7

Visoka zdravstveno sanitarna kola strukovnih studija Visan, BeogradPredmet: Farmaceutsko zakonodavstvo i etika

Predklinika ispiticanja

Mentor: Student: Predrag Vukomanovi Andjela Mirkovi 4-V/14

U Beogradu,12,2014

Sadraj:

Uvod...........................................................................................................3Pretklinika ispitivanja............................................................................4Farmakodinamska ispitivanja................................................................4Toksikoloka ispitivanja..........................................................................6Ispitivanje akutne toksinosti.................................................................6Toksinost viekratno primenjenih doza,hronina toksinost............7Ispitivanja genotoksinosti i mutagenosti.............................................7Ispitivanje reproduktivne toksinosti....................................................8Ispitivanje kancerogenosti......................................................................8Ispitivanja podnoljivosti i sigurnosti....................................................9Farmakokinetska i toksikokinetska ispitivanja....................................9Zakljuak.................................................................................................10Literatura.................................................................................................11

Uvod:

Razvoj novih lekova obuhvata predkliniku I kliniku fazu. Tokom predklinike faze vri se odabir izmedju molekula, koje bi mogle u budunosti postati lek.U sklopu predklinikih ispitivanja sprovode se fiziko-hemijska ispitivanja: in vitro,koja obuhvataju ispitivanja fiziko-hemijskih svojstava ispitanih molekula, njihovu stabilnost, rastvorljivost I permeabilnost,I ispitivanja na ivotinjama in vivo, farmakodimanska, farmakokinetska I toksikoloka ispitivanja.In vitro i in vivo pretklinika ispitivanja potencijalnog leka se sprovode u skladu sa principima dobre laboratorijskoprakse, pri emu je za ispitivanja na ivotinjama neophodno dobiti saglasnost Etike komisije za rad sa eksperimentalnim ivotinjama.Posle dobijanja povoljnih rezultata predklinikih studija, sprovode se ispitivanja na ljudima, klinike studije, koja imaju za cilj da se otkriju farmakodinamske osobine ispitivanog potencijalnog leka, njegova neeljena delovanja I farmakokinetika u cilju odredjivanja delotvornosti I sigurnosti ispitane supstance kod ljudi. Klinika ispitivanja se sprovode u skladu sa principima dobre klinike prakse.

Predklinika ispitivanja

Farmakodinamska ispitivanja

Obuhvataju delovanje leka na organizam, mehanizam dejstva, ciljne structure na koji potencijalni lek deluje (receptori, jonski kanali, enzimi), ispitivanja odnosa doze I efekta leka, odnos structure I efekta leka.U odnosu farmakodinamskih pretklinikih ispitivanja, sprovode se farmakodinamski testovi koji imaju za cilj da se utvrdi potencijalnog leka na glavne organske sisteme labaratoriskih ivotinja. Pomou njih se otkriva organ ili sistem na koji ispitivana supstanca ispoljava najpovoljnije potencijalno terapijsko dejstvo. Za farmakodinamske testove se najee koriste glodari, mievi I pacovi.

Farmakodinamski testovi obuhvataju ispitivanja:Spontane aktivnosti Eventualnog analitikog delovanja(centralnog i perifernog)Hipnotikog delovanjaPsihomotorne koordinacijePotencijalnog anksiolitikog delovanjaPotencijalnog antidepresivnog delovanjaUticaja na krvni pritisak,sranu frekvencu I respiracijuUticaja na pokretljivost gastointestinalnog traktaUticaja na metabolizam (koncentracija glukoze u krvi,koncentracija lipida)

Najee korieni testovi za ispitivanje potencijalnog analigetikog delovanja su metode vrele ploe, test uvijanja I test radijacione toplote

1. Metoda vrele ploe zasniva se na merenju reakcionog vremena od momenta stavljanja ivitinje na vrelu plou (zagrejana na temperature od 52 do 53 stepena) do momenta lizanja zadnje ape usled pojave bola. Nakon izlganja vreloj ploi,ivotinja prvo lizne prednju ape je integrisano u viim sferama mozga, dok su prava dva refleksa tipina za nie sfere I kimenu modinu. S obzirom na to, metoda vrele ploe je pouzdan metod za ispitivanje analgezije koja se ostvaruje centralnim mehanizmima.2. Test radijacione toplote zasniva se na usmeravanju snopa svetlosti na vrh repa labaratoriske ivotinje,pri emu se izaziva bol i spinalni odbrambeni refleks pomeranja repa. Supstance iji mehanizam delovanja obuhvata spinalnu analgeziju znaajno poveavaju prag za nastanak bola I produavaju vreme izlaganja repa ivotinje-toplotnoj drai bez izazivanja odbrambenog refleksa.3. Ukoliko ispitana supstanca analgetiko delovanje ostvaruje inhibicijom sinteze prostaglandina to je mehanizam delovanja neopijatnih analgetika tj. Nesteroidnih antiinflamatornih lekova, efikasan metod za ispitivanje analgetikog dejstva je test kojim se bolna dra provocira intraperitonealnom primenom rastvora siretne kiseline zbog ega se kod teretnih ivotinja javljaju karakteristini grevi. Ukoliko ispitivana supstanca poseduje analitiko delovanje broj greva e biti znaajno manji u grupi tretiranoj kombinacijom siretne kiseline I ispravne supstance u odnosu na grupu tretiranu samom siretnom kiselinom.4. Poremeaj psihomotorne koordinacije moe se javiti posle primene odredjenog broja lekova. Ovaj poremeaj je posebno karakteristian za lekove koji se koriste u leenju anksioznosti, antidepresive, lekove u leenju psihoza, antihistaminike I moe se ispraviti na ivotinjama metodom rotirajueg tapa.5. Vaan farmakodinamski test, pomou koga se ispituje potencijalno hipnotiko delovanje je test merenja vremena trajanja spavanja izazvanog primenom hipnotika pentabaribitala. Ukoliko ispitivana supstanca ispoljava hipnotiko dejstvo, spavanje ivotinje izazvano pentobarbitalom e biti produeno. Takodje, pomenutim testom se ispituje I uticaj na aktivnost enzima koji uestvuju u biotransformaciji pentobarbitala. U okviru farmakodinamskih testova, uticaj supstance na funkciju centralnog nervnog sistema labaratoriskih ivotinja se odredjuje merenjem finih miinih pokreta koji se ne mogu uoiti posmatranjem ivotinje. Supstance koje stimuliu pokretljivost centralnog nervnog sistema (kofein,kokain), poveavaju broj spontanih pokreta skeletne muskulature tretiranih ivotinja.6. Farmakodinamski testovi za ispitivanje potencijalnog antidepresivnog efekta lelca obuhvataju test u visecem poloaju, test podrazumeva privrenje mieva na visini od 58cm. Neposredno nakon imobilizacije mieva, prirodno je da pokuavaju da se isprave ,pri emu su nemirni. U jednom momentu prestaju da se suprostavljaju viseem poloaju. Ukoliko ispitivana supstanca ispoljava antidepresivnu aktivnost, produava se trajanje pokuaja mia koji visi da se vrati u fizioloki uobiajni poloaj.7. Tokom testa, nakon aplikovanja leka, mievi se ubacuju u cilindar napunjen vodom I posmatra se ponaanje mia. Mi se smatra nepokretnim kada lebdi pasivno, vrei samo minimalne pokrete neophodne da mu glava bude iznad vode . Ukoliko ispitivana supstanca ispoljava antidepresivnu aktivnost trajanje pasivnog lebdenja u void se skrauje, a produava vreme plivanja mia,tj. ivotinja se motivie za suprotstavljanje neprirodnim nefiziolokim uslovima. Za ispitivanje potencijalnog anksiolitikog efekta ispitivane supstance korisni farmakodinamski testovi su testovi su test lavirinta I test otvorenog polja.8. Tokom lavirint testa, mievi se postavljaju u standardne ograniene prostore koji se sastoje od dva otvora, dva zatvorena dela I centralne platform. Otvoreni delovi se nalaze jedan naspram drugog odvojeni medjusobno centralnom platformom. Nakon aplikovanja leka mia treba postaviti u centralni deo, I okrenuti ga ka jednom od otvorenih delova. Test traje 5min. Neophodno je meriti vreme provereno u otvorenim I zatvorenim delovima, kao broj ulazaka mia u otvorene I zatvorene delove. Ukoliko ispitivana supstanca ispoljava anksiolitiko delovanje, produava se vreme boravka mia u otvorenim delovima I poveava se broj ulazaka ivotinje u otverene delove.9. Test otvorenog polja podrazumeva postavljanje mia nakon aplikovanja leka u centar staklene arene iji je pod izdeljen u 16 jednakih kvadrata. Tokom 5 min trajanja testa prati se specifino ponaanje mia. 10. Merenje krvnog pritiska I registrovanje EKG promena, najee su farmakodinamske metode za ispitivanje funkcije kardiovaskularnog sistema. Precizni efekti uticaja kardioaktivnih lekova se mogu videti primenom supstanci pomou infuzione pumpe u jugulacnu venu laboratorijske ivotinje. Istovremeno, ivotinja je prikljuena I na EKG aparat. Na ovaj nain se precizno mogu uoiti prve reakcije miokarda na primenu ispitivane supstance, kontimirana reakcija I toksini efekti, a na osnovu brzine mogue je izraunati dozu supstance koja je pomenute promene izazvala.11. Farmakodinamski efekti supstanci koje utiu na funkciju respiratornog centra efikasno se procenjuju merenjem broja respiracija u minute I odredjivanjem parcijalnog pritiska kiseonika I ugljendioksida u kapilarnoj krvi. Gasnim analizama kapilarne krvi oglednih ivotinja, uoava se npr. da morfin dozno-zavisnim mehanizmom smanjuje osetljivost respirativnog centra, na parcijalni pritisak ugljen-dioksida, koji je povien kod ivotinja tretiranih viim dozama morfina.12. Promena peristatike tankog creva usled primene neke supstance najee se ispituje na mievima. Princip metode sastoji se u tome da se ivotinjama per os daje 10% na suspenzije medicinskog uglja. Nakon 30min, mievi se rtvuju I nakon preparacije tankog creva, meri se udaljenost medicinskog uglja, (crni sadraj), od slepog creva ivotinja. Kod kontrolne grupe ivotinja, udaljenost je u interval od 8-12cm. Ako supstanca smanjuje mortilitet intestinalnog trakta (antidijaroici: loperamid, opijatni analgetici:mortin, antagonisti, acetilholina na muskarinskim receptorima: atropine), udaljenost na medicinskog uglja od slepog creva I obrnuto.13. Da bi ispitali farmakodimatski efekti supstanci sa potencijalnim antidijabetesnim delovanjem, neophodno je izazvati dijabetis kod labarotorijskih ivotinja. Dijabetis se najee indikuje primenom aloksana ili streptozotocina. Aloksan izazivanjem oksidativnog stresa unitava beta elije endokrinog pankreasa I tako izaziva dijabetis. Danas se istraiovanja esto sprovode u pravcu prouavanja supstanci koje imaju sposobnost spreavanja beta elija endokrinog pankreasa, kao I sposobnost izazivanja njihovog umnoavanja I uveavanja ime bi se povealo luenje insulin I poboljala gliko regulacija.

Toksikoloka ispitivanja:

U okviru toksikolokih ispitivanja se odredjuje akutna, subaktutna I hronina toksinost, uticaj na reprodukciju, mutagenost, genotoksinost I kancerogenost. Kandidat za lek, koji je zadovoljio kriterijume poetnog odabira I kome je grubo odradjen potencijalni farmakoloki profil, ulazi u detaljna pretklinika ispitivanja koja obuhvataju odredjivanje sigurnosti I ispitivanje farmakokinetskih osobina.

Ispitivanje akutne toksinosti

Efekti jednokratnih doza moraju se sprovesti na najmanje dve vrste sisara. Tokom ispitivanja akutne toksinosti poeljno je odrediti maksimalnu dozu pri kojoj se jo ne javljaju toksini efekti minimalnu letalnu dozu(najmanju dozu koja izaziva smrt ivotinje) srednju lefalnu (LD50), (doza koja izaziva smrt 50% ivotinja).Ispitivana supstanca se primenjuje intravenski I obavezno na nain za koji se predpostavlja da e se primeniti kod ljudi. To moe biti per os,intramuskularna, suplcutana, intraperitonealna, inhalaciona I transdermalna primena.U ispitivanjima akutne toksinosti koriste se glodari (mievi I pacovi) I neglodari. Ispitivanje se sprovodi posebno na enkama I mujacima sa najmanje 3 razliite doze. Svaka primenjena doza se ispituje na najmanje 6 mujaka I enki,tako da je najmanji broj glodara koji se ukljuuje u ispitivanje akutne toksinosti oko 200-300. Posle sprovodjenja testova akutne toksinosti, preivele ivotinje se posmatraju najmanje 14 dana, a na kraju posmatranog perioda ivotinje se rtvuju I vre se makropatoloke I listopatoloke analize. Imajui u vidu das u danas razvijeni testovi toksinosti in vitro, ispitivanja akutne toksinosti potrebno je sprovoditi na to je mogue manjem broju ivotinja. Pretklinika toksikoloka ispitivanja, iz etikog razloga sprovode se u skladu sa tzv. Principom 3R. Replacement-zamena ivotinjskog modela in vitro ispitivanjima, Reductuon-smanjenje broja ivotinja ukljuenih u ogled(to se postie korienjem istog sloja labaratoriskih ivotinja, identinog genetskog porekla, kako bi se smanjile intertndividualne razlike I smanjila standardna devijacija parametra koji se ispituju, Refinementi-poboljanje I tehniko usavravanje modela ispitivanja tj. Primena tehniki preciznijih metoda I aparata kojima bi se znaajno umanjile grekemerenja.Tokom ispitivanja akutne toksinosti neophodno je pratiti znakove koji prethode smrtnom ishodu ivotinja, nakostreenost dlake, poremeaj koordinacije, krvarenje.

Ispitivanja genotoksinosti i mutagenosti

Testovi genotoksinosti I mutagenosti odredjuju da li ispitivana supstanca ima potencijal da izazove oteenje gena I mutaciju polnih I somatskih elija. Tekstovima genotoksinosti se moe utvrditi potencijal ispitivane supstance za izazivanje malignih oboljenja. Ova ispitivanja moraju biti zavreni pre poetka II faze klinikih studija tj. Pre primene potencijalnog leka na obolelim osobama.

Ispitivanje reproduktivne toksinosti

Testovi reproduktivne toksinosti obuhvataju ispitivanja

a) fertiliteta (sposobnosti oplodnje) i ranog embrionalnog razvoja (ispitivana supstanca se primenjuje pre parenja, sve do oplodnje); uticaj na mogunost parenja,prati se ponanje pre parenja I polna elja, kao I sposobnost zaea.b) embrio-fetalnog razvoja, to ujedno predstavlja I ispitivanje potencijalne teratogenosti (ispitivana supstanca se primenjuje skotnim enkama u period organogeneze (to je kod pacova period od 6 do 15 dana gestacije)c) prenatalnog i postriatalnog razvoja (kada se ispitivana supstanca primenjuje od 6-og dana gestacije do 21-og dana laktacije kod pacova); prati se uticaj na tok trudnoe, porodjaj, broj fetusa, broj ivorodjenih I mrtvo rodjenih mladunacad) multigeneracijske studije, kada se ispitivana supstanca primenjuje na vie generacija laboratorijskih ivotinja.

Tokom ispitivanja reproduktivne toksinosti na mujacima, odredjuje se uticaj ispitivane supstance na broj i pokretljivost spermatozoida I vijabilnost (odrivost) sperme.

Ispitivanja kancerogenosti

Cilj ispitivanja kancerogenosti je da se dokae potencijal leka za izazivanje malignih tumora ivotinja I da se odredi koliko su rezultati ispitivanja kancerogenosti na ivotinjama relevantni za ljude. Za svaku supstancu koja se namerava ispitivati na ljudima neophodno je sprovesti ispitivanja kancerogenosti. Nakon ispitivanja uporedjuje se broj maligniteta kod kontrolnih I ispitivanih ivotinja I analiziraju se mogui rizici pojave maligniteta usled primene ispitivane supstance. Ako se broj maligniteta kod ispitivanih ivotinja znaajno razlikuje u odnosu na kontrolne, supstanca ima kancerogeni potencijal. Ispitivanja kancerogenosti se sprovode tako da se potencijalni lek primenjuje putem hrane ili vode za pie doivotno, a pojava tumora se odredjuje posle uginua ivotinja ili pre smrti, patohistolokom analizom pogodjenih tkiva. Testovi kancerogenosti se sprovode tako da se potencijalni lek primenjuje putem hrane ili vode za pie doivotno, a pojava tumora se odredjuje posle uginua ivotinja ili pre smrti, patohistolokom analizom pogodjenih tkiva.Testovi kancerogenosti su dugotrajni 2 godine traju na pacovima, 7 godina na psima I majmunima, tako da se danas najee kancerogenost ispituje na geteski modifikovanim mievima u trajanju od 6 meseci.

Ispitivanje podnoljivosti i sigurnosti

Tokom pretklinikih ispitivanja prate se neeljena dejstva kod ivotinja, ime se dolazi do informacija o potencijalno tetnim efektima nove molecule. Postoje neeljena delovanja, koja ukoliko se jave na ivotinjama, najverovatnije e se javiti I kod ljudi: oteenje centralnog i perifernog nervnog sistema labaratoriskih ivotinja su neeljena delovanja koja se ne mogu sa velikom pouzdanou preneti I na ljude.

Farmakokinetska I toksikokinetska ispitivanja

Farmakokinetska ispitivanja obuhvataju prouavanje resorpcije sa mesta: primene do sistemske cirkulacije raspodelu u organizmu, biotransformaciju i ekskreciju potencijalnog leka. Rezultat biotransformacije I ekskrecije je eliminacija iz organizma. Tokom farmakokinetskih ispitivanja naroito panja se posveuje ispitivanju uticaja nove molecule na funkciju mikrozomalnih enzima jetre. Mikrozomalni enzimi jetre su od kljunog znaaja za biotransformaciju ksenobiotika (materija stranih organizama), a potencijalni lek moe indukovati ili inhibisati njihovo delovanje I tako stupati u znaajne interakcije sa drugim supstancama sa kojima se istovremeno primenjuje[footnoteRef:1]. [1: Aleksandar Rakovi, stavljanje leka u promet,pretklinika i klinika ispitivanja leka 1-7]

Zakljuak:

Delovanje leka na ivotinjama esto se razlikuje u odnosu na delovanje kod ljudi, farmakokinetski parametric, takodje se esto razlikuju izmedju ivotinja I ljudi,I konano neke bolesti koje se javljaju kod ljudi, ne pojavljuju se kod ivotinja, tako da se nakon ispitivanja na ivotinjama potencijalni lekovi moraju ispitati na ljudima.

Literature:Aleksandar Rakovi, stavljanje leka u promet,pretklinika i klinika ispitivanja leka 1-7