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Parametri NMRAccoppiamento Scalare
Mario PiccioliMagnetic Resonance Center
CERMDepartment of Chemistry
University of Florence, Italy
Ringraziamenti
M.Levitt Spin DynamicsJ. Keeler Understanding NMR Spectroscopy
H.Gunther NMR Spectroscopy
Stefano MammiStefano ChimichiAlessandro BagnoDaniel CiceroPaola Turano
Termini dell’Hamiltoniano di spin
Meccanismi di accoppiamento
La partecipazione degli elettroni cambia il modo in cui l’interazione tra spin é dipendente dalla loro riorientazione
Pertanto, quando in un liquido isotropico le interazioni sono mediate per effetto del moto, rimane un termine isotropico.
Esso fornisce una diretta evidenza spettrale dei legami chimici e pertanto é un prezioso strumento per la determinazione strutturale
Gli effetti di accoppiameno dipolare indiretto sono SOLO INTRAMOLECOLARI
L’effetto é misurabile sono per un limitato numero di legami chimici
Significato fisico della J
Significato fisico della J
Accoppiamento scalare
13C 1H
13C
1H
Accoppiamento scalare
13C 1H
13C
1H
Accoppiamento scalare
1H 13C
S I
α α
β
β
Accoppiamento scalare
Accoppiamento scalare
E= -1/2 γ ħB0= - miνi
mi= - ½ , ½
E
-1/2 νA -1/2 νX
-1/2 νA +1/2 νX
+1/2 νA -1/2 νX
+1/2 νA +1/2 νX
E= -∑i miνi
Due spin isolati
νA
νA
νX
νX
E= -1/2 γ ħB0= - miνi
mi= - ½ , ½
E
-1/2 νA -1/2 νX
-1/2 νA +1/2 νX
+1/2 νA -1/2 νX
+1/2 νA +1/2 νX
E= -∑i miνi +∑ij Jijmimj
Due spin accoppiati
+1/2 νA +1/2 νX +1/4 JAX
+1/2 νA -1/2 νX -1/4 JAX
-1/2 νA +1/2 νX -1/4 JAX
-1/2 νA -1/2 νX +1/4 JAX
νA
νA
νX
νX
νX+ ½ JAX
νX- ½ JAX
νA- ½ JAX
νA+ ½ JAX
Accoppiamento debole
J<<∆ν
Accoppiamento scalare
CH3-CH2-OH
Accoppiamento scalare
2J
3J
3J
2JHβHβ’
3JHαHβ
3JHΝHα
Accoppiamento scalare
1JHC
1JHN
1JCC
n.Spin X Spin A osservato
0 νA
1 νA± ½ JAX
2 νA± ½ JAX ± ½ JAX
3 νA± ½ JAX ± ½ JAX ± ½ JAX
Freq. A osservate
Molteplicità dell’accoppiamento
Molteplicità dell’accoppiamento
Accoppiamento scalare
Accoppiamento scalare
Il segno della costante
A X A XA X
ββββ αααα ββββ αααααααα ββββ αααα ββββ
L’effetto del campo magnetico
Sistemi del 1°ordine
Accoppiamento debole
J<<∆ν
Separazione in frequenza almeno pari a 10*J
Se aumento il campo magnetico, ∆ν aumenta e J rimane costante
Aumentare il campo magnetico semplifica l’analisi dei sistemi di spin
Torneremo dopo sul concetto di accoppiamento forte e accoppiamento debole
Ma intanto ricorda che…Esperimenti in rotating frame (TOCSY, ROESY, DIPSI, sono se mpre in accoppiamento forte)
Gli esperimenti heteronucleari HSQC, HMQC, INEPT di og ni tipo…) sono sempre in accoppiamento debole
Sistema AX
Sistemi di spin A2X3
Combinando insieme accoppiamenti diversi
Sistema AMX
Sistema AMX
Spettri del 2°ordine
Accoppiamento forte significa che l’accoppiamento è forte rispetto alla differenze di energia dei livelli energetici del sistema, che determinano poi le frequenze di transizione
In effetti un accoppiamento tra due spin non cambia di valore, è il resto del sistema che cambia nel passaggio da accoppiamento forte ad accoppiamento debole
νννν1,2,3,41,2,3,41,2,3,41,2,3,4=(ννννA+ννννB)/2 ±D/2 ±J/2 νννν1,21,21,21,2=ννννA ±J/2 νννν3,43,43,43,4=ννννB ±J/2
Spettri del 2°ordine
Sistema AB
J=5Hz
I2/I1=∆ν1,4/∆ν2,3
(2C)2= (νΑ–νΒ)2 +J2
Misure dirette
JAB
2C
Sistema AB
Sistema AB
Sistema AB
From AX2 to AB2
500 MHz
200 MHz
From AX2 to AB2
From AX2 to AB2
Sistema AB2
Sistema AB2
Sistema AB2
Sistema ABX
Sistema ABX
Accoppiamento forte e accoppiamento debole
2 spin
Accoppiamento forte e accoppiamento debole
Accoppiamento debole
Accoppiamento debole
Accoppiamento forte
Accoppiamento forte
Spin Magneticamente Equivalenti
Singlet-triplet basis
Multipletti e larghezza di riga
La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2.
In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata.Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi
In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto.In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili
3-10 Hz
15 HzMW ca. 5000
20-35 HzMW. 10-20000
N
Importante
3J dipendono dall’angolo
diedro
INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE
3JHNHαααα= Acos2φφφφ + B cosφφφφ +C
DeMarco, Llinas, Wutrich, Biopolymers, 1978
Karimi Nejad, Schmidt, Ruterjans, Schwalbe, Grieseinger, Biochemistry, 1994
3J 1Hb-15N
Ogni costante di accoppiamento 3J
sottende un angolo diedro
3J 1Ha-1Hb
Angolo diedro χ1
Schmidt, Blumel, Lohr, Ruterjans, J. Biomol. NMR 1999
Per ogni curva di Karplus i coefficenti sono calcolati in base al confronto tra valori sperimentali e parametri
strutturali e validati con vari strumenti
3J C’C ’
N
13C Direct Detected COCO-TOCSY
a. diedro φφφφ
Accoppiamento scalare rende possibile un trasferimento di magnetizzazione tra i spin accoppiati
Questa proprietà é del tutto indipendente dal fatto che un accoppiamento sia “visibile” o “invisibile” in un esperimento NMR come
Nella maggior parte dei casi gli accoppiamenti scalari sono invisibili, ma misurabili anche in modo quantitativo attraverso NMR multidimensionale
Accoppiamento e Magnetizzazione
Heteronuclear cases
The scheme of 1J scalar couplings
The 2D Hetcor experiment
Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment
2D HETCOR Expriment
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
Seconda dimensione
2D HETCOR Expriment
Prima dimensione
Seconda dimensione
EsempioHETCOR
514
32
1J couplings for backbone resonances
Ca2+
Apo Cb @ 3.3 M GdmCl
Loss of secondary structure elements: unfolded protein
Refolding
Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl
The role of metal cofactor in protein unfolding
Metal triggered protein folding
7795
5935
26
60
45 96 7
33
20
34
27
75
15 6
62
65
9472
90
137812
80
100
8
8846
4286
87
81
8568
102
582
5254 55
71
56 91
29
66
36
328
38101
255898 53
76
1674
8430
21
3969
40
9767
37
41
99 1443
6489
2448
5147
11
23
9357 19
4 10
83
22
1779
HNε1 83
HNδ 28
HNε 32
Apo vs holo protein, mapping the Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ionenvironment of the metal ion
15N
15H
3J NiC’ j
Ma il legame a idrogeno é una interazione elettrostatica?
N
O
C
3J !
Eteronuclei
205Tl in Transferrina2J 205Tl-13C
270-290Hz
Fe3+
o oC
o
Aramini et al. Biochemistry 1994
Utschig, Bryson, O’Halloran, Science 1995
199Hg
Eteronuclei