CUIDADOS Y REGENERACION DE

COLUMNAS HPLC

Regeneración de una columna Adsorción irreversible de las impurezas

derivadas de la matriz en la cabeza de la columna puede causar cambios en la selectividad o de división de picos. A menudo esas "columnas suciaa" puede ser regeneradas mediante la aplicación de los siguientes protocolos.

La regeneración de empaque RP

RP-empaques son fases estacionarias C18, C8, C4, C1, C30, CN o fenilo.

Lavar la columna con 20 volúmenes de columna ( agua) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Acetonitrilo ) Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (Isopropanol ) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna(Heptano) Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (Isopropanol ) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Acetonitrilo )

La regeneración de empaque NP (fase normal) NP-empaques son sílice, Diol, nitro y amino fases estacionarias. Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Heptano) Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (Isopropanol ) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Acetonitrilo

) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna ( agua) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Acetonitrilo

) Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (Isopropanol ) Lavar la columna con 20 volúmenes de columna (Heptano)

La regeneración de empaque de intercambio de iones

Los empaque de intercambio ionico son de aniones o cationes (WCX, SCX, WAX y SAX)

• Lavar la columna con 20 volúmenes de columna del mismo eluyente, pero el doble concentracion de buffer.

• Siga el protocolo de regeneración de empique RP (véase más arriba)

• Lave con 20 volúmenes de columna (agua)

• Equilibrar la columna ahora a las condiciones originales.

Columnas a base de polimeros Fases estacionarias a base de polímeros muestran una

mayor estabilidad del pH, pero menor estabilidad mecánica, en comparación con las columnas a base de sílice. También, empaques a base de polímeros no son compatibles con todos los disolventes orgánicos. Se hinchan o se contraien en algunos disolventes orgánicos. Desafortunadamente, la estabilidad de la presión y la compatibilidad del disolvente son diferentes para la diferente naturaleza de los polímeros y de fabricante a fabricante. Por lo tanto, no hay reglas generales para el cuidado de la columna de materiales basados en polímeros no se pueden dar. Lea siempre las instrucciones para el uso de esas columnas. En caso de duda, póngase en contacto con el fabricante correspondiente.

endcapping El término "endcapping" fue introducido a finales de los

años 70, cuando se hizo evidente que algunos silanoles son todavía accesibles después de modificación superficial con cadena larga ligandos.

Trimetilclorosilano es el reactivo más común para cubrir accesibles silanoles residuales. Esta molécula es relativamente pequeño y puede penetrar a la superficie de la sílice y para abarcar "tope" algunas áreas irregulares de silanoles sin reaccionar. Por lo general, conduce a la mejora significativa de las propiedades adsorbentes de fase reversa (menos asimetría y retención más predecible de compuestos polares).

COLUMNA

LA COLUMNA: Es responsable de la separación de los componentes.

Requerimiento generales para una columna:

• Funcionamiento reproducible de columna a columna

• Suficiente numero de platos teóricos para el análisis.

• Empaque de partícula de tamaño uniforme.

• Fácilmente obtenible.• Larga duración (resistente)• Bajo costo.

COLUMNA

Frit El componente poroso en

cualquiera de los extremos de una columna que sirve para contener el empaque de columna. Es colocado a los extremos de los tubos de la columna, o más comúnmente, en el final del fitting. Los Frits son hechos de acero inoxidable u otro metal inerte o plástico, como PTFE poroso o polipropileno.

Fittirng final y Frits (aparte del empque de la columna, estas partes de la columna son mas susceptibles de dañarse por uso inapropiado). El empaque de la columna se sostiene dentro de la columna por los trits, y los frits se sostienen dentro de la columna por el Fitting final.

COLUMNA

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LONGITUD Las columnas vienen a tamaños diferentes, con el

diámetro interno (i.d). de la mayor parte de columnas igualan a 4.6 milímetros (el mm) = 0.46 centímetros La longitud de la columna es por lo general 10 o 15 cm de largo,

CARACTERISTICAS COLUMNAS

RELLENOS DE COLUMNA

Causas de falla en una Columna

Para que la columna LC funcione bien , debe guardarse en la forma adecuada. Hay varias formas que la columna puede ser dañada, y esto se evidencia en el cromatógrama.

• Picos de la muestra serán más amplios y no simétricos,

• los tiempos de retención de diferentes picos pueden cambiarse,

• La separación generalmente será más pobre

Causas de falla en una Columna

Las causas mas importantes por las cuales una columna falla son:

• Ataque químico

Taponamiento de la columna con partículas

• Choques mecánicos• Adsorciòn de impurezas

Ataque químicoLas causas mas importantes por las cuales una columna falla

son:• Ataque químico Ciertas fases móviles pueden quitar la fase enlazada

de la superficie de la partícula de silicona, rompiendo el enlace químico que sostiene esta capa orgánica a la silicona.

Además estas mismas fases móviles a menudo pueden disolver a la misma silicona. Las mas agresivas son las fases móviles que son básicas (el pH mayores que 7) o fuertemente ácidas (el pH menos de 2.5).

Entonces la mayor parte de cromatografistas evita estos extremos de pH al desarrollar las condiciones para un procedimiento LC.

Si usted realmente trabaja en el pH más alto, es posible usar los empaques de columna que sobre todo son diseñados para soportar pH extremos.

TAPONAMIENTO DE LA COLUMNA

• Taponamiento de la columna con partículas

La segunda causa de falla de columna es el taponamiento del frit o el empaque de la columna por las pequeñas partículas de residuos . Estas partículas a menudo son introducidas con la muestra, lo cual quiere decir que cualquier muestra que contiene partículas debería ser filtrada, usando un filtro de 0.5 micras que esta diseñado para muestras de HPLC. Si usted está en la duda sobre la presencia de partículas en la muestra, solamente sostenga la solución de la muestra (que usted va a inyectar) contra la luz, y agite con cuidado. Usted debería ser capaz de ver partículas flotantes o un aspecto nublado - si hay cualquier problema.

TAPONAMIENTO DE LA COLUMNA• Taponamiento de la columna con partículas El taponamiento de columna también puede ser causado por

partículas en la fase móvil o arrastradas del sistema normal HPLC. Los sellos de bomba y las partes móviles del inyector de la muestra gradualmente se arrastran, deshaciéndose las partículas que pasan a la entrada de la columna. Las fases móviles que están constituidas de solventes HPLC, con nada más añadido, por lo general no tienen problema de partículas, si la cristalería usada es limpia y los depósitos son cubiertos para no dejar pasar el polvo. Estos solventes son filtrados con cuidado por el fabricante. Sin embargo si los elementos sólidos como buffers o reactivo de par iónico son añadidos a la fase móvil, es buena práctica filtrar las fases móviles finales antes del empleo. Partículas llevadas de sistema - que puede ser un problema importante – se maneja mejor usando un filtro en linea entre el inyector y la entrada de columna.

Choques mecánicos• La tercera causa de daño de columna es el choque

mecánico. Recuerde que la columna es un artículo caro, varios cientos de dólares, entonces trátelo con el respeto que esto merece. No deje caer la columna, y cuando no es instalado sobre el sistema LC lo ponen con cuidado en su caja original para la protección.

• Hay otros modos de dañar una columna, además de la golpeadura de ella. La fase móvil que se mueve por la columna ejerce una fuerza sobre el empaque de la columna, y si esta fuerza es bastante grande, esto causará que las partículas de columna se compriman juntas más fuerte - o aún romper las partículas .Esto entonces conduce a la formación de espacios vacíos en el empaque a la entrada de la columna. Un vacío va a en casi todos los casos causando una pérdida catastrófica en el funcionamiento de columna, y requieren su reemplazo.

Adsorción de impurezasAdsorción de impurezas La causa final de daño de columna es la adsorción de

impurezas de muestras "sucias". Las muestras que son sacadas de las plantas o especimenes de animales, muestras ambientales, o mezclas de reacción química, a menudo contienen los compuestos que son fuertemente atraídos a la fase enlazada. Estos gradualmente se acumulan sobre la columna y bloquean la superficie de la fase enlazada.

Los picos de la muestra entonces muestran la disminución en el tiempo de retención y el aumento de ancho, y tarde o temprano la columna debe ser desechada.

Esta acumulación " de la basura química " sobre la columna puede ser evitada por una limpieza inicial de la muestra antes de la inyección.

Las columnas que han acumulado estas impurezas, en algunos casos, pueden ser regeneradas, lavando la columna con solventes convenientes