BÀI GIẢNG

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

Dr. Nguyen Ngoc Vinh

Sample Mobile phase

t0 t1 t2 t3 t4

t0 t1 t2 t3 t4

Det

ecto

r

sign

als

Time

Detector

Sample Mobile phase

t0 t1 t2 t3 t4t0 t1 t2 t3 t4

t0 t1 t2 t3 t4t0 t1 t2 t3 t4

Det

ecto

r

sign

als

Time

Detector

Khoa Công Nghệ Hóa Học– Bộ môn Hóa Phân Tích

ĐH Công Nghiệp – TP.HCM

Chƣơng 4:

phƣơng pháp GC/MS và GC/IR

4.1. Sắc ký khí ghép khối phổ

1. Nguyên tắc

2. Điều kiện kỹ thuật

3. Phân tích sắc ký ghép khối phổ

4.2. Sắc ký ghép hồng ngoại

1. Nguyên tắc

2. Điều kiện kỹ thuật

3. Phân tích định tính và định lƣợng

Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry - MS) là một

phƣơng pháp phân tích công cụ quan trọng trong phân tích

thành phần, cấu trúc chất

Bắt đầu từ cuối thế kỷ XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy

rằng một chùm tia ion dƣơng có thể tách ra khỏi nhau dƣới tác

dụng của một điện trƣờng và từ trƣờng

1913, Thomson thấy khí neon tự nhiên gầm 2 loại có khối lƣợng

nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol), ông cũng sử

dụng máy phổ khối lƣợng trong phân tích hóa học, xác định khối

lƣợng phân tử và nguyên tử

1940 MS đƣợc sử dụng trong phát hiện dầu mỏ và trong phân

tích hormon/steroid (1950). Sự kết hợp GC/MS thực hiện năm

1960 và LC/MS năm 1970. Sau đó nhiếu kỹ thuật mới trong MS

nhanh chóng phát triển nhƣ FAB, TS, tứ cực, TOF, MALDI…

Có phạm vi ứng dụng rất rộng lớn trong các ngành hóa hữu cơ,

hóa sinh, vô cơ và nguyên tố đồng vị

1. Sắc ký khí ghép khối phổ

Cơ sở của phƣơng pháp MS đối với các hợp chất hữu cơ là sự

bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện

tích dƣơng, hoặc phá vỡ các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau

bằng các phần tử mang năng lƣợng cao:

Năng lƣợng bắn phá phân tử thành ion phân tử khoảng 10eV, sự

phá vỡ này phụ thuộc cấu tạo chất, phƣơng pháp và năng lƣợng

bắn phá quá trình ion hóa. Ion phân tử có số khối (m/e) ký hiệu

là M+ Có nhiều phƣơng pháp ion hóa khác nhau nhƣ va chạm

electron, va chạm electron, ion hóa photon, ion hóa trƣờng, bắn

phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh

Phƣơng pháp khối phổ chính là phƣơng pháp nghiên cứu các

chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng chất đó

1.1. Nguyên tắc chung

ABCD + e

ABCD-

ABCD2+ + 3e

ABCD+ + 2e > 95%

Thiết bị khối phổ đầu tiên đƣợc J. Thomson (Anh) chế tạo năm

1912 và đƣợc hoàn thiện hơn vào năm 1932. Sơ đồ chung:

1. Nạp mẫu và hóa khí mẫu:

Mẫu nạp vào máy có thể ở dạng khí, lỏng, rắn

Mẫu sau khi biến thành dạng khí đi qua sang buồng ion hóa qua

giao diện interface.

2. Cơ sở kỹ thuật của MS

Hóa khí

mẫu

Bơm hútXử lý số

liệu

Ion hóa detctorPhân tích

ion theo

số khối

Nạp mẫu

2. Ion hóa:

các phân tử ở dạng khí phải đƣợc ion hóa bằng các pp thích hợp.

Phƣơng pháp va chạm electron (Electron impact - EI): Phƣơng pháp phổ

biến, dòng khí của mẫu đi vào buồng ion hóa, va chạm với dòng electron

từ một sợi đốt (catod) chuyển động vuông góc với dòng phân tử mẫu. Áp

suất buồng ion hóa đạt 0,005 torr, to 200 0,25oC.

Các e va chạm với pt trung

hoà tạo các mảnh ion, mảnh

gốc hay pt trung hòa nhỏ. Sau

đó các ion đi qua một điện

trƣờng 400 – 4000V để tăng

tốc, vận tốc ion tỷ lệ với khối

lƣợng của chúng.

Phƣơng pháp ion hóa hóa học (chemical ionization - CI): Ion hóa hóa học

là cho dòng phân tử khí va chạm với một dòng ion dƣơng hoặc âm để

biến pt trung hòa thành ion phân tử hay ion mảnh. Dòng ion này đƣợc

hình thành từ pt dạng khí H2, CH4, H2O, CH3OH, NH3… qua sự ion hóa nhƣ

bắn phá chúng bằng dòng electron mang năng lƣợng cao. Mỗi phân tử

dạng khí có thể tạo ra các ion dƣơng khác nhau làm tác nhân trong ion

hóa hóa học (bảng dƣới đây)

Phân tử khí Tác nhân ion dƣơng

H2

CH4

H2O

CH3OH

i-C4H10

NH3

(CH3)2CO

H3+

CH4+, CH3

+, CH5+, C2H5

+, C3H7+

H+, (H2O)n

H+, (CH3OH)n

C4H9+, C3H3

+

H+, (NH3)n

(CH3)2CO+

Ion hóa bằng ion dƣơng xảy ra theo các bƣớc sau:

Bƣớc 1: pt trung hòa (CH4) va chạm với dòng electron mang năng lƣợng

cao trở thành nguồn ion

CH4 + e CH4+ + 2e

CH4+ + CH4 CH5

+ + CH3+

CH4+ CH3

+ + H

CH4+ CH2

+ + H2

CH3+ + CH4 C2H5

+ + H2

CH2+ + CH4 C2H4

+ + H2

CH2+ + CH4 C2H3

+ + H2 + H

C2H3+ + CH4 C3H5

+ + H2

Bƣớc 2: các ion dƣơng này va chạm với pt mẫu dạng khí

CH5+ + MH CH4 + MH2

+ (MH là mẫu chất)

CH3+ + MH CH4 + M+

CH4+ + MH CH4 + MH+

Phƣơng pháp ion hóa trƣờng (field ionization):

sử dụng điện trƣờng mạnh để làm bật ra e từ phân tử. Với bề mặt KL

anod có hình nhọn hay sợi mỏng và dƣới chân không cao (10-6 torr) sẽ

phát sinh lực tĩnh điện đủ làm bật e ra khỏi phân tử mà không đòi hỏi

năng lƣợng quá dƣ.

Trong pp ion hóa trƣờng, nguồn ion đƣợc tạo ra nhờ một kim nhỏ có d

= vài µm làm anod gắn ngay trƣớc khe vào buồng ion hóa, khe vào

chính là catod, còn có khe hội tụ để tập trung nguồn ion

Phƣơng pháp ion hóa photon:

Nhiều quá trình ion hóa đòi hỏi năng lƣợng từ 10eV tƣơng ứng với các

photon có bƣớc sóng khoảng 83 – 155nm nằm trong vùng tử ngoại

chân không do đó có thể thực hiện quá trình va chạm photon.

khối phổ đạt đƣợc cũng tƣơng tự pp va chạm electron. Do năng lƣợng

nhỏ hơn nên phổ này chủ yếu cho ion phân tử và một số mảnh có số

khối lớn tƣơng tự pp ion hóa trƣờng.

Ngƣời ta cũng sử dụng nguồn laser làm nguồn ion hóa, đó là nguồn

đơn sắc (laser rubi) mang năng lƣợng cao.

3. Tách các Ion theo số khối:

Các ion hình thành có khối lƣợng m và điện tích e , tỷ số z = m/e gọi là số

khối. Chúng sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau nhờ một nam châm có từ trƣờng

Ho hoặc kèm theo một điện trƣờng nữa. Các loại thiết bị tách gồm có:

Thiết bị khối phổ hội tụ đơn hoặc còn gọi là khối phổ hình quạt hay lệch

từ. (single-focusing magnetic deffection hay sector mass analyser)

Thông thƣờng nhất là dùng thiết bị từ trƣờng hình quạt (sector-

field spectrometer) để tách các ion theo khối lƣợng

Các ion trƣớc khi ra khỏi buồng ion hóa đã đƣợc tăng tốc nhờ

một điện trƣờng có thế U, đi qua nam châm hình ống có từ

trƣờng H. Các ion sẽ chuyển động theo hình vòng cung bán kính

r trong từ trƣờng này. Với r:

Vậy với giá trị U và H nhất định thì số khối m/e tỷ lệ với bán kính r.

Từ biểu thức trên nhận thấy các ion có m/e khác nhau sẽ đƣợc

tách ra khỏi nhau do r của vòng cung chuyển động của chúng

khác nhau. Máy hội tụ đơn có độ phân giải thấp (1000 – 5000)

Thiết bị khối phổ hội tụ kép (double-focusing sector spectrometer): để

máy có độ phân giải cao (10.000 – 100.000) ngƣời ta chế tạo bộ tách ion

gồm 1 điện trƣờng và một từ trƣờng đặt cạnh nhau. Các ion trƣớc khi

qua từ trƣờng hình quạt, sẽ đi qua 1 điện trƣờng tĩnh điện để tách biệt

nhau một lần nữa

Sơ đồ tandem sector instrument với EBEb ion optic (Jeol HX110, với hệ

khối phổ hội tụ 4 lần).

Thiết bị khối phổ tứ cực (quadrupole): khối phổ tứ cực sử dụng

4 thanh tròn đặt song song nhau thành 1 bó. Từng cặp đối diện

điện tích âm hay dƣơng của nguồn điện 1 chiều (DC). Ngoài ra

thế điện xoay chiều đƣợc sử dụng cho cả hai cặp.

Cả 2 trƣờng đều không làm tăng tốc dòng điện tích dƣơng từ

nguồn đi ra nhƣng làm chúng dao động quanh trục trung tâm

khi chuyển động và chỉ các ion có số khối nhất định mới đến bộ

phận thu góp. Tần số và thế thay đổi các ion có số khối khác

nhau lần lƣợt đến bộ phận thu góp.

Các ion đi vào trƣờng tứ cực theo hƣớng trục z đồng thời dao động

theo hƣớng trục x, y dƣới ảnh hƣởng của một trƣờng điện tần số

cao. Chỉ các dao động của các ion có m/e đặc biệt không tăng lên

theo biên độ dao động và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục.

Các ion khác có biên độ dao động tăng sẽ va đập vào thành các

điện cực trƣớc khi có thể vƣợt qua các điện cực đi vào detector.

Phƣơng trình tổng quát của phổ tứ cực nhƣ sau:

Trong đó K: hằng số,

V: điện áp tần số cao,

r: khoảng cách 2 điện

cực đối nhau, f: tần

số dao động ion

Độ phân

giải phổ kế

tứ cực

thông

thƣờng đạt

từ 500 –

1000, muốn

nâng cao

Rs, nối 2 –

3 bộ tứ cực

với nhau

nhƣ hình

dƣới (Rs có

thể đạt tới

20.000):

4. Detector:

Sau khi ion hình thành và tách khỏi nhau theo số khối, chúng cần

đƣợc phát hiện và ghi nhận nhiệm vụ của detector. Các loại

detector trong MS gồm có cốc Faraday, nhân electron thứ cấp, tấm

kính ảnh nhạy ion, hệ thống đếm ion.

5. Độ phân giải của MS:

Độ phân giải là khả năng tách 2 số khối liền nhau m và m + m. Độ

phân giải R của MS đƣợc tính theo:

Các máy có R < 1000 đƣợc coi là độ phân giải thấp, R > 10.000 là

có độ phân giải cao

Các mẫu chất trong phân tích MS phải nằm ở dạng hơi do đó hỗn

hợp khí mang và mẫu chất từ GC có thể đƣa vào buồng ion hóa

của MS nhƣng phải giảm tốc độ khí mang từ cột đi ra khoảng <

2ml/min

Do thế ion hóa của He là 24,58 eV, nên để tăng độ nhạy của máy

thông qua việc tăng thế ion hóa của buồng ion hóa lên 70eV,

ngƣời ta phải tách He ra khỏi dòng khí trƣớc khi vào buồng ion

hóa.

Cấu tạo của GC/MS gồm 2 phần là thiết bị GC và MS đƣợc ghép

với nhau thông qua bộ kết nối (interface). Nhằm mục đích loại

bớt He, N2 để giảm áp suất dòng khí mang và phân tử mẫu chất

đi vào buồng ion hóa, phần GC dùng cột mao quản và phần MS

sử dụng buồng ion hóa EI hay CI với bộ tách tứ cực và detector

khối phổ

3. Sắc ký khí ghép MS

Rotary pump

Turbo

pump

Phƣơng pháp HPLC đƣợc dùng để tách các chất lỏng khó bay hơi,

không thể tách đƣợc bằng GC. Sự kết hợp giữa LC và MS cũng

cho những thuận lợi tƣơng tự GC/MS. Tuy nhiên interface ở đây

đóng vai trò quan trọng và gồm nhiều loại khác nhau.

Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (direct liquid insertion, DLI)

Bộ kết nối băng chuyền (moving belt interface)

Bộ kết nối phun nhiệt (thermospray)

Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA,

Continuous Flow Fast Atom Bombardment)

Bộ kết nối phun điện

4. Sắc ký lỏng hiệu quả cao ghép MS