Presentacion Jornada Biodisponibilidad

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Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad, resistencia gastrointestinal e

interacción con la microbiota del colon de compuestos bioactivos

Blanca Viadel CrespoDpto Nuevos Productos

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Métodos in vitro para estimar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos

Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon

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Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos

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Boca: masticación y mezclado con la saliva que contiene enzimas que inician el proceso químico de la digestión, formándose el bolo alimenticio.

Digestión gástrica: transformación del bolo alimenticio en una masa más fluida llamadaquimo. Dicha transformación se realiza a través de la acción mecánica (contracciones u ondas peristálticas) y la secreción gástrica (jugo gástrico: constituido por proteasas, lipasas y el ácido clorhídrico).

Digestión intestinal: incremento de pH(mediante la liberación de bicarbonato de sodio), continúa la digestión de los componentes alimentarios por medio de la bilis (segregada por el hígado) y el jugo pancreático (proteasas, amilasas, lipasas) formándose el quilo. La mayoría de nutrientes se absorben en el intestino delgado

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NutrienteLocalización del proceso de digestión

Boca Estómago Intestino

Proteínas -

La enzima pepsina los degrada a Polipéptidos.

Las enzimas tripsina y quimiotripsina los degrada a Péptidos y posteriormente la enzima peptidasa los degrada en aminoácidos

Grasas -

La lipasa gástrica degrada los triglicéridos en Ácidos Grasos y glicerol.

La bilis las emulsiona y la lipasa pancreática las degrada en ácidos grasos, glicerol y monoglicéridos

Glúcidos Complejos (almidón y glucógeno)

La amilasa salival los degrada a disacáridos.

-

La amilasa pancreática degrada al almidón hasta maltosa (disacárido), y luego la enzima Maltasa la degrada hasta monosacárido

Glúcidos Simples (lactosa y sacarosa) - - Las enzimas lactasa y sacarasa

los degradan en monosacáridos


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Para que un nutriente cumpla con su efecto funcional en el organismo, se requiere que atraviese intacto el aparato digestivo (resistencia gastrointestinal), se absorban en el intestino delgado, alcancen niveles sanguíneos adecuados y mantengan concentraciones estables en el sitio de acción (biodisponibilidad)

El porcentaje de nutriente o compuesto bioactivo en un alimento,comida o dieta que es utilizado para las funciones corporales normales

(Fairweather et al., 1992)

Resistencia gastrointestinal


Biodisponibilidad

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La biodisponibilidad es el resultado de 3 etapas (Fairweather et al., 1995, 1996, 1997; Wienk et al., 1999)

Principales determinantes de la biodisponibilidad

Etapa 1 digestibilidad y solubilidad del nutriente o compuesto bioactivo en el tracto gastrointestinal

Factores dietéticos:-forma química en que éste se encuentre-solubilidad-interacciones con otros elementos presentes

Etapa 2 absorción y transporte a la circulación

Factores fisiológicos:-edad-posibles anomalías genéticas-estado fisiológico (embarazo, lactancia) y nutricional-estados patológicos-flora intestinal

Etapa 3 incorporación a una entidad funcional


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Técnicas propuestas para medir elgrado de biodisponibilidad de un nutriente

Métodos in vivo Métodos in vitro

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Métodos in vivo de la biodisponibilidad

Balance químico Mide la ingesta y excreción del nutriente o compuesto bioactivo por un período determinado de tiempo

Medición en plasma Consiste en la medición en plasma de un elemento tras la ingestión del mismo en grandes concentraciones

Marcaje por isótopos El marcaje con isótopos, se presenta como una alternativa en la estimación de la fracción absorbida y excretada de un animal


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Métodos in vitro de la biodisponibilidad

Solubilidad Incluyen una digestión gástrica con HCl o HCl-pepsina, posterior digestión intestinal mediante neutralización con una base (usualmente NaOH o NaHC03), incubación con pancreatina-extracto biliar y posterior centrifugación

Diálisis Consta de una digestión de la muestra con pepsina -HCl, y a continuación se introduce una bolsa de diálisis que contiene NaHC03. Tras incubación, se adiciona pancreatina-sales biliares, se incuba de nuevo y finalmente se determinan los contenidos de los elementos minerales del dializado. Dicha etapa simula el paso del intestino al torrente sanguíneo

Cultivos celulares La captación y transporte de nutrientes por la mucosa intestinal puede estudiarse in vitro utilizando, entre otros modelos experimentales, enterocitos


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Métodos in vivo vs in vitro

Métodos in vivo Métodos in vitro

- Lo ideal serían los estudios realizados en seres humanos: por ejemplo por el método de los balances, pero se trata de un método largo, laborioso y de baja precisión.- Este problema puede evitarse mediante el uso de radioisótopos. Los métodos in vivo que utilizan isótopos son costosos, requieren de instrumental sofisticado y se aplican a grupos restringidos de población (Yergey, 1996).- En los ensayos in vivo con animales, surgen dudas sobre si los resultados obtenidos pueden ser predictores fiables de la absorción de elementos en seres humanos (Reddy & Cook, 1991).

- Los métodos in vitro son de gran utilidad como etapa previa a la estimación de la biodisponibilidad de los nutrientes o compuestos bioactivos en seres humanos.- Estos métodos pueden constituir una buena alternativa para estudiar los efectos de los factores dietéticos sobre la biodisponibilidad de los nutrientes o compuestos bioactivos. - Son métodos menos laboriosos y tienen una gran significación biológica ya que ayudan a estimar el porcentaje de nutriente capaz de ser transformado, en el intestino, en una forma absorbible por el organismo.


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-la información obtenida a través de los sistemas in vitro tienen una gran significación biológica y aunque no puedan predecir los cambios in vivo que se producen en el organismo, ya que se tratan de métodos de simulación gastrointestinal, sí ayudan a comprender mejor los resultados obtenidos in vivo y a diseñar futuras experiencias a realizar en organismos vivos (Johnson, 1989).

-son métodos más rápidos, de menor coste y de fácil manipulación

-con posibilidad de toma de muestra en cualquier parte del tracto gastrointestinal

-con mejor reproducibilidad que los estudios in vivo

-no supone limitaciones éticas

Ventajas de los métodos de estimación de la biodisponibilidad in vitro

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Los métodos in vitro presentan inconvenientes que se pretenden solucionar

mediante el desarrollo de reactores o digestores in vitro


No existen técnicas o modelos perfectos para estudiar el grado de

biodisponibilidad de los nutrientes en el hombre, y es necesario

la acción conjunta de diversos sistemas in vitro e in vivo

para obtener una información completa de

la biodisponiblidad de

nutrientes

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El modelo TIM-1 desarrollado por el centro Holandés de Investigación Científica Aplicada TNO (Nutrition and Food Research)

Estomago artificial desarrollado por el Instituto Británico de Investigación Alimentaria de Norwich (IFR)

Modelo dinámico totalmente computerizado capaz de reproducir las condiciones fisiológicas del estomago (químicas y mecánicas), aportando además la novedad de una fase preliminar de masticación

Sistema de reactores que posibilita la reproducción de los movimientos peristálticos propios del sistema digestivo humano, compuesto por cuatro compartimentos que simulan el estómago y las distintas zonas del intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon)

Digestor Dinámico in vitro desarrollado por ainia

Sistema dinámico totalmente computerizado capaz de la realización de dos funciones: mecánica y físico-química


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El digestor dinámico in vitro diseñado y desarrollado por ainia reproduce las condiciones naturales del tracto gastrointestinal humano (estómago e intestino delgado) y sus características principales

- El digestor reproduce el proceso de digestión gastrointestinal.

- En el estómago se lleva a cabo la digestión gástrica de los alimentos, consistente en la transformación del bolo alimenticio en una masa fluida llamada quimo (digerido gástrico).

- Posteriormente continúa la digestión intestinal, donde se siguen descomponiendo los nutrientes y/o compuestos bioactivos, dando lugar al quilo (digerido intestinal).

- Tras alcanzar un adecuado tamaño, dichos compuestos se absorben a través del equipo de diálisis


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Especificaciones del Digestor Dinámico in vitro

-reproduce los movimientos peristálticos mediante impulsión de agua en cámaras flexibles (incrementa el grado de mezcla y trituración del alimento)

-controla la temperatura del agua de bombeo, lo que permite realizar la digestión a la temperatura deseada

-los bombeos se realizan a intervalos regulares en dos cámaras conectadas


-regula las condiciones de acidez a través de un control del Ph en la cámara del estómago y/o del intestino, mediante un electrodo que regula la adición de ácido o base.

-control total del proceso y de sus variables operativas y condicionantes (tiempo, concentraciones de reactivos, condiciones básicas que se dan en el tacto gastrointestinal…) con posibilidad de recolección y análisis de los datos obtenidos.

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Cámara 1 Cámara 2

Cámara 1 Cámara 2

Diagrama de flujo del Digestor Dinámico in vitro

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• estudiar la biodisponibilidad de los compuestos seleccionados para un alimentoEjm. Evaluación de la cantidad de minerales que se absorben por el organismo tras el proceso de digestión

• estudiar las interacciones entre nutrientes de un alimentoEjm. Identificación de los compuestos de los alimentos que son capaces de aumentar o disminuir la biodisponibilidad de sus nutrientes.

• determinar el efecto de los pretratamientos de alimentos sobre la biodisponibilidadEjm. Análisis de las diferentes variables de cocinado de un alimento y cómo estas variables influyen en la mayor o menor absorción de minerales del alimento por parte del organismo

• estudiar nuevas formulaciones que posibiliten una mejor absorción de los nutrientesEjm. Análisis de las diferentes formas de incorporación del ingrediente funcional (omega 3, probióticos, fibra…) a un alimento y validar aquellas que son más óptimas para su ingesta adecuada

• estudiar la resistencia al tracto gastrointestinal de compuestos alimentariosEjm. Determinar la viabilidad de los probióticos tras su paso a través del tracto gastrointestinal

• verificar la eficacia de la microencapsulación de compuestos alimentariosEjm. Validar la técnica de microencapsulación de compuestos bioactivos mediante la evaluación a la resistencia al tracto gastrointestinal de dichos compuestos

Aplicaciones del Digestor Dinámico in vitro

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Sistema integrado Digestor Dinámico in vitro/cultivos celulares

Digestor Dinámico in vitro

Monocapa celular Caco-2

Estudio absorción/transporte intestinal

Estudio funcionalidad órgano diana

Bioensayo celular en células Raw 264.7

Determinación en la monocapa celular y en la parte basal de compuestos bioactivos biodisponibles

Determinación la capacidad inmunoestimulante mediante análisis de expresión de genes por RT-PCR

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Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del

colon

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Dicha absorción se realiza lentamente y al final solo queda en el digerido intestinal los materiales no digeribles, junto con el agua y los minerales que se han segregado en las diferentes fases del proceso digestivo

Durante el proceso de digestión gastrointestinal los nutrientes que ya han alcanzado un tamaño adecuado y son de utilidad atraviesan la pared intestinal

Esta mezcla pasa al intestino grueso, donde se inicia el proceso de fermentación por acción de la microbiota intestinal

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La microbiota del intestino incluye especies nativas que colonizan permanentemente el tracto gastrointestinal, y microorganismos vivos que transitan temporalmente por el tubo digestivo (Guarner y col., 2003).

Las bacterias nativas se adquieren al nacer y durante el primer año de vida, mientras que las bacterias en tránsito se ingieren continuamente a través de los alimentos, bebidas, etc

Luz intestinal

Enterocitos(células epiteliales intestinales

Microorganismos

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En el estómago y el duodeno, el número de microorganismos se ve reducido debido a las secreciones ácidas, biliares y pancreáticas

En el intestino disminuye la acidez lo que facilita la colonización bacteriana, fundamentalmente en el intestion grueso.

Entre los grupos bacterianos más abundantes en esta zona destacan miembros del género (Gibson y Roberfroid, 1995; Guarner, 2006) :

- Bacteroides- Bifidobacterium- Eubacterium- Clostridium- Lactobacillus- Cocos Gram-positivos

En menor proporción:

- Enterococos- Representantes de la familia Enterobacteriaceae

Distribución bacteriana en el tracto gastrointestinal humano (figura modificada de B. Sartor Gastroenterology, 2008)

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Bacterias que segregan bacteriocinas que impiden la

implantación de bacterias extrañas al ecosistema

Principales funciones de la microbiota presente en el colon

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Principales grupos bacterianos del colon en función de sus efectos beneficiosos y perjudiciales sobre la salud (Salminen y col., 1998, modificada)

Bacteroides

Eubacterias

Bifidobacterias

Peptoestreptococos y Ruminococos

Costridios

Lactobacilos

Enterobacterias

Sulfato reductoras y Fusobacterias

Veillonellas

Estafilococos

104 CFU/g

1011 CFU/g

Efectos perjudiciales

- Putrefacción- Producción de toxinas- Producción de carcinógenos

Efectos beneficiosos

- Disminución de la producción de gas- Producción de SCFA- Efecto inmunoestimulante- Actividad antitumoral

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El intestino grueso es el sitio principal para la biotransformación de moléculas endógenas y exógenas.

El intestino grueso es el sitio principal para la biotransformación de moléculas endógenas y exógenas.

Sin embargo la inaccesibilidad impide el estudio de la actividad metabólica y ecológica de la microbiota. Además los estudios con humanos y con animales para estudiar esta región son costosos y tienen inconvenientes éticos.

Sin embargo la inaccesibilidad impide el estudio de la actividad metabólica y ecológica de la microbiota. Además los estudios con humanos y con animales para estudiar esta región son costosos y tienen inconvenientes éticos.

No existe un método ideal, sino una combinación de métodos que se deben utilizar para identificar el papel de las bacterias intestinales en el metabolismo de compuestos. No existe un método ideal, sino una combinación de métodos que se deben utilizar para identificar el papel de las bacterias intestinales en el metabolismo de compuestos.

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Métodos in vitro de digestión del colon publicados

1. Cultivos en baños estáticosEs el más simple de los fermentadores in vitro, ya que son baños de cultivos estáticos. Tienen la ventaja de la simplicidad y facilidad de uso. Sin embargo una de las desventajas de esta metodología es su adecuación sólo por períodos de incubación muy corto (Coates et al., 1988).

2. Sistemas de cultivo semi-continuo y continuoPermiten reproducir con mayor exactitud las condiciones gastrointestinales, se trata de sistemas que añaden continuamente medio de cultivo fresco y al mismo tiempo eliminan el cultivo gastado (Coates et al., 1988; Gibson et al., 1988).

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Métodos in Vitro de digestión del colon publicados

3. Simulador del ecosistema intestinal microbiano humano (SHIME)Un sistema más complejo fue desarrollado por Molly et al. (1993) que consiste en un reactor de cinco etapas (estgómago, intestino, colon ascendente, transversal y descendente). Este reactor puede evaluar la dinámica de la ecología microbiana del tracto gastrointestinal (Molly et al., 1994).

4. Sistema de control computerizado y con la absorción de agua, los movimientos peristálticos, y la absorción de productos de la fermentación (TIM2)Minekus et al. (1999) introdujo un nuevo tipo de sistema que combina la eliminación de los metabolitos y el agua.

5. La inmovilización de la microbiota fecal La inmovilización de las bacterias asegura la eliminación de las células muertas favoreciendo con ello un óptimo crecimiento de las células inmovilizadas Cinquin et al. (2004; 2006).

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El Digestor in vitro de Fermentación Colónica desarrollado por ainia, reproduce el proceso de digestión gastrointestinal (estómago , intestino delgado y colon)


En el estómago se lleva a cabo la digestión gástrica de los alimentos, consistente en la transformación del bolo alimenticio en el quimo (digerido gástrico)

Posteriormente continúa la digestión intestinal, donde se siguen descomponiendo los nutrientes y/o compuestos bioactivos, dando lugar al quilo (digerido intestinal)

Posteriormente, en el intestino grueso (colon ascendente, transversal y descendente) tiene lugar la fermentación por acción de la microbiota intestinal

Estómago Intestino delgado

Colon ascendente

Colon transversal Colon

descendente

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Especificaciones del Digestor in vitro de Fermentación Colónica (DIF)

-funcionamiento del sistema en continuo, simulando las condiciones reales del tracto digestivo

-reproducción de tres tipos de medio de reacción, simulando las condiciones del colon ascendente, transversal y descendente

-control del pH en todos los reactores, mediante electrodos que regulan la adición de ácido o base

-Control de temperatura mediante el bombeo de agua a 37ºC


-Mantenimiento de todo el sistema de reacción en condiciones de anaerobiosis, para asegurar la ausencia de oxígeno a lo largo de todo el proceso

-posibilidad de recolección y análisis de los datos obtenidos

- monitorización del crecimiento de la flora bacteriana característica presente en el colon

Colon ascendente

Colon transversal

Colon descendente

Estómago Intestino

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300 ml medio de cultivo

Permanencia 2h Permanencia 6h

Extracto biliar-

pancratina

Flujo contínuo ( )

HCl NaOH

NaOH NaOH NaOH

Estómago Intestino Colon ascendente

(CA)

Colon transversal

(CT)

Colon descendente

(CD)

Flujo discontínuo (-----------)

Permanencia 76 horas

pH: 2-1.7 pH: 5-6 pH: 5.5-6 pH: 6-6.4 pH: 6.4-6.8

300ml 450ml 1000ml 1600ml 1200ml

Diagrama de flujo del Digestor in vitro de Fermentación Colónica

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Aplicaciones

- estudiar la resistencia al tracto gastrointestinal de compuestos alimentarios

- evaluar las propiedades fermentativas de ciertos compuestos tales como fibras, prebióticos y prebióticos mediante el análisis de metabolitos como ácidos grasos de cadena corta o aminoácidos

- estudiar la composición y actividad metabólica de la microbiota del colon

- estudiar la interacción de patógenos y probióticos con la microbiota del colon

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Sistema integrado Digestor in vitro de fermentación colónica/cultivos celulares

Evaluación de la capacidad de adhesión de bacterias intestinales a la monocapa de las células

Digestor Dinámico in vitro

Estudio de la interacción de los agentes patógenos y los probióticos con las células intestinales

Células Caco-2

Células HT-29

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Nuevos productos

Ingenieria y Procesos

Instrumentación y automática

Bioensayos

Blanca ViadelMaite NavarroElisa Gallego

Mariana ValverdeDaniel Rivera

Jose Luis GómezSonia PortaLidia Tomás

Gracias por su atención

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