PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂYgust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26986.pdf · LỜI CAM ĐOAN 7ôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ:

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY

AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC

PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY

AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC

PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ NGÀNH: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. NGUYỄN THANH TRÀ

HÀ NỘI 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích cấu trúc một số

hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt Nam bằng các

phương pháp hóa lý hiện đại” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hƣớng dẫn

của TS.Nguyễn Thanh Trà. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá

nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong

luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình

bày trong luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019

Học viên

Trần Thị Kim Mỵ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thanh Trà – Phòng Hóa

sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt

Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi

hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Để hoàn thành bản luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ

kinh phí của đề tài cấp Viện HLKH & CN Việt Nam thuộc 7 hƣớng ƣu tiên,

MSĐT: VAST 04.03/18.19

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm đào tạo Sau đại học Học Viện

Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH &

CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu

các phƣơng pháp Phổ ứng dụng.

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự

nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu

sót. Rất mong nhận đƣợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019

Học viên

Trần Thị Kim Mỵ

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

CC Column Chromatography Sắc ký cột

TLC Thin layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

IR Infrared Spectrometry Phổ hồng ngoại

MS Mass Spectrometry Phổ khối lƣợng

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

1H-NMR

1H-Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

Proton

13C-NMR

13C-Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocoy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

Carbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer

Tăng cƣờng biến dạng bằng

chuyển phân cực

HPLC High-performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC-MS Liquid Chromatography–Mass

Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

NOESY Nuclear Overhauser

Enhancement Spectroscopy

Phổ tăng cƣờng hạt nhân

IC50 50% Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế 50%

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tƣơng tác hai chiều đồng

hạt nhân

HSQC Heterronuclear Single

Quantum Coherence

Phổ tƣơng tác hai chiều dị hạt

nhân

HMBC Heterronuclear Multiple Bond

Correlation

Phổ tƣơng tác đa liên kết hai

chiều dị nhân

HR-MS High Resolution Mass

Spectroscopy

Phổ khối phân giải cao

δH, - δC Độ chuyển dịch hóa học của

proton và cacbon

https://twitter.com/who

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres................................................ 5

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres ............................................... 7

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres .................................................... 8

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.) ............................................................ 9

Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta) ........................................ 9

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu hái ở Kiên

Giang (Hữu Duyên, 2016) ................................................................................................... 10

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu hái ở Bình

Phƣớc (Ngọc Quang, 2018) ................................................................................................. 11

Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf ............................................................................................... 13

Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng .................................................................. 14

Hình 1.10: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột ........................................................................... 15

Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại Thừa Thiên-Huế .......... 20

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 8 hợp chất phân lập từ thân cây An xoa ............................ 31

Hình 3.2: Phổ MS của hợp chất HH01 ................................................................................ 32

Hình 3.3: Phổ 1H của hợp chất HH01 .................................................................................. 33

Hình 3.4: Phổ 13C của hợp chất HH01 ................................................................................. 33

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất HH01 ............................................................................ 34

Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất HH01 .......................................................................... 34

Hình 3.7: Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH01 ................................................................ 35

Hình 3.8: Phổ MS của hợp chất HH02 ................................................................................ 36

Hình 3.9: Phổ 1H của hợp chất HH02 .................................................................................. 37

Hình 3.10: Phổ 13C của hợp chất HH02 ............................................................................... 37

Hình 3.11: DEPT của hợp chất HH02 ................................................................................. 38

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH02 ................................................................ 38

Hình 3.13: Phổ MS của hợp chất HH03 .............................................................................. 39

Hình 3.14: Phổ 1H của hợp chất HH03 ................................................................................ 40


Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03 .......................................................................... 41

Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH03 ................................................................ 41





Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất HH04 .............................................................................. 44




Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05 .................................................................................... 47

Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06 ................................... 48

Hình 3.28: Phổ 1H-NMR của hợp chất HH06 ..................................................................... 48

Hình 3.29 : Phổ 13

C-NMR của hợp chất HH06 ................................................................... 49

Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HH06 ......................................................................... 49

Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HH06 ........................................................................ 50

Hình 3.32 : Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH06 ............................................................. 50

Hình 3.33: Phổ 1H-NMR của HH07 .................................................................................... 51

Hình 3.34: Phổ 13

C-NMR của HH07 ................................................................................... 52

Hình 3.35: Phổ DEPT của HH07 ......................................................................................... 52

Hình 3.36: Phổ HMBC của HH07 ....................................................................................... 53




Hình 3.40: Phổ DEPT của hợp chất HH08 .......................................................................... 56


Bảng 2.1: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz,

13C: 125 MHz) của hợp chất HH06 và của

chất tham khảo [49] (đo trong CD3OD) ............................................................................... 29

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa ............................................... 22

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc ............................................... 25

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES) ...................................... 3

1.2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES) ......................... 3

1.2.1. Các triterpenoid ................................................................................................. 4

1.2.2. Các coumarin .................................................................................................... 8

1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO

(STERCULIACEAE) .................................................................................................. 8

1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CÁC

HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN .................................................................................... 12

1.4.1. Các phƣơng pháp chiết xuất ............................................................................ 12

1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký ................................................................................. 13

1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc .......... 15

1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy)

................................................................................................................................... 16

1.4.3.2. Phổ khối lƣợng MS (Mass spectrometry) .................................................... 17

1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ...... 17

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 20

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 20

2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................. 20

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 21

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 21

2.3.1. Xử lý mẫu thực vật .......................................................................................... 21

2.3.2. Điều chế các cặn chiết ..................................................................................... 21

2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự

nhiên [35,36] ............................................................................................................. 22

2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa ...................... 24

2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP

ĐƢỢC ....................................................................................................................... 25

2.4.1. Betulin (HH01) ................................................................................................ 25

2.4.2. Axit betulinic (HH02) ..................................................................................... 26

2.4.3. Axit alphitolic (HH03) .................................................................................... 27

2.4.4. Axit oleanolic (HH04)..................................................................................... 27

2.4.5. Hibiscolactone A (HH05) ............................................................................... 28

2.4.6. Heliclactone (HH06) ....................................................................................... 28

2.4.7. Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH07) ............................................................... 29

2.4.8. β-sitostenone (HH08): ..................................................................................... 30

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 31

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH01 (betulin) ................ 31

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH02 (axit betulinic) ...... 35

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH04 (axit oleanolic) ...... 41

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH05 (3, 9 –dihydroxy-

1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide hay hibiscolactone A) .................................... 44

3.6.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH06 (heliclacton) ........... 47

3.7.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH07 (6β-hydroxyenone) 51

3.8. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT HH08 β-

SITOSTENONE ........................................................................................................ 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 58

1

MỞ ĐẦU

Cho tới nay, cây dƣợc liệu vẫn đóng một vai trò quan trọng trong chăm

sóc sức khoẻ con ngƣời. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện

có khoảng 80% dân số thế giới vẫn tin dùng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên,

trong đó chủ yếu từ thực vật [1]. Trên thế giới, từ các thảo dƣợc các nhà khoa

học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới có hoạt tính cao và đƣợc sử dụng rộng rãi

trong việc điều trị bệnh. Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai hoạt chất

Vinblastine và Vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don),

họ Trúc đào (Apocynaceae) và Taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), họ

Thông (Pinaceae). Cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp nhƣ Taxotere từ 10-

deacetyl bacatin III, hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã

chính thức đƣợc sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thƣ.

Việt Nam là quốc gia nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có

hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Trong số này, nguồn tài nguyên cây

làm thuốc chiếm khoảng 30%. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình

nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt nam đã đƣợc thực hiện và đã có

những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.

Những loài thực vật có tác dụng chữa bệnh là nguồn dƣợc liệu quý giá bởi

chúng có khả năng chữa bệnh cho con ngƣời và để lại ít tác dụng phụ hơn các

thuốc có nguồn gốc tổng hợp. Ngày nay, với mối hiểm họa về tình trạng gia

tăng bệnh tật đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, tim mạch…thì việc

nghiên cứu tác dụng làm thuốc của các loài thực vật mang tính ý nghĩa khoa

học và thời sự [2].

Cây An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam

và trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung

nhọt, kiết lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan. Ở nƣớc ta, cây mọc

nhiều ở Bình Phƣớc, ven các sông suối, ngoài ra còn tìm thấy ở Lâm Đồng và

các tỉnh miền núi phía Bắc. Theo y học cổ truyền, từ xa xƣa, cây An xoa đƣợc

xem nhƣ là một bài thuốc gia truyền hỗ trợ điều trị xơ gan của ngƣời dân tộc

thiểu số Camphuchia. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học hoàn

2

chỉnh và tác dụng dƣợc lý của cây An Xoa ở Việt Nam và trên thế giới vẫn

còn rất hạn chế. Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Phân tích

cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt

Nam bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại” với mục tiêu nghiên cứu

thành phần hóa học trong cây An xoa nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử

dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả.

*Mục tiêu nghiên cứu:

Nghiên cứu thành phần hóa học của thân cây An xoa (Helicteres

hirsuta L.) thu hái ở Việt Nam

*Nội dung nghiên cứu:

- Thu hái mẫu cây An xoa tại Thừa Thiên, Huế.

- Phân lập các hợp chất tử thân cây An xoa bằng các phƣơng pháp sắc ký.

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng

pháp phổ hiện đại: MS, 1D, 2D-NMR.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES)

Thành phần loài: Chi Dó (Helicteres) là một chi thuộc họ Trôm

(Sterculiaceae) bao gồm khoảng 40 loài đƣợc tìm thấy ở các vùng nhiệt đới

thuộc châu Á và châu Mỹ. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ [3], chi Dó

(Helicteres) ở Việt Nam bao gồm 9 loài, đó là: Helicteres viscida Bl…(dó

trỉn, dó chuột), H. angustifolia L.. (dó hẹp, ổ kén), H. angustifolia var.

glaucoides Pierre (dó mốc), H. angustifolia var. obtusa Pierre (ổ kén hẹp), H.

angustifolia glabriuscula Wall (ổ kén không lông), H. isora L. (dó tròn), H.

lanceolata DC.. (dó thon), H. plebeja Kurz (dó thƣờng) và dó lông hay An

xoa. H. hirsuta Lour.

Về mặt hình thái: Cây gỗ hay cây bụi, có lông hình sao. Lá đơn, có

cuống. Cụm hoa ở nách lá; nhiều hoa. Đài hình ống có 5 răng, thƣờng chia 2

môi. Cánh hoa 5, hình dải thuôn, thẳng hay gấp khúc, thon thành hình móng

dài ở nửa dƣới, thƣờng có tai ở trên móng, không giống nhau. Nhị 10, đính

trên một cột hay nhụy dài, chỉ nhị 10, dính nhau nhiều hay ít; bao phấn lắc lƣ,

thƣờng ngoại hƣớng, rồi nội hƣớng, 2 ô. Nhị lép 5, ở trong xen kẽ với nhị.

Bầu đính ở giữa các nhị; 5 ô; lá noãn 5, phân cách bởi các rãnh quả; noãn

nhiều, đảo, xếp thành 2 dãy dọc; vòi thành cột; đầu nhụy không rõ. Qủa nang,

có lông, hạt nhiều, hình tháp.

Thành phần hóa học và tác dụng dược lý: Một số loài của chi này đƣợc

sử dụng trong y học dân tộc, nhƣ: rễ của loài Helicteres isora đƣợc dùng để

trị chứng mƣng mủ, viêm dạ dày, nhiễm trùng ruột, tiểu đƣờng. Loài H. ovata

và H. sacarolha đƣợc dùng để trị bệnh giang mai, và rễ của loài H. hirsuta

đƣợc dùng để trị đau dạ con.

1.2. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES)

Các nghiên cứu sinh học của một số loài thuộc chi này đã chứng tỏ

rằng dịch chiết của loài H. isora có hoạt tính chống tiểu đƣờng, giảm mỡ máu

4

[4-6]; dịch chiết của H. hirsuta có hoạt tính độc tế bào [7] và dịch chiết của H.

gardneriana thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét,

leishmania…[8].

Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Helicteres đã chỉ ra đƣợc

việc phân lập các hợp chất: triterpenoid, flavonoid, lignan, neolignan và các

dẫn xuất của axit rosmarinic.

1.2.1. Các triterpenoid

Từ rễ của loài H. angustifolia. Các nhà khoa học Đài Loan [9] đã tách và

định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ba triterpenoid có khung lupan đó là:

3β-acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester (1), 3β-

acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid (2) và 3β-acetoxy-27- (p-

hydroxyl) benzoyloxylup -20(29)-en-28-oic acid methyl ester (3).

Tiếp theo nghiên cứu trên, vào năm 2008, khi nghiên cứu rễ của loài H.

angustifolia, nhóm tác giả Min-Hsiung Pan và cộng sự [10] đã công bố các

kết quả phân lập, và xác định cấu trúc của 3 triterpen mới đó là 3β-acetoxy-

27-[(E)-cinamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl este (4), 3β-acetoxy-

27-[4-hydroxybezoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid (5), 3β-acetoxy-27-[(4-

hydroxybezoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl este (6), cùng với 8

triterpen có cấu trúc đã biết là 3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)_olean-12-en-28-

oic acid methyl este (7), cylicodiscic acid (3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28-

oic acid) (8), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulinic acid (9), pyracrenic acid (3β-

O-(trans-caffeoyl)_betulinic acid) (10), 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid

(11), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulin (12), 3β-O-(cis-coumaroyl)_betulin

(13), 3β-O-(trans-caffeoyl)_betulin (14), và 3β-O-(trans-feruloyl)_betulin

(15).

Ngoài ra, một số triterpenoid có khung lupan cũng đƣợc công bố bởi

các nhóm tác giả khác nhau khi nghiên cứu loài H. angustifolia nhƣ 3β-

acetoxylup-20 (29)-en-28-ol (16) [10], 3β-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid

3-caffeate (17) [12], axit betulinic (18).

5

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres

Ngoài ra, các hợp chất cucurbitacin cũng đƣợc tìm thấy trong một số loài

của chi Helicteres. Về mặt hóa học, các cucurbitacin đƣợc xếp vào lớp chất

triterpenoid, các cucurbitacin thƣờng có nhiều ở các cây trong họ

Cucurbitaceae (họ bầu bí).

Từ rễ của loài H. angustifolia thu hái ở Đài Loan, các nhà khoa học Đài

Loan đã phân lập đƣợc 2 cucurbitacin mới là cucurbitacin B2-sunfate (19) và

6

cucurbitacin glucoside (20) cùng với 2 cucurbitacin glucoside đã biết là

arvenin I (21) và arvenin III (22) [14].

Một nghiên cứu khác từ rễ của loài H. angustifolia của nhóm tác giả

Trung Quốc [15] đã công bố việc phân lập và xác định cấu trúc của

cucurbitacin D (23) và cucurbitacin J (24) vào năm 2006, hai chất này có hoạt

tính tốt đối với cả hai dòng tế bào ung thƣ: tế bào ung thƣ gan BEL-7402 (với

giá trị IC50 của hai chất lần lƣợt là 1,41 và 1,37 µM) và ung thƣ sắc tố da SK-

MEL-28 (với IC50 tƣơng ứng là 1,22 và 1,28 µM).

Từ loài H. isora, nhóm tác giả Bean, M. F và cộng sự [16] đã phân lập

đƣợc cucurbitacin B (25) và isocucurbitacin B (26), đây là hai hợp chất đƣợc

phát hiện là có độc tính trên dòng tế bào ung thƣ KB với giá trị ED50=

7

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres

Cũng từ rễ của loài H. angustifolia [15], các tác giả Trung Quốc đã phân

lập đƣợc một steroit có khung pregnan tên là 2α,7β,20α-trihydroxy-3β,21-

dimethoxy-5-pregnanene (27).

8

1.2.2. Các coumarin

Từ rễ loài H. angustifolia, nhóm tác giả Wenliang Chen và cộng sự đã

phân lập đƣợc một coumarin mới có tên là 6,7,9α-trihydroxy-3,8,11α-

trimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin (28) [15]. Cũng từ loài H. angustifolia,

Wang và cộng sự [17] đã phân lập ra một hợp chất coumarin mới và đặt tên là

heliclacton (29)

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres

Ngoải ra, chi Helicteres còn có chứa các hợp chất khác nhƣ

sesquiterpenoid quinon [19, 20], lignan [21], neolignan [22, 23], acid

rosmarinic [24] và flavonoid [25,26].

1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO

(STERCULIACEAE)

Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là

Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae. An xoa là cây bụi,

cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông. Lá hình trái xoan, dài 5-17cm,

rộng 2,5-7,5cm. Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn. Mép có răng

không đều. Mặt dƣới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5,

cuống lá dài 0,8-4cm, lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng. Cụm hoa là những

bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có

khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5

răng. Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có

nhiều gợn, chứa 25-30 noãn trong mỗi lá noãn. Quả nang hình trụ nhọn, hạt

nhiều, hình lăng trụ. Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [27].

9

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.)

Cây An xoa phân bố ở Nam Trung Quốc và nhiều nƣớc Nam Á nhƣ Ấn

Độ, Camphuchia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippine...Ở Việt Nam,

cây thƣờng gặp trên các đồi cây bụi, rừng thƣa, ven rừng, phổ biến từ Bắc tới

Nam, nhƣ ở Bình Phƣớc, Lâm Đồng và các tỉnh miền núi phía Bắc [28]. Cây

An xoa đã đƣợc nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam và trên

thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau nhƣ cảm cúm, sởi, ung nhọt, kiết

lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan [29,30].

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Khi nghiên cứu loài An xoa Helicteres hirsuta có nguồn gốc từ

Indonexia, nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) đã phân lập đƣợc 6 lignan

có tên là (±)-pinoresinol (30); (±)-medioresinol (31); (±)- syringaresinol (32);

(-)-boehmenan (33); (-)-boehmenan H (34) và (±)-trans-dihydro diconiferyl

alcohol (35) [21].

Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta)

10

Trong số 6 lignan tách ra từ loài này thì có 3 chất là 1, 4 và 5 là có hoạt

tính ức chế 3 dòng tế bào ung thƣ là: ung thƣ phổi (Lu1), ung thƣ tuyến tiền

liệt (LNCaP) và ung thƣ vú (MCF-7), trong đó, (±)-pinoresinol (30) thể hiện

khả năng gây độc tế bào mạnh trên dòng ung thƣ phổi Lu1, ung thƣ tuyến tiền

liệt (LNCaP), ung thƣ vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml.

Gần đây, cây An xoa cũng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học

trong nƣớc. Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015, 2016) đã công bố cặn chiết nƣớc

và cặn chiết methanol từ lá và thân cây An xoa thu hái ở Khánh Hòa, Việt

Nam giàu nhóm chất phenol và flavonoid có tác dụng chống oxy hóa invitro

trên hệ DPPH, ABTS, FRAP [31, 32]. Nhóm tác giả Hữu Duyên (2016) đã

phân lập đƣợc 4 hợp chất từ cặn petroleum ether (PE) cây An xoa thu hái ở

Kiên Giang: lupeol (36), stigmasterol (37), tiliroside (38) và apigenin (39), kết

quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE và cao chiết

dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ gan HepG2 với IC50

lần lƣợt là 28,29 và 30,30 µg/ml [33].

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu

hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016)

Ngoài ra, nhóm tác giả Ngọc Quang (2018) đã phân lập đƣợc 12 hợp

chất từ loài An xoa H.hirsuta thu hái ở Bình Phƣớc bao gồm: 3-O-

transcaffeoylbetulinic acid (40), 3b-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid

methyl ester (42), betulinic acid (43), lupeol (44),

4-hydroxybenzoic acid (45), 3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester

11

(46), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (47), 5,8-dihydroxy-7,40-

dimethoxyflavone (48), isoscutellarein 4’-methyl ether 8-O-b-

Dglucopyranoside (49), methyl caffeate (50) and stigmasterol (51) [34].

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L. thu

hái ở Bình Phƣớc (Ngọc Quang, 2018)

Từ tổng quan tài liệu trên đây, chúng ta thấy chi Dó (Helicteres ) có

phong phú các lớp chất giàu hoạt tính sinh học nhƣ: terpenoid, lignan,

polyphenol, flavone, courmarin...trong đó các công trình công bố cho tới nay

về cây An xoa còn khá ít ỏi. Vì vậy, các nghiên cứu sâu rộng hơn nữa là việc

làm cần thiết để chứng minh tác dụng chữa bệnh của loài thực vật này.

12

1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC

CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

1.4.1. Các phƣơng pháp chiết xuất

Phƣơng pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và

cách chiết. Một phƣơng pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể đƣợc hoạch định

khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra. Mỗi loại hợp chất có

độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một

phƣơng pháp chiết xuất chung cho tất cả các dƣợc liệu.

Phƣơng pháp chiết có hai phƣơng pháp chiết:

Phương pháp 1: Phƣơng pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu

sơ bộ khi chƣa biết rõ thành phần hóa học của dƣợc liệu, dùng phƣơng pháp

cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh

để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dƣợc liệu. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi:

ether dầu, ether, chloroform, cồn và cuối cùng là nƣớc.

Phương pháp 2: Phƣơng pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ

thành phần trong dƣợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc

ethanol (80%). Nhất là methanol đƣợc xem nhƣ là dung môi vạn năng, nó hòa

tan đƣợc chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro

với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu đƣợc, đem loại hết

dung môi thu đƣợc cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dƣợc liệu. Khi

cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa

lẫn với nƣớc và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: ether

dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol.

Về cách chiết có hai cách chiết:

- Chiết ngâm lạnh: là phƣơng pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ

xƣa. Sau khi chuẩn bị dƣợc liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dƣợc liệu

trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết.

Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút

dịch chiết ở dƣới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần.

- Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý

một cách mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất

13

cần chiết xuất. Phƣơng pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phƣơng

pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhƣng có nhƣợc điểm là chỉ áp dụng đƣợc

với quy mô nhỏ.

1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dƣợc liệu vì đơn

giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha

động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh

là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, đƣợc trải mỏng

đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một

hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định

tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu

tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha

động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp

mỏng.

Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và

khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 1.8). Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến

giá trị Rf.

Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf

Các bƣớc trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 1.9):

Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trƣớc khi dùng phải hoạt hóa trong tủ

sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút

ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đƣờng chấm chất phân tích (cách

14

mép dƣới của bản mỏng 1,2 cm), đƣờng giới hạn di chuyển của dung môi

(cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết

chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).

Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc

micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ,

lƣợng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng

không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.

Triển khai sắc ký: Bình triển khai thƣờng là bình thủy tinh, có nắp đậy

kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ

dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để

giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển

khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín

bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đƣờng giới hạn,

lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc sóng

254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là

Ce(SO4)2).

Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng

Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,

kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.

Phương pháp sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất

hấp phụ pha tĩnh đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà

có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.

Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân

cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi

cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong

15

quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc

phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột.

Kỹ thuật sắc ký cột (Hình 1.10):

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải đƣợc hoạt hóa ở 120°C

trong 4 giờ trƣớc khi đƣa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải

thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải đƣợc phân tán đồng đều trong cột. Có 2

cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ƣớt với dung môi. Sau khi đƣa chất hấp phụ

lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột

và không đƣợc để khô dung môi trong cột.

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đƣa chất lên cột sao cho chất

phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều

cách đƣa chất lên cột: phƣơng pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất

cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lƣợng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột

mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thƣờng hoặc áp xuất nén. Hứng dịch

chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng

thể tích.

Hình 1.10: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột

1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân

lập đƣợc

Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một quá trình tập hợp và phân

tích các dữ liệu từ nhiều nguồn khác nhau, mỗi nguồn cung cấp một số thông

tin về cấu trúc của chất. Cấu trúc của chất đƣợc xác định phải phù hợp với tất

16

cả các thông tin cấu trúc từ các nguồn trên. Hiện nay, các phƣơng pháp phân

tích cấu trúc hiện đại đã đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các

phƣơng pháp phổ hấp thụ nhƣ phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng

ngoại (IR), các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lƣợng (MS).

Ngoài ra, sự phát triển và ứng dụng các phƣơng pháp “ghép-nối" giữa sắc kí

lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các phƣơng pháp khác nhƣ HPLC-MS,

HPLC-NMR,… đã làm tăng tốc độ và độ nhạy của các phƣơng pháp xác định

cấu trúc.

Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là

kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện

đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ: phổ

hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 chiều và 2

chiều (1H-NMR,

13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC…).

1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared

Spectroscopy)

Phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ

thuật phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin nhanh về cấu trúc phân tử mà

không đòi hỏi các phƣơng pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên

nguyên lí là các phân tử khác nhau sẽ hấp thụ ở các vùng bức xạ khác nhau.

Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử ở trạng thái kích thích sẽ

dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ

hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng

ngoại tƣơng ứng với các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân

tử.

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong

vùng từ 10000 đến 100 cm-1

và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử.

Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng

quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với

cƣờng độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR). Mỗi loại dao

động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối

lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình

17

học của nguyên tử. Do đó, phổ hồng ngoại cho phép xác định thông tin về cấu

trúc hóa học nhƣ cấu dạng và nhóm chức đặc trƣng của hợp chất hữu cơ.

Đơn vị trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1). Sự hấp thụ có nhiều ý

nghĩa trong việc ứng dụng phổ hồng ngoại để phân tích câu trúc các hợp chất

hữu cơ là sự hấp thụ trong vùng 4000 – 660 cm-1

1.4.3.2. Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry)

Khối phổ là một trong các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định

khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu. Cơ sở của phƣơng pháp này là sử dụng

từ trƣờng và điện trƣờng để bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ thành ion phân

tử hoặc các mảnh ion mang điện tích trong chân không. Phƣơng pháp MS khác

với các phƣơng pháp phân tích phổ khác là nó không phụ thuộc vào độ hấp thụ

của bức xạ điện từ mà dựa trên quá trình phân tử bị bắn phá bởi chùm electron

mang năng lƣợng cao. Dƣới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị

mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có

thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung

hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lƣợng của

M+ chính là khối lƣợng của phân tử. Dựa trên số khối của ion phân tử (M

+) có

thể xây dựng đƣợc công thức phân tử của hợp chất.

1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(NMR)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic

Resonance ), là một phƣơng pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và

hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một

chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của

các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của phƣơng

pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của

các hạt nhân từ (1H và

13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng

khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học. Trong phổ NMR

có hai thông số có đặc trƣng liên quan đến cấu trúc hóa học của 1 phân tử là độ

dịch chuyển hóa học () và hằng số tƣơng tác spin – spin (J).

18

Phổ proton 1H-NMR

Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học () của các proton đƣợc xác

định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hóa của

các nguyên tử cũng nhƣ cấu trúc hoá học của phân tử. Mỗi loại proton cộng

hƣởng ở một từ trƣờng khác nhau, vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ

dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hoá học, diện tích pic

cũng nhƣ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà ngƣời ta có thể xác

định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. Dựa vào những đặc trƣng của và

tƣơng tác J để có thể cung cấp các thông tin giúp xác định cấu trúc hóa học của

hợp chất.

Phổ 13

C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch carbon. Mỗi nguyên tử

carbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác

nhau. Thang đo cho phổ 13

C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm nhƣng với dải

thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm). Ngoài ra phổ

13C còn đƣợc ghi theo phƣơng pháp DEPT (Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer)

Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phân loại các bậc carbon khác

nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của

CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên

phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13

C-NMR và

phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4.

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence )

Phổ HSQC cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của 1H và

13C. Phổ

HSQC cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và cacbon.

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Đây là phổ thể hiện tƣơng tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa cacbon

và proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn

bộ phân tử đƣợc xác định. Phổ này đặc biệt thích hợp trong trƣờng hợp phân

tử chứa cacbon bậc bốn vì nó thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở

một nguyên tử 13C với tín hiệu của

13C khác ở cách xa nó 2-3 liên kết thậm chí

trong một số trƣờng hợp là bốn liên kết.

Phổ COSY (Correlation spectroscopy)

19

Phổ COSY biểu diễn các tƣơng tác giữa proton – proton. Các proton

tƣơng tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một

cacbon hoặc với cacbon liền kề. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc

xác định.

Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)

Phổ NOESY biểu diễn các tƣơng tác không gian của các proton không

kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách không gian của chúng

đƣợc phân bố trong phân tử (khoảng 4A0). Dựa vào kết quả phổ này có thể

xác định cấu trúc không gian của phân tử.

20

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mẫu lá, thân loài cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) đƣợc thu hái tại

Thừa Thiên-Huế tháng 9 năm 2017. Mẫu tiêu bản ký hiệu là TRA020917.

Tên khoa học của các loài thực vật này đƣợc PGS.TS Trần Thế

Bách, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam xác định. Các mẫu tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại phòng

Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại

Thừa Thiên-Huế

2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hóa chất, dụng cụ

- Các dung môi: n-hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone, ethanol,

methanol...đều đƣợc cất trƣớc khi sử dụng.

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel

(Merch) 60-F254 có độ dày 0,25mm.

- Sắc ký cột (CC): sử dụng các chất hấp phụ gồm: silica gel (Merck), cỡ hạt

40-60 µm và Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), cỡ hạt 25-100 µm. Cột sắc

ký có kích cỡ khác nhau.

21

- Thuốc hiện trong phân tích TLC: sắc ký lớp mỏng đƣợc quan sát dƣới ánh

sáng tử ngoại với bƣớc sóng 254nm và 365nm, và đƣợc hiện màu bằng

thuốc thử ceri sulfat.

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu

- Máy cô quay chân không Buchi 3120.

- Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy melting point meter Buchi B545.

- Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy Spectrum Two PerkinElmer bằng

phƣơng pháp viên nén KBr hoặc bao film. P

- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) đƣợc đo trên máy sắc ký lỏng ghép

khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode

ESI và đầu dò DAD.

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker Avance

500,13 MHz spectrometer với TMS là chất nội chuẩn.

Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học và Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn

lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Xử lý mẫu thực vật

Cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) sau khi thu hái đƣợc chia thành hai

bộ phận riêng biệt là lá và thân cây. Từng bộ phận này đƣợc thái nhỏ, phơi

trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45o C, sau đó đem nghiền nhỏ riêng rẽ.

2.3.2. Điều chế các cặn chiết

3,2kg bột khô thân cây An xoa đƣợc ngâm chiết với ethanol 70o

(2L/lần) bằng siêu âm ở 40-450C. Quá trình chiết đƣợc lặp lại 3-4 lần. Gộp

chung dịch của 3 lần ngâm chiết và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu

đƣợc cao chiết ethanol tổng. Tiếp đó, hòa cao chiết tổng bằng dung dịch

ethanol: H2O (1:1) và chiết phân bố lần lƣợt với dung môi n- hexane, ethyl

acetate. Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần sử dụng 500 ml dung môi.

Gộp chung dịch chiết của các lần chiết và làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất

loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cặn cặn chiết tƣơng ứng gồm

22

cặn n- hexane (12g) và cặn ethyl acetate (40,5g). Phần dịch nƣớc còn lại đƣợc

cất loại hết dung môi thu đƣợc cặn chiết nƣớc (45g).

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa

2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các

hợp chất tự nhiên [35,36]

Việc phân lập, tinh chế các hợp chất từ các cặn chiết đƣợc thực hiện

bằng các phƣơng pháp kết tinh và sắc ký khác nhau nhƣ: sắc ký lớp mỏng

(TLC, dùng để khảo sát, điều chế lƣợng nhỏ), sắc ký cột thƣờng (CC) với pha

tĩnh là silica gel (Merck) và sephadex LH-20. Dung môi rửa giải chủ yếu dùng

các hệ dung môi nhƣ n-hexan/CH2Cl2, n-hexan/EtOAc, n-hexan/axetone,

CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.

Phƣơng pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là

sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý nhƣ điểm nóng cháy, độ quay

cực []D… với các phƣơng pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ hồng ngoại (IR),

phổ khối lƣợng (MS), các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một

23

chiều (1H-NMR,

13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY,

NOESY) đƣợc sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các

chất đƣợc phân lập).

Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)

Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong

phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trƣng của các nhóm

chức đó.

Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định

khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử

[M]+, [M+H]

+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử.

Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ khối lượng MS (Mass spectrometry)

Phổ khối lƣợng dựa trên sự phân tách chất tƣơng ứng khối lƣợng phân

tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trƣờng và điện trƣờng để tác động lên

các hạt tích điện (ion) trong chân không. Phổ khối không xác định trực tiếp

khối lƣợng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lƣợng (m) và điện tích (z) của

ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thƣờng là 1 nên giá trị m/z của

phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lƣợng của ion. Dƣới những điều kiện

nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi

la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là

các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có

thể bỏ qua, nên khối lƣợng của M+ chính là khối lƣợng của phân tử.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR là phƣơng pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp

chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hƣởng của các hạt nhân của các nguyên

tử khi đƣợc đặt trong một từ trƣờng. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc

trƣng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học

δ và hằng số tƣơng tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D

NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.

Các hợp chất sau khi đƣợc tinh chế bằng các phƣơng pháp sắc kí sẽ

đƣợc tiến hành đo phổ NMR. Trƣớc tiên, các hợp chất sẽ đƣợc đo phổ proton

24

1H-NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ đƣợc tiến hành đo tiếp phổ

cacbon 13

C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay

gặp có thể xác định đƣợc cấu trúc chỉ với số liệu cộng hƣởng từ hạt nhân một

chiều (1H-NMR,

13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến

hành đo thêm các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ

IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp

chất sau khi đã đƣợc xác định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ đã nêu sẽ

đƣợc khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HR-

MS.

2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa

Tiến hành sắc ký cột silica gel cặn EtOAc (50g) với hệ dung môi n-

Hexan/EtOAc gradien (100:0-0:100), thu đƣợc 12 phân đoạn chính, kí hiệu F1-

F12.

Từ phân đoạn F1(1,95g), sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung

môi n-hexan/EtOAc gradien, thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F1.1- F1.3.

Tinh chế tiếp F1.2 (300mg) trên cột Sephadex LH-20 và cột silica gel (n-

hexan/aceton) thu đƣợc hợp chất HH08 (11mg) và hợp chất HH06 (9mg).

Phân đoạn F3 (2,5g) đƣợc tinh chế trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi n-

hexan/aceton gradient (95:5-0:100) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ F3.1-F3.3. Hợp

chất HH04 (12mg) thu đƣợc từ phân đoạn nhỏ F3.1 sau khi kết tinh trong

axetone. Phân đoạn nhỏ F3.3 (450mg) đƣợc phân tách trên cột silica gel (n-

hexan/aceton 93:7-0:100) thu đƣợc hợp chất HH07 (30mg). Phân đoạn

F4(1,75g) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH) thu

đƣợc 3 phân đoạn nhỏ F4.1-F4.3. Tiếp tục tinh chế F4.3 bằng cột silica gel

(diclometane/aceton 98:1-0:100) thu đƣợc hợp chất HH05 (15mg). Từ phân

đoạn F6 (3,7g) tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton

gradient (0-100%) thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ ký hiệu F5.1-F5.5. Phân đoạn

nhỏ F6.3 (700mg) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi

MeOH/diclometane: 9/1) thu đƣợc hợp chất HH02. Phân đoạn nhỏ F6.5

(900mg) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi

MeOH/diclometane: 9/1) sau đó rửa giải trong hệ dung môi aceton thu đƣợc

hợp chất HH03. Phân đoạn F9 (3,8g) đƣợc phân tách trên cột silica gel với hệ

25

dung môi rửa giải là diclometan/methanol gradient (0-70%) thu đƣợc 3 phân

đoạn nhỏ ký hiệu F9.1- F9.3. Phân đoạn nhỏ F9.3 tinh chế bằng sắc ký bản

mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan/aceton 8/2 thu đƣợc hợp chất

HH01 (15mg).

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc

2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN

LẬP ĐƢỢC

2.4.1. Betulin (HH01)

CẶN CHIẾT

EtOAc

Sephadex LH-20 và cột silica gel n-He/Aceton

Điều chế bản

mỏng hệ dm CH

2Cl

2/aceton

8/2

n-Hexan/EtOAc gradient (0:100-100:0)

F1 1,95g

F3 2,5g

F4 1,75g

F6 3,7g

F9 3,8g

F1.2 300mg

n-He/EtOAc gradien

HH08 11mg

HH06 9mg

n-He/Aceton gradient (95:5-0:100)

F3.1 15mg

F3.3 450mg

Kết tinh trong Aceton

HH04 12mg

n-He/aceton 93:7-0:100

HH07 30mg

sephadex LH-20 hệ dm MeOH

F4.3 27.5mg

CH2Cl

2/aceton

98:1-0:100

HH05 15mg

n-He/aceton gradient 0-

100

F6.3 700mg

Sephadex LH-20 MeOH/CH

2Cl

2 9/1

HH02 21mg

F6.5 900mg

Sephadex LH-20 hệ MeOH/CH

2Cl

2

9/1

HH03 13mg

CH2Cl

2/MeOH

gradient 0-70%

F9.3 900mg

HH01 15mg

F1.1-F1.3 F3.1-F3.3 F4.1-F4.3 F6.1-F6.5 F9.1-F9.3

26

Bột vô định hình màu trắng, đnc. 251-252oC.

ESI-MS: m/z 443 [M+H]+. C30H50O2

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ ppm 0,76 (3H, s, H-24-CH3), 0,83 (3H, s, H-

25-CH3), 0,97 (3H, s, H-23-CH3), 0,98 (3H, H-27-CH3), 1,02 (3H, s, H-26-

CH3), 1,68 (3H, s, H-30-CH3), 2,38 (1H, dt, J= 5,5 và 11,0Hz, H-19), 3,18

(1H, dd, J 5,0 và 11,5 Hz, H-3), 3,33 (1H, d, H-28a), 3,79 (1H, dd, J= 1,5;

10,5Hz H-28b), 4,58 (1H, d, J= 2,0Hz, H-29a), 4,68 (1H, J= 2,0Hz, H-29b).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ ppm 14,77 (C-27); 15,35 (C-24); 16,0 (C-

25); 16,1 (C-26); 18,3 (C-6); 19,1 (C-30); 20,8 (C-11); 25,2 (C-12); 27,1 (C-

2); 27,4 (C-15); 28,0 (C-23); 29,2 (C-21); 29,8 (C-16); 34,0 (C-7); 34,2 (C-

10); 37,2 (C-22); 37,3 (C-13); 38,7 (C-1); 38,9 (C-4); 39,9 (C-8); 42,7 (C-14);

47,8 (C-19); 48,8 (C-18), 50,4 (C-9); 50,8 (C-17), 55,3 (C-5); 60,6 (C-28);

79,0 (C-3); 109,7 (C-29); 150,5(C-20).

2.4.2. Axit betulinic (HH02)

Chất rắn màu trắng, đnc: 315-317oC

ESI-MS: m/z 439 [M-H2O+H]+. C30H48O3

1H-NMR (500,13 MHz, CD3OD): δH 0,78 (3H, s, H-25), 0,88 (3H, s, H-24),

0,98 (3H, s, H-26), 1,00 (3H, s, H-27); 1,03 (3H, s, H-23); 1,72 (3H, s, H-

30); 3,15 (1H, dd, J 5,0 và 11,5 Hz, H-3); 3,03 (1H, dt, J= 4,5 và 11,0Hz, H-

19); 4,61 (1H, dd, J 2,0 và 3,5 Hz, H-29); 4,73 (1H, br. d, J = 2,0 Hz, H-

29).

13C-NMR (125,76 MHz, CD3OD): δ 15,1 (C-27); 16,0 (C-24); 16,6 (C-25);

16,7 (C-26); 19,5 (C-6); 19,6 (C-30); 22,1 (C-11); 27,0 (C-12); 28,1 (C-2);

28,6 (C-23); 30,9 (C-15); 31,8 (C-21); 33,4 (C-16); 35,7 (C-7); 38,1 (C-10);

38,4 (C-22); 39,8 (C-13); 40,0 (C-1); 40,2 (C-4); 42,1 (C-8); 43,7 (C-14);

27

49,8 (C-19); 50,7 (C-18), 52,1 (C-9); 57,0 (C-5); 57,5 (C-17); 79,8 (C-3);

110,0 (C-29); 152,0 (C-20); 180,0 (C-28, COOH).

2.4.3. Axit alphitolic (HH03)

Chất rắn màu trắng, đnc: đnc: 276-278oC

ESI-MS: m/z 473 [M+H]+. C30H48O4

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 0,81 (3H, s, CH3-25), 0,94 (3H, s, CH3-24),

0,99 (3H, s, CH3-26), 1,01 (3H, s, CH3-27); 1,03 (3H, s, CH3-23); 1,72 (3H,

s, H-30); 2,91 (1H, d, J=1,0 Hz, H-3); 3,03 (1H, dt, H-18); 3,63 (1H, dt, H-

2); 4,62 (1H, s, H-29); 4,73 (1H, br. d, J=2,0 Hz, H-29).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 15,1 (C-27), 16,6 (C-26), 17,2 (C-24),

17,8(C-25), 19,5 (C-6), 19,6 (C-30), 22,2 (C-11), 26,8 (C-12), 29,1 (C-21);

30,8 (C-15), 31,7 (C-16), 33,3 (C-7); 35,5 (C-22); 38,1 (C-13), 39,5 (C-10);

39,6 (C-8); 40,5 (C-4); 41,9 (C-14); 43,6 (C-1); 48,3 (C-2); 48,4 (C-24);

50,4 (C-18), 51,9 (C-19), 56,8 (C-9); 57,5 (C-5); 69,7 (C-17); 84,4 (C-3),

110,2 (C-29), 151,9 (C-20), 180,0 (C-28).

2.4.4. Axit oleanolic (HH04)

Chất rắn màu trắng, đnc: >300oC

ESI-MS (m/z): 457 [M+H]+; C30H48O3

28

1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD): δH (ppm) 0,77 (3H, s, CH3), 0,80

(3H, s, CH3), 0,90 (3H, s, CH3), 0,92 (3H, s, CH3), 0,93 (3H, s, CH3), 0,97

(3H, s, CH3), 1,15 (3H, s, CH3), 2,84 (1H, dd, J= 4,0; 13.5 Hz, H-18), 3,17

(1H, dd, J= 5,0; 11,0 Hz, H-3), 5,26 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12).

13C-NMR (125MHz, CD3OD): 39,3 (C-1); 27,4 (C-2); 79,3 (C-3); 39,4 (C-4);

56,2 (C-5); 19,1(C-6); 33,3 (C-7); 40,0 (C-8); 48,6 (C-9); 37,7 (C-10); 23,7

(C-11); 123,1 (C-12); 144,7 (C-13); 42,1(C-14); 28,4 (C-15); 24,1 (C-16);

47,2 (C-17); 42,5 (C-18); 46,7 (C-19); 31,2 (C-20); 34,6 (C-21); 33,5 (C-22);

28,5 (C-23); 15,7 (C-24); 16,1 (C-25); 17,4 (C-26); 26,4 (C-27); 181,6 (C-

28); 33,4 (C-29); 23,9 (C-30).

2.4.5. Hibiscolactone A (HH05)

ESI-MS (m/z): 257 [M -H]-. C15H14O4

1H-NMR (500,13 MHz, CD3OD): 1,40 (6H, d, J=6,9 Hz, H-12, H-13); 2,43

(3H, s, H-15); 3,67 (1H, sept, J=6,9 Hz, H-11); 6,94 (1H, s, H-8); 7,55 (1H, s,

H-5).

13C-NMR (125,76 MHz, CD3OD): 17,6 (C-15); 23,8 (C-12, C-13); 30,6 (C-

11); 99,8 (C-10); 114,8 (C-8); 118,2 (C-6); 120,2 (C-5); 129,5 (C-4); 132,7

(C-1); 132,8 (C-2); 138,5 (C-3); 157,9 (C-7); 160,6 (C-9); 168,2 (C-14).

2.4.6. Heliclactone (HH06)

ESI-MS: m/z 261,11 [M+H]+; C15H16O4

29

Bảng 2.1: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz,

13C: 125 MHz) của hợp chất

HH06 và của chất tham khảo [49] (đo trong CD3OD)

Chất tham khảo HH06

C δC δH (J, Hz) δC δH

(J, Hz)

2 166,5 166,0

3 119,2 115,3

4 149,5 151,1

4a 109,2 110,0

5 126,2 126,1

6 140,8 139,9

7 147,7 146,9

8 111,0 110,4

8a 149,3 148,8

9 65,2 4,98 br s 23,1 2,81; 2,92

10 37,1 1,90; 2,11 28,9 1,90; 2,00

11 27,4 3,32 27,1 3,46 m

12 12,5 2,10 12,0 2,11 s

13 8,9 2,18 8,3 2,28 s

14 22,6 1,36 d (7.3) 18,9 1,25 d (6,0)

2.4.7. Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH07)

Chất rắn màu trắng. C29H48O2

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,78 (3H, s, H-18); 0,82-0,85 (9H, H-26,

27, 29); 0,95 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21); 1,39 (3H, s, H-19); 4,28 (1H, s, H-6);

5,80 (1H, s, H-4);

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 12,3 (C-18); 12,4 (C-29); 19,2 (C-27); 19,3

(C-21); 19,6 (C-17); 20,1 (C-26); 21,8 (CH2); 23,8 (CH2); 24,9 (CH2); 26,9

(CH2); 29,0 (CH2); 30,0 (C-25); 30,4 (C-7); 30,7 (C-8); 34,7 (C-22); 37,0 (C-

20); 38,0 (C-1); 39,0 (C-10); 39,5 (C-2); 40,6 (C-12); 43,3 (C-13); 46,9 (C-

30

24); 6,8 (C-14); 57,0 (C-17); 54,8 (C-9); 73,3 (C-6); 126,4 (C-4); 171,5 (C-

5); 203,0 (C-3).

2.4.8. β-sitostenone (HH08):

Chất rắn màu trắng, đnc: 94-96oC;

[α]28

D +68,5 (c 1,24; CHCl3);

ESI-MS (m/z): 413 [M + H]+. C29H48O

1H-NMR (500,13 MHz, CDCl3): δH 0,70 (3H, s, H-18); 0,81 (3H, d, J=6,8

Hz, H-27); 0,83 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-26); 0,84 (3H, t, J= 7,4 Hz, H-29); 0,91

(3H, d, J= 6,5 Hz, H-21); 1,17 (3H, s, H-19); 5,71 (1H, s, H-4).

13C-NMR (125,76 MHz, CDCl3): δC 11,9 (C-29); 12,0 (C-18); 17,4 (C-19);

18,7 (C-21); 19,0 (C-27); 19,8 (C-26); 21,0 (C-11); 23,1 (C-28); 24,2 (C-15);

26,1 (C-23); 28,2 (C-16); 29,2 (C-25); 32,1 (C-7); 32,9 (C-6); 33,9 (C-2);

34,0 (C-22); 35,6 (C-1); 35,7 (C-8); 36,1 (C-20); 38,6 (C-10); 39,6 (C-12);

42,4 (C-13); 45,8 (C-24); 53,8 (C-9); 55,9 (C-14); 56,0 (C-17); 123,7 (C-4);

171,6 (C-5); 199,6 (C-3).

31

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Từ mẫu cây An xoa sau khi thu hái, phơi khô, ngâm chiết với các dung

môi khác nhau đã thu đƣợc các cặn chiết tƣơng ứng. Từ cặn chiết ethylacetate

đã tiến hành phân lập bằng các phƣơng pháp sắc ký và các kỹ thuật tinh chế

thu đƣợc 8 chất sạch (Hình 3.1). Các hợp chất này đƣợc phân tích cấu trúc

hóa học bằng các phƣơng pháp phổ vật lý hiện đại, kết quả đƣợc trình bày

nhƣ sau:

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 8 hợp chất phân lập từ thân cây An xoa

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH01 (betulin)

Hợp chất HH01 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng, điểm

nóng chảy 250-252 oC. Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho píc giả phân

tử ở m/z 443 [M +H]+ cùng với các tín hiệu cộng hƣởng trên phổ

13C-NMR và

DEPT cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất HH01 là

32

C30H50O2.

Hình 3.2: Phổ MS của hợp chất HH01

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất HH01 xuất hiện các tín hiệu của 6

nhóm methyl singlet ở δH 0,76 (s, 3H), 0,83 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,98 (s,

3H), 1,02 (s, 3H), 1,68 (s, 3H), trong đó nhóm methyl singlet ở δH 1,68 gợi ý

nhóm này đƣợc liên kết với một nối đôi, hai proton olefinic có tín hiệu cộng

hƣởng ở δH 4,58 và 4,68 cũng đƣợc quan sát thấy. Ngoài ra, một proton ở δH

3,0 chứng tỏ thuộc nhóm hydroxymetin, dựa vào hằng số tƣơng tác (J=5,0;

11,5 Hz) có thể biết vị trí α của proton này (H-3).

33

Hình 3.3: Phổ 1H của hợp chất HH01

Phổ 13

C-NMR và DEPT ghi nhận tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon bao

gồm: 6 nhóm methyl (CH3), 12 nhóm methylen (CH2) trong đó có 1 nhóm

methylene sp2 (δC 109,7), 6 nhóm methine (CH) sp

3 trong đó có một nhóm

hydroxymethine (δC 79,0), 5 cacbon bậc 4 lai hóa sp3, 1 cacbon bậc 4 sp

2 (δC

150,5).

Hình 3.4: Phổ 13C của hợp chất HH01

34

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất HH01

Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1H,

13C, DEPT NMR, gợi ý đến cấu trúc

khung lupan cho HH01, hợp chất này còn có chứa một nhóm

hydroxymethine, một nhóm methylenoxy. Cấu trúc của HH01 đƣợc khẳng

định nhờ phân tích dữ liệu phổ HMBC.

Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất HH01

35

Trên phổ HMBC, tƣơng tác xa giữa proton thuộc 2 nhóm methyl CH3-23

(δH 0,97 ) và CH3-24 (δH 0,76 ) với cacbon C-3 (C 79,0)/C-4 (C 38,9)/ C-5

(C 55,3), tƣơng tác giữa proton của nhóm methyl CH3-24 (δH 0,76) với C-23

(C 28,0), tƣơng tác giữa proton thuộc nhóm methyl CH3-23 (δH 0,97) với C-

24 (C 15,3) cho phép xác định nhóm hydroxyl ở vị trí 3 của vòng A . Tiếp

theo, tƣơng tác của proton thuộc nhóm methyl CH3-30 (δH 1,68) với C-29 (C

109,7)/C-20 (C 150,5)/C-19 (C 47,8) và tƣơng tác của proton thuộc nhóm

methylen (δH 4,61 và 4,73) với C-30 (C 19,6)/C-19 (C 47,8) xác định vị trí

của nối đôi ở C20-C29 của khung lupane. Cuối cùng, tƣơng tác của proton

thuộc nhóm methylenoxy (δH 3,33 và 3,79) với C-17 (C 50,8)/C-18 (C

48,8)/C-16 (C 29,2)/C-22 (C 34,0) và tƣơng tác của H-19 (δH 2,38) với C-17

((C 50,8)/C-18 (C 48,8) xác định nhóm methylenoxy ở vị trí 28 của khung

lupan. Kết hợp phân tích các dữ liệu phổ trên đây và so sánh với tài liệu tham

khảo [37,38] cho phép kết luận HH01 là betulin. Betulin đƣợc biết đến là một

hợp chất triterpenoid phổ biến trong tự nhiên, có hoạt tính sinh học hấp dẫn

nhƣ hoạt tính chống ung thƣ, kháng viêm, chống virút.

Hình 3.7: Tƣơng tác HMBC của hợp chất HH01

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH02 (axit betulinic)


nóng chảy 272-274 oC, có tính quang hoạt với độ quay cực [α]

23D +8,0 (c 0,6;

CHCl3+MeOH/1:1). Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho píc giả phân tử ở

36

m/z 439 [M-H2O+H]+ cùng với các tín hiệu cộng hƣởng trên phổ

13C-NMR và

DEPT cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất HH02 là C30H48O3.



nhóm metyl singlet ở δH 0.65 (s, 3H), 0.73 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.86 (s, 3H),

0,88 (s, 3H), 1.59 (s, 3H), trong đó nhóm methyl singlet ở δH 1,59 cho thấy

nhóm này đƣợc liên kết với một nối đôi, hai proton olefinic có tín hiệu cộng

hƣởng ở δH 4.59 (1H, dd, 1.5 và 2.5 Hz), 4.71 (1H, br. d, 2.5 Hz) cũng đƣợc

quan sát thấy. Ngoài ra, một proton ở δH 3,0 chứng tỏ thuộc nhóm

hydroxymetin, dựa vào hằng số tƣơng tác (J 5,0; 11,5 Hz) có thể biết vị trí α

của proton này.

37


Phổ 13

C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt của 30 nguyên tử cacbon

bao gồm: 6 nhóm methyl, 10 nhóm methylen sp3, 1 nhóm methylene sp

2, 6

nhóm methin sp3 trong đó có một nhóm hydroxymethine (δC 78,8), 5 cacbon

bậc 4 lai hóa sp3, 1 cacbon bậc 4 sp

2 (δC 150,6), 1 nhóm cacboxylic (δC

179,2).


38

Hình 3.11: DEPT của hợp chất HH02

Khi so sánh phổ phổ NMR của HH01 và HH02 thì thấy chúng tƣơng tự

nhau, chỉ có sự khác nhau là nhóm hydroxy-methylene ở HH01 (δH 3,33 và

3,79; δC 60,6) đƣợc thay bằng nhóm –COOH (δC 179,2) ở HH02.

Nhƣ vậy, bằng cách phân tích cụ thể các dữ liệu phổ MS, NMR và so

sánh với dữ liệu trong tài liệu tham khảo [39,40] cũng nhƣ so sánh với chất

chuẩn trên bản mỏng cho thấy HH02 chính là axit betulinic. Axit betulinic

đƣợc biết đến là một hợp chất triterpenoid có hoạt tính sinh học đa dạng nhƣ

hoạt tính chống khối u, chống oxi hóa, kháng viêm chống HIV [41,42].

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH02

3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH03 (axit alphitolic)


nóng chảy 276-279 oC. Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho píc giả phân

39

tử ở m/z 473 [M+H]+ cùng với các tín hiệu cộng hƣởng trên phổ

13C-NMR và

DEPT cho phép xác định công thức phân tử của HH03 là C30H48O4.


Phổ 1H-NMR của hợp chất HH03 xuất hiện các tín hiệu của 6 nhóm

methyl singlet ở δH 0,81 (3H, s, CH3-25), 0,94 (3H, s, CH3-24), 0,99 (3H, s,

CH3-26), 1,01 (3H, s, CH3-27); 1,03 (3H, s, CH3-23); 1,72 (3H, s, H-30),

trong đó nhóm methyl singlet ở δH 1,72 cho thấy nhóm này đƣợc liên kết với

một nối đôi, hai proton olefinic có tín hiệu cộng hƣởng ở δH 4,62 (1H, s, H-

29a) và 4,73 (1H, br. d, J=2,0 Hz, H-29b) cũng đƣợc quan sát thấy. Ngoài ra,

còn có 2 proton ở δH 2,91 (1H, d, J=1,0 Hz, H-3); và δH 3,63 (1H, dt, H-2)

chứng tỏ chúng thuộc nhóm hydroxymethin, khác với HH02 chỉ có 1 nhóm

hydroxymetin ở vị trí H-3.

40


Phổ 13


bao gồm: 6 nhóm methyl, 10 nhóm methylen sp3, 1 nhóm methylen sp

2, 7

nhóm methin sp3 trong đó có 2 nhóm hydroxymethine δC 48,3 (C-2) và δC

84,4 (C-3). 5 cacbon bậc 4 lai hóa sp3, 1 cacbon bậc 4 sp

2 (δC 150,6), 1 nhóm

cacboxylic (δC 179,2).


41

Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03

Phân tích cụ thể các dữ liệu phổ và so sánh với dữ liệu trong tài liệu

tham khảo [43-45] cũng nhƣ so sánh với chất chuẩn trên bản mỏng cho thấy

HH03 chính là axit alphitolic.

Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH03

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH04 (axit oleanolic)

Hợp chất HH04 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng

chảy 286-287oC. Phổ khối ESI-MS cho píc ion giả phân tử ở m/z 457 [M+H]

+

phù hợp với công thức phân tử C30H48O3 .

42


Phổ 1H-NMR chỉ ra sự có mặt của 7 nhóm methyl singlet ở δH 0,77,

0,80, 0,90, 0,92, 0,93, 0,97 và 1,15. Sự có mặt của 1 proton olephinic cộng

hƣởng ở δH 5,26 (t, J = 3,5 Hz) và 1 proton sp3 cộng hƣởng ở trƣờng thấp δH

3,17 (dd, J 5,0, 11,0 Hz), cũng đƣợc quan sát thấy trên phổ proton tƣơng

ứng với H-12 và Hα-3. Phổ 13

C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 30

nguyên tử cacbon trong đó có 7 nhóm methyl, các tín hiệu của 5 nhóm methin

sp3 ở δC 42,5, 48,6, 56,2, 79,3 và 123,1, 10 nhóm methylen, 1 liên kết đôi, 1

nhóm –COOH và 8 cacbon bậc 4 sp3 ở δC 181,6, 144,7, 47,2, 42,1, 40,0, 39,4,

37,7 và 31,2. Sự có mặt của liên kết đôi đƣợc khẳng định bằng tín hiệu cộng

hƣởng δC 123,1, còn nhóm –COOH trên phổ đƣợc đặc trƣng bằng tín hiệu ở

181,6 ppm. Giá trị δC 79,3 và δH 3,17 gợi ý đến nhóm methin liên kết với –OH

ở C-3 là vị trí thƣờng thấy.

43



44


Bằng việc phân tích các dữ liệu phổ MS, 1

H-NMR, 13

C, DEPT-NMR có

thể kết luận hợp chất HH04 là một triterpen khung olean có một nhóm axit và

1 nhóm OH, cùng với tham khảo các tài liệu đã công bố [46,47], có thể kết

luận HH04 là axit oleanolic, một triterpen khung oleanan (có cấu trúc nhƣ

hình dƣới đây) đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật, và nó thể hiện hoạt

tính sinh học đa dạng nhƣ kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính gây

độc tế bào.

Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất HH04

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH05 (3, 9 –

dihydroxy-1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide hay hibiscolactone A)

Hợp chất HH05 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối

va chạm electron ESI-MS của hợp chất HH05 cho pic ion giả phân tử ở m/z

45

257 [M - H]-, cùng với các dữ liệu phổ

1H,

13C-NMR cho phép dự đoán công

thức phân tử của HH05 là C15H14O4.



nhóm methyl trong đó có 2 nhóm methyl doublet tƣơng đƣơng ở δH 1.40 (d,

6.9 Hz, 6H), một nhóm methyl singlet ở δH 2.43 và 3 tín hiệu của 3 proton ở

δH 3.67 (q, 6.9 Hz, 1H), 6.94, (s, 1H), 7.55 (s, 1H).

46


Phổ 13


gồm có 3 nhóm methyl trong đó trong đó có 2 nhóm methyl tƣơng đƣơng ở δC

23,8 ; 3 nhóm methin trong đó có 1 nhóm methin sp3 ở δC 30,6 và 2 nhóm

methin sp2 ở δC 114,8 và 120,2; còn lại là 9 cacbon bậc 4 sp

2 trong đó có một

nhóm cacbonyl ở δC 168,2, độ chuyển dịch hóa học của ba cacbon bậc 4 ở δC

132,7; 138,5; 157,9 gợi ý đến chúng có liên kết với nguyên tử oxy.

47


Từ những phân tích phổ trên gợi ý đến hợp chất HH05 là một

sesquiterpen có kiểu khung cadalen, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo

[48] cho thấy hợp chất HH05 là 3,9-dihydroxy-1,3,5,7,9 cadinapentaene-

14,2-olide hay hibiscolactone A.

Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05

3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH06 (heliclacton)

Hợp chất HH06 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối

ESI-MS (đo ở mode positive) cho pic ion giả phân tử ở m/z 261,1121 [M+H]+

(số khối lý thuyết tính cho công thức phân tử C15H17O4 là 261,1127), nhƣ vậy

kết hợp với dữ liệu trên phổ 13

C-NMR xác định đƣợc công thức phân tử của

HH06 là C15H17O4 và phân tử có 8 nối đôi tƣơng đƣơng.

48

Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06

Phổ 1H-NMR chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm methyl singlet ở δH 2,11 và

2,28, một nhóm methyl doublet ở δH 1,25 (3H, d, J 6,0 Hz) và tín hiệu của

5 proton thuộc vùng aliphatic.

Hình 3.28: Phổ 1H-NMR của hợp chất HH06

Phổ 13

C-NMR kết hợp với HSQC cho tín hiệu cộng hƣởng của 15

cacbon gồm có 3 nhóm methyl ở δC 8,3; 12,0; 18,9, hai nhóm methylen sp3 ở

δC 23,1 và 28,9, một nhóm methine sp3 ở δC 27,1 còn lại là 8 cacbon bậc bốn

sp2 và 1 nhóm carbonyl este.

Documents

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂYgust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26986.pdf · LỜI CAM ĐOAN 7ôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: