Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Teknologi IsOIOp dan Radiasi, lax;

PENGUJIAN ISOLA T KLINIK Mycobacterium tuberculosis RESISTENTERHADAP BEBERAPA ANTIBIOTIKA DENGAN METODE REAKSIBERANTAI POLIMERASE /POLYMERASECHAIN REACTION (PCR)

Maria Lina R., Dadang, S., dan F. Suhadi

Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, Batan, Jakarta

ABSTRAK

PENGUJIAN ISOLAT KLINIK Mycobacterium tuberculosi\' RESISTEN TERHADAP BEBERAPAANTIBIOTIKA DENGAN METODE REAKSI BERANTAI POLIMERASE I POLYMERASE CHAINREACTION (PCR) Uji PCR menggunakan 2 pasang primer (Pt8 & Pt9 dan Pt3 & Pt6) untuk mendeteksiDNA 9 isolat bakteri M tuberculosis yang resisten terhadap beberapa macam antibiotika seperti isoniazid,streptomisUl, isoniazid + streptomisin, dan isoniazid + rifampisin, telah dilakukan Teknik PCR dilakukan untukmengamplifIkasi DNA basil ekstraksi sel 9 isolat M. tuberculosis resisten yang sudah dilisiskan. DNA 8 isolatmenunjukkan basil postifyaitu terdapatnya pita DNA pada gel agarosa setelah diampIifIkasi dengan primer Pt8 &Pt9, sedangkan satu isolat resisten memberikan basil negatif (tidak ada pita DNA). AmplifIkasi DNA denganm,enggunakan primer Pt3 & Pt6 memberikan basil positif pada 2 isolat bakteri, sedangkan 7 isolat bakteriresisten yang lain memberikan basil negatif. DNA strain H37Rv yang diamplifikasi dengan primer Pt8 & Pt9maupun primer Pt3 & Pt6, juga menunjukkan basil positif. Ukuran fragmen DNA basil amplifikasi denganprimer Pt8 & Pt9 dan primer Pt3 & Pt6 masing-masing adalah 541 dan 188 bp.

ABSTRACT

PCR (pOLYMERASE CHAIN REACTION) ASSAY ON ANTmIOTICS RESISTANTCLINICAL ISOLATES OF Mycobacteriwn tuberculosis To detect the DNA of 9 drug-resistant isolates of M.tuberculosis such as isoniazid, streptomycin, isoniazid + streptomycin, and isoniazid + rifampisin- resistantisolates, the DNA amplification by using PCR assay was carried out after lysing the bacterial cells. Two primerpairs for amplification used were Pt8 & Pt9 and Pt3 & Pt6. The amplified DNA target of 8 drug-resistantisolates and I drug-resistant isolate by means Pt8 & Pt9 primer, gave the positive mId negative results,respectively. Presence of amplified DNA target fragments! bands on agarose gel, showed the positive results andvice versa. PCR process by using Pt3 & Pt6 primer revealed the positive results on 2 drug- resistant isolates,whereas there was no amplified DNA bands from the other 7 isolates. DNA amplification by using either Pt8 &Pt9 or Pt3 & Pt6 primers occured on H37Rv strain DNA. Size of the amplified DNA products with Pt8 & Pt9 andPt3 & Pt6 primers were 541 bp and 188 bp, respectively.

PENDAHULUAN

Saat ini peningkatan kasus tuberkulosis suatupenyakit infeksi disebabkan bakteri Mycobacteriumtuberculo,s'is sejalan denga11 peningkatan kasustuberkulosis yang resisten terlladap a11tibiotika (obat antituberkulosis = oat) klmsusnya di negara berkembang

temasuk Indonesia. Para peneliti memperkirakan :t 50juta orang terinfeksi strain M tuberculosis yang resistenterlladap paling tidak satu macam oat (NCCR, Mei1998), Mini-epiderni penyakit tuberkulosis / tbcdisebabkan strain yang resisten oat ganda pemahdilaporkan terjadi di Amerika Serikat dan penyembuhankasus tersebut dengan pengobatan terbaik l1anyamencapai 20 -40 % , (1). Di Medan pemah dilakukanpenelitian yang menyatakan 96 % penderita mengandungkuman TB resisten terlladap satu atau lebih daTi 4 rll.,1Camobat .yaitu etambutol, rifampisin, isoniazid, da11streptornisin (2). Kegagala11 prograrn pengendalianpenyakit tbc antara lain disebabkan kegagalan terapikasus tuberkulosis yang resisten terlladap oat disampingkelemahan dalam diagnostik (3,4), Penderita yang telahmenerima pengobatan tetapi gagal merespon obat

tersebut, masih dapat menularkan ke penderita lainataupun ke orang yang sedang dalam terapi.

Resistensi terhadap antibiotika (oat) seperti INH/isoniazid, streptomisin, etambutol, rifampisin, dll dapatdisebabkan oleh beberapa lml, antara lain pengobatanyang tidak adekwat, ketidak patuhan berobat, pemakaianobat tunggal pada penderita tbc. Timbulnya resistensiterhadap oat pada M tuberculosis disebabkan mutasirandom pada kromosom bakteri. Proses mutasi tersebutterjadi secara spontan pada strain liar, bahkan terjadinyasebelum kODiak dengan obat (3). Sifat resistensi ini jugadisebabkan karena adanya mutasi gen yang menyandiprotein alan enzim tertentu dalam bakteri tersebut,misalnya terjadinya reistensi terhadap rifampisin karenamutasi gen rpo/3 yang menyandi RNA polimerase subunit /3 (5).

Penggunaan metode PCR (Polymerase ChainReaction) untuk mendeteksi M tuberculosis telahbanyak dikembangkan daD diaplikasikan (6). SekwensDNA target yang diamplifikasi dapat dianalisis denganelektroforesis gel agarosa. Nmnun penggunaan pelacakDNA spesifik yang dilabel antara lain dengan radioisotopr2 P) untuk menghibridisasi produk amplifikasi tersebut

69

Risalah Pertemvan Ilm/3h Penel/lian dan Pengwbangan Teknologi Isolop dan Radiasi. 2{XJO

temyata iebii. sensitif dal. sp":sifik (7,3). Penguji&ndengan kultur pada 11 spesimen penderita tbcmenunjukkan basil negatif sedangkan setelah diujidengan PCR yang dilanjutkan dengan uji hibridisasimenggunakan pelacak yang dilabel dengall 32 P, 9

spesimen daTi jmnlah tersebut menunjukkan basil positif(8).

Penelitian telall dilakukan Ulltuk mengetalluiapakall metode PCR juga dapat digunakan untukmendeteksi isolat M tuberculosis yang resisten terhadapantibiotika (obat anti tuberkulosis).

BAHAN DAN TATA KERJA

tuberculvsls kompieks, masing-rnasiI'g pada pasanganbasa 105 sampai 124 dan 626 sampm 645 (10). Primer 2merupakan pasangan primer Pt3 (5'-GAACGGCTGATGACCAAACf-3') dan Pt6 (5'-ACGT AGGCGAACCCTGCCCA-3'), masing-lnasingterletak pacta pasangan basa 664 sampm 683 dan 832sampai 851 daTi IS 986 (7). DNA sampel sebanyak 100ng (10~) ditmnballkan ke dalam cmnpurnn reaksi PCR(40j.ll) untuk tiap satu reaksi. Sebagai kontrol positifdigunakan DNA M. tuberculosis H37Rv. Campuranreaksi PCR terdiri daTi komponen-komponen sepertipenelitian terdahulu (9) yaitu biller reaksi (10rnM Tris-HCl + 50rnM KCl), 2,0 rnM MgCI2, 0,01 % gelatin,

dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) rnasing-masing 0,2j.lM,primer Pt8 & Pt9 rnasing-rnasing 0,2j.lM, daD I Unit Taqpolimerase. Penggunaan primer Pt3 & Pt9 masing-masing 0,4j.lM dan Taq polimerase yang ditambahkanadalah 2,5 Unit (7). Amplifikasi dilakukan dalam DNAthermocycler (perkin-Elmer) dengan tahap denaturasiselama 1,5 menit pacta suhu 94°C, tahap annealing pactasuhu 65°C selarna 2 menit dan tahap extension 3 menit,suhu 72°C. Banyaknya siklus yang digunakan 40 siklus.

Teknik Elektroforesis Gel Agarosa. Teknik inidigunakan untuk mendeteksi DNA basil amplifikasi.Produk PCR setelah ditambah dengan loading bufferdilnasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Hae III 0X174yang diencerkan daD juga ditambah dengan loadingbuffer dirnasukkan juga ke dalam sumur tersebut sebagaipenanda ukuran molekul DNA (marker). Elektroforesisdilakukan selarna :t 1 jam dengan voltase 100V dalamlarutan biller THE (Tris-Borat-EDT A).

Visualisasi DNA. DNA 113sil amplifikasi yangtelah dielektroforesis divisualisasi dengan mewammDNA dalam gel menggunakan larutao etidium bromida.Dengan menggunakan UV transilluminator, pita DNAakan terlibat daD dapat diketahui ukurannya berdasarkanpenanda ukurnn molekul yang dinyatakan dengan base

pair (bp).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ekstraksi DNA isolat M tuberculosisresisten terbadap beberapa antibiotika dapat dilibat padaTabel I. Konsentrasi DNA dari 9 strain bakteri tersebutbervariasi yaitu berkisar antara 109,5 -556,5 fig/Ill. Halini disebabkan tingkat pertumbuhan strain-strain tersebutberbeda, sehingga mempengaruhi jumlah DNA yangdiekstraksi. Nilai rasio (I.. 260nm / 1..280nm) yangmenunjukkan tingkat kemurnian DNA basil ekstraksi 9strain bakteri tersebut juga bervariasi antara 1,27 -1,50.Nilai rasio 1,8 -1,9 menunjukkan kemurnian DNA basilekstraksi (10). Hasil ekstraksi DNA dalam penelitian inimempunyai nilai rasio di bawah 1,8 menununjukkanadanya kontaminasi dengan protein (II). Kontaminasitersebut kemungkinan daTi protein medium pertumbuhanyang tercampur pada saat penyediaan suspensi selbakteri. Kontaminasi protein daTi medium kecilkemungkinannya apabila menggunakan medium cairuntuk penyediaan suspensi bakteri. KOLK, dkk (10)menggunakan juga kultur cair M tuberculosis dalammedia cair Sauton, Middlebrook 7HII atau Tween

.S'train Bakteri. Dalam penelitian ini digw1akan 9buah strain bakteri M. tuberculosis resisten terhadapbeberapa antibiotika berasal dari penderita tuberkuIosisyang diperoleh dari rumah sakit Persa11abatan. Strainyang resisten terhadap isoniazid / INH berjumlah 4sampel (isolat I a, I b, I c, I d), resisten streptomisin satusampel (isolat S), resisten isoniazid + streptomisin satusampel (isolat I + S), dan resisten isoniazid + rifampisin3 sampel (isolat IR.I, IR.2, IR.3). Metode untukmenentukan resistensi yang digunakan adalah modifiedabsolute concentration (konsentrasi absolut yangdimodifikasi). Strain bakteri resisten tersebut kemudianditmnbuhkan dalmn medimn Lowenstein Jensen, SuI1U

c./37°C selanla :t I bulml.Persiapan DNA Bakteri .DNA yang dipersiapkan

untuk proses PCR dilakukan dengan metode fenol-kloroform sesuai dengan penelitian terdalluIu (9). Secarasingkat dapat dijelaskan sebagai berikut, DNA diisolasidari kuIt11f bakteri dalmn medium agar miringLowenstein Jensen. Sel bakterr dari agar miring dibuatsuspensi dengan menambal1kcw larutan NaCI 0,9 %,dipanaskan pada SuI1U 90°C untuk mematikan sel.Suspensi disentriftlgasi, dicuci, dan dibuat pelet. reletbakteri diresuspensikan dengan biller TE (Tris-EDT NEthylene Diamine Tetra Acetic) ditaInbah denganlisosim, proteinase-K dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)untuk melisiskan sel. Larutan fenol-kloroform-isoamilalkohol (24 : I) kemudian ditambal1kan denganvolume smna, disentrifugasi, dan diperoleh rase air yangmengandlmg DNA. DNA diendapkan denganmenambal1kcw larutan NaC.\ 5M dan etanol absolutdingin (-20°C). relet DNA didapatkan denganmensentrifugasi suspensi tersebut dengan kecepatan13.000 rpm, SuI1U -10°C.

Penentuan Kon.~entrasi don Tingkat KemurnianDNA. relet DNA disuspensikan dengan biller TE pH 8,0.Suspensi DNA tersebut dibuat pengenceran, kemudianditentukan konsentrasi dan kemurnian DNA basilekstraksi, dengan menggulli'lkan spektrofotometer padc1A (panjang gelombang) 260 run dan 280 nm.

Amplifikasi DNA. DNA M. tuberculosis resistenantibiotika diamplifikasi dengan teknik PCRmenggunakan 2 nlacam primer. Primer I adalahpasangan primer Pt8 (5' -

GTGCGGA TGGTCGCAGAGA T -3') dan Pt9(CTGGATGCCCTCACGGTTCA-3') yang terletakdalam sekwens sisipan (IS6110) genom bakteri M

70

RiSillah Pertemuan Ilmiah Penell~ian dan pengembangan Teknologi Isolop dan Radias~ ZOOO

ribosomal S 12 dan gen rrs yang menyandi 16rRNA,terdapat pada j: 80 % strain M tuberculosis resistenstreptomisin. (16). Strain resisten rifampisin (:t 95%)mengalami mutasi pada daerah spesifik dari gen rpopyang menyandi RNA polimerase sub unit P (17).Mekanisme utarna resistensi obat anti tuberkolosis gandaadalah akumulasi perubahan dalam gen yang menyandisasaran obat dalam sel (5). Dalam penelitian ini, lokasisekwens DNA target dengan menggunakan primer Pt8 &Pt9 maupun Pt3 & Pt6 adalah pada sekwens sisipan(IS6110 & IS986) dari genom M tuberculosis. Jadi tidakpada gen yang menyandi sasaran obat dalam genomtersebut. Namun, DNA beberapa isolat tidak dapatdiamplifikasi seperti satu isolat resisten isoniazid +rifampisin dengan menggunakan primer Pt8 & Pt9 dan 7isolat dengan menggunakan primer Pt3 & Pt6. Hal inimungkin disebabkan adanya mekanisme resistensi laindalam genom bakteri yang resisteD tersebut. Berdasarkanpenelitian MORRIS (5), gen rrs dan rpsL pada 27 %isolat resisteD streptomisin, tidak mengalami mutasidemikian juta 17 isolat resisteD isoniazid daTi 42 isolattidak mengalami perubahan pada gen katG atau inhA.

Apabila dibandingkan uji PCR menggunakanprimer Pt8 & Pt9 dan PtJ & Pt6, temyata primer Pt8 &Pt9 lebih sensitif. Sekwens DNA sasaran untuk primerPt8 & Pt9 kemungkinan terdapat lebih banyak dalamgenom isolate yang digunakan dalam penelitian ini,daripada sekwens untuk Pt3 & Pt6. Penggunaan primerPt3 & Pt6 akan lebih sensitif daD spesifik untuk deteksiM. tuberculosis apabila digunakan sebagai primer ke 2untuk mengamplifikasi DNA basil PCR dengan primerINS 1 & INS2 pada nested PCR (7)

albumin lmulk ekstraksi DNAnya dan memberikantingkat kemurnian yang baik. Namun. Imsil pcnclitianterdahulu (12) dengan menggunakan medium padat yangsarna dengan penelitian ini, menunjukkan tingkatkemumian DNA Ai. tuberculosi.s- H37Rv sebagai strainstandar cukup baik (nilai rasio 260 mn/ 280 nm = 1,9).Pernbalmn pada sel bakteri yang resisteD terbadapantibiotika, mungkin juga dapat mempengaruiu DNAbasil ekstraksinya. Menurut MORRIS (5) M. tuberculosisresisteD streptomisin mengalalni pernbalmn padaselubung illuding selnya yang menyebabkanpenneabilitasnya menunm, kemungkilmn akanmempengarnlli ekstraksi pada DNA nya.

Hasil amplifikasi DNA 9 isolat strain Mtuberculosis resisten terbadap beberapa antibiotikamenggunakan primer Pt8 & Pt9 yang dianalisis denganteknik elektroforesis gel agarosa, dapat dilihat padaGambar 1 dan 2. Dari gambar tersebut dapat dilihat 8isolat dari 9 isolat resisteD antibiotika,menunjukkan basilpositif demikian juga strain H37Rv. Adanya fragmen/pitaDNA pada gel agarosa dari 4 isolat resisteD isoniazid(Gambar 1 lajur 3, 5, 8, daD Gambar 2, lajur 2 ), saulisolat resisteD streptomisin dan I isolat resisteD isoniazid+ streptomisin IMsing-masing pada Gambar 2 lajur 3 daD

lajur 6, menlmjukk.:wlmsil positif. DNA 2 isolat bakteriresisteD isoniazid + rifampisin yang diamplifikasi dengan

pasangan primer tersebut, juga menunjukkan Imsil positif(Gambar I, lajur 4 dan 7). Junllah DNA isolat dan strainH37Rv yang diamplifikasi masing-masing adalah 100 ngdaD 10 ng. Fragmen DNA tersebut mempunyai ukuran541 bp. Pada Gambar 2 lajur 5 juga terlibat Imsil negatif(tidak adanya pita DNA) dari satu isolat resisteDisoniazid + rifampisin (IR3). Hal ini mungkin disebabkanadanya pernbahan sekwens DNA pada daeral1/ lokasisasaran primer Pt8 & Pt9 yang terletak pacta sekwenssisipan (IS 6110) daTi isolat tersebut. Jmnlall kopi IS6110dalam genom isolat resisten tersebut juga sangatmempengarnhi DNA Imsil mnplifikasi. Beberapa strainbakteri M tuberculosis hanya mempunyai 1 kopi IS61 10ballkan acta strain yang tidak mempunyai kopi tersebut..(13).

KESIMPULAN

Deteksi M. tuberculosis resistent terhadapbeberapa antibiotika (obat anti tuberkulosis) dengan PCRmenggunakan primer Pt8 & Pt9, lebih sensitif dibandingdengan primer Pt3 & Pt6. Jadi uji PCR dengan primerPt8 & Pt9 dapat dipakai untuk mengetahui adanyabakteri resisteD tersebut.

Uji PCR dengan menggunakan primer yangdidisain dari gen yang menyandi protein / enzim yangmenjadi sasaran obat anti tuberkulosis (oat), yangdilanjutkan dengan teknik biologi molekuler yang lainseperti sekwensing dapat mendeteksi resistensi M.tuberculosis terltadap oat, sehingga dapat diberikan terapiyang tepat.

U CAP AN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terilna kasih kepada Sdr.Almaida, Sdr. Suheni, dan Sdr. Rika Heryani atasbantuan yang diberikan, sehingga penelitian dapatterlaksana dengan baik.

Analisis DNA produk PCR yang dimplifikasimenggunakan primer PtJ & Pt6 diperlibatkan padaGambar 3 dan 4. Gmnbar tersebut menunjukkan di antara9 isolat M tuberculo..,is yang resisteD pada antibiotika,Imnya terdap.'lt 2 isolat memberikan Imsil positif yaituisolat resisteD isoniazid (I.a) daD isolat resisteD isoniazid+ rifampisin (IR. I). Fragmen DNA 2 isolat tersebutterdapat pada lajur 3 daD 6 gel agarosa (Gambar 3) DNAstrain standar H37Rv Imsil amplifikasi sebagai kontrolpositif juga memberikan basil positif. Jumlah DNA isolatdan strain standar masing-nk'lsing adalah lOOng danlOng. Fragnlen DNA basil amplifikasi menggunakaJlprimer Pt3 & Pt6 baik untuk isolat maupun strain standaradalah 188bp.

Beberapa peneliti menyatakan resistensi terlmdapobat anti tuberkulosis pada M tuberculosis disebabkanperubahan ataupun mutasi pada gen dalam genombakteri. Perubaltan pada gen katG yang menyandikatalase-peroksidase atau gen inllA yang mengkodeenzim yang terlibat dt'llam biosintesis asam mikolat,menyebabkan terjadinya sifat resistensi terhadapisoniazid (14,15). Mutasi gen rpsl yang menyandi proteiIl

DAFTARPUSTAKA

1 KOENTJAHJA. Tempi tuberkulosis pada pengidapHIV. Kumpulan Naskah Ilmiah Tuberkulosis

71

Hisalah Pet1emtJan Ilmiah Penelil/an dan Pengembangan Teknologi IsOlop dan Had/asi, 2(xx)

Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. PertemuanIlmiah Nasional Tuberkulosis, SumSel .Jambi(1997).

10. KOLK, A.H.J., KOx, L.F.F., van LEEUWEN. J.,and KlliJPER, S. Polymerase chain reaction forthe M tuberculosis complex. Laboratory ofTropical Hygiene, Department of BiomedicalResearch Royal Tropical Institute, AInsterdam,The Netherlands (1995) 1-35.

2. AZHAR. T..KELIAT. E.N. Resistensi Mtuberculosis terltadap obat anti tuberkulosispacta penderita tuberkulosis pam yang telahmengalalni pengobatan. Maj. Kedokt. Indon. .4Q(1996) 242 -247.

11. SAMBROK, J., FRITSCH, E.F., and MANIATIS,T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2 nd

edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York (1989) E.5.3. WINARIANI,K. Pedoman penanganan tuberkulosis

pam dengan reseistensi multi obat (MDR- TB).Kumpulan Naskah Ilmiall TuberkulosisPerhimpunan Dokter Paru Indonesia. PertemuanIlrniall Nasional Tuberkulosis, SwnSel -JaJnbi(1997).

12. LINA,M.R. Deteksi Mycobacterium tuberculosisdengan reaksi berantai polimerasa / PolymeraseChain Reaction (PCR). Tesis Magister. ProgramPascasarjana Bidang IImu Kesehatan, ProgramStudi IImu Biomedik, KekhususanMikrobiologi, Universitas Indonesia, Jakarta(1998) 32-46.

4. 5TYBLO,K. Overview and epidemiologic assesmentof the current global tuberculosis situation withan emphasis on control in developing countries.Rev. Infect. Dis. II (52) (1989) 339 -346. SOLINGEN, D., de HAAS, P.E. W.,

HERMANS, P.W.H., GROENEN, P.M.A., andvan EMBDEN, J.D.A. Comparison of variousrepetitive DNA elements as genetic markers forstrain differentiation and epidemiology ofMycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol.1(1993) 1987-1995.

13. van

5. MORRIS, S., HAN BAI,G., SUFFYS, P.,PORTILLO-GOMEZ, L., FAIRCHOK,M., andROUSE, D. Molecular mechanisms of multipledrug resistance in clinical isolates ofMycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. ill(1995) 954 -960.

14.

ZHANG, Y., HEYM, B., ALLEN, B., YOUNG, D.,and COLE, S. The catalase-peroxidase, geneand isoniazid resistance of Mycobacterriumtuberculosis. Nature 328 (1992) 591 -593

BEAVIS, K.G., LICHTY, M.B., JUNGKIND, D.L.,and GIGER, O. Evaluation of amplicor PCR fordirect detection of A{vcobacterium tuberculosisfrom SputWll specimen. J. Clin. Microbiol. 11(1995) 2582-2586.

6.

15. BANERJEE, A., DUBNAU,E, Quemaid, A.,BALASUBRAMANIAN, V., SUN UM, K.,WILSON, T., COLLINS, D., de LISTE, G.,and JACOBS, Jr. W.R. InhA, a gene encodinga target for isoniazid and ethionamide inAlfycobacterium tuberculosis. Science. ~(1994) 227 -230

KOLK, A.H.J., SCHUITEMA, A.R.J., KUIJPER,S.,van LEEUWEN,J., HERMANS, P. W.M., vanEMBDEN, J.D.A., and HARTSKEERL, R.A.Detection of Mycobacterium tuberculosis inclinical samples by using polymerase chainreaction and a nonradioactive detection system..J. Clin. Microbiol. J.Q 10 (1992) 2567 -2575.

7.

16. KATASUKAWA, C.; TAMARU, A., MIYATA, Y.,ABE, C., MAKINO, M., and SUZUKI, Y.Characterization of the rpsL and rrs genes ofstreptomycin -resistant clinical isolates ofA~ycobacterium tuberculosis in Japan. J. Appl.Microbiol. ~ (1977) 634 -640.

YAP, S.F., CHEN, Y.C., WONG, P.W., alld SOO-HOO, T.S. Application of tIle polymerasechain reaction and moleculer probe technologyfor tIle diagnosis of tuberculosis. InRadionuclides in Molecular Technology forDiagnosis of Communicable Disese.Tharavanyi, S., and Khusrnith, S. (eds).IAEA- Tec. Doc., Vienna, Austria (!994) 93-96.

8.

7. TELENTI, A., IMBODEN, P., MARCHESI, F.,LOWRIE, D., COLE, S.T., COLSTON, M.J.,MATTER, L., SCHOPFER, K., andBODMER, T. Detection of rifampicin-resistance mutants in Mycobacteriumtuberculosis. Lancet ill (1993) 647 -650

LINA, M.R., SUDARMONO, P., IBRAHIM, F., daDSOEBANDRIO, A. Deteksi Mycobacteriumtubercu/osi.., H37Rv dengan reaksi berantaipolimerase (PCR). Maj. Kedokt. Indon. 1

(1999)250-255.

9

72

/I'S.11.1h 1"'~If!nIU.111 i'mi.1h 1'r"f!"";111 d1111'f!lIg""l/lill1q.lIllf!Allologi IsOlop ddll h'd"'~1S'; ?(XX)

Tabcll. Kon~cntra~i dan tin~kat kcmurnian (ra~io ab~orban~i pllda )., 260 nm I )., 2ROnm)DNA basil ckstrak~i isolat AI. tuherculo.\'i.\' rcsi~tcn i~oniazid (I), streptomisin (8),isoniazid + strcptomisin (I+S), dan isoniazid + rifampisin (IR)

Macam Isolaj Kon!icntra!ii DNA

(ng I 1.11)

Ra!iio ab!iorl)al1!ii

(A.260 11m/A. 28011m)

Isolat I.a. 144 1.41

lsolall.b 400,5 1.43

150l<lt I.c IOIJ~ 1.30

IsoIat I.d 181,5 1,33

Isolat S 324 1,50

Isolat I + S 1.40121,5

Isolat JR. I 145,4 1,30

Isolat IR.2 318 1.42

Isolat JR.3 556,5 1,27

34567 II ,23456 It

Gambar Alluli~is DNA prod uk PCR isolulM. luherculu.~i.~ rcsislclI. dclIguIIprimcr PI8 & 1'19 mcIIggullakallclcktrof()rcsis gcl ugurosu

Gumbar 2. Allalisis DNA prouuk PCI~ isoluti\,1. IIlbercltl(J.~is resistel!, uellgm!prilller PIR & PI9 mellggullukm!eleklruloresis gel ugurosu

IAljllr I : Al{II*(~,.0XI74111Iclll

Lujur2: I)Nt\~lrllillll)71{v 1(llIg

(kontrol +)Lajur3: Isolat l.a(IOOng)l.ujur4: l~olulll{.I(I()(hlg)Lajur5: Isolull.h(IO(lIlg)Lajur 6: Kolllrol -(Tanpa DNA)Lajur 7: Isolat IR.2 (1 OOng)Lajur 8: Isolat I.c (I DOng)

IAljur I: Afllli..,.0XI741111t:111

IAljur2: l~olllll.d(I()()lIg)Lajur 3: Isolat S (IOOng)Lajur 4: Kontrol -(tanpa DNA)1.lljurS: I~olnlll{.3 (!(X)lIg)1~!ljur 6: Isolnll + S (IOOlIg)Lajur 8: DNA strain H37Rv lOng

(kontrol +)

73

.-1(,5.11.111 1'l'rll'mu.1l1llml.111 1'l'I1l'ltlh111 d.111I'l'llgl'fllb.1I1gJfI IrAflo!tJgllsOlop all1l':ldl;ISI; 201J0

J4567 8 2 J ..5 6 7 8

Gambar 3. Analisis DNA produk PCI{ isolalM. tuberculosis rcsislcn, dcngmlprimer Pl3 & Pt6 menggunakaneleklro[orcsis gel agarosa

Gmnbar 4. Arullisis I)NA produk Pl-:!{ isolalM. tllberculosis resisten, dellgmlprirnerPt3 & Pt6 rnenggUlillkanelcklro[oresis gel agarosa

Lujur I: fv!a,-ker0XI74fluclllLajur 2: Isolat I + S (IOOllg)Lajur 3: Isolat l.a (I DOng)Lajur 4: Kontrol -(Tanpu DNA)

I_ujur5: DNAstruinl137RviOng(kontrol +)

Lujur 6: Isolulll?.1 (I OOng)Lajur 7: fsolul S (I DOng)1.lljllrR: Isolull.h(I()(}llg)

Lajur I: Alm:k(!r0XI74IJuclllLajur 2: DNA struin HJ7Rv IOllg

(koulrm +)Lajur 3: Koutrol -(tanpa DNA)Lajur4: Isolut l.c(IO(hlg)Laj ur 5: Isola! Il{.2 ( IOOng)Lajur 6: Isola! I.d (I (){)ng)Lajur 8: Isola! IR.3 (I ()()ng)

DISKUSI

NAZL Y HILMY MARIA LINA

Bcrapa lama kcccpalan analisis dcngan PCRdibandingkan dcllgan mclode kollvcnsiollal pada pasicnyang terkontarninasi kwnan TB resisten ?

DclIgml mctodc kollvCIIsiolla1 uji rcsistClIsi 1\/.tuberculosis: uji pcmbiakrul + liji rcsistensi : 2 -4 bulrul.Dengan metode PCR : dilanjutkan dengrul metode RFLPataupull sekwensillg : 2 -3 hari.

74