razaraju stanični citoskelet, dovode do gubitka
membranskog potencijala te snižene produkcije ATP (Johnson-Lyles i sur., 2010) te iv) da
nanočestice fulerena i fulerenola direktno oksidiraju građevne molekule stanice (Lyon i sur;
96
2008a; 2008b), ili se oksidacija molekula može pripisati generiranju reaktivnih vrsta kisika u
vodenim otopinama posebice pod utjecajem UV ili VIS zračenja (Kamat i sur., 1998; 2000;
Kasermann i Kempf, 1997; Marković i sur., 2007; Sayes i sur., 2004).
Svakako, jedno od najmanje istraženih područja antimikrobnog učinka nanočestica fulerena i
fulerena je interakcija s mikotoksikogenim plijesnima, a posebice sa plijesni A. flavus. Ova
saprofitna plijesan je oportunistički patogen, koji producira aflatoksine. U okolišu je široko
rasprostranjena pri čemu je prisutna u obliku micelija, sklerocija i spora. Aflatoksinima
kontaminira kukuruz, pšenicu, orašaste plodove, pamuk i začine (Heydati i sur., 2007; Klich,
2007). Obzirom na rasprostranjenost i životni ciklus ove plijesni te rasprostranjenost i prisutnost
nanočestica fulerena i fulerenola u okolišu vjerojatnost za interakciju s nC60 i FNP je vrlo velika.
Upravo iz gore navedenog cilj je ove disertacije bio ispitati utjecaj nanočestica fulerena C60
(nC60) i fulerenola C60(OH)24 (FNP) na modulaciju oksidativnog stresa, produkciju aflatoksina
i rast plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251. Pri tome je pretpostavljeno da će nC60 i FNP
modulirati oksidativni stres plijesni A. flavus ovisno o primijenjenoj koncentraciji i uvjetima
uzgoja, kao i ovisno o izloženosti VIS svjetlu. Očekivano je da će smanjena razina oksidativnog
stresa izazvati antiaflatoksikogeni učinak, povišena razina aflatoksikogeni i/ili antifungalni
učinak, a oksidativni stres kvazistacionarne razine povećani rast micelija plijesni i povećanu
produkciju aflatoksina.
5.1. Karakterizacija suspenzija nanočestica fulerena i fulerenola
Prema definiciji Zajedničkog istraživačkog centra Europske komisije (Rauscher i sur., 2015)
nanočesticama se smatraju prirodne, slučajno ili namjerno proizvedene čestice koje
pojedinačno, kao agregati ili aglomerati imaju vanjski promjer između 1 i 100 nm, i to najmanje
50% od ukupnog broja čestica. Pri tome se u slučaju fulerena, listića grafena i ugljikovih
nanocjevčica, nanočesticama smatraju i čestice kod kojih je jedna ili više vanjskih dimenzija
manja od 1 nm. Kako bi se utvrdilo da pripremljene nanočestice fulerena i fulerenola ispitivane
u ovoj disertaciji svojim promjerom odgovaraju definiciji, provedena je karakterizacija
nanočestica određivanjem hidrodinamičkog radijusa primjenom metode dinamičkog raspršenja
svjetlosti (DLS). Uz navedeno, određen je i zeta potencijal nanočestica primjenom metode
elektroforetskog rasipanja svjetlosti (ELS). Naime, u ovom su istraživanju pripremane vodene
suspenzije nanočestica fulerena i fulerenola. Glavni razlog pripreme vodenih suspenzija
nanočestica su literaturni podatci koji pokazuju da u slučaju nanočestica pripremljenih
97
izmjenom organskog otapala antimikrobni učinak može biti posljedica zaostatka otapala
zarobljenih u strukturi aglomerata nanočestica.
Rezultati određivanja hidrodinamičkog radijusa nC60 i FNP (Slika 14 i 15) pokazali su da se
radi o polidisperznom sustavu gdje 62,5% nanočestica fulerena i 100% nanočestica fulerenola
imaju promjer manji od 100 nm, što znači da se proizvedene nanočestice mogu i u pravom
smislu smatrati nanočesticama. Nadalje, srednja vrijednost hidrodinamičkog promjera nC60 po
broju iznosila je 78 nm, a FNP 10 nm. Proizvedene suspenzije nC60 posjedovale su zeta
potencijal od -24,5 mV, a suspenzije FNP -34,9 mV.
Slične vrijednosti hidrodinamičkog radijusa i zeta potencijala nanočestica fulerena i fulerenola
mogu se pronaći u dostupnim literaturnim izvorima. Naime, Lyon i sur. (2006) su ustanovili da
prosječna veličina nanočestica fulerena pripremljenih na isti način kao i u ovoj disertaciji iznosi
74,9 nm, Park i sur. (2010) navode veličinu nanočestica od 46,7 ±18,6 nm, a prema Fortneru i
sur. (2005) ona iznosi oko 100 nm. U slučaju nanočestica fulerenola prosječni hidrodinamički
radijus prema Unkoviću i sur. (2015) iznosi 8,7 nm, a Johnson-Lyles i sur. (2010) 15,7 nm. Pri
tome se referirani zeta potencijal nanočestica fulerena kreće od -30,24 mV (Park i sur., 2010)
do -36 mV (Fortner i sur., 2005), a za nanočestice fulerenola od -34,4 mV (Ratnikova i sur.,
2011) do -53,3 mV (Unković i sur., 2015).
5.2. Usporedba uzgoja plijesni A. flavus u tami i uz izloženost VIS svjetlu na porast mase
micelija, koncentraciju lipidnih peroksida i glutationa, te aktivnost antioksidativnih
enzima
Obzirom da je ovo istraživanje utjecaja nanočestica fulerena i fulerenola na plijesan A. flavus
provedeno u tami te uz izloženost VIS svjetlu u režimu 12 h tama/12 sati VIS svjetlo bilo je
potrebno utvrditi postoje li razlike pri uzgoju plijesni pri ova dva uvjeta, posebice sa stanovišta
potencijalne usporedbe rezultata utjecaja nanočestica na plijesan prilikom uzgoja u tami te uz
izloženost svjetlu. U literaturi se mogu pronaći oprečne informacije o utjecaju svjetla na
produkciju aflatoksina B1. Tako su Aziz i Mousa (1997) pronašli da tijekom uzgoja uz
izloženost svjetlu plijesan A. flavus producira više, a Joffe i Lisker (1969) manje aflatoksina
B1. Pri tome istraživanja Aziza i Mouse (1997) upućuju da izloženost svjetlu tijekom uzgoja
utječe i na porast biomase plijesni A. flavus.
Za razliku od Aziza i Mouse (1997) rezultati ovog istraživanja pokazuju negativan utjecaj
svjetla na porast biomase. Naime, tijekom uzgoja micelija plijesni A. flavus u tekućoj YES
podlozi pri 29°C tijekom 168 sati u tami i uz izloženost svjetlu (Slika 34) ustanovljeno je da
98
izloženost VIS svjetlu dovodi do sniženja mase micelija 1,2 do 3,5 puta u odnosu na uzgoj u
tami. U oba slučaja krivulja porasta mase micelija bila je karakteristična za rast
mikroorganizama. Plijesan A. flavus nalazila se tako u lag fazi rasta tijekom prvih 48 sati,
trofofazi od 48 do 72 sata, a nakon 96 sati rasta u idiofazi do 168 sati rasta.
Sniženi prirast biomase plijesni A. flavus NRRL 3251 uz izloženost VIS svjetlu odrazio se i na
sniženu produkciju aflatoksina B1 (Slika 35). Tako je nakon 48 sati uzgoja plijesni uz
izloženost svjetlu produkcija aflatoksina B1 bila potpuno inhibirana, a od 72 do 168 sati uzgoja
količina AFB1 bila niža za 56 do 84 %, u odnosu na uzgoj u tami. Sličan postotak sniženja
produkcije aflatoksina B1 pod utjecajem svjetla pokazuje istraživanje Joffe i Lisekera (1969).
Nasuprot tome Aziz i Mousa (1997) su ustanovili da izloženost svjetlu uzrokuje povećanje
produkcije aflatoksina B1 i do 75 %, ovisno o danu uzgoja. Najvjerojatniji razlog zašto je došlo
do snižene produkcije aflatoksina tijekom uzgoja plijesni A. flavus NRRL 3251 uz izloženost
svjetlu je utjecaj svjetla na VeA transkripcijski faktor. Naime, VeA s transkripcijskim faktorima
VelB i LeaA tvori Velvet kompleks zadužen za regulaciju sekundarnog metabolizma plijesni.
Uslijed izloženosti svjetlu, djelomično je onemogućena interakcija Vea s VelB u citoplazmi što
onemogućava njihovo dospijevanje u jezgru, interakciju s LeaA te rezultira sniženom
produkcijom aflatoksina B1 (Bok i Keller, 2004; Calvo i Cary, 2016; Roze i sur., 2011; Yin i
Keller, 2011).
Jedan od fokusa istraživanja ove disertacije bio je praćenje oksidativnog stresa u plijesni
A. flavus tijekom uzgoja. Navedeno je provedeno određivanjem koncentracija TBARS te
reduciranog i oksidiranog glutationa, kao i aktivnosti antioksidativnih enzima: Cu,Zn-SOD,
Mn-SOD, CAT, GPX i GR. Izloženost svjetlu tijekom uzgoja plijesni dovela je do snižene
koncentracije TBARS (Slika 36), povišene koncentracije reduciranog i snižene oksidiranog
glutationa (Slika 37), te shodno tome i povećanog omjera GSH/GSSG u miceliju plijesni u
odnosu na uzgoj u tami (Slika 38). Uzgoj uz izloženost svjetlu doveo je i do sniženih aktivnosti
Mn-SOD, CAT, GPX i GR (Slika 40 - 43) u miceliju plijesni. Jedini od antioksidativnih enzima
koji je pokazao povišenu razinu aktivnosti je Cu,Zn-SOD (Slika 39). Pri tome je aktivnost
navedenog enzima bila prosječno veća za 1,2 puta u odnosu na uzgoj u tami. Jedan od mogućih
razloga zašto su zabilježene snižene razine antioksidativnih enzima tijekom uzgoja uz
izloženost svjetlu je utjecaj svjetla na inhibiciju stvaranja Velvet kompleksa koji se prema
Baidya i sur. (2014) povezuje i sa regulacijom ekspresije CAT.
Stoga, značajne razlike u ispitivanim parametrima tijekom uzgoja micelija plijesni u tami i uz
izloženost svjetlu upućuju da se usporedba rezultata utjecaja koncentracija nanočestica na
plijesan prilikom gore navedenih uvjeta uzgoja ne može provoditi na osnovi kvantitativnih
99
vrijednosti, već se mora provoditi na temelju relativnih odnosa praćenih parametara u odnosu
na kontrolni uzgoj.
5.3. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerena tijekom
uzgoja u tami i uz izloženost VIS svjetlu
U ovoj disertaciji ispitan je utjecaj nanočestica fulerena C60 na plijesan A. flavus NRRL 3251
pri tri različite koncentracije, 10, 50 i 100 ng mL-1. Navedene koncentracije odabrane su s
obzirom na dostupne podatke o koncentracijama pronađenim u okolišu (Sanchis i sur., 2013;
Farre i sur, 2010) kao i obzirom na potencijalno povećanje koncentracije u okolišu zbog
povećanja proizvodnje, uporabe i odlaganja nC60. Pri tome je uzgoj plijesni proveden u tami te
uz izloženost VIS svjetlu u režimu 12 h tama/12 sati VIS svjetlo kako bi se simuliralo okolišne
uvjete. Uzgojem u tami željelo se simulirati rast plijesni u tlu, dok uzgojem u režimu 12 h
tama/12 sati VIS svjetlo rast uz prirodnu izmjenu dana i noći.
Pronađeno je da nanočestice fulerena ne pokazuju antifungalni učinak na plijesan A. flavus bilo
tijekom uzgoja u tami (Slika 16), bilo tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu (Slika 44). Štoviše,
tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu može se zamijetiti stimulativni utjecaj nanočestica fulerena
na prirast biomase plijesni. Da nanočestice fulerena ne djeluju antifungalno na C. albincans,
M. furfur i S. cerevisiae pokazuju istraživanja Aoshima i sur. (2009) te Hadduck i sur. (2010),
dok istraživanja Huang i sur. (2014) pokazuju da nanočestice fulerena mogu djelovati
stimulativno na rast bakterija aktivnog mulja.
Iako nanočestice fulerena nisu izazvale antifungalni učinak, djelovale su na produkciju
aflatoksina B1 plijesni A. flavus prilikom uzgoja u tami te uz izloženost svjetlu. Pri tome je
prilikom uzgoja u tami zabilježen antiaflatoksikogeni učinak pri koncentracijama nC60 od 10 i
100 ng mL-1 (Slika 17), a pri uzgoju uz izloženost svjetlu aflatoksikogeni učinak pri
10 i 50 ng mL-1 nC60 (Slika 45). Najbolji antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri
koncentraciji nanočestica fulerena od 100 ng mL-1, pri kojoj tijekom 72 sata uzgoja plijesni
dolazi do potpune inhibicije produkcije aflatoksina, dok je u vremenu od 96 do 168 sati uzgoja
produkcija aflatoksina prosječno snižena za 88 %. Najjači aflatoksikogeni učinak izazvala je
najniža primijenjena koncentracija nC60 (10 ng mL-1) pri kojoj je produkcija aflatoksina B1
povećana 8 puta u odnosu na kontrolni uzgoj proveden uz izloženost svjetlu. Sve ovo upućuje
da nanočestice fulerena imaju značajan učinak na produkciju aflatoksina B1. Prema literaturi
povećana produkcija aflatoksina B1 pripisuje se pojačanom oksidativnom stresu u stanicama
plijesni (Jayashree i Subramanyam, 2000; Narasaiah i sur., 2006; Reverberi i sur., 2008). Za
100
razliku od toga, sniženi oksidativni stres u stanicama plijesni može biti posljedica
antioksidativnog djelovanja različitih tvari (Reverberi i sur., 2005). Stoga bi se uočeni
antiaflatoksikogeni i aflatoksikogeni učinak nanočestica fulerena mogao pripisati modulaciji
razina oksidativnog stresa u stanicama plijesni. Da nanočestice fulerena ovisno o primijenjenoj
koncentraciji izazivaju promjene oksidativnog statusa plijesni tijekom uzgoja u tami pokazuju
promjene koncentracija lipidnih peroksida (Slika 18), omjera GSH/GSSG (Slika 19) te
aktivnosti Cu,Zn-SOD (Slika 20) i GPX (Slika 24). Pri tome snižena koncentracija TBARS,
snižene aktivnosti Cu,Zn-SOD i GPX pri 10 ng mL-1 nC60 upućuju na antioksidativnu aktivnost
nanočestica, što slijedno dovodi i do snižene produkcije aflatoksina B1. U slučaju koncentracije
nC60 od 100 ng mL-1 pri kojoj je zabilježen najjači antiaflatoksikogeni učinak, čini se da plijesan
na povećanu razinu oksidativnog stresa vidljivu po najvišoj koncentraciji TBARS (Slika 18)
odgovara pojačanim gomilanjem GSH (Tablica 10) unutar stanica plijesni. To se odražava na
povoljniji omjer GSH/GSSG (Slika 19) čime je osigurana neutralizacija viška ROS, a slijedno
time i snižena produkcija aflatoksina B1. Stoga, čini se da pri povećanim koncentracijama
nanočestice fulerena tijekom uzgoja u tami djeluju prooksidativno. Tijekom uzgoja plijesni uz
izloženost svjetlu povećana produkcija lipidnih peroksida (Slika 46) u ranim fazama rasta (48
sati) upućuje da nanočestice fulerena djeluju kao oksidansi. Navedeno se može zamijetiti i po
znatno povećanoj koncentraciji oksidiranog glutationa u miceliju plijesni (Tablica 15, Slika
47) što dugoročno rezultira snažnim aflatoksikogenim učinkom pri 10 i 50 ng mL-1 nC60. Na
oksidativno djelovanje navedenih koncentracija nanočestica fulerena u stanicama plijesni
tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu upućuju i povećane razine Cu,Zn-SOD (Slika 48), Mn-
SOD (Slika 49) te CAT (Slika 50) koje očito nisu dovoljne za neutralizaciju prekomjernog
nakupljanja ROS, što dugoročno dovodi do povećane produkcije aflatoksina B1. Da izloženost
plijesni oksidansima tijekom uzgoja može dovesti do povišenih razina superoksid dismutaze i
katalaze pokazuju istraživanja Angelove i sur. (2004) i Li i sur. (2008).
Na osnovi gore navedenog može se zaključiti da ovisno o primijenjenoj koncentraciji
nanočestice fulerena moduliraju oksidativni status plijesni A. flavus tijekom uzgoja u tami
djelujući antioksidativno ili prooksidativno, a prilikom uzgoja uz izloženost svjetlu pokazuju
oksidativno djelovanje. Da nanočestice fulerena mogu djelovati kao antioksidansi upućuju
istraživanja Gharbi i sur. (2005) koji su pokazali zaštitni učinak nC60 pripremljenih dugotrajnim
miješanjem u vodi na neutralizaciju ROS u stanicama jetre štakora te istraživanja
Baati i sur. (2012) koji produženi životni vijek štakora, čija je ishrana suplementirana fulerenom
C60, pripisuju antioksidativnom djelovanju fulerena. Suprotno tome, prema Isakoviću i sur.
(2006) nanočestice fulerena mogu dovesti do značajnog povećanja ROS u glioma stanica
101
štakorske stanične linije C6 što upućuje da nC60 mogu djelovati kao oksidansi. U prilog tome
govore istraživanja Oberdorstera (2004) koji je pokazao da nanočestice fulerena povećavaju
lipidnu peroksidaciju u stanicama mozga pastrvskog grgeča (Micropterus salmoides), kao i
istraživanja Lyon i sur. (2008a; 2008b) koji su pokazali da nanočestice fulerena mogu direktno
izazvati oksidativna oštećenja staničnih komponenti mehanizmima koji ne uključuju
generiranje ROS. Međutim, nije nužno da će neka tvar koja djeluje kao oksidans dovesti do
oksidativnog stresa u stanici, nego će svojim blagim oksidativnim djelovanjem izazvati
pojačanu staničnu antioksidativnu obranu te će zapravo djelovati kao prooksidans (Plauth i sur.,
2016). Upravo bi se time mogao pojasniti uočeni prooksidativni efekt nanočestica fulerena
koncentracije 100 ng mL-1 tijekom uzgoja u tami, što upućuje na hormetički učinak,
antioksidativno djelovanje pri niskim koncentracijama te prooksidativno pri visokim
koncentracijama. Pojačana produkcija reaktivnih vrsta kisika nanočesticama fulerena postiže
se primjenom fotoekscitacije u vidljivom ili ultraljubičastom dijelu spektra. Naime, istraživanja
Hotze i sur. (2008), Kamat i sur. (1998; 2000), Kong i Zepp (2012), i Yamakoshi i sur. (2003)
pokazuju da se oksidativno djelovanje nanočestica fulerena može pripisati njihovoj sposobnosti
generiranja singlet kisika i superoksidnog aniona uslijed izloženosti UV i/ili VIS zračenju.
Upravo bi povećana sposobnost generiranja ROS nanočesticama fulerena fotoekscitacijom
mogla biti glavni razlog uočenog oksidativnog djelovanja tijekom uzgoja plijesni u prisutnosti
VIS svjetla, a shodno tome i zamijećenom aflatoksikogenom učinku.
Da je oksidativno djelovanje nanočestica fulerena najvjerojatniji razlog aflatoksikogenog
učinka tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu upućuje i činjenica da bi izloženost svjetlu trebala
dovesti do snižene produkcije aflatoksina B1 što pokazuju rezultati usporedbe kontrolnih
uzgoja (Slika 35). Kako je već prije navedeno, snižena produkcija aflatoksina B1 se može
pripisati djelovanju svjetla na sposobnost udruživanja transkripcijskog faktora VeA u Velvet
kompleks (Bok i Keller, 2004; Calvo i Cary, 2016; Roze i sur., 2011; Yin i Keller, 2011).
Međutim, očito je da nanočesticama izazvan oksidativni stres u stanicama plijesni dovodi do
aktivacije drugih puteva koji poništavaju utjecaj svjetla na formiranje Velvet kompleksa. Jedan
od njih je HOG (eng. High-Osmolarity Glycerol) signalizacijski put koji dovodi i do aktivacije
transkripcije aftB gena (Baidya i sur., 2014; Fountain i sur., 2014) čiji produkt transkripcije,
transkripcijski faktor AftB regulira odgovor plijesni na oksidativni stres. Naime, AftB pripada
u istu skupinu transkripcijskih faktora kao i AP-1, ortolog transkripcijskog faktora YAP-1, pri
čemu oba omogućuju ekspresiju klastera gena zaduženih za biosintezu aflatoksina (Fountain i
sur., 2014; Reverberi i sur., 2008; Roze i sur., 2011). Stoga, čini se da je aflatoksikogeni učinak
102
nanočestica fulerena tijekom uzgoja plijesni A. flavus uz izloženost svjetlu odraz pojačane
ekspresije ova dva transkripcijska faktora.
5.4. Modulacija oksidativnog stresa plijesni A. flavus nanočesticama fulerenola tijekom
uzgoja u tami i uz izloženost VIS svjetlu
Obzirom da je opća pretpostavka da se dio u prirodi prisutnih nanočestica fulerena transformira
u fulerenole, u ovoj disertaciji ispitan je i utjecaj nanočestica fulerenola C60(OH)24 na plijesan
A. flavus NRRL 3251 pri tri različite koncentracije od 10, 100 i 1000 ng mL-1. Za koncentraciju
nanočestica fulerenola od 10 ng mL-1 pretpostavljeno je da će biti prisutna u okolišu kao
posljedica transformacije fulerena, 100 ng mL-1 uslijed gomilanja fulerena i slijedne
transformacije u okolišu, dok je za koncentraciju od 1000 ng mL-1 pretpostavljeno da će biti
posljedica ispuštanja nanočestica direktno iz proizvodnih procesa ili nepropisnog skladištenja
medicinskog otpada budući da se u medicinskim istraživanjima upotrebljavaju vrlo visoke
koncentracije fulerenola, čak do 150 µg mL-1 (Grebowski i sur., 2013). Pri tome je uzgoj plijesni
proveden na isti način kao i u slučaju nanočestica fulerena, u tami te uz izloženost VIS svjetlu
u režimu 12 h tama/12 sati VIS svjetlo.
Pronađeno je da nanočestice fulerenola pokazuju blagi antifungalni učinak na plijesan A. flavus
pri koncentraciji od 1000 ng mL-1 tijekom uzgoja u tami (Slika 25) te koncentraciji od 100 ng
mL-1 tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu (Slika 53). Ovi podaci djelomično su sukladni s
istraživanjem Aoshime i sur. (2009) koji su pokazali da fulerenoli s različitim brojem
hidroksilnih skupina (C60(OH)12, C60(OH)36 i C60(OH)44) potpuno inhibiraju rast C. albicans i
M. furfur u rasponu koncentracija od 60 do 500 µg mL-1, što su od 60 do 100 puta više
koncentracije od najviše ispitivane u ovoj disertaciji. Antifungalni učinak FNP na plijesni
A. flavus, A. parasiticus i A. ochraceus tijekom petodnevnog submerznog uzgoja u prisutnosti
5,2 ng mL-1 FNP pokazali su i Unković i sur. (2015) koji su ustanovili da je pri navedenoj
koncentraciji FNP prirast biomase snižen u rasponu od 75 do 94 %. Za razliku od toga, Gao i
sur. (2011) navode da fulerenol (C60(OH)24–26) pri koncentraciji višoj od 10 µg mL-1 stimulira
rast plijesni A. niger.
Nanočestice fulerenola djelovale su na produkciju aflatoksina B1 plijesni A. flavus prilikom
uzgoja u tami te uz izloženost svjetlu. Pri tome je prilikom uzgoja u tami zabilježen
antiaflatoksikogeni učinak (Slika 26), a prilikom uzgoja uz izloženost svjetlu aflatoksikogeni
učinak (Slika 54), i to pri sve tri ispitivane koncentracije FNP (10, 100 i 1000 ng mL-1). Najbolji
antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri koncentraciji FNP od 100 ng mL-1 pri kojoj tijekom
103
72 sata uzgoja plijesni dolazi do potpune inhibicije produkcije aflatoksina, a u vremenu od 96
do 168 sati uzgoja inhibicija produkcije aflatoksina B1 iznosi 85 % u odnosu na kontrolni uzgoj.
Gotovo identičan postotak inhibicije produkcije aflatoksina B1 postignut je i pri koncentraciji
od 10 ng mL-1, ali je potpuna inhibicija produkcije aflatoksina zabilježena do 48 sati uzgoja.
Najslabiji antiaflatoksikogeni učinak postignut je pri koncentraciji FNP od 1000 ng mL-1 pri
kojoj je inhibicija produkcije aflatoksina B1 bila prosječno 57 %. Nanočestice fulerenola su
identičnim slijedom antiaflatoksikogenog djelovanja pokazale aflatoksikogeni učinak tijekom
uzgoja uz izloženost svjetlu i to prvenstveno u trofofazi i ranoj idiofazi (48 do 96 sati) (Slika
54). Pri tome je u navedenom vremenskom periodu od 48 do 96 sati uzgoja produkcija
aflatoksina B1 bila povećana 3,9 puta pri koncentraciji FNP od 100 ng mL-1, 3,1 puta pri
10 ng ml-1, te 2,7 puta pri 1000 ng mL-1 u odnosu na kontrolni uzgoj. Aflatoksikogeni učinak
nanočestica fulerenola na plijesni A. parasiticus i A. flavus pri koncentraciji od 5,2 ng mL-1
pokazali su Unković i sur. (2015). Međutim, navedeno istraživanje je provedeno pri temperaturi
koja ne pogoduje produkciji aflatoksina (22 ± 2°C) te pri samo jednoj koncentraciji FNP (5,2
ng mL-1).
Uočeni antiaflatoksikogeni i aflatoksikogeni učinak nanočestica fulerenola (Slika 26 i 54) bi se
kao i u slučaju nanočestica fulerena, mogao pripisati modulaciji oksidativnog stresa u stanicama
plijesni. Međutim, za razliku od nanočestica fulerena modulacija oksidativnog stresa FNP se
može pripisati prooksidativnom djelovanju tijekom uzgoja u tami ili oksidativnom djelovanju
tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu. Da nanočestice fulerenola tijekom uzgoja u tami pokazuju
prooksidativno djelovanje upućuju visoke razine aktivnosti Cu,Zn-SOD (Slika 29) u trofofazi
(48 i 72 sata uzgoja). Čini se da visoka razina Cu,Zn-SOD učinkovito neutralizira superoksidne
anione te na taj način sprječava pojačanu lipidnu peroksidaciju, što je i uočeno po sniženim
razinama TBARS tijekom uzgoja (Slika 27). Sposobnost generiranja singlet kisika i
superoksidnog aniona u otopinama koje sadrže nanočestice fulerenola i NADH, bez izlaganja
svjetlu pokazuju istraživanja Badireddy i sur. (2007) i Hotze i sur. (2008). Stoga, uzevši u obzir
da YES podloga sadrži određenu koncentraciju NADH (Sporty i sur., 2008) očito je da
nanočestice fulerenola stupaju u interakciju s NADH što dovodi do povećanja razine
superoksidnog aniona u podlozi i slijedno inducira povećane razine Cu,Zn-SOD u miceliju
plijesni tijekom ranih faza rasta. Upravo na to upućuje i proporcionalna ovisnost razine
aktivnosti Cu,Zn-SOD (Slika 29) u trofofazi o primijenjenoj koncentraciji FNP. Ove povišene
razine aktivnosti Cu,Zn-SOD u trofofazi očito su dovoljne kako bi snizile oksidativni stres u
stanicama plijesni što se dugoročno odražava na sniženu produkciju aflatoksina B1 (Slika 26),
ali isto tako i na nešto niže razine CAT (Slika 31) i GPX (Slika 31). U prilog tome govori i
104
istraživanje Li i sur. (2008) koji su pokazali da se plijesni adaptiraju na niske razine ROS u
podlozi pojačavajući antioksidativnu obranu.
Znatno veću sposobnost generiranja ROS (superoksidnog aniona i singlet kisika) pokazuju
otopine nanočestica fulerenola i NADH izložene djelovanju UV svjetla (Badireddy i sur., 2007;
Hotze i sur., 2008) pri čemu to povećanje može iznositi i do 30 puta u odnosu na generiranje
ROS u tami. Stoga ne začuđuje činjenica da su nanočestice fulerenola tijekom uzgoja plijesni
uz izloženost VIS svjetlu pokazale oksidativno djelovanje koje se zamjećuje po povišenim
koncentracijama lipidnih peroksida tijekom uzgoja (Slika 55), sniženom omjeru GSH/GSSG
(Slika 56) te povišenoj razini aktivnosti Mn-SOD (Slika 58) u odnosu na uzgoj u tami. Pri tome
je pojačani oksidativni stres u stanicama plijesni očito doveo do pojačane produkcije aflatoksina
B1, odnosno aflatoksikogenog učinka. I u ovom slučaju može se pretpostaviti da je
afaltoksikogeni učinak posljedica ekspresije transkripcijskih faktora AftB i AP-1 kako je to već
pojašnjeno u slučaju aflatoksikogenog učinka nanočestica fulerena.
Jedna od svakako zanimljivih činjenica vezanih uz antiaflatoksikogeno i aflatoksikogeno
djelovanje nanočestica fulerenola je neproporcionalno povećanje učinka o koncentraciji.
Naime, dok se antiaflatoksikogeni i aflatoksikogeni učinak pojačavaju kada se koncentracija
FNP povisi sa 10 na 100 ng mL-1, primjena najviše koncentracije od 1000 ng mL-1 dovodi do
najslabijeg antiaflatoksikogenog i aflatoksikogenog učinka. Najvjerojatniji razlog tomu je
potencijalno djelovanje FNP na razaranje i/ili inhibiciju formiranja staničnog citoskeleta,
inhibiciju membranskog transporta, gubitak membranskog potencijala kao i sniženu produkciju
ATP-a koje su najčešće uočene tijekom primjene visokih koncentracija FNP (Grebowski i sur.,
2013; Johnson-Lyles i sur., 2010, Ratnikova i sur., 2011).
Na osnovi svega navedenog očigledno je da nanočestice fulerena C60 i fulerenola C60(OH)24
pokazuju dvojni učinak na modulaciju oksidativnog stresa u stanicama plijesni A. flavus. Tako
prilikom uzgoja u tami kojim se željelo simulirati rast plijesni u tlu ili zatvorenim skladišnim
prostorima obje vrste nanočestica snižavaju razinu oksidativnog stresa u stanicama plijesni što
posljedično dovodi do snižene produkcije aflatoksina B1. Nasuprot tome, prilikom uzgoja
plijesni u režimu 12 h tama/12 sati VIS svjetlo kojim se htjelo simulirati rast uz prirodnu
izmjenu dana i noći nanočestice fulerena i fulerenola pojačavaju razinu oksidativnog stresa u
stanicama plijesni i posljedično dovode do pojačane produkcije aflatoksina B1.
Nanočesticama izazvana snižena produkcija aflatoksina B1 tijekom uzgoja u tami upućuje na
potencijalnu primjenu nanočestica fulerena ili fulerenola u posliježetvenoj kontroli
kontaminacije aflatoksinom B1. Međutim, povećana produkcija aflatoksina B1 tijekom uzgoja
105
uz izloženost svjetlu u prisutnosti nanočestica upućuje na negativan učinak ispuštanja ovih vrsta
nanočestica u okoliš, i to posebice sa stanovišta moguće interakcije mikotoksikogenih plijesni
i nanočestica fulerena i fulerenola što za posljedicu može imati povećanu kontaminaciju
mikotoksinima.
106
6. ZAKLJUČCI
Na temelju rezultata ove disertacije mogu se donijeti sljedeći zaključci:
1. Porast biomase, produkcija aflatoksina B1 i modulacija oksidativnog stresa plijesni
A. flavus NRRL 3251 tijekom submerznog uzgoja u YES podlozi pri 29°C ovisni su o
prisutnosti svjetla,
2. Izloženost plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom uzgoja VIS svjetlu u režimu 12 sati
svjetlo/12 sati tama dovodi do sniženog porasta biomase, snižene produkcije aflatoksina B1
te sniženja razine oksidativnog stresa u miceliju plijesni u odnosu na uzgoj u tami,
3. Nanočestice fulerena ne pokazuju antifungalni učinak na plijesan A. flavus NRRL 3251 bilo
tijekom uzgoja u tami, bilo tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu u rasponu ispitivanih
koncentracija od 10 do 100 ng mL-1,
4. Nanočestice fulerena pokazuju antiaflatoksikogeni učinak na plijesan A. flavus NRRL 3251
pri koncentracijama nC60 od 10 i 100 ng mL-1 tijekom uzgoja u tami, dok pri uzgoju uz
izloženost svjetlu pokazuju aflatoksikogeni učinak pri koncentracijama od 10 i 50 ng mL-1,
5. Ovisno o primijenjenoj koncentraciji nanočestice fulerena snižavaju razinu oksidativnog
stresa u stanicama plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom uzgoja u tami djelujući
antioksidativno (10 ng mL-1) ili prooksidativno (100 ng mL-1), a prilikom uzgoja uz
izloženost svjetlu pojačavaju razinu oksidativnog stresa djelujući oksidativno
(10 i 50 ng mL-1),
6. Nanočestice fulerenola pokazuju blagi antifungalni učinak na plijesan A. flavus pri
koncentraciji od 1000 ng mL-1 tijekom uzgoja u tami te pri koncentraciji od 100 ng mL-1
tijekom uzgoja uz izloženost svjetlu,
7. Nanočestice fulerenola pokazuju antiaflatoksikogeni učinak na plijesan A. flavus NRRL
3251 prilikom uzgoja u tami, a prilikom uzgoja uz izloženost svjetlu aflatoksikogeni učinak
pri sve tri ispitivane koncentracije (10, 100 i 1000 ng mL-1),
8. Ovisno o primijenjenoj koncentraciji nanočestice fulerenola snižavaju razinu oksidativnog
stresa u stanicama plijesni A. flavus NRRL 3251 tijekom uzgoja u tami djelujući
prooksidativno, a prilikom uzgoja uz izloženost svjetlu pojačavaju razinu oksidativnog
stresa djelujući oksidativno,
107
9. Nanočesticama izazvana snižena produkcija aflatoksina B1 tijekom uzgoja plijesni u tami
upućuje na potencijalnu primjenu nanočestica fulerena ili fulerenola u posliježetvenoj
kontroli kontaminacije aflatoksinom B1,
10. Nanočesticama izazvana povećana produkcija aflatoksina B1 tijekom uzgoja uz izloženost
svjetlu upućuje na negativan učinak ispuštanja nanočestica fulerena i fulerenola u okoliš.
108
7. LITERATURA
Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods in enzymology. 105, 121-126.
Amaike, S., Keller, N. P. (2011) Aspergillus flavus. Annu. Rev. Phytopathol. 49, 107-133.
Angelova, M. B., Pashova, S. B., Spasova, B. K., Vassilev, S. V., Slokoska, L. S. (2005)
Oxidative stress response of filamentous fungi induced by hydrogen peroxide and parquet.
Mycol Res. 109, 150-158.
Aoshima, H., Kokubo, K., Shirakawa, S., Ito, M., Yamana, S., Oshima, T. (2009) Antimicrobial
activity of fullerenes and their hydroxylated derivatives. Biocontrol Sci. 14, 69-72.
Avanasi, R., Jackson, W. A., Sherwin, B., Mudge, J. F., Anderson, T. A. (2014) C60 fullerenes
soil sorption, biodegradation and plant uptake. Environ. Sci. Technol. 48, 2792-2797.
Aziz, N. H., Moussa, L. A. (1997) Influence of white light, near-UV irradiation and other
environmental conditions on production of aflatoxin B1 by Aspergillus flavus and ochratoxin
A by Aspergillus ochraceus. Nahrung 41, 150-154.
Baati, T., Bourasset, F., Gharbi, N., Njim, L., Abderrabba, M., Kerkeni, A., Szwarc, H.,
Moussa, F. (2012) The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of
[60] fullerene. Biomaterials. 33, 4936-4946.
Badireddy, A. R, Hotze, E. M., Chellam, S., Alvarez, P., Wiesner, M. R. (2007) Inactivation of
bacteriophages via photosensitization of fullerol nanoparticles. Environ. Sci. Technol. 41,
6627-6632.
Bai, Z., Harvey, L.M., McNeil, B. (2003) Oxidative stress in submerged cultures of fungi. Crit.
Rev. Biotechnol. 23, 267-302.
Baidya, S., Duran, R. M., Lohmar, J. M., Harris-Coward P. Y., Cary, J. W., Hong, S-Y., Roze,
L. V., Linz, J. E., Calvo, A. M. (2014) VeA is associated with the response to oxidative stress
in the aflatoxin producer Aspergillus flavus. Eucaryot. Cell. 8, 1095-1103.
Bakry, R., Vallant, R. M., Najam-ul-Haq, M., Rainer, M., Szabo, Z., Huck, C. W., Bonn, G. K.
(2007) Medicinal applications of fullerenes. Int. J. Nanomed. 2, 639-649.
109
Battilani, P., Rossi, V., Giorni, P., Pietri, A., Gualla, A., van der Fels-Klerx, H. J., Booij, C. J.
H., Moretti, A., Logrieco, A., Miglietta, F., Toscano, P., Miraglia, M., De Santis, B., Brera, C.
(2012) Scientific report submitted to EFSA. Modelling, predicting and mapping the emergence
of aflatoxins in cereals in the EU due to climate change. EFSA 2012.
Battilani, P., Toscano, P., Van der Fels-Klerx, H. J., Moretti, A., Camardo Leggieri, M., Brera,
C., Rortais, A., Goumperis, T., Robinson, T. (2016) Aflatoxin B1 contamination in maize in
Europe increases due to climate change. Sci. Rep. 12, 6:24328.
Benn, T. M., Westerhoff, P., Herckes, P. (2011) Detection of fullerenes (C60 and C70) in
commercial cosmetics. Environ. Pollut. 159, 1334-1342.
Bennett, J. W. (2010) An overview of the genus Aspergillus. U: Aspergillus: molecular biology
and genomics (Machida, M., Gomi, K., ured) Caister Academic Press, Norfolk, UK, str. 1-18.
Bok, J. W., Keller, N. P (2004) LaeA, a regulator of secondary metabolism in Aspergillus spp..
Eukaryot. Cell. 3, 527-535.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D., Surampalli, R. Y. (2010) Engineered nanoparticles in
wastewater and wastewater sludge--evidence and impacts. Waste. Manage. 30, 504-520.
Breitenbach, M., Weber, M., Rinnenthaler, M., Karl, T., Koller-Breinenbach, L. (2015)
Oxidative stress in fungi: its function in signal transduction, interaction with plant hosts, and
lignocellulose degradation. Biomolecules 5, 318-342.
Brendt, C., Lillig, C. H., Holmgren, A. (2008) Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of
protein folding. Biochim. Biophys. Acta. 1873, 641-650.
Calvo, A. M., Cary, J. W. (2016) Association of fungal secondary metabolism and sclerotial
biology. Front. Microbiol. 6, 1-16.
Chanda, A., Roze, L.V., Kang, S., Artymovich, K. A., Hicks, G. R., Raikhel, N. V., Calvo, A.
M., Linz, J. E. (2009) A key role for vesicles in fungal secondary metabolism. P. Natl. Acad.
Sci. USA. 106, 19533-19538.
Chanda, A., Roze, L. V., Linz, J. E. (2010) A possible role for exocytosis in aflatoxin export in
Aspergillus parasiticus. Eukaryot. Cell 9, 1724-1727.
110
Chen, R., Ratnikova, T. A., Stone, M. B., Lin, S., Lard, M., Huang, G., Hudson, J. S, Ke, P. C.
(2010) Differential uptake of carbon nanoparticles by plant and mammalian cells. Small. 6,
612-617.
Chen, Z., Westerhoff, P., Herckes, P. (2008) Quantification of C60 fullerene concentrations in
water. Environ. Toxicol. Chem. 27, 1852-1859.
Cleveland, T. E., Yu, J., Fedorova, N., Bhatnagar, D., Payne, G.A., Nierman, W. C., Bennett,
J. W. (2009) Potential of Aspergillus flavus genomics for applications in biotechnology. Trends.
Biotechnol. 27, 151-157.
Coley-Smith, J. R., Cook, R. C. (1971) Survival and germination of fungal sclerotia. Annu. Rev.
Phytopathol. 9, 65-92.
Cox, R. J. (2007) Polyketides, proteins and genes in fungi: programmed nano-machines begin
to reveal their secrets. Org. Biomol. Chem. 5, 2010-2026.
Daly, T. K., Buseck, P. R., Williams, P., Lewis, C. F. (1993) Fullerenes from a fulgurite. Science
259, 1599-601.
de Bekker, C., Jerre van Veluw G., Ad Wiebenga, A. V. L., Wösten, H. A. B. (2011)
Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ.
Microb. 2, 1263-1267.
Dickinson, B. C., Chang, J. C. (2011) Chemistry and biology of reactive oxygen species in
signaling or stress responses. Nat. Chem. Biol. 7, 504-511
Dinesh, R., Anandaraj, M., Srinivassan, V., Hamza, S. (2012) Engineered nanoparticles in the
soil and their potential implications to microbial activity. Geoderma 173-174, 19-27.
Duraković S, Duraković L (2000) Specijalna mikrobiologija. 1. izd., Durieux, Zagreb.
Esworthy, R. S., Chu, F. F., Doroshow, J. H. (2005) Chapter 7(7.1.1.-7.1.32.). U: Current
protocols in Toxycology (Morgan, K., ured.), John Wiley & Sons, New York.
Farré, M., Pérez, S., Gajda-Schrantz, K., Osorio, V., Kantiani, L., Ginebreda, A., Barceló, D.
(2010) First determination of C60 and C70 fullerenes and Nmethylfulleropyrrolidine C60 on the
suspended material of wastewater effluents by liquid chromatography hybrid quadrupole linear
ion trap tandem mass spectrometry. J. Hydrol. 383, 44-51.
111
Foley, S., Crowley, C., Smaihi, M., Bonfils, C., Erlanger, B. F., Seta, P., Larroque, C. (2002)
Cellular localisation of a water-soluble fullerene derivative. Biochem. Biophys. Res. Commun.
294, 116–119.
Foote, C. S. (1991) Definition of type-I and type-II photosensitized oxidation. Photochem.
Photobiol. 54, 659-659.
Fortner, J. D., Lyon, D. Y., Sayes, C. M., Boyd, A.M., Falkner, J. C., Hotze, E. M., Alemany,
L. B., Tao, Y. J., Guo, W., Ausman, K. D., Colvin, V. L., Huges, J. B. (2005) C60 in water:
Nanocrystal formation and microbial response. Environ. Sci. Technol. 39, 4307-4316.
Fountain, J. C., Scully, B.T., Chen, Z.-Y., Gold, S. E., Glenn, A. E., Abbas, H. K., Lee, R. D.,
Kamerait R. C., Guo, B. (2015) Effects of Hydrogen Peroxide on Different Toxigenic and
Atoxigenic Isolates of Aspergillus flavus. Toxins 7, 2985-2999.
Fountain, J. C., Bajaj, P., Pandey, M., Nayak, S. N., Yhang, L., Kumar, V., Jayale, A. S.,
Chitikineni, A., Zhuang, W., Scully, B. T., Lee, R. D., Kamerait, R. C., Varshney, R. K., Guo,
B. (2016) Oxidative stress and carbon metabolism influence Aspergillus flavus transcriptome
composition and secondary metabolite production. Sci. Rep-Uk. 6, 38747.
Foyer, C. H., Noctor, G. (2005) Redox homeostasis and antioxidant signaling: a metabolic
interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17, 1866-1875.
Free, S. J. (2013) Fungal cell wall organization and biosynthesis. Adv. Genet. 81, 34-82.
Fridovich, I. (1998) Oxygen toxicity: a radical explanation. J. Exp. Biol. 201, 1203-1209.
Frisvad, J.C., Frank, J.M., Houbraken, J. A. M. P., Kuijpers, A. F. A., Samson, R. A. (2004)
New ochratoxin A producing species of Aspergillus section Circumdati. Stud. Mycol. 50,
23-43.
Fuller, K. K., Ringelberg, C. S., Loros, J. J., Dunlap, C. J. (2013) The fungal pathogen
Aspergillus fumigatus regulates growth, metabolism, and stress resistance in response to light.
mBio 4, 142-13.
Gabriel, F., Accoceberry, I., Bessoule, J-J., Salin, B., Lucas-Guérin, M., Manon, S.,
Dementhon, K., Noël, T. (2014) A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists
both in peroxisomes and mitochondria of the Ascomycete yeast Candida lusitaniae. Plos One.
9, e114531
112
Gao, J., Wang, Y., Folta, K. M., Krishna, V., Bai, W., Indeglia, P., Georgieva, A., Nakamura,
H., Koopman, B., Moudgil, B. (2011) Polyhydroxy fullerenes (fullerols or fullerenols):
Beneficial effects on growth and lifespan in diverse biological models. Plos One. 6, e19976.
Gharbi, N., Pressac, M., Hadchouel, M., Szwarc, H., Wilson, S. R., Moussa, F. (2005)
[60]Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Letters.
5, 2578-2585.
Gibbons, J. G. (2012) The function and evolution of the Aspergillus genome. Doktorska
disertacija. Graduate School of Vanderbilt University, Nashville.
Grebowski, J., Krokosz, A., Puchala, M. (2013) Membrane fluidity and activity of membrane
ATPases in human erythrocytes under the influence of polyhydroxylated fullerene. Biochim.
Biophys. Acta. 1828, 241-248.
Hadduck, A. N., Hindagolla, V., Contreras, A. E., Li, Q., Bakalinsky, A. T. (2010) Does
aqueous fullerene inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae or Escherichia coli? Appl.
Environ. Microb.76, 8239-8242.
Hedayati, M. T., Pasqualotto, A.C., Warn, P. A., Bowyer, P., Denning, D. W. (2007)
Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer. Microbiology 153,
1677-1692.
Herreo, E., Ros, J., Tamarit, J., Belí, G. (2006) Glutaredoxins in fungi. Photosynth. Res. 89,
127-140.
Horn, B. W. (2007) Biodiversity of Aspergillus section Flavi in the United States: A review.
Food. Adit. Contam. 24, 1088-1101.
Hotze, E. M., Labille, J., Alvarez, P., Weisner, M. R. (2008) Mechanisms of photochemistry
and reactive oxygen production by fullerene suspensions in water. Environ. Sci. Technol. 42,
4175-4180.
Huang, F., Ge, L., Zhang, B,, Wang, Y., Tian, H., Zhao, L., He, Y., Zhang, X. (2014) A fullerene
colloidal suspension stimulates the growth and denitrification ability of wastewater treatment
sludge-derived bacteria. Chemosphere 108, 411-417.
Huang, J. Q., Jiang, H. F., Zhou, Y. Q., Lei, Y., Wang, S. Y., Liao, B. S. (2009) Ethylene
inhibited aflatoxin biosynthesis is due to oxidative stress alleviation and related to glutathione
redox state changes in Aspergillus flavus. Int. J. Food. Microbiol. 130, 17-21.
113
Isaacson, C. W., Usenko, C. Y., Tanguay, R. T., Field, J. A. (2007) Quantification of fullerenes
by lc/esi-ms and its application to in vivo toxicity assays. Anal. Chem. 79,
9091-9097.
Isakovic, A. (2006) Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene.
Toxicol. Sci. 91, 173–183.
Jayashree, T., Subramanyam, C. (2000) Oxidative stress a prerequisite for aflatoxin production
by Aspergillus parasiticus. Free. Radic. Biol. Med. 29, 981-985.
Jehlička, J., Ozawa, M., Slanina, Z., Obarsawa, E. (2000) Fullerenes in Solid Bitumens from
Pillow Lavas of Precambrian Age (MÍTOV,Bohemian Massif). Fullerene. Sci. Techn. 8, 449-
452.
Joffe, A. Z., Lisker, N. (1696) Effects of light, temperature, and pH value on aflatoxin
production in vitro. J. Appl. Microbiol. 18, 517-518.
Johnson-Lyles, D. N., Peifley, K., Lockett, S., Neun, B. W., Hansen, M., Clogston, J., Stern, S.
T., McNeil, S. E. (2010) Fullerenol cytotoxicity in kidney cells is associated with cytoskeleton
disruption, autophagic vacuole accumulation, and mitochondrial dysfunction. Toxicol. Appl.
Pharmacol. 248, 249-258.
Kamat, J. P., Devasagayam, T. P. A., Priyadarsini, K. I., Mohan, H., Mittal, J. P. (1998)
Oxidative damage induced by the fullerene C60 on photosensitization in rat liver microsomes.
Chem-Biol. Interact. 114, 145-159.
Kamat, J. P., Devasagayam, T. P. A., Priyadarsini, K. I., Mohan, H. (2000) Reactive oxygen
species mediated membrane damage induced by fullerene derivatives and its possible biological
implications. Toxicology 155, 55-61.
Käsermann, F., Kempf, C. (1997) Photodynamic inactivation of enveloped viruses by
buckminsterfullerene. Antivir. Res. 34, 65-70.
Keller, N. P., Turner, G., Bennett, J. W. (2005) Fungal secondary metabolism - from
biochemistry to genomics. Nat. Rev. Microbiol. 3, 937-947.
Keller, N. P. (2015) Translating biosynthetic gene clusters into fungal armor and weaponry.
Nat. Chem. Biol. 11, 671-677.
Kistler, H. C., Broz, K. (2015) Cellular compartmentalization of secondary metabolism. Front.
Microbiol. 6, 1-11.
114
Klich, M. A. (2007) Aspergillus flavus: The major producer of aflatoxin. Mol. Plant. Pathol.
8,713-722.
Kong, L., Zepp, R. G. (2012) Production and consumption of reactive oxygen species by
fullerenes. Environ. Toxicol. Chem. 31, 136-143.
Korge, P., Calmettes, G., Weiss, J. N. (2015) Increased reactive oxygen species production
during reductive stress: The roles of mitochondrial glutathione and thioredoxin reductases.
Biochim. Biophys. Acta. 1847, 514-525.
Korman, T. P, Crawford, J. M., Labonte, J. W., Newman, A. G., Wong, J., Townsend, C. A.,
Tsai, S-C. (2010) Structure and function of an iterative polyketide synthase thioesterase domain
catalyzing Claisen cyclization in aflatoxin biosynthesis. PNAS 107, 6246-6251.
Krusic, P. J., Wasserman, E., Keizer, P. N., Morton, J. R., Preston, K. F. (1991) Radical
reactions of C60. Science 22, 1183-1185.
Kubatova, H., Zemanova, E., Klouda, K., Bilek, K., Kadukova, J. (2013) Effects of C60
Fullerene and its Derivatives on Selected Microorganisms. J. Microbiol. Res. 3, 152-162.
Li, Q., McNeil, B., Harvey, L. M. (2008) Adaptive response to oxidative stress in the
filamentous fungus Aspergillus niger B1-D. Free. Radical. Bio. Med. 44, 394-402.
Li, Q., Harvey, L. M., McNeil, B. (2009) Oxidative stress in industrial fungi. Crit. Rev.
Biotechnol. 29, 199-213.
Lushchak, V. I., Gospodaryov, D. V. (2005) Catalases protect cellular proteins from oxidative
modification in Saccharomyces cerevisiae. Cell. Biol. Int. 29, 187-192.
Lushchak, V. I. (2011) Adaptive respons to oxidative stress: Bacteria, fungi, plants and animals.
Comp. Biochem. Phys. C. 153, 175-190.
Lushchak, V. I. (2012) Glutathione homeostasis and functions: potential targets for medical
interventions. J. Amino Acids 2012, 736837.
Lyon, D. Y., Adams, L. K., Falkner, J. C., Alvarez, P. J. J. (2006) Antibacterial activity of
fullerene water suspensions: Effects of preparation method and particle size. Environ. Sci.
Technol. 40, 4360-4366.
Lyon, D. Y., Alvarez, P. J. J. (2008a) Fullerene water suspension (nC60) exerts antibacterial
effects via ros-independent protein oxidation. Environ. Sci. Technol. 42, 8127-8132.
115
Lyon, D. Y., Brunet, G. W., Wiesner, M. R., Alvarez, P. J. J. (2008b) Antibacterial activity of
fullerene water suspensions (nC60) is not due to ROS-mediated damage. Nano Letters 8, 1539-
1543.
Maggio-Hall, L. A., Keller, N. P. (2004) Mitochondrial β-oxidation in Aspergillus niger.
Mol. Microbiol. 54, 1173-1185.
Marković, Z., Todorović-Marković, B., Kleut, D., Nikolić, D., Vranješ-Đurić, S., Misirkić, M.,
Vučićević, Lj., Janjetović, K., Isaković, A., Harhaji, Lj., Babić-Stojić, B., Dramičanin, M.,
Trajković, D. (2007) The mechanism of cell-damaging reactive oxygen generation by colloidal
fullerenes. Biomaterials 28, 5437-5448.
Marković, Z., Trajković, V. (2008) Biomedical potential of the reactive oxygen species
generation and quenching by fullerenes (C60). Biomaterials. 29, 3561-3573.
Martin, A. M. (1992) Growth response of the mushroom Agaricus campestris to nitrogen
sources when cultivated in submerged fermentation. U: Food science and human nutrition
(Charlambous, G., urd.), ElsevierScience Publishers B.V., Amsterdam/London/New
York/Tokyo, str. 229-236.
Melezhik, V. A., Filippov, M. M., Romashikin, A. E. (2004) A giant Palaeoproterozoic deposit
of shungite in NW Russia: genesis and practical applications. Ore. Geol. Rev. 24, 135-154.
Mihalitsch, R., Kallinger, C., Verbrant, Y., Veefkind, V., Huebner, S. R. (2008) The fullerene
patent landscape in Europe. NLB 5, 85-94.
Monticelli, L., Salonen, E., Ke, P. C., Vattulainen I. (2009) Effects of carbon nanoparticles on
lipid membranes: a molecular simulation perspective. Soft Matter 5, 4433-4445.
Narasaiah, K. V., Sashidhar, R. B., Subramanyam, C. (2006) Biochemical analysis of oxidative
stress in the production of aflatoxin and its precursor intermediates. Mycopathologia 162, 179-
189.
Oberdörster, E. (2004) Manufactured nanomaterials (Fullerenes, C60) induce oxidative stress in
the brain of juvenile largemouth bass. Environ. Health. Persp. 112, 1058-1062.
Oktyabrsky, O. N., Smirnova, G. V. (2007) Redox regulation of cellular functions.
Biochemistry (Moscow) 72, 132-145.
Osherov, N., May, G. (2000) Conidial germination in Aspergillus nidulans requires RAS
signaling and protein synthesis. Genetics 155, 647-656.
116
Osherov, N., May, G. (2001) The molecular mechanisms of conidial germination. FEMS
Microbiol. Lett. 199, 153-160.
Panina, L. K., Kurochkin, V. E., Bogomolova, E. V., Estrapov, A. A., Spitsyina, N. G (1997)
Biotransforamtion of fullerenes. Doklady Biological Sciences 357, 530-532.
Parku, E-U., Kim, H., Kim, Y., Yi, J., Choi, K., Park, K. (2010) Carbon fullerenes (C60s) can
induce inflammatory responses in the lung of mice. Toxicol. Appl. Pharm. 244, 226–233.
Perkins, A., Nelson, J. K., Parsonage, D., Poole, L. B., Karplus, P. A. (2015) Peroxiredoxins:
guardians against oxidative stress and modulators of peroxide signaling. Trends. Biochem. Sci.
40, 434-445.
Piccinno, F., Gottschalk, F., Seeger, S., Nowack, B. (2012) Industrial production quantities and
uses of ten eingineerd nanomaterials in Europe and the world. J. Nanopart. Res. 14, 1109-9.
Plauth, A., Giekowski, A., Cichon, S., Wowro, S. J., Liedgens, L., Rousseau, M., Weidner, C.,
Fuhr, L., Kliem, M., Jenkins, G., Lotito, S., Wainwright, L. J., Sauer, S. (2016) Hormetic
shifting of redox environment by pro-oxidative resveratrol protects cells against stress. Free
Radical Bio. Med. 99, 608-622.
Poiriuer, Y., Antonenkov, D. V, Glumoff, T., Hiltunen, J. K. (2006) Peroxisomal β-oxidation-
A metabolic pathway with multiple functions. Biochim. Biophys. Acta. 1763, 1413-1426.
Pycke, B. F. G., Chao, T. C., Herckes, P., Westerhoff, P., Halden, R. U. (2012) Beyond nC60:
strategies for identification of transformation products of fullerene oxidation in aquatic and
biological samples. Anal. Bioanal. Chem. 404, 2583-2595.
Qiao, R. (2007) Translocation of C60 and its derivatives across a lipid bilayer. Nano Letters 7,
614-619.
Ratnikova, T. A., Govindan, P. N., Salonen, E., Ke, P. C (2011) In vitro polymerization of
microtubules with fullerene derivative. ACS Nano 5, 6306-6314.
Rauscher, H., Roebben, G., Boix Sanfeliu, A., Emons H., Gibson, P., Koeber, R., Lisinger, T.,
Rasmussen, K., Riego Sintes, J., Sokull-Kluettgen, B., Stamm, H. (2015) Towards a review of
the EC Recommendation for a definition of the term "nanomaterial", Part 3: Scientific-technical
evaluation of options to clarify the definition and to facilitate its implementation. EUR -
Scientific and Technical Research Reports, Italija
117
Reverberi, M., Fabbri, A. A., Zjalić, S., Ricelli, A., Punelli, F., Fanelli, C. (2005) Antioxidant
enzymes stimulation in Aspergillus parasiticus by Lentinula edodes inhibits aflatoxin
production. Applied Microbial and Cell Physiology. 69, 207-215.
Reverberi, M., Zjalic, S., Ricelli, A., Punelli, F., Camera, E., Fabbri, C., Picardo, M., Fanelli,
C., Fabbri, A. A. (2008) Modulation of antioxidant defense in Aspergillus parasiticus is
involved in aflatoxin biosynthesis: a role for the ApyapA gene. Eukaryot. Cell. 7, 988-1000.
Reverberi, M., Ricelli, A., Zjalic, S., Fabbri, A. A., Fanelli, C. (2010) Natural functions of
mycotoxins and control of their biosynthesis in fungi. Appl. Microbiol. Biot. 87, 899-911.
Reverberi, M., Punelli, M., Smith, C. A., Zjalić, S., Scarpari, M., Scala, V., Cardinali, G.,
Aspite, N., Pinzari, F., Payne, G. A., Fabbri, A. A., Fanelli, C. (2012) How peroxisomes affect
aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus. Plos One. 7, e48097.
Riquelme, M., Yarden, O., Bartnicki-Garcia, S., Bowman, B., Castro-Longoria, E., Free, S. J.,
Fleissner, A., Freitag, M., Lew, R. R., Mourino-Perez, R., Plamann, M., Rasmussen, C.,
Richthammer, C., Roberson, R. W., Sanchez-Leon, E., Seiler, S., Watters, M. K. (2011)
Architecture and development of the Neurospora crassa hypha - a model cell for polarized
growth. Fungal Biology. 115, 446-474.
Ritter, A. C., Hoeltz, M., Noll, I. B. (2011) Toxigenic potential of Aspergillus flavus tested in
different culture conditions. Ciênc. Tecnol. Aliment. 31, 623-628.
Roze L. V., Chanda, A., Linz, J. E. (2011) Compartmentalization and molecular traffic in
secondary metabolism: a new understanding of established cellular processes. Fungal. Genet.
Biol. 48, 35-48.
Roze, L., Hong, S-Y., Linz, J. E. (2013) Aflatoxin biosynthesis: current frontiers. Annu Rev
Food Sci T. 4, 293-311.
Sanchís, J., Berrojalbiz, N., Caballero, G., Dachs, J., Farré, M., Barceló, D. (2012) Occurrence
of aerosol-bound fullerenes in the Mediterranean sea atmosphere. Environ. Sci. Technol. 46,
1335–1343.
Sanchís, J., Božović, D., Al-Harbi, N. A., Silva, L. F., Farré, M., Barceló, D. (2013)
Quantitative trace analysis of fullerenes in river sediment from Spain and soils from Saudi
Arabia. Anal. Bioanal. Chem. 405, 5915-5923.
118
Sayes, C. M., Fortner, J. D., Guo, W., Lyon, D., Boyd, A. M., Ausman, K. D., Tao, Y. J.,
Shitaraman, B., Wilson, L. J., Hughes, J. B., West, J. L., Colvin, V. L. (2004) The differential
cytotoxicity of water-soluble fullerenes. Nano Letters 4, 1881-1887.
Schreiner, K. M., Filley, T. R., Blanchette, R. A., Bowen, B. B., Bolskar, R. D., Hockaday, W.
C., Masiello, C. A., Raebiger, J. W. (2009) White-rot basidiomycete-bediated decomposition
of C60 fullerol. Environ. Sci. Technol. 43, 3162-3168.
Science for Environment Policy (2012) European Commission DG environment news alert
service. SCU, The University of the West of England, Bristol.
Senft, A. P., Dalton, T. P., Shertzer, H. G. (2000) Determining glutathione and glutathione
disulfide using the fluorescence probe o-phthalaldehyde. Anal. Biochem. 280, 80-86.
Sporty, J. L., Kabir, M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Bench, G. (2008) Single sample
extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces
cerevisiae. J. Sep. Sci. 31, 3202–3211.
Sweeney, M. J., Dobson, A. D. W (1998) Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and
Penicillium species. Int. J. Food. Microbiol. 43,141-158.
Šarkanj, B. (2014) Utjecaj inhibitora glutation S – transferaze na produkciju aflatoksina plijesni
Aspergillus flavus. Disertacija. Prehrambeno-tehnološki fakultet, Osijek.
Talbot, C. (1999) Fullerene and nanotube chemistry: an update. School Science Review 81,
37-48.
Tariq, V. (2013) Structure of hyphae. British Mycological Society
<http://www.fungionline.org.uk/3hyphae/1hypha_ultra.html> . Pristupljeno 12. svibnja 2013.
Thön, M., Al-Abdallah, Q., Hortschansky, P., Brakhage, A. A. (2007) The thioredoxin system
of the filamentous Aspergillus nidulans. J. Biol. Chem. 282,
27529-27269.
Unković, N., Ljaljević Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Janković, V., Jović, D., Đorđević,
A. (2015) Aspergilli response to benzalkonium chloride and novel-synthesized fullerenol /
benzalkonium chloride nanocomposite. The Scientific World Journal 2015, Article ID 109262.
Usenko, C. Y., Harper, S. L., Tanguay, R. L. (2008) Fullerene C60 exposure elicits an oxidative
stress response in embryonic zebrafish. Toxicol. Appl. Pharm. 229, 44-55.
119
Varga, J., Frisvad, J. C., Samson, R. A. (2009) A reappraisal of fungi producing aflatoxins.
World. Mycotoxin. J. 2, 263-277.
Varga, J., Frisvad, J. C., Samson, R. A. (2011) Two new aflatoxin producing species, and an
overview of Aspergillus section Flavi. Stud. Mycol. 69, 57-80.
Villamena, F. A. (2013) Molecular basis of oxidative stress. 1. izd., John Wiley & Sons, New
Jersey.
Winterbourn, C. C. (2008) Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.
Nat. Chem. Biol. 4, 278-286.
Wösten, H. A. B., van Veluw, G. J., de Bekker, C., Krijgsheld, P.(2013) Heterogeneity in the
mycelium: implications for the use of fungi as cell factories. Biotechnol. Lett. 35,1155-1164.
Yabe, K., Nakajima, H. (2004) Enzyme reactions and genes in aflatoxin biosynthesis. Appl.
Microbiol. Biot. 64, 745-755.
Yamakoshi, Y., Umezawa, N., Ryu, A., Arakane, K., Miyata, N., Goda, Y., Masumizu, T.,
Nagano, T. (2003) Active oxygen species generated from photoexcited fullerene (C60) as
potential medicines: O2·- versus 1O2. J. Am. Chem. Soc. 125, 12803-12809.
Yin, W., Keller, N.P. (2011) Transcriptional regulatory elements in fungal secondary
metabolism. J. Microbiol. 49, 329-339.
Yu. J. (2012) Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in
reducing aflatoxin contamination. Toxins 4, 1024-1057.
120
ŽIVOTOPIS Tihomir Kovač je rođen 29. srpnja 1986. u Pakracu. Maturirao je 2005. u Srednjoj školi „August
Šenoa“ u Garešnici, a zatim je upisao Prehrambeno–tehnološki fakultet u Osijeku.
Preddiplomski studij Prehrambena tehnologija završava 2008. godine, a diplomski studij
Procesno inženjerstvo 2010. godine kao prvi student po programu Bolonjskog procesa i prvi
student u generaciji. Tijekom studija dobitnik je stipendije Sveučilišta Josipa Jurja
Strossmayera u Osijeku, a potom stipendije Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa
(kategorija C). Bio je predsjednik Studentskog zbora Prehrambeno-tehnološkog fakulteta
Osijek od travnja 2008. do lipnja 2010. godine. Po završetku studija zapošljava se u mljekarskoj
industriji Novi Domil d.o.o. (članica poslovnog sustava Vindija) u Županji gdje kao kemijski
analitičar/tehnolog u proizvodnji radi od 13.9.2010. do 12.7.2011. Kao odgovorna osoba za rad
s opasnim kemikalijama zaposlen je od 13.7.2011. do 31.12.2011. u tvrtki Kontrolkem d.o.o. u
Samoboru. Na Prehrambeno–tehnološkom fakultetu Osijeku od 1.1.2012. zaposlen je kao
asistent. U suradničkom zvanju asistenta sudjeluje u izvođenju kolegija Biokemija na
preddiplomskom studiju Prehrambena tehnologija te kolegija Interakcija hrane i gena na
diplomskom studiju Znanost o hrani i nutricionizam. Sveučilišni poslijediplomski doktorski
studij Biotehnologija i bioprocesno inženjerstvo na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu
Sveučilišta u Zagrebu upisao je 2012. godine. Temu doktorskog rada pod naslovom
„Modulacija oksidativnog stresa plijesni Aspergillus flavus nanočesticama fulerena“ Senat
Sveučilišta u Zagrebu prihvaća 2015. godine. Tihomir Kovač je kao suradnik sudjelovao na
projektima „Utjecaj fulerena na inhibiciju sinteze aflatoksina“ (Sveučilište Josipa Jurja
Strossmayera u Osijeku) 2013-2014. i „Antiaflatoksikogeni učinak flavonoida kvercetina“
(Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku) 2015-2016 godine. Dobitnik je FEMS-ove
stipendije za mlade znanstvenike za međunarodni kongres Power of fungi (2015.). U okviru
programa mobilnosti ERASMUS+ znanstveno se usavršavao na Odjelu za agrobiotehnologiju,
Centru za analitičku kemiju, IFA-Tulln na Sveučilištu BOKU u Austriji, u razdoblju od 20.7.
do 21.8.2015. godine. Član je Hrvatskog društva za biokemiju i molekularnu biologiju,
Hrvatskog mikrobiološkog društva, Hrvatskog toksikološkog društva, Udruge TehnOS -
Udruga bivših studenata i prijatelja Prehrambeno-tehnološkog fakulteta Osijek te lovačkog
društva “Srnjak”, Garešnica.
121
Popis objavljenih radova
Objavljeni radovi iz grupe A1:
1. Kovač, T., Šarkanj, B., Klapec, T., Borišev, I., Kovač, M., Nevistić, A., Strelec, I. (2017)
Fullerol C60(OH)24 nanoparticles and mycotoxigenic fungi: A preliminary
investigation into modulation of mycotoxin production. Environ. Sci. Pollut. R. (xx),
1-9. doi: 10.1007/s11356-017-9214-z (prihvaćen za objavljivanja)
2. Kovač, T., Kovač, M., Strelec, I., Nevistić, A., Molnar, M. (2017) Antifungal and
antiaflatoxigenic activities of coumarinyl thiosemicarbazides against Aspergillus flavus
NRRL 3251. Arh. Hig. Rada. Toksikol. 68 (1), 40-46.
3. Molnar, M., Kovač, T., Strelec, I. (2016) Umbelliferone-thiazolidinedione hybrids as
potent mushroom tyrosinase inhibitors. Int. J. Pharm. Res. Allied Sci. 5 (2),
305-310.
Objavljeni radovi iz grupe A3:
1. Kovač, T., Oršolić, D., Sluganović A., Šarkanj B., Strelec, I. (2016) Razbijanje enzimski
tretirane stanične stijenke plijesni Aspergillus flavus NRRL 3251 ultrazvučnom
homogenizacijom. Proceedings & abstract of the 9th International
Scientific/Professional Conference Agriculture in Nature and Environment Protection.
Ur. Šimić, Ivan, Vukovar, Glas Slavonije, 209-214.
2. Šarkanj B., Kovač, T., Kolarić, B., Brodar L., Klapec, T. (2016) Uloga biosinteze
aflatoksina u regulaciji staničnog stresa plijesni Aspergillus flavus. Proceedings &
abstract of the 9th International Scientific/Professional Conference Agriculture in
Nature and Environment Protection. Ur. Šimić, Ivan, Vukovar, Glas Slavonije, 217-
221.
3. Brodar L., Šarkanj B., Soldić, A., Kovač, T., Klapec, T. (2016) Analiza pojavnosti
mikotoksina na površinama zasijanim žitaricama u Republici Hrvatskoj od 2011. do
2015. Proceedings & abstract of the 9th International Scientific/Professional
Conference Agriculture in Nature and Environment Protection. Ur. Šimić, Ivan,
Vukovar, Glas Slavonije, 190-194.
4. Kovač, T., Šarkanj B., Strelec, I. (2015) Primjena ultrazvuka za homogenizaciju
micelija plijesni Aspergillus flavus. Proceedings & abstract of the 8th International
Scientific/Professional Conference Agriculture in Nature and Environment Protection.
Ur. Baban, Mirjana i Rašić, Sanda, Vukovar, Glas Slavonije, 143-148.
