BRYK z cytofizjologii

Opracowanie zbiorowe

Wrocław 2011

Rozdział 1

Organizacja i funkcjonowanie jądra komórkowego (RZECZY NIE ROBIONE NA SEMINARIUM MAŁĄ CZCIONKĄ)

Dane ogólne

Wielkość i kształt jądra zależą od stanu czynnościowego i typu komórki: � Komórki młode, proliferujące: duże, okrągłe jądro, wyraźne jąderko, rozproszona

chromatyna � Kom. dojrzałe: jądra różnokształtne � Kom. stare: kondensacja (kariopyknosis) lub fragmentacje (kariorhexis) chromatyny

• W fazie G1 niewielkie jądra

• W G2 większe i nieregularne Otoczka jądrowa

Wybiórczo i aktywnie uczestniczy w transporcie RNA do cytoplazmy, a enzymów, czynników transkrypcyjnych i niskocząsteczkowego RNA do nukleoplazmy. Ich ilość zależy od metabolizmu, wieku czy typu komórki.

1. Wewnętrzna błona otoczki jądrowej 2. Zewnętrzna błona otoczki

• Obie błony wykazują asymetrię (rybosomy i kontakt z RER na zewnątrz; kontakt z blaszką jądrową wewnątrz; różny skład białkowy)

3. Przestrzeń okołojądrowa między błonami 4. Pory jądrowe zawierające jądrowe kompleksy porowe (JKP)

� Ilość zależy od wieku, aktywności i typu komórki

• Cylindryczna struktura oktagonalna złożona z trzech współosiowo ułożonych pierścieni białkowych (jeden pierścień „nad” drugim)

1) Pierścień cytoplazmatyczny 2) Pierścień jądrowy 3) Zrąb podstawowy – kompleks 8 promieniście wpuklających się do

kanału segmentów (przypominają szprychy koła i tworzą kompleks kanału centralnego)

• Każda „szprycha” ma 4 podjednostki – 1 służy do zaczepienia całego kompleksu porowego w otoczce; wszystkie układają się tak, że wraz z otoczką tworzą 8 kanałów peryferycznych – są one miejscem dyfuzji biernej jonów i małych cząsteczek

• Od pierścienia cytoplazmatycznego odchodzi 8 filamentów białkowych

• Od pierścienia jądrowego także 8, ale one dochodzą do mniejszego pierścienia końcowego „pływającego” w nukleoplazmie tworząc strukturę podobną do „koszyka”

• W strukturach JKP znaleźć można ok. 100 białek – tzw. nukleoporyny odpowiadające za przekaźnictwo jądrowo cytoplazmatyczne

• Kanał centralny JKP zawiera często kompleks kanału centralnego (sic! tak jest w Zablu) = transporter = czop = ziarnistość centralna – jest to białko przechodzące przez kanał

5. Blaszka jądrowa � Przylega do bł. wew. otoczki jądrowej � Fibryle blaszki składają się z lamin A,B,C w 25-50%. Posiadają strukturę i skład

podobny do filamentów pośrednich – przez to są zaliczane do szkieletu jądra

i. Białka blaszki nadają kształt jądru tworząc zrąb dla JKP i otoczki. ii. Laminy uczestniczą w przemianach otoczki w mitozie

iii. Blaszka mocuje pętle chromosomów. � Wymiana jądrowo-cytoplazmatyczna

� Kanały peryferyczne: jony, nukleotydy, białka do 10 nm � Kanał centralny – transport aktywny (z udziałem ATP, GTP) RNP, polimeraz i

lamin (mają przyczepione aminokwasowe sekwencje sygnałowe) 1. Dzięki sekwencji białko najpierw łączy się z receptorem cytoplazmy

podstawowej (np. z białkiem szoku cieplnego) 2. Kompleks białko-sekwencja-receptor przyczepia się do JKP (w tym

łączeniu uczestniczą nukleoporyny) 3. Białkowy nośnik transportujący wahadłowo transportuje kompleks do

jądra 4. Receptor wraca do cytoplazmy

• RNP w kierunku przeciwnym na podobnej zasadzie

Macierz jądrowa = matrix jądrowa = nukleoszkielet = szkielet jądrowy

� Struktura pozachromatynowa pozostała po strawieniu kwasów nukleinowych. 1. Blaszka jądrowa wraz z JKP 2. Jąderka resztkowe 3. Macierz wewnętrzna(pozająderkowa włóknisto-ziarnista sieć w przestrzeni interchromatynowej)

Skład

• Włókienka(ogólnie zwane matrycyną) o średnicy 3-5nm składające się z białek matryn � Laminy, białka Ag-NOR, aktyna, białka RNP jądrowych

• Gęste elektronowo ziarna kojarzone ze składnikiem ziarnistym jąderka Rola macierzy:

I. Organizacja strukturalna jądra, konfiguracja chromatyny II. Filamenty macierzy wiążą kompleksy replikacyjne

III. Uczestnictwo w regulacji ekspresji genów IV. Udział w transkrypcji i dojrzewaniu pre-rRNA i hnRNA V. Wiązanie hormonów steroidowych

VI. Fosforylacja białek wirusowych VII. Wiązanie karcynogenów

Budowa i struktura kwasów nukleinowych

DNA – polimer; deoksyrybonukleotyd – monomer Nukleozyd = deoksyryboza + zasada azotowa; nukleozyd + Pi = nukleotyd Reguła komplementarności: A-T, G-C; nici DNA są antyrównoległe Szkielet cukrowo-fosforanowy na zewnątrz helisy, rdzeń z zasad azotowych

Formy przestrzenne DNA � DNA B – najpowszechniejsza

o Prawoskrętna helisa(średnica 2 nm) o 10 nukleotydów na skręt; skok 3,4 nm(bo odległość między nt 0,34) o Rowek większy i rowek mniejszy

� DNA Z (jak Zygzakowate)– powstaje gdy mamy dużo naprzemiennie ułożonych puryn i pirymidyn

o Lewoskętna o Najmniejsza średnica o Tylko jeden rowek

� DNA A – największa średnica, najmniejszy skok

RNA – jednoniciowe i pofałdowane z wyjątkiem krótkich fragmentów komplementarnych mogących się parować, U zamiast T Replikacja DNA

Zawsze od 5’ do 3’ (czyli przyłączamy grupę fosforanową nowego nukleotydu do węgla 3’ cukru. Jest semikonserwatywna. Uczestniczy w niej aparat replikacyjny (replisom) zawierający:

� Helikazę – rozplatającą podwójną nić DNA � Białka SSB wiążące pojedynczą nić DNA � Polimerazę DNA przyłączającą nowe nukleotydy � Prymazę syntezującą startery RNA (9-10 nt) � Nukleazy zamieniające startery RNA na DNA � Polimerazę naprawczą DNA łączącą nukleotydy utworzone przez nukleazy na nici

opóżnionej � Ligazę łączącą fragmenty DNA na nici opóźnionej � Białko „ruchoma obręcz” - łączy polimerazę z matrycą DNA i umożliwia ślizgowy ruch

wzdłuż niej

1. Początek replikacji – białka inicjujące replikację znajdują miejsce ori a. Helikaza rozdziela nić, a białka SSB stabilizują pojedyncze łańcuchy b. Powstaje para widełek replikacyjnych o kształcie Y w obrębie których replikacja

odbywa się dwukierunkowo 2. Przebieg replikacji

a. Synteza startera przez prymazy b. Na matrycy 5’->3’ synteza odbywa się w sposób ciągły, a nową nić 3’->5’

nazywamy nicią wiodącą c. Na matrycy 3’->5’ powstaje nić opóźniona z udziałem fragmentów Okazaki (100-

300 pz) – tylko tyle polimeraza potrafi zsyntetyzować „pod prąd”. Każdy nowy fragment wymaga nowego startera. Usuwanie starterów RNA, zamiana na DNA i łączenie fragmentów są przeprowadzane przez nukleazy, polimerazę naprawczą i ligaz

3. Redagowanie – polimeraza łączy nowy nukleotyd tylko gdy poprzedni jest prawidłowy – polimeraza posiada aktywność nukleazową w kierunku przeciwnym do replikacji(5’->3’).

Naprawa DNA

• Pierwsze zabezpieczenie to aktywność nukleazowa polimerazy(usuwa 99% błędów)

• Naprawa przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia – nie przerywamy tu łańcucha o Metylotransferazy przenoszą grupy alkilowe z zasad azotowych na cysteinę o Fotoliazy DNA usuwają dimery pirymidynowe oraz rozszczepiają fotoprodukty pirymidynowe, z

utworzeniem zasad, które wchodziły w skład fotoproduktów

• Naprawa przez wycinanie zasad azotowych 1. Glikozylazy DNA hydrolizują wiązanie glikozydowe zasady azotowej z cukrem. Powstaje w ten

sposób wolne miejsce, tzw. miejsce AP (acceptor place). 2. Endonukleazy AP rozpoznają miejsce AP i hydrolizują wiązanie fosfodiestrowe po stronie 5’

uszkodzonego nukleotydu 3. Usuwana jest reszta uszkodzonego nukleotydu 4. Polimerazy uzupełniają, a ligazy łączą.

• Naprawa przez wycinanie nukleotydów 1. Helikazy rozplatają podwójną nić DNA 2. Endonukleaza zależna od ATP rozcina nić po obu stronach uszkodzenia (w miejscach zejścia się

podwójnej helisy z pojedynczą nicią)

3. W ten sposób „wyrzucamy” 30 nukleotydową nić 4. Na pozostałej, dobrej nici synteza komplementarnej przez kompleks polimeraz połączonych z

kofaktorami reakcji – niejakimi PCNA (kofaktorem polimerazy DNA delta) i czynnikiem replikacyjnym C

5. Łączenie przez ligazy � Szybciej usuwane są w ten sposób większe zniekształcenia helisy niż mniejsze � Alternatywnie działa szlak sprzężony z transkrypcją naprawiający uszkodzenia blokujące syntezę

mRNA. Uczestniczą w tym białka CSA i CSB (zmieniają konfigurację dając dostęp białkom naprawczym do helisy DNA). Defekty genów kodujących te białka prowadzą do choroby Cockayne’a (CS) [karłowatość, niedorozwój, zwyrodnienie OUN, uszkodzenia wzroku]

• Naprawa błędnie sparowanych zasad azotowych � źle sparowane zasady zaburzają geometrię helisy DNA i są rozpoznawane przez białka

naprawiające. Nić jest przecinana, a luka uzupełniana przez polimerazę i łączona przez ligazę.

• Naprawa przez rekombinację – naprawa pęknięć dwuniciowych(unikamy aberracji chromosomowych) � Rekombinacja homologiczna(przeważa w późnej fazie S i G2) – wykorzystuje nieuszkodzony

homolog. Po pęknięciu obie nici są trawione przez egzonukleazy aż do uzyskania jednoniciowego 3’-końca – potem jest łączony z chromosomem homologicznym, który służy za matrycę.

� Dopasowanie pojedynczych nici DNA – białka naprawcze szukają sekwencji powtórzonych w sąsiedztwie pęknięcia. Nici odcinków niehomologicznych między pęknięciami są przemieszczane poza helisę i wycinane bezpowrotnie. Decyduje to o dużej wierności tego szlaku naprawy.

� Rekombinacja niehomologiczna (dominuje we wczesnej fazie S i G1) z udziałem kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PK). Ma podjednostkę o zdolności helikazy (zależnej od ATP), która zabezpiecza koniec dwuniciowego DNA. Druga podjednostka fosforyluje białka naprawcze.

Chromatyna

DNA wiąże się z różnymi białkami tworząc DNP(50% to białka - strukturalne i enzymatyczne). Białka histonowe mają małą masę (10-23kDa), są dodatnio naładowane(możliwe wiązania z Pi DNA) ponieważ mają dużo Lys (najwięcej w H1) i Arg (naj. w H4). Mamy histony rdzeniowe od H2A do H4 oraz największy histon H1. Histony wykazują bardzo dużą konserwatywność. Wyróżniamy także 300 różnych białek niehistonowych:

a) Enzymatyczne (np.polimerazy) b) Regulatorowe (regulujących ekspresję genów) c) Strukturalne (odpowiadające za przestrzenną organizację DNA np. laminy)

Włókno nukleosomowe (=sznur korali) składa się z nukleosomów, a te możemy podzielić na rdzeń nukleosomu (oktamer 2x H2A,H2B,H3,H4 o kształcie dysku i dwukrotnie lewoskrętnie nawinięte 146pz superhelikalnego DNA) i DNA łącznikowy(20-95nt między kolejnymi rdzeniami). Nukleosom odpowiada nie tylko za strukturę, ale też zmienia kształt w trakcie replikacji. Histon H1 znajduje się tam, gdzie DNA wchodzi i opuszcza rdzeń nukleosomu. Ze względu na 1,8 obrotu wokół rdzenia nukleofilament przyjmuje zygzakowate ułożenie. H1 chroni także po ok.10 pz przed i za wejściem na rdzeń. Jest to jedyny tkankowo swoisty histon (powoduje to także swoistość tkankową łącznikowego DNA). Chromatosom = rdzeń, H1 i 20 chronionych przez niego pz. Solenoid = włókno 30nm – powstaje dzięki superspiralizacji nukleofilamentu – powstaje pusta wewnątrz cewka o średnicy 30nm. Jest to lewoskrętna helisa z 6/8 nukelosomami na skręt. Upakowanie to jest możliwe dzięki histonowi H1. Płaskie powierzchnie dysku są równoległe do osi solenoidu. Pętle włókien chromatynowych = domeny solenoidy zostają zakotwiczone w rusztowaniu macierzy jądrowej (białka NHP) lub w blaszce jądrowej

� Upakowanie. Nukleofilament powoduje 7x kondensację DNA, solenoid- 7x(=49x), domeny 35x(=1700). Chromosomy interfazowe są skondensowane nawet x10000.

� Książka nie zagłębia się w to, w jakim stanie kondensacji jest chromatyna w poszczególnych fazach.

Strefa interchromatyny(=nukleoplazma) – tu odbywa się proces przetwarzania, dojrzewania i składania pre-mRNA oraz transport do JKP. Znajduje się pomiędzy skupieniami chromatyny.

a) Ziarna perichromatyny – PG – związane z transkrypcją i formowaniem mRNA. Regularne kuliste ziarna, spotykane pojedynczo, wielkość 50nm; reprezentują transportową formę pozająderkowego mRNA. Składają się z cienkich włókien utworzonych przez rybonukleproteidy.

b) Włókna perichromatyny – PF –zlokalizowane w strefie brzeżnej chromatyny skondensowanej. Włokienka 3-4nm średnicy, nieregularnie zwinięte. Zawierają hnRNA(prekursor pre-mRNA). Ulegają zagęszczeniu po stymulacji transkrypcji pozająderkowego RNA. Morfologia pozająderkowych kompleksów transkrypcyjnych różni się od genów jąderkowych (patrz niżej – „choinka”) – nie jest tak regularna.

c) Włókna interchromatyny – IF – reprezentują morfologiczny wykładnik transportu PF w nukleoplazmie i korespondują do izolowanych cząsteczek hnRNP w czasie ich migracji w przestrzeni interchromatynowej

d) Ziarna interchromatyny – IG - 20nm, zbudowane z delikatnie poskręcanych włókienek oraz połączone między sobą włóknami tworzą luźną sieć. Ich funkcja pozostaje niewyjaśniona. Zawierają być może snRNA i RNA o powolnym metabolizmie.

e) Ciałka jądrowe – nieznana funkcja, 200 nm i więcej, fibrylarna otoczka i ziarnisty rdzeń. Ich podgrupą są ciałka zwinięte zawierające m.in. różne składniki spliceosomów. Mogą więc być wielofunkcyjnymi strukturami obrabiającymi preRNA

Jąderko - struktura i funkcja

Miejsce biogenezy rybosomów; nieobłonione, sferyczne struktury zmienne w cyklu komórkowym. Zanikają w profazie i odnawiają się w telofazie w okolicach jąderkotwórczych (NOR) związanych z chromosomami akrocentrycznymi (13-15,21,22). Składniki aktywnego transkrypcyjnie jąderka (1-3 zawierają RNP):

1. Ośrodki włókniste (FC) – interfazowe odpowieniki NOR (czyli na chromosomie mamy NOR, a w chromatynie FC) – są w nich zlokalizowane geny kodujące rRNA. Zbudowane z luźnego materiału włókienkowego otoczone DFC (patrz niżej)

2. Gęsty składnik włóknisty(DFC) – zawiera 45S pre-rRNA – zawiera włókna o średnicy 4-5nm gęsto upakowane w pasma dookoła ośrodka włóknistego.

3. Składnik ziarnisty jąderka (GC) – zbudowany z ziaren ok. 15nm w postaci pól wymieszanych z DFC. Zawiera 28S pre-rRNA

• Synteza pre-rRNA odbywa się między FC. a DFC, DFC jest zaś prekursorem GC. 4. Chromatyna związana z jąderkiem 5. Wakuole jąderkowe

Typy strukturalno-czynnościowe jąderek: 1) Jąderka uformowane w nukleolemmę (gąbczaste) – aktywne transkrypcyjnie 2) Jąderka zwarte (aktywne) mają ciasno upakowane i wymieszane włókienka i ziarenka,

występują głównie w młodych kom. 3) Jąderka zwarte z segregacją składników – (nieaktywne) oddzielenie poszczególnych

składników RNP jest wyrazem zahamowania syntezy rRNA 4) Jąderka pierścieniowate – (nieaktywne) obwodowe rozmieszczenie składników RNP 5) Mikrojąderka(nieaktywne) - w kom. starych i degenerujących

Odczytywanie informacji genetycznej Transkrypcja RNA – polimerazy RNA

1. Pol I – w jąderku – transkrypcja rRNA 2. Pol II – w nukleoplaźmie – synteza pre-mRNA i snRNA 3. Pol III – w nukleoplaźmie – synteza pre-tRNA i 5sRNA

Etapy transkrypcji (to co jest dokładniej w rozdziale drugim tu mniejszą czcionką)

I. Wiązanie Pol przez matrycę – do wiązania potrzebne są dodatkowe białka – czynniki transkrypcyjne(TF). W pierwotnym transkrypcie znajduje się na końcu 5’ pre-mRNA czapeczka utworzona przez GTP

II. Inicjacja transkrypcji – odbywa się w miejscu startu transkrypcji poprzedzonym promotorem(do 200 nukleotydów, zawierający sekwencję TATA). W regulacji szybkości procesu uczestniczą także regiony regulatorowe(wzmacniacze, wyciszacze).

III. Elongacja – dołączanie kolejnych nukleotydów IV. Zakończenie – sygnałem dla końca transkrypcji jest sekwencja AAUAAA. 10-30nt za nimi w kierunku 3’

mamy miejsce poliadenylacji(miejsce przyłączenia sekw. poli-A)

Dojrzewanie RNA – splicing – umożliwiają przejście RNA z jądra do cytoplazmy i oczytanie informacji przez rybosomy

• Pierwotny transkrypt składa się z eksonów i intronów

• Introny wycina spliceosom składający się białek i niskocząsteczkowego RNA a. Kompleks snRNP rozpoznaje i zbliża do siebie końce intronów. b. Połączone introny tworzą „lasso” następnie wycinane i degradowane. c. Następnie dochodzi do kowalencyjnego łączenia eksonów.

• Modyfikowane są także końce: a. 5’ w wieloetapowym procesie otrzymuje czapeczkę z 7-metyloguanozyny b. 3’ jest poliadenylowany(otrzymuje ogonek poli-A)

Redagowanie RNA – Jest to mechanizm regulacji ekspresji genów, ulegają mu niektóre fragmenty RNA, transkrypt traci albo zwiększa liczbę nukleotydów od 3’ do 5’ – mogą powstać dzięki temu nowe ramki odczytu. W redagowaniu uczestniczą korygujące sekwencje RNA.

Biogeneza rybosomów Struktura rDNA Zawiera 3 rodzaje sekwencji nukleotydowych:

o Sekwencje transkrybowane i obecne w dojrzałym rRNA o Sekwencje nietranskrybowane – NTS rozdzielające jednostki transkrypcyjne

(czyli kolejne kopie genów rDNA) w tandemach o Sekwencje transkrybowane i obecne w pierwotnym transkrypcie, ale wycięte

podczas dojrzewania RNA – ITS i ETS

• Jednostka transkrypcyjna zawiera sekwencje kodujące, ITS i ETS

• NTS- zawiera sekwencje regulujące funkcje rDNA (teraz będą odwołania do budowy jąderka)

� Synteza pre-rRNA między chromatyną wenątrzjąderkową a DFC � DFC zawiera 45S pre-rRNA � GC zawiera 28S pre-rRNA

Kompleksy transkrypcyjne reprezentujące aktywne geny rybosomalne to „choinki” (ze względu na wygląd). Są one:

a. Ułożone tandemowo i rozdzielone przez NLS b. Osią kompleksu(pniem choinki) jest włókno DNA pokryte prostopadłymi włókienkami

(łodygami)reprezentującymi transkrypty c. U podstawy każdego transkryptu (u nasady łodygi) znajduje się Pol I d. Transkrypty wzrastają od 5’ do 3’ (łodyżki) e. Na końcu każdego transkryptu jest granula końcowa – zwinięty świeżo powstały RNA

Jednostki transkrypcyjne zawierają sekwencje nieobecne w dojrzałym rRNA. Po transkrypcji 45S łączy się z białkami rybosomowymi tworząc kompleks RNP i w wyniku modyfikacji powstają podjednostki 40S i 60S. Po ich przeniesieniu przez pory obie podjednostki tworzą rybosomy.

Rozdział 2

Geny – lokalizacja, struktura, funkcja. Inżynieria genetyczna

Chromatyna i chromosomy

• DNA występuje w postaci chromosomów, każdy z nich to kompleks jednej pary nici z białkami.

• Zmiany w organizacji DNA przed podziałem obejmują replikację oraz kondensację.

• Na końcach chromosomów telomery obecne są telomery – n kopii GGGGTTA niezbędne do syntezy nici opóźnionej, a także chroniące nić przed skracaniem nici przy podziale i przed nukleazami.

• W interfazie chromosomy są rozluźnione, zajmują terytoria w jądrze kom., przymocowane są do otoczki jądrowej i do macierzy jądrowej. W interfazie chromatyna skondensowana niejednorodnie – heterochromatyna (silnie skondensowana, nieaktywna transkrypcyjnie, głównie materiał wokół centromeru i na końcach) i euchromatyna (rozproszona, aktywna transkrypcyjnie).

• W dekondensacji chromatyny ważną rolę odgrywają defosforylacja histonu H1 i acetylacja pozostałych histonów.

• Aktywna transkrypcyjnie chromatyna jest podatna na trawienie przez nukleazy.

Organizacja i funkcjonowanie genów

• Gen jest to odcinek DNA obejmujący jedną jednostkę transkrypcyjną kodującą określony polipeptyd, polipeptyd powstały w skutek dojrzewania RNA (lub prekursora białkowego) albo RNA nie podlegające translacji a regulujące transkrypcję innych genów. W komórkach eukariotycznych geny mają charakter mozaikowy – obecne są eksony i introny (introny wycinane po transkrypcji przez snRNP - małe jądrowe nukleoproteiny - splicing).

• W DNA część niekodująca składa się w większości z wielokrotnych powtórzeń określonych sekwencji (powtórzenia tandemowe – sekwencje bezpośredni za sobą; sekwencje rozproszone – wielokrotne kopie w genomie,).

• W zależności od długości powtórzenia tandemowe dzielimy na minisatelity (9-80 pz, łącznie 20-30 tys pz) oraz na mikrosatelity (1-6 pz, łącznie do 100 pz).

• Sekwencje rozproszone mają długość od kilkuset do kilku tysięcy pz powtarzające się tysiące razy. Dwa rodzaje sekwencji – Alu i L1 (LINE-1) – stanowią 10% genomu, Alu ma około 300pz i występuje w genomie w ok 0,5 mln kopii. Alu i L1 są transpozonami (ruchomymi elementami DNA, należą do grupy retrotranspozonów – aby się przemieścić są transkrybowane na RNA a następnie przenoszone na DNA przez odwrotną transkryptazę w innym miejscu).

• Sekwencje w części niekodującej zmienne osobniczo (zastosowanie w medycynie sądowej i badaniach populacyjnych).

• Geny mogą występować w grupach – np. geny kodujące produkty potrzebne w dużych ilościach (geny kodujące rRNA - u człowieka na pięciu chromosomach, w obszarach nazywanych organizatorem jąderka; w każdym chromosomie ok 40 kopii genu kodującego prekursor 45S rRNA. Także geny kodujące histony w tandemowych zespołach genów)

Kontrola ekspresji genów

• Ekspresja – powstanie produktu kodowanego przez dany gen. Procesy składające się na ekspresję to transkrypcja, dojrzewanie transkryptu, jego transport do cytoplazmy, translacja oraz dojrzewanie białka. W regulacji ekspresji największe znaczenie ma kontrola transkrypcji. Przed fragmentem kodującym właściwe białko znajduje się miejsce, w którym przyłącza się polimeraza RNA (ok. 50 pz), które wraz z miejscem inicjacji tworzy promotor. W obrębie promotora lub przed nim mogą być obecne sekwencje regulatorowe (u bakterii <10 pz, u eukariota są długie i mogą leżeć daleko od genu który kontrolują). Sekwencje regulatorowe aktywują lub hamują funkcję promotora i genu poprzez związanie białek regulatorowych.(motywy wiążące – homeodomeny, palce cynkowe, zamki leucynowe).

• Inicjacja transkrypcji wymaga przyłączenia do promotora polimerazy RNA i regulatorów białkowych (ogólnych czynników transkrypcyjnych). Regulatory łączą się z kasetą TATA (występującą w większości promotorów eukariotycznych), białko ją wiążące (TBP) wchodzi w skład kompleksu białkowego TFIID (TF - transcription factor), którego przyłączenie wygina nić i umożliwia przyłączenie kolejnych czynników (IIB, IIE IIF, IIH) i powstanie kompleksu inicjującego. Jeden ze składników kompleksu TFIIH fosforyluje polimerazę RNA, co uwalnia ją i aktywuje aktywność katalityczną.

• Alternatywny mechanizm inicjacji (bez kasety TATA) jest związany z przyłączeniem czynnika sp1 do sekwencji promotorowej bogatej w CG. Do sp1 przyłącza się następnie TFIID i spółka. Rolę kasety TATA spełnia (prawdopodobnie) element inicjatorowy zlokalizowany w miejscu inicjacji transkrypcji. Geny bez kasety TATA dla białek niezbędnych do utrzymania stałego metabolizmu komórkowego (np. enzymy cyklu Krebsa), mają one stały poziom transkrypcji (house-keeping genes/promoters/proteins).

• Inny element regulujący transkrypcję – blok CCAAT (100-200 pz od promotora, jedna lub kilka kopii).

• Powyższy przebieg inicjacji jest właściwy dla polimerazy RNA II (syntetyzuje ona wszystkie prekursory RNA dla białek oraz niektórych małych genów jądrowych). U eukariota obecne są także polimeraza RNA I (syntetyzująca prekursor rRNA w jąderku) oraz polimeraza RNA III (syntetyzująca prekursory 5S rRNA, tRNA i inne małe jądrowe i cytoplazmatyczne RNA).

• Dla polimerazy RNA I niedaleko promotora (60 pz przed) jest region kontrolny UCE , do którego przyłącza się UBF (UCE binding factor) . W wiązaniu enzymu do promotora bierze udział czynnik selekcyjny SLI.

• Poza promotorami obecne są także sekwencje wzmacniające i wyciszające. Sekwencje wzmacniające stymulują transkrypcję z dalekich promotorów. Mogą być przed, w obrębie lub za genem który wzmacniają.. Regulowane są przez sygnały ze środowiska zewnętrznego oraz sygnały swoiste tkankowo. Nie oddziałują bezpośrednio, ale przez np. wygięcie nici w sposób ułatwiający lub uniemożliwiający przyłączenie kompleksu inicjującego transkrypcję.

• Ogólne czynniki transkrypcyjne są niezbędne do inicjacji transkrypcji, wiążą się z promotorem i umożliwiają powstanie kompleksu transkrypcyjnego. Czynniki TFIID, A i B umożliwiają przyłączenie polimerazy RNA II i TFIIF, następnie do kompleksu TFy-polimeraza przyłączają się TFIIE, H i J (TFIIH kompleks białkowy o aktywności kinazy – fosforyluje polimerazę – oraz helikazy, bierze udział w elongacji i fosforyluje niektóre CDK ).

• W niektórych komórkach obecne są swoiste czynniki transkrypcyjne (aktywatory i represory), które łączą się z określonymi odcinkami w promotorach i oddziałują na kompleks transkrypcyjny „przyczepiony” do kasety TATA. W swoistych czynnikach transkrypcyjnych dwie charakterystyczne domeny – domena wiążąca (najczęściej helisa-zwrot-helisa, palce cynkowe lub zamek leucynowy) i domena aktywująca.

• Czynniki transkrypcyjne biorą udział w różnicowaniu ekspresji genów w różnych komórkach wpływając na ich fenotyp, np. podczas rozwoju lub odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Przykłady genów kodujących czynniki transkrypcyjne – w rozwoju embrionalnym geny homeotyczne Hox, geny kierujące procesem segmentacji (np. Pax). Są także białka, których ekspresja warunkuje powstawanie typów komórek i całych narządów – np. MyoD (czynnik transkrypcyjny aktywny w kom prekursorowych mięśni szkieletowych; aktywuje on także własną ekspresję – przekazywanie dalej wzorca ekspresji genów).

• Alternatywne dojrzewanie prekursora matrycowego RNAprowadzi do powstania różniących się od siebie produktów. Różnice mogą być w miejscu poliadenylacji RNA (alternatywne dojrzewanie końca poliadenylanowego – inna lokalizacja w komórce i stabilność) lub w zestawie eksonów (alternatywny splicing – może prowadzić do powstania bardzo różnych produktów np. immunoglobuliny powierzchniowej i rozpuszczalnej). Może następować także (b. rzadko w kom. zwierzęcych) redagowanie RNA – potranskrypcyjna zamiana pojedynczych zasad.

Zmienność genetyczna

• Dwa podstawowe źródła zmienności to mutacje i segregacja materiału genetycznego przy powstawaniu gamet.

• Mutacje DNA są wynikiem błędów w replikacji DNA, oraz czynników fizycznych i chemicznych. Te, które nie zostaną skorygowane mogą wpłynąć na powstanie zmienionego fenotypu. Niewielkimi zmianami są mutacje punktowe, delecje oraz insercje (ostatnie dwie częściej prowadzą do zmiany fenotypu, gdyż zmieniają ramkę odczytu). Do rozległych mutacji DNA (rearanżacji genomowych) zaliczamy duplikacje części lub całości genomu, delecje obszarów genomu oraz translokacje części genomu między chromosomami. Rozległe mutacje mogą wyniknąć podczas rekombinacji DNA, aktywacji wirusów lub w wyniku funkcjonowania transpozonów (ruchomych elementów genomu).

• Przypadkowa duplikacja jest jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za powstawanie nowych genów, prawdopodobnie odpowiada też za powstawanie rodzin genowych kodujących białka homologiczne. (przykład - rodzina genów β-globiny).

• Innym mechanizmem prowadzącym do powstawania nowych genów jest rekombinacja (tasowanie) eksonów (np. na skutek niesymetrycznego crossing-over – geny z dodatkowymi, zduplikowanymi domenami białkowymi lub z wprowadzonymi zupełnie nowymi domenami – białka hybrydowe). Do tasowania przyczyniają się też transpozony.

Analiza i modyfikacja materiału genetycznego, inżynieria genetyczna.

• Izolacja kwasów nukleinowych - zastąpione przez PCR (reakcja z termostabilną polimerazą DNA – polymerase chain reaction), które niweluje potrzebę izolowania metodami fizykochemicznymi większych ilości materiału genetycznego.

• Enzymatyczna modyfikacja kwasów nukleinowych – przy pomocy endonukleaz restrykcyjnych ( rozcina DNA na fragmenty przy określonych sekwencjach) polimeraz DNA i RNA, egzo- i endonukleaz, ligaz, fosfataz i kinaz.

• Wektory – nośniki obcego DNA zdolne do autonomicznego namnażania się w komórce, konstruowane np. na podstawie bakteryjnych plazmidów, genomu bakteriofagów lub chromosomów drożdży. Wektor ma marker selekcyjny (np. gen odporności na antybiotyk) pozwalający wyizolować rekombinanty.

• Klonowanie – namnażanie DNA i RNA, z wykorzystaniem wektorów.

• Analiza DNA – głównie techniki hybrydyzacji. Aby stwierdzić aktywność danego odcinka wprowadza się sondę DNA lub RNA komplementarną do szukanego odcinka, znakowaną izotopem lub chemicznie. Alternatywą jest sekwencjonowanie – głównie automatyczne.

• Ekspresja białek – inżynieria umożliwiła syntezę w dużych ilościach białek rzadkich w komórkach. Wyizolowane geny tych białek ulegają ekspresji w komórkach bakterii, drożdży owadów lub ssaków dzięki zastosowaniu wektorów ekspresyjnych z danym genem. W wektorach takich są odpowiednie sekwencje promotorowe i regulacyjne.

• GMO (organizmy transgeniczne) – możliwe modyfikacje to dodanie genu, zastąpienie go zmutowaną formą lub jego usunięcie (znokautowanie).

Rozdział3

Cyklkomórkowyistarzeniekomórek

FazaG1

� syntezaRNAibiałekstrukturalnych,regulatorowychienzymatycznych

� trwakilka-kilkanascieh

� punktrestrykcyjnydecydującyowejsciudocyklu,zsyntetyzowanebiałkaregulatorowei

enzymatycznepotrzebnedorozpoczęciafazySiunieczynnionebiałkoRB

FazaS

� syntezaDNA

� rozpoczynasięniejednoczesniewpunktachstartowych

� trwa6-8h,postępujedwukierunkowo

� syntezą przeprowadzają replikony, składniki macierzy jądra (helikazy-rozszczepiające

helisę na widełki, polimerazy DNA α i δ-dodająca komplementarne nukleotydy,

telomerazy

• znacznik:koenzympolimerazyδ-PCNA

• mechanizmzapobiegającyponownejreplikacji,dołączanieiodłączaniebiałek

FazaG2

• trwaok2-4h

• syntezaRNAibiałekregulatorowychienzymatycznychpotrzebnychdomitozy

• punktkontrolnysprawdzającyczyniemawadwgenomie(jeslisątoaktywacjap53)

• system naprawy DNA:rozpoznanie błędu i wycięcie przez nukleazy, uzupełnienie i

wbudowaniepolimeraząiligazą

Mitoza

• trwa0,5-1,5h,najpierwkariokineza,pozniejcytokineza

• kondensacjachromatynywchromosomyirozdziałkazdegonachromatydy

• profaza,metafaza,anafaza,telofaza

• kinezynyłączącentrosomzmikrotubulamiwrzecionapodziałowego

• chromokinezynyłącząmikrotubulezramionamichromosomow

• dyneinyłącząpromienistemikrotubulezbłonąkomorkową

• podkoniecmetefazychromatydysiostrzanesąkołączonekohezyną(separyna i sekuryna),

rozkładanąprzezcyklosom(kompleksanafazowyAPC)izaczynasięanafaza

Regulacja

Cykljestpobudzanyprzezbiałkakodowaneprzezprotoonkogeny,ahamowanyprzezbiałkagenowsupresorowych.

CDK - kinazy cyklinozalezne (1-8, cykliny A-J), aktywowane przez cykliny, fosforylują grupy

białekregulująccykl

CKI - inhibitory cyklin i CDK, dzielą się na dwie rodziny: białka p21 (p27 i p57) i INK4

(p15,p16,p18,p19),białkap53iRB

GenRB(retinoblastoma)'wrotacyklukomorkowego'-gensupresorowykom.nowotworowych,

kodującybiałkoRB,ktore zatrzymujekomorkiw fazieG1hamując transkrypcję.Działa

hamująconaE2Fizwiększakondensacjęchromatyny.Fosforylacjajeinaktywuje!

białko p53 - 'straznik genomu'- czynnik transkrypcji aktywowany (fosforylowany!) przez

uszkodzenie DNA, hamuje komorki w fazie G1, pozwalając na naprawę lub apoptozę

(aktywujegenp21-inhibitorcykluirozpoczynanaprawę)

Cyklsamonapędzający

SpadekstęzeniaokreslonychcyklinprowadzidoodłączeniaodCDKiprzejsciadokolejnejfazy.

PrzejścieG1-S-punktrestrykcyjny

• regulowaneprzezkinazyCDK4i6,aktywowanecyklinamiD1,2,3

• niskiestęzenieCKI(p27)inieczynne(ufosforylowane)białkoRB

PrzejścieG2-M-punktkontrolny

− zalezy od kompleksow MPF (B1,2/CDK1) -ich wysokie stęzenie pozwala przejsc do

mitozy,

− doaktywacjipotrzebnajestpodwojnafosforylacjaidefosforylacjaCDK1

− nakoncurozpadcyklinyprzyudzialeproteasomow

Wyjściezmitozy

− regulowanebiałkamiMEN(zestawbiałekwyjsciazmitozy)

− zapobiegająwchodzeniudofazyG1komorkomzdefektami

− inaktywująkompleksB/CDK1(MPF)pozwalającopuscicmitozę

Regulacjazzewnątrz

Cytokiny-peptydoweczynnikiwzrostuiroznicowania,zmuszającekomorkidowyjsciazG0do

cyklu, np. PDGF, EGF, FGF, TGF oraz 20 interleukin. Wiązą się do białek powodując

autofosforylację, przekazują sygnał do kinaz MAPERK, ktore aktywują transkrypcję i inne

procesypodziałowe.

PDGF-płytkowyczynnikwzrostu,stymulujeproliferacjękom.mięsniitk.łącznej

EGF-epidermalnyczynnikwzrostumstymulujeprofliferacjękom.skory

FGF-czynnikwzrostufibroblastow,stymulujeprofliferacjęfibroblastow

HGF-czynnikwzrostuhepatocytow,stymulujeprofliferacjęhepatocytow

Sirtuliny-genydługowiecznosci,regulująaktywnoscp53iq76-indukująceapoptozęinaprawę

DNA.Niedoborkaloriiistresaktywujątegeny.

Rozdział4

Apoptoza

apoptozaanekroza

Apoptoza Nekroza

Proces aktywny Proces pasywny

„zaprogramowana” smierc, synteza białek, aktywacja szlakow biochemicznych

Sbmierc w wyniku uszkodzenia

Pojedyncze komorki Występuje masowo

Po zakonczeniu pojawiają się ciałkaapoptotyczneulegające fagocytozie

Nabrzmiałe komorki pękają, następuje wylanie się cytoplazmy to przestrzeni zewnątrzkomowrkowej

Wybiorcza proteoliza składnikow komorki (DNA pocięte na odcinki 180-200 pz)

Raczej chaotyczne trawienie składnikow komorki przez enzymy lizosomalne

Proces fizjologiczny (rekrutacja komorek immunologicznych, apoptoza neuronow w okresie

rozwoju)

Proces patologiczny

Brak reakcji otaczających komorek Stan zapalny w otoczeniu komorek (pojawienie makrofagow, granulocytow...)

Do apoptozy prowadzą zarowno sygnały proapoptotyczne, jak i sprzeczne – dot. apoptozy i proliferacji docierające do komorki jednoczesnie. Zaburzenia apoptozy prowadzą do rozwoju nowotworow, cukrzycy insulinozaleznej (apoptoza komorek B wysp Langerhansa), uszkodzenia wątroby (pod wpływem alkoholu etylowego i nadmiernej ilosci zołci), kardiomiopatii, chorob autoimmunologicznych. 2.etapyapoptozy INDUKCJA → INICJACJA → EGZEKUCJA a) indukcja Wyrozniamy szlak zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny.Wewnątrzpochodny – aktywacja pod wpływem uszkodzen DNA, niekontrolowanej proliferacji komorek, działania glikokortykoidow. Element indukujący – białkop53.Przebieg szlaku wewnątrzpochodnego przedstawia się następująco: Białkop53→uwolnieniecytochromuczmitochondriów→aktywacjaprokaspazZewnątrzpochodny – inicjacja poprzez kontakt z inną komorką/białkami (TNF-alfa, FAS-ligand, TRAIL). Odmiana – aktywacja apoptozy poprzez granzym B (e. Proteolityczny prod. przez limfocyty T). Przebieg: kontaktzkomórką/substancją→wiązaniezreceptoramibłonowymi→receptorywiąząsięzbiałkamiadaptorowymi→uwolnieniecytochromuc...

3.kaspazyCotojest?

� proteazycysteinowe� działająnakilkarodzajowsekwencjiaminokwasow� występują w formie nieaktywnej (prokaspazy) w cytoplazmie. Wykazują pewną

aktywnosc.Aktywacjaprokaspaz:Zachodzipoprzezreakcjeenzymatyczne1.N-koniec-----------------------------------------------------------------------------------C-koniec2.przecięciełancuchana2–krotkiidługi:N-koniec------------------------------------------------------CN----------------------------C-koniec3.odcięcieN-koncowejpradomenyN-koniec-------CN----------------------------------------------CN----------------------------C-koniec4.Agregacja2 łancuchowdługich i2krotkich– tworzysięAKTYWNYtetramer.Kaspazama2miejscakatalityczne.Agregacjamozliwajestdzięki2rodzajomprodomen:

• DED(domenyefektorowesmierci)–kaspazy8i10• CARD(domenyrekrutacjikaspaz)1,2,4,5i9kaspaza

Aktywacjazachodzipoprzez:� proteolizęzaleznąodinnychkaspaz,� aktywacjęposredniąpoprzezgranzymB,� aktywacjęprzezmitochondrialnyAIF

Charakterystykakaspaz:

Numerkaspazy/kaspaz Charakterystyka Rola

8,9,10 Długie prodomeny, agregują zinnymibiałkami

KASPAZYINICJATOROWE

3,6,7 Krotkie prodomeny, aktywacjazalezna od proteolizy zal. odinnychenzymow

KASPAZYEGZEKUTOROWE/EFEKTOROWE

1 Niezwiązana z procesemapoptozy

Konwertuje interleukinę,uczestniczy w procesachzapalnych

4.SzlakzewnątrzpochodnyInicjowany przez receptory TNF-alfa – tzw. receptory śmierci, występujące w błoniekomorkowejlimfocytowTikomorekNKlubwformiewolnej.Sąto:receptorTNF typu I←aktywuje sfingomielinazę.Produkt rozkładusfingomielinywbłoniekomorkowej–ceramidrowniezindukujeapoptozę.receptorFASreceptorTRAIL2pierwsze zawierają domenę śmierciDD.Po związaniu ligandu receptory grupują się (po 3rec.) Następnie wiązą się z białkami adaptorowymi w miejscu ich domen smierci (FADD lubTRADD).

BiałkaadaptorowepoprzezDDłącząsięzreceptorami,apoprzezdomenęDEDzprokaspazą8,aktywującją.Innesubstancjebiorąceudziałwtransdukcjisygnałudoapoptozy:RAIDD,CARD(aktywujeprokaspazę3)RIP (wraz z RAIDD aktywuje prokaspazę 2). ← jednoczesnie moze aktywowac czynniktranskrypcyjnyNfκBpromującyprzezycieiproliferacjękomorek.Receptorywabikowewiąząligandodpowiedzialnyzaapoptozę,leczniepowodująinicjacjitegoprocesu.Zapobiegatoprzypadkowejinicjacjiapoptozyprzyniewielkimstęzeniuliganda.5.SzlakwewnątrzpochodnyInicjowany przez rozne bodzce uszkadzające lub stresowe, ktore powodują jeden lub kilkaponizszychmechanizmow:

• aktywacjabiałkap53• uwolnieniemitochondrialnychczynnikowinicjującychapoptozę• aktywacjakinazcytoplazmatycznych

Białkop53-„strażnikgenomu”.AktywowaneprzyuszkodzeniachDNA.Zwyklenieaktywnewnowotworachzłosliwych.Jest to CZYNNIK TRANSKRYPCYJNY. - powoduje indukcję inhibitora CDK p21, a ten BLOK WCYKLUKOMOb RKOWYM.Aktywowanyzapomocąkinazprzezfosforylację.Duzeuszkodzeniawgenomiedopuszczajądezaktywacjęp53ikontynuacjęcyklukomorkowegoponaprawieniubłędowwgenomie.Rozległeuszkodzeniapowodująekspresjębiałekproapoptotycznych(Bcl-2,Bax,Noxa).

6.egzekucjaapoptozy

3fazy:UWALNIANIE→UWYPUKLANIE→KONDENSACJA

UWALNIANIE UWYPUKLANIE KONDENSACJA

Utrata kontaktu z podłozem iinnymikomorkami,reorganizacja cytoszkieletuaktynowego,rozpadmikrotubul,

Skurcze włokienek aktynowych,degradacja białek za pomocąkaspaz

Rozpad na wiele ciałekapoptotycznych,depolimeryzacjaaktyny

Proteoliza enzymownaprawiającychDNAorazbiałekhamujących nukleazy ICAD zapomocąkaspaz

7.inhibitoryapoptozyIAP–blokująaktywnoscenzymatycznąkaspaz.SamesąblokowaneprzezczynnikDiablo.PrzykłademIAPjestsurwiwina–dezaktywujekaspazę3i7.AsocjujezWWKwczasiemitozy.Zaburzenietegoprocesupowodujeaktywacjękaspazy3ismierckomorki.8.mitochondriaUwalniająbiałkaAIFicytochromc,ktorepowodująapoptozę.AIFaktywujekaspazy,flopazę(przesuwafosfatydyloserynęnazewnątrzbłonykomorkowej).

Cytochrom c łączy się z APAF (zawiera domenę rekrutującą kaspazy CARD) tworząc APOPTOSOM. - aktywuje kaspazę 9, a ta inne kaspazy. Cyt. C jest uwalniany z mitochondriow dzięki Bcl-2. Wbudowują się w błonę mitochondriow tworząc PTP – kanał jonowy zwany porem zmiany przepuszczalnosci. Wpuszcza H2O i jony do srodka mitochondriow powodując pękanie i uwalnianie zawartosci. 9.fosfatydyloserynaUmozliwia rozpoznanie ciałek apoptotycznych przez makrofagi, ktore uwalniają wtedy cytokinyprzeciwzapalne.Fosfatydyloseryna pojawia się na powierzchni błony komorkowej dzięki flopazie aktywowanej przez AIF. 10.pitfiryna-alfaBlokuje białko p53. Znajduje zastosowanie w zapobieganiu skutkom ubocznym chemioterapii nowotworow. Umozliwia stosowanie większych dawek, gdyz prawidłowe komorki są bardziej wrazliwe na działanie p53 niz komorki nowotworowe. 11.metodywykrywaniaapoptozy• ocena komorek pod względem morfologii chromatyny – pomaga odroznic komorki w

poznym stadium apoptozy. Mogą byc uzywane barwniki jak bibenzimid – uzywany do znakowania DNA.

• Techniki immunocytochemiczne. • metoda TUNEL – znakowanie wolnych koncow DNA z udziałem koncowej transferazy

deoksynukleotydow. Takie „nadtrawione” na 3'-koncach cząsteczki powstają w trakcie apoptozy.

• Przeciwciała monoklonalne – wykrywanie epitopow aktywnych kaspaz. • Wykrywanie fragmentow PARP – polimerazy poli-ADP-rybozy powstajacej w wyniku

działalnosci kaspaz. • Wiązanie aneksyny V znakowanej fluorescencyjnie z fosfatydyloseryną – wykrycie

wczesnych etapow apoptozy. • Jodek propidyny – umozliwia odroznienie komorek apoptotycznych od martwiczych

(przenika tylko do tych ostatnich). Wiąze się z DNA. • Elektroforeza DNA na zelu agarozowym. Wykrywa apoptozę w populacji komorek – podczas

apoptozy powstają fragmenty DNA o długosci 180-200pz lub wielokrotnosc, dając obraz „drabinki DNA”.

• Proba kometowa – elektroforeza in situ. Wybarwiony preparat bada się następnie pod

mikroskopem. Komorki apoptotyczne dają smugę DNA w kształcie komety.

Rozdział 5

Mechanizmy rozwoju i różnicowania komórek Komorka totipotencjalna – zdolna do wytworzenia wszystkich typow komorek,charakterystycznych dla danego organizmu. Np. zygota. Kom. pluripotencjalna – zdolna do wytworzenia wielu, ale nie wszystkich mozliwych, typow zroznicowanego potomstwa. Ich aktywnosc ogranicza się zwykle do jednej tkanki. Np. kom. osteogenne, komorki macierzyste szpiku kostnego. W dalszym etapie specjalizacji powstają kom. ukierunkowane i komorki szlaku koncowego zroznicowania, przy czym te ostatnie mają okresloną strukturę, funkcję i ograniczone/brak zdolnosci do podziału. Np. erytrocyty Stabilność genomu w czasie różnicowania

Poza nielicznymi wyjątkami w jądrach wszystkich komorek somatycznych ludzkiego ciała znajduje się ten sam zestaw 23 par chromosomow homologicznych, zawierający tę samą informację genetyczną – w trakcie powstawania roznorodnych fenotypowo komorek nie dochodzi* (są wyjątki) do zmian jakosciowych i ilosciowych w genomie. Dowody: -Transdyferencjacja (przeroznicowanie) – zmiana orientacji programu rozwojowego komorki, zachodząca na wczesnych etapach embiogenezy. np. przekształcenie się (w warunkach in vitro) chromochłonnych komorek rdzenia nadnerczy, pod wpływem NGF, w neurony wydzielające noradrenalinę. Dzięki temu, ze genom nie zmienia się jakosciowo mozliwa jest zmiana programu rozwojowego komorek juz zroznicowanych. Do transdyferencjacji dochodzi rowniez w przypadku regeneracji narządow. -Indukowana in vitro fuzja komorek somatycznych nalezących do odrębnych linii komorkowych moze doprowadzic do ich funkcjonalnej reorientacji. -Klonowanie – transplantacja jądra komorki zroznicowanej do pozbawionej jądra komorki jajowej i uzyskiwanie w ten sposob w pełni funkcjonalnych organizmow. Powstałe w wyniku klonowania organizmy są identyczne genetycznie z organizmami, z ktorych pozyskiwano jądra do transplantacji. Wyjątki: -poliploidyzacja – zwielokrotnienie podstawowego zestawu chromosomow -amplifikacja – selektywna replikacja tylko okreslonych genow. W komorkach ssakow zachodzi w przypadku protoonkogenow co stanowi jedną z form ich aktywacji. -dyminucja chromatyny – eliminacja fragmentow chromatyny w komorkach. Dotyczy niektorych bezkręgowcow i ryb. -strukturalna reorganizacja genomu zachodząca np. w limfocytach ssakow (związana z wytwarzaniem przeciwciał) Zróżnicowana ekspresja genów – podstawa specjalizacji strukturalnej komórek

Przyczyną specjalizacji jest odmienna aktywnosc genow w komorkach. - komorki zroznicowane roznią się wzorem ekspresji genow, ktory warunkuje powstanie okreslonego zestawu białek enzymatycznych i strukturalnych. Klasy genow : 1.Geny od ktorych zalezą podstawowe procesy metaboliczne w komorce. Ulegają ekspresji we wszystkich komorkach. np. gen dehydrogenazy bursztynianiowej 2.Geny, ktorych ekspresja warunkuje powstawanie białek charakterystycznych tylko dla okreslonego typu komorki. Ulegają transkrypcji w jednych a represji w innych.

Wczasierozwojuwzorekspresjigenowwkomorcemozesięzmieniac.Do regulacji funkcji genow dochodzi na wszystkich poziomach jego ekspresji – transkrypcja,dojrzewanieRNA, syntezabiałka, potranslacyjnemodyfikacje.Regulacjawystępuje głownienapoziomietranskrypcjizasprawączynnikowtranskrypcyjnych.Rozdzielenieokreslonychczynnikowtranskrypcyjnychdookreslonychkomorekwarunkuje ichroznicowanie:Powstająca w wyniku zapłodnienia zygota dzieli się na blastomery, przy czym nie wzrastacałkowita masa zarodka → materiał cytoplazmy kom. jajowej zostaje rozdysponowany dokolejnych blastomerow – rozne blastomery posiadają cytoplazmę z roznych regionow oocytu(wraz z zawartoscią). Te fragmenty cytoplazmy zawierają tzw. determinanty ooplazmatyczne(będącenajprawdopodobniejczynnikamitranskrypcyjnymi,awłasciwiemRNA,ktorejekoduje).Czyli: pierwotne zroznicowanie komorek zarodkowych zalezy od nierownomiernej lokalizacjideterminantow (mRNA) w cytoplazmie komorki jajowej oraz od sposobu ich segregacji wasymetrycznychpodziałachbruzdkowania.Dotyczytoniektorychgatunkowomozaikowymtypierozwoju(rozmieszczeniedeterminantowwcytoplazmiemacharakterprecyzyjnejmapy).Ussakowjajasącytoplazmatyczniehomogenne→bruzdkowaniejestsymetryczne,apojawiającesięblastomerydostadium8-komorkowegosąniezroznicowane.Powyzszyproces(segregacjadeterminantow)maznaczeniewustalaniuogolnegoplanubudowyzarodka – wyznaczenie osi symetrii ciała. Stanowi rowniez podłoze dla dalszych procesowroznicowania.Oddziaływaniemiędzykomórkowearóżnicowanie Sąsiadujące komorki wpływają na siebie, na zasadzie indukcji, poprzez induktory(substancje sygnałowe), ktorych stęzenie jest niewielkie. Zdolnosc do wytworzenia ligandu iodpowiedzi na niego (receptory) jest krotkotrwała. Wynikiem połączenia induktora zreceptorem jest aktywacja czynnika transkrypcyjnego, ktory zmienia dotychczasowy wzorekspresjigenow→nowykierunekroznicowania. Do substancji sygnałowych nalezą m.in. peptydowe czynniki wzrostu (FGF, TGD beta),peptydyzrodzinyhedgehogiglikoproteidyWnt. Sposobprzekazywaniasygnału:-przekazanieliganduwrazzbłonąkomorkiindukującej(bezposrednikontakt!)-ligandzakotwiczonywmacierzyzewnątrzkomorkowej-dyfuzjaligandawprzestrzenizewnątrzkomorkowej(sekrecjaparakrynna)W wyniku dwoch ostatnich komorki znajdujące się w roznej odległosci od miejsca sekrecjiligandusąeksponowanenarozne jegostęzenia.Substancjeindukujące,ktorychefektdziałaniaindukcyjnegowprocesachroznicowaniakomoreksąsiadującychzalezyodgradientuichstęzenianazywanesąmorfogenami.InformacjapozycyjnaTworzeniesięinformacjipozycyjnejzalezyodsygnalizacjimiędzykomorkowej.Przykład:powstawaniekonczynyptaka.W tylnej strefie zawiązka konczyny znajduje się grupa komorek mezenchymalnych pełniącafunkcjęcentrumsygnalizacjiprzednio-tylnej.Wydzielająonemorfogen. Jegogradientmalejewkierunkuprzednimcoindukujekomorkimezenchymatycznedoutworzeniapalcowwłasciwychdladanegoregionu(komorkiznajdującesięwniskimstęzeniuformująpalecII,kom.znajdującesięwwyzszympalecIV...).Wkomorkachcentrumsygnalizacji ulega ekspresji gen sonichedgehog (shh), kodującybiałkosonichedgehog.WzaleznosciodprogowychwartoscistęzeniaShhwroznychstrefachzawiązkakonczyny dochodzi do ekspresji roznych genow Hox a i d. Nakładające się na siebie domenyekspresjitychgenowwyznaczająprecyzyjnywzorprzestrzenny.Shh wpływa rowniez na determinację pewnych struktur OUN, reguluje prawidłowefunkcjonowanie komorek nabłonkowych tworzących mieszki włosowe w skorze. Zaburzeniasygnalizacji Shh prowadzą do powstania powaznych deformacji rozwojowych np. cyklopia, atakzeprocesownowotworowych(rakpodstawnokomorkowyskory).

Pamięćkomórkowa Powstały w wyniku roznicowania wzor ekspresji genow, charakterystyczny dla danej linii komorkowej, zostaje zapisany w pamięci komorkowej i jest dziedziczony w kolejnych pokoleniach komorek potomnych. Jednym z mechanizmow pamięci jest pozytywne sprzęzenie zwrotne, w ktorym produkt danego genu jest czynnikiem transkrypcji aktywującym ten gen np. w przekształcaniu komorek miogennych we włokna mięsniowe przez białko myoD będące produktem genu myoD. Innym mechanizmem jest modyfikacja strukturalna DNA – selektywna kondensacja pewnych regionow chromatyny w heterochromatyny powodując jej dezaktywację transkrypcyjną. Do dezaktywacji poszczegolnych genow moze dojsc takze poprzez chemiczną modyfikację DNA – metylacja cytozyny we fragmentach CG w okreslonych odcinkach DNA, przez metylazę DNA. Odnowaiprzebudowatkanekinarządów Metaplazja – proces transformacji jednego zroznicowanego typu komorek w drugi. Dochodzi do niej w czasie regeneracji tkanek lub pod wpływem bodzcow srodowiskowych/przewlekłego oddziaływania czynnikow szkodliwych. Naturalna metaplazja zachodząca na wczesnych etapach embriogenezy to trandyferencjacja (patrz wyzej) Przykładami metaplazji są zmiany nabłonka drog oddechowych i nabłonka szyjki macicy w nabłonek wielowarstwowy płaski. Tkanki charakteryzujące się stabilnoscią składu komorkowego – tk. nerwowa, mięsien sercowy, komorki soczewki oka. W czasie odnowy tkankowej komorki zroznicowane giną i są zastępowane przez nowe. Odnowa ta odbywa się po roznym czasie, ktory zalezy od tkanki. W tkankach roznego typu moze się ona wiązac z proliferacją komorek zroznicowanych (np. hepatocyty) lub obecnoscią niezroznicowanych komorek macierzystych. W niektorych tkankach odnowa składu komorkowego ma charaktrer ciągły i jest mozliwa dzięki obecnosci komorek macierzystych, ktore wyroznia się je na podstawie kryteriow funkcjonalnych : zdolnosc do samoodnowy i generowania zroznicowanego potomstwa. W wyniku jej podziału moze powstac identyczna komorka macierzysta i komorka zroznicowana lub dwie kom. macierzyste. Występują one m.in. w szpiku kostnym, OUN i tkankach nabłonkowych. Zaburzenia systemu kontroli komorek macierzystych prowadzą do roznych patologii np. łuszczycy (nadprodukcja keratynocytow w naskorku i ich niekontrolowane rogowacenie i złuszczanie się), nowotwory.

Rozdział 6

Błony biologiczne i transport przez błony Błona komórkowa – oddziela środowisko wewnętrzne kom.od środowiska zewnętrznego Jedna z najważniejszych cech życia: wewnątrz komórki zachodzą przemiany obniżające entropię, prowadzące do wytworzenia energii i gromadzenia jej – przemiany miejscowe. Wirusy to nie komórki, bo nie wytwarzają błony. *Wnikanie wirusa grypy do komórki. wirus ma na otoczce glikoproteinę (hemaglutyninę), która wiąże się z receptorami na pow. komórki, które zawierają kwas neuraminowy. Kwas ten jest wiązany przez hemaglutyninę → 8 nici DNA wirusa dostaje się do komórki → replikuje się i odtwarza białko wirusa. U Eucaryota występują przedziały wewnątrzkomórkowe (wnętrze podzielone błonami śródplazmatycznymi). Jednym z przedziałów jest jądro kom. U Eucaryota liczba par zasad genomu oraz zawartość DNA jest większa niż u Procaryota. Przedziały wewnątrzkomórkowe umożliwiają:

� wykorzystanie procesów transportu wewnątrz komórki do gromadzenia i wytwarzania energii

� tworzenie w pewnych okolicach kom. magazynów jonów i substancji � transport cząsteczek w określonych kierunkach wewnątrz komórki

1. Dwuwarstwa lipidowa

• fosfolipidy – amfipatyczne • biegun hydrofilowy posiada ładunek elektryczny i wiąże cząsteczki wody; jest

skierowany do środowiska wodnego (wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego) • warstwa od strony środowiska zewnętrznego – warstwa E (exoplasmic space) • warstwa od wnętrza komórki – warstwa P (protoplasmic space) • łańcuchy kw. tłuszczowych oddziałują na siebie i utrzymują strukturę dwuwarstwy • środowisko płynne

Płynność – łatwość, z jaką cząsteczki przemieszczają się w płaszczyźnie błony. Jest zależna od długości łańcuchów kw. tłuszczowych (zazwyczaj 14-24 atomów węgla) i ilości wiązań podwójnych. Krótsze łańcuchy i więcej podwójnych wiązań – większa płynność. Obecność dużych cząsteczek (np. cholesterol) - mniejsza płynność. Półpłynność dwuwarstwy ułatwia przemieszczanie się wbudowanych w nią innych cząsteczek, np. białek. Dyfuzja boczna zachodzi co ok. 10-6s, a ruchy flip-flop (między warstwami) co ok. 105s.

• asymetria warstwa E: sfingomielina (więcej w tej warstwie), fosfatydylocholina (więcej w tej warstwie), fosfatydyloetanoloamina, glikolipid, cholesterol

warstwa P: fosfatydyloetanoloamina (więcej w tej warstwie), fosfatydyloseryna, fosfatydyloinozytol, fosfatydylocholina, sfingomielina, cholesterol

• glikolipidy – syntetyzowane w błonach śródplazmatycznych przez dołączenie reszt cukrowych lub spoza komórki

• biosynteza fosfolipidów – półokres trwania fosfolipidów błon in vivo jest różny, np. w erytrocycie – kilka tygodni. W komórkach, w których błony podlegają częstej wymianie lub przyrasta pow. błony, jest on krótszy. Biosynteza i wbudowywanie do błony odbywa się w cytoplazmie z CDP-diglicerydów i L-seryny → powstają fosfatydyloseryny → (dekarboksylacja) → fosfatydyloetanoloaminy → (metylacja) → fosfatydylocholiny. Składniki błon pojawiają się najpierw w warstwie P, potem mogą być przeniesione do E za pomocą białek (flipaz). Składniki błon mogą być pobierane także z środowiska zewnętrznego np. cholesterol.

• funkcje dwuwarstwy lipidowej:

- odkształcalna, elastyczna, przepuszczalna dla małych cząsteczek (woda, amoniak, mocznik, CO2), nieprzepuszczalna dla jonów, większych cząsteczek (aminokwasów, peptydów, nukleotydów, oligonukleotydów)

- uszkodzenia są natychmiast spontanicznie reperowane – nie można jej przekłuć - zapewnia możliwość efektywnego i wybiórczego transportu wielu substancji, które

nie przenikają przez dwuwarstwę w wyniku prostej dyfuzji z odpowiednią szybkością - białka transportowe

2. Białka błonowe

regulują transport substancji koniecznych do życia komórki

• Białka integralne: � zakotwiczone w błonie za pomocą domen hydrofobowych (z aminokwasów

hydrofobowych) - zbudowane z około 20 aminokwasów (struktura α-helisy); domeny hydrofilowe wystają po jednej lub obu stronach błony

� białka zakotwiczone poprzez kowalencyjnie dołączone grupy lipidowe, same pozostają na powierzchni błony

Białka te można oddzielić od błony działaniem detergentów i czynnikami chelatującymi jony. Sposoby zakotwiczenia w błonie: � zakotwiczenie jedną α-helisą z grupą N-końcową na powierzchni komórki

(glikoforyna, receptor LDL, ciężki łańcuch cząsteczki HLA-A) � zakotwiczenie jedną α-helisą z grupą C-końcową na powierzchni komórki (receptor

transferyny) � zakotwiczenie kilkoma α-helisami (białko 3 prążka elektroforycznego erytrocytu [N i

C-koniec w komórce], rodopsyna [N-koniec na zewnątrz, C-koniec w środku komórki]) � zakotwiczenie α-helisą nieprzechodzącą przez całą błonę (cytochrom b5), N-koniec w

środku, C-koniec wewnątrz błony � zakotwiczenie dołączoną gr. mirystylową (białko Src), C-koniec w cytoplazmie, N

wewnątrz błony � zakotwiczenie dołączoną gr. fosfatydyloinozytolową (białko Th-1 limfocytu), N-koniec

na zewnątrz, C-koniec wewnątrz błony

• Białka powierzchniowe: - tworzą kompleksy z białkami integralnymi → są związane z jedną z

powierzchni błony

• Wbudowywanie białek do błon: � większość białek integralnych – syntetyzowana na rybosomach RER � początkowy odcinek N-końca zbudowany z ok. 20 aminokwasów, hydrofobowy –

odcinek sygnałowy → wiąże SRP (signal recognition particle) i może wniknąć do dwuwarstwy lipidowej → zostaje otoczony przez receptory tworzące kanał w dwuwarstwie → przez kanał mogą przesuwać się dalsze części łańcucha polipeptydowego, również hydrofilne. Biosynteza zachodzi jednocześnie z translokacją – kotranslacja. Odcinek sygnałowy jest odcinany przez proteazę. Kotranslacja kończy się syntezą drugiej domeny hydrofobowej służącej do zakotwiczenia.

� inna hipoteza: sekwencje aminokwasów hydrofobowych są obecne w białkach błonowych oraz rozpuszczalnych w cytoplazmie → białka przeznaczone od wbudowania w błonę w kontakcie z nią przyjmują konformację umożliwiającą przemieszczenie przez błonę, np.: oksydaza cytochromowa, dehydrogenaza 3-fosforanu glicerolu, cytochrom b5, transferaza galaktozylowa → dobrze rozpuszczalne w r-rach wodnych bez detergentu, mogą spontanicznie wbudowywać się w błony – fałdowanie łańcuchów zależne od błony

� obie hipotezy ↑ nie wykluczają się: białka z N-końcem na zewnątrz – efekt kotranslacji, białka z C-końcem na zewnątrz – fałdowanie

3. Błona erytrocytu i szkielet błony Szkielet błony – warstwa białek leżących pod błoną zespolonych z białkami integralnymi błony, które umożliwiają utrzymanie kształtu erytrocytów przy przeciskaniu się przez kapilary naczyń. Elektroforeza białek błony erytrocytu Wyróżniono wiele białek, dwa główne – białka integralne: glikoforyna i białko 3 prążka elektroforetycznego, pozostałe – powierzchniowe białka szkieletu błony. • Glikoforyna

- 131 aminokwasów - zamocowana jednym odcinkiem α-helisy (23 aminokwasy) - koniec N od strony środowiska zewnętrznego - przyłączone liczne łańcuchy cukrowe

� Białko 3 prążka (szczytu) - kanał dla anionów, HCO3 i Cl- - dimer tworzy kanał - większe od glikoforyny - zakotwiczone 14 odcinkami α-helis, N i C-koniec od strony cytoplazmy

� Spektryna - główne białko powierzchniowe - tetrametry złożone z dwóch heterodimerów: łańcuchy 220 i 240 kD (α i β) - dimery – długie (100 nm) splatające się powrozy – biegną równolegle do

powierzchni błony i tworzą regularną sieć - w regularnych odstępach zamocowana do białka 3 prążka za pomocą

ankiryny (białko prążka 2.1) - dołączone są w regularnych odległościach białko prążka 4.1 (połączone z

glikoforyną) i F-aktyna (krótkie mikrofilamenty) � Inne białka szkieletu błony erytrocytu:

- aktyna (łączy się z glikoforyną, tropomiozyną, adducyną i tropomoduliną) - tropomiozyna - adducyna (łączy się z aktyną i spektryną) - tropomodulina (łączy się z aktyną i tropomiozyną) - białko 4.9 (z spektryną)

* KLINIKA: Liczne powiązania białek szkieletu błony i integralnych – dobra stabilność

mechaniczna kształtu erytrocytu. Nieprawidłowości budowy spektryny – erytrocyty różnokształtne (pojkilocytoza), erytrocyty eliptyczne (eliptocytoza) → łatwo podlegają hemolizie → niedokrwistość. Wiele komórek (neurony, limfocyty) w korowej warstwie cytoplazmy mają białka podobne do spektryny – fodryny.

4. Białko integralne leukocytów – CD45 • inaczej GP180, T200 lub wspólny antygen leukocytów • jest to enzym – białkowa fosfataza tyrozynowa • zamocowane jednym odcinkiem α-helisy, powierzchniowy odcinek ma przyłączone gr.

cukrowe – różna długość części powierzchniowej → izoformy • miejsce aktywne enzymu – w domenie cytoplazmatycznej (konserwatywna ewolucyjnie), w

tym odcinku – miejsce wiązania fodryny • z fodryną i mikrofilamentami aktynowymi tworzy szkielet błony • kompleks z fodryną zwiększa aktywność fosfatazową – prawdopodobny udział w

przekazywaniu sygnału i aktywacji leukocytów • ekspresja CD45 jest niższa w kom. niektórych chłoniaków – diagnostyka i odróżnienie kom.

chłoniaka od prawidłowych limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej

5. Glikokaliks • warstwa oligosacharydów (związanych z glikolipidami i białkami integralnymi) pokrywająca

powierzchnię komórki • ochrona komórki i uczestnictwo w oddziaływaniach między komórkami np. oddziaływanie

leukocytów z kom. śródbłonka w zapaleniu: adhezja leukocytów do śródbłonka naczyń → na powierzchni kom. śródbłonka pojawiają się białka integralne – selektyny E i P → wiążą swoiste oligosacharydy na pow. leukocytów → zatrzymanie leukocytów i wywędrowanie ich z naczyń do zagrożonej tkanki * selektyny L pojawiają się na leukocytach i oddziałują z oligosacharydami powierzchni kom. Śródbłonka

6. Transport cząstek przez błony biologiczne � Ładunki wewnątrz komórki:

Aniony: białka i kwasy nukleinowe (grupy fosforanowe i karboksylowe), wodorowęglanowe HCO3-, chlorkowe Cl-, fosforanowe Kationy: głównie K+

� przy braku równowagi jonowej komórka pobiera wodę → pęcznieje i pęka � przez błonę komórkową są transportowane m.in.: aminokwasy, cukry, nukleozydy, Na+, K+,

Ca2+

� przez wewnętrzną bł. mitochondrialną: pirogronian, ADP, H+/ATP � przez błonę lizosomalną: H+

a) Cechy transportu przez błony • transport prosty: woda (lub ułatwiony: akwaporyny), mocznik, etanol,

gazy (dwutlenek węgla, tlen, tlenek azotu (II)), substancje dobrze rozpuszczalne w lipidach

• białka są niezbędne do transportu substancji hydrofilnych i obdarzonych ładunkiem

• do transportu aa, cukrów, nukleozydów, jonów niezbędne są białka błonowe, ale niepotrzebna jest energia z zewnątrz

• transport ułatwiony białkami przenośnikowymi jest zgodny z gradientem stężeń w poprzek błony, a jony dyfundują zgodnie z potencjałem elektrycznym

• dwie grupy białek biorących udział w tym transporcie: o białka przenośnikowe – swoiście wiążą dane cząsteczki –

białko przenośnikowe zmienia konformację – cząsteczka jest uwalniana po drugiej stronie błony

o białka tworzące kanały – budują otwarte pory, umożliwiające wolną dyfuzję cząsteczek odpowiedniej wielkości i ładunku; część kanałów może być otwierana ligandem lub zmianą potencjału

b) Transport aminokwasu do komórki (na przykładzie transportu L-leucyny do komórek

raka wysiękowego Ehrlicha) • jest zależny od różnicy stężeń L-Leu po obu stronach błony i zgodny z ich gradientem • stężenie L-Leu w komórce jest niskie i na stałym poziomie (jest włączana do

procesów metabolicznych) • zwiększanie stężenia L-leu na zewnątrz kom. powoduje wzrost szybkości transportu

aminokwasu do komórki • transport przenośnikiem (w tym wypadku) jest stereoswoisty

c) Transport glukozy do i z komórki � dwie rodziny białek transportujących glukozę: GLUT (transport wysycalny, stereoswoisty,

dwukierunkowy) i SGLT1 (jelitowy kotransporter Na+/glukoza, wykorzystuje elektrochemiczny gradient Na+ do wtórnie aktywnego transportu glukozy i galaktozy wbrew gradientowi stężenia; bierze udział w pobieraniu Glc i Gal z jelita cienkiego i reabsorpcji glukozy z moczu w nefronie)

� białko GLUT: w błonie większości komórek zwierzęcych, bierze udział w transporcie ułatwionym D-glukozy do komórki

� GLUT1 – masa ok. 55 kD, jeden łańcuch N-oligosacharydowy od str. środowiska, zamocowany 12 α-helisami → każda helisa → 21 aminokwasów → układają się resztami hydrofobowymi w kierunku warstwy lipidowej → 7 zewn. domen przenośnika, a 5 domen z resztami hydrofilnymi → wnętrze kanału do wiązania glukozy; w erytrocycie, w tkankach płodowych, kom. hodowanych in vitro, w nerce, jelicie grubym dorosłych

� GLUT2 – wątroba (podstawnoboczna błona komórkowa hepatocytów), kom. β trzustki, jelito cienkie, nerka

� GLUT3 – neurony, mózg, łożysko, jądro � GLUT4 – białko integralne, transport heksoz do różnych typów kom.

zależnych od insuliny. W kom. mięśniowch, adipocytach pod wpływem insuliny następuje przemieszczanie GLUT4 z endosomów do błony kom.

� GLUT5 – komórki nabłonkowe jelita cienkiego, plemniki – transport fruktozy w j. cienkim, nerce, mięśniu szkieletowym, adipocytach, mózgu, jądrze

Glukoza wewnątrz kom. jest natychmiast fosforylowana, gradient stężenia → najczęściej z osocza do komórki. Transport może odbywać się w drugą stronę: np. z hepatocytów do osocza podczas głodzenia. W kom. kanalików nerkowych proksymalnych – boczno-podstawne pow. błony kom. – transport zwrotny do osocza. * Cukrzyca typu I (insulinozależna, młodzieńcza): brak wydzielania insuliny wskutek autoimmunologicznego zniszczenia kom. β trzustki → poważne zaburzenia gospodarki weglowodanowej → kwasica ketonowa, hiperglikemia i przekroczenie progu nerkowego (glukozuria). Stosując iniekcje insuliny przed każdym posiłkiem możliwe jest normalne funkcjonowanie. Cukrzyca typu II (wieku dojrzałego): insulinooporna – niedostateczna odpowiedź na insulinę → niedostatek receptora insulinowego lub mniejsza aktywacja przenośnika GLUT4 → upośledzenie wykorzystania glukozy przez komórkę. Leczenie dietą i lekami zwiększającymi wydzielanie insuliny. d) Transport adenozyny i deoksyadenozyny * Nukleozydy deoksypuryn (np. deoksyadenozyna) oraz np. 2-chlorodezoksyadenozyna (2CdA, kladribina – lek stosowany w białaczkach) wnikają do kom. z udziałem transporterów. W komórce: nukleozydy → (fosforylacja) → 5’-monofosforan → (kinaza deoksycytydyny cDK) → trójfosforan. Wbudowana do DNA kom. białaczkowych 2CdA (nieprawidłowa zasada) uruchamia mechanizmy reperacji DNA – nieskuteczna → apoptoza Nukleozydy puryn – również białka transportujące, przenośnik adenozyny został opisany w błonie Trypanosoma brucei. Białko zbudowane z 463 aa, 10 α-helis kotwiczących; transporter P1 (przenosi adenozynę i inozynę do kom.) i P2 (adenozynę, adeninę, dipirydamol i tlenek malarsenu - lek wykorzystywany w leczeniu zakażeń Trypanosoma, blokuje transport adenozyny) e) Białka tworzące kanały jonowe Kanały dla K+, Na+ i Ca2+ występują we wszystkich komórkach. Białka je tworzące należą do jednej rodziny. Kanał K+ - cztery zasocjowane, identyczne łańcuchy, każdy z nich jest zakotwiczony w błonie 6 helisami, a od strony cytoplazmy N i C-koniec. Helisa 4 zawiera liczne dodatnio naładowane aa – czujnik otwierający kanał w odp. na zmiany potencjału błonowego Kanał Na+ - jeden łańcuch z czterema powtarzającymi się domenami, każda podobna do podjednostki kanału K+

Kanał Ca2+ - zbliżony budową do kanału Na+

Transport aktywny • przenoszenie substancji przeciw gradientowi elektrochemicznemu, 3 mechanizmy:

� Translokacja grupowa – u niektórych bakterii

� Transport aktywny pierwotny – tworzenie nowych wiązań kowalencyjnych w przenośniku; energia jest zużywana do zmiany konformacyjnej białka przenośnika

� Transport aktywny wtórny – aktywnie transportowany substrat 1 tworzy gradient potencjału elektrochemicznego warunkujący transport substratu 2 zgodnie z tym gradientem

• uniport; kotransport: symport (SGLT1 w jelicie cienkim i nefronie, 2Na+/glukoza), antyport • wymiennik jonowy – układ, w którym jony są wymieniane przez antyport np.: Na+/H+,

białko wymiany tych jonów reguluje pH wewnątrz kom. • w sarkolemmie kom. mięśnia sercowego – Na+/Ca2+ - w spoczynku 3 jony Na+ do komórki, 1

jon Ca2+ (od komórki) → generacja prądu. W czasie pobudzenia odwrócenie transportu (wapń do środka, sód na zewnątrz). Napływ Ca2+ do wnętrza → aktywacja uwalniania Ca2+ z ER → generacja skurczu mięśnia sercowego

Ad. 2. Pompa sodowa (Na+/K+) • utrzymuje różnice stężeń jonów po obu stronach błony, energia z hydrolizy ATP • jony Na+ są wiązane w miejscach o dużym powinowactwie do nich od strony cytoplazmy →

hydroliza ATP i fosforylacja pompy → zmiana konformacji białka → przesuwa miejsce wiązania ku zewnątrzkom. str. błony i zmniejsza powinowactwo do Na+ → są one uwalniane na zewnątrz; w pompie pojawiają się m-ca (od str. zewnątrzkom.) silnie wiążące K+ → hydroliza grupy fosforanowej białka pompy → zmiana konformacji → jony K+ uwalniane do cytoplazmy

• praca pompy jest ważna dla kom., niektóre zużywają na nią 25% ATP • umożliwia przenoszenie sygnałów elektrycznych w neuronach i kom. mięśniowych, wtórny

transport wielu substancji i utrzymanie równowagi osmotycznej i objętości komórki • jej działanie przeciwdziała dużemu stężeniu makrocząsteczek, aa, nukleozydów i

nukleotydów wewnątrz kom. które powodują wnikanie wody → pęknięcie kom; jon Na+ wiąże więcej wody niż jon K+

• budowa: 3 podjednostki α (113kD) – zachowawcza ewolucyjnie sekwencja aminokwasów, duże znaczenie dla działania pompy, w tej podjedn. leży sekwencja aa zawierająca Asp372 – ważna dla wiązania Mg2+ATP, jest zakotwiczona w błonie 10 helisami, β (35kD) – zakotwiczona jedną helisą w błonie, ma 3 mostki dwusiarczkowe na pow. kom. (ważne dla aktywności enzymatycznej ATP-azy), δ (10 kD). *Glikozydy nasercowe (leczenie zaburzeń rytmu serca) wiążą się ze wszystkimi podjednostkami.

Aktywny transport jonów Ca2+ - pompa Ca2+

• strukturalnie podobna do pompy Na+/K+, wymaga energii z ATP • b. aktywnie usuwa jony wapnia z cytoplazmy – ich stężenie jest ponad 10 000 razy niższe niż

poza kom. • wzrost stężenia wewnątrzkom. – znaczenie w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i skurczu

mięśniowym • w kom. mięśnia sercowego są pompy wapniowe w sarkolemmie (mają mniejsze znaczenie w

skurczu) oraz w błonach śródplazmatycznych (odpowiadają za magazynowanie wewnątrz ER jonów wapniowych, – co w pewnym stopniu uniezależnia skurcze tej komórki od aktualnego stężenia jonów w jej otoczeniu)

• pobudzenie → otwarcie kanałów Ca2+ w błonach ER (tzw. receptory rianodynowe) → gwałtowny wzrost stężenia jonów Ca2+ w cytoplazmie → skurcz

Aktywny transport jonów H+

• pompy protonowe są strukturalnie odmienne od pomp Na+ i Ca2+

• transportują protony do wnętrza lizosomów i endosomów → aktywacja zawartych tam proenzymów

• inny typ pompy H+ - w wewnętrznej błonie mitochondriów → pracuje odwrotnie → jony przemieszczane są zgodnie z gradientem elektrochemicznym → jest to wykorzystane do syntezy ATP

Endocytoza – pobieranie substancji w formie otoczonych błoną pęcherzyków 1. Fagocytoza

- włączanie do kom. stałych cząstek tj.: bakterie, kom. w apoptozie, fragmenty rozpadłych kom.

- w procesie aktywne są neutrofile i komórki układu makrofagów - otoczenie wypustkami cząstki zaadsorbowanej na powierzchni komórki → powstaje

wakuola zawierająca cząsteczkę → dołączenie lizosomów → powstają fagolizosomy 2. Pinocytoza

- włączanie do kom. substancji znajdujących się w płynie otaczającym komórkę - pęcherzyki pinocytarne powstają podobnie jak fagocytarne, średnica 150 – 250

nm - w miocytach gładkich i kom. śródbłonka obserwuje się transport tranzytowy –

pęcherzyki 65-120 nm

Sposób włączania substancji do komórki może mieć znaczenie dla jej aktywności biologicznej: 3. Endocytoza płynnej fazy

- peroksydaza chrzanowa, natywna ferrytyna - do kom. są włączane subst. po zetknięciu się z przypadkową okolicą błony - pęcherzyki – dołączają się lizosomy, zostają otoczone przez liczne

mikrofilamenty aktynowe uczestniczące w ich transporcie 4. Endocytoza adsorpcyjna

- proces dwuetapowy - etap 1: substancje włączane do kom. są adsorbowane na jej powierzchni, etap 2:

dopiero później endocytowane w pewnych okolicach błony kom. - endocytoza zależna od receptorów – np. insulina i jej receptor komórkowy;

adsorpcja na zasadzie swoistego wiązania liganda - wiele substancji. o charakterze kationów jest adsorbowanych na pow. kom. już

przy 4°C, ale włączanie do wnętrza – optimum 37°C - przy 37°C następuje przemieszczenie się związanych ligandów w płaszczyźnie

błony i ich miejscowe zagęszczenie - w tych okolicach błona od strony cytoplazmy zostaje pokryta klatryną (białko) –

opłaszcza ona dołki błony, o średnicy ok. 150 nm, koszyk utworzony z beleczkowatych pięcio- i sześciokątnych agregatów klatryny

- formowanie się agregatów kompleksów ligand - receptor w dołkach odbywa się dzięki obecnej tam transglutaminazie – katalizuje powstanie mostków izopeptydowych między gr. ε-aminowymi Lys i gr. –COOH kw. glutaminowego i jest hamowana analogami Lys i Glu (bacitracyna i dansykadaweryna) – niektóre z tych analogów są wykorzystywane w leczeniu zakażeń wirusowych – zmniejszają endocytozę cząsteczek wirusa

- zagęszczone w dołkach substancje po ok. 30 min pojawiają się wewnątrz kom. w receptosomach (250-400nm). Odsznurowanie się receptosomu od dołka wymaga ATP i biorą w tym udział mikrofilamenty aktynowe i kalmodulina. Dalszy transport receptosomów – mikrotubule

- przenoszone w ten sposób ligandy i receptory docierają głównie do Aparatu Golgiego (nie łączą się z lizosomami!)

- receptor EGF-R pobrany drogą enodocytozy adsorpcyjnej jest depolimeryzowany w lizosomach wraz z czynnikiem wzrostowym

- receptor insuliny i LDL częściowo powracają na powierzchnię komórki - α2-makroglobulina powraca w całości na pow. komórki - lektyna, konkawalina A wiązana przez reszty D-mannozowe oligosacharydów na

powierzchni powoduję nasiloną endocytozę, wakuole zawierające lektynę pozostają długo w komórce → zablokowanie krążenia błon i wzmożona biosynteza błon w komórce

Oporność wielolekowa (MDR – multidrug resistance) • oporność mało swoista, dotyczy wielu cytostatyków i antybiotyków • przyczyna niepowodzeń w leczeniu chorób nowotworowych i bakteryjnych • wynika ona z obecności w błonie m.in.: P-glikoproteiny i białka MRP (multidrug resistance

protein)

• układ MDR chroni komórkę przed substancjami toksycznymi o charakterze lipofilnych kationów (w stanie zdrowia) i może „bronić” komórkę przed lekami → leki podawane choremu są usuwane z komórek → stany patologiczne są mało podatne na leczenie → niekorzystne!

• P-glikoproteina – integralne białko błonowe, fosfoglikoproteina, 170 kD, działa jak pompa zależna od ATP, transportuje toksyny na zewnątrz komórki; w wielu kom. nowotworowych – nadekspresja tego białka → chemioterapia nowotworów jest utrudniona. Budowa P-glikoproteiny: 6 α-helis przezbłonowych, łańcuch polipeptydowy tworzy 3 pętle na obu powierzchniach błony, w cytoplazmie (blisko C-końca) znajduje się dwa miejsca wiązania ATP (motyw ABC – ATP-binding cassette)

• Białko MRP – 190 kD, 1531 aa, trzy zespoły po 6 α-helis, białko stosunkowo stabilne, połowiczny czas życia: 20h, jednak część jest degradowana szybciej już w ER. Białko MRP znajdujące się w ER i AG – magazyn skąd może być ono przenoszone do błony kom., nie wiadomo czy i jak degradacja jest regulowana. Nadekspresja tego białka pojawia się wcześnie w kom. nowotworowych nawet przy niskim stężeniu leku.

• wiele nowotworów tj.: rak sutka, jajnika, chłoniaki nie-Hodgkina, białaczki u dorosłych początkowo dobrze odpowiadają na chemioterapię (stosowaną w nowotworach z przerzutami celem przedłużenia życia lub paliatywnie) potem jednak stają się oporne

• prowadzone są badania nad lekami wybiórczo kierowanymi do kom. nowotworowych → nie będą prowadzić do MDR, bo po pierwszym okresie leczenia doprowadzą do zniszczenia kom. nowotworowych

• nowotwory tj.: niedrobnokomórkowy rak płuca, rak jelita grubego, żołądka, nerki, trzustki od początku są oporne na leczenie chemiczne

Zjawisko fuzji błon • powszechna np. podczas endocytozy, wydzielania, krążenia składników błon wewnątrz

komórki, podczas łączenia kom. jajowej z plemnikiem czy łączenia mioblastów w czasie biogenezy; także w procesach patologicznych: tworzenie kom. wielojądrzastych w odpowiedzi zapalnej lub podczas wnikania wirusów

• fuzja błon – dwuwarstwa lipidowa błony komórki łączy się z dwuwarstwą innej kom., wirusa, pęcherzyka; zawartość przestrzeni zamkniętych błonami łączy się, białka błonowe się mieszają

• niektóre wirusy mają w błonie białka od których zależy wnikanie wirusa do kom.: wirus grypy – hemaglutynina, wirus Sendai – białko F → białka te zawierają tzw. peptydy fuzji (16-26 aa hydrofobowych) mogą tworzyć α-helisę → jej pow. zewnętrzna – hydrofobowa, a wewnętrzna może wiązać H+ → wirus zatrzymywany na pow. kom. → endocytoza → domeny α-helis wiążą H+ i agregują → fuzja błony endosomu i otoczki wirusa

• białka zawierające peptydy fuzji są wykorzystywane do celowego łączenia komórek np. tworzenie heterokarionów (hybrydy – dwa różne genomy) → otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych

• dużo przeciwciała → wiąże się ono stale z epitopem badanego białka. Limfocyt B zdolny do wytworzenia danego przeciwciała po pobudzeniu → dzieli się → powstaje z niego mały klon komórek wytwarzających identyczne przeciwciało – monoklonalne

• chcąc otrzymać duży klon danego limfocytu B → zmiana limfocytu w kom. nowotworową dzielącą się bez ograniczeń → przez fuzję limfocytu z kom. nowotworową – szpiczakiem → hybrydoma

• np. monoklonalne przeciwciało anty-CD20 stosuje się w leczeniu niektórych chłoniaków B-komórkowych

Rozdział 7

Cytoszkielet

Cytoszkielet: tj. złożony system wewnątrzkomórkowych włókienek białkowych; wewnętrzne rusztowanie komórki, warunkuje jej organizację, umożliwia skurcz, jej ruch, podziały, uczestniczy w wewnątrzkom. transporcie organelli i makromolekuł;

Wyróżniamy 3 klasy elementów cytoszkieletu ze względu na:

-typy i rozmiar włókienek; -organizacja przestrzenna; Są to mikrotubule, mikrofilamenty i filamenty pośrednie;

Mikrotubule: -średnica 25 nm; -mogą występować pojedynczo lub tworzyć złożone układy np. rzęski, wrzeciono kariokinet.; -zbudowane z tubuliny; -stabilne dzięki białkom towarzyszącym mikrotubulinom- MAP; -tubulina jest dimerem, ma 2 globularne podjednostki: tubulinę α i tubulinę β; Dimery łączą się ze sobą w protofilamenty - mają budowę spolaryzowaną: Biegun α (-) Biegun β (+)- rośnie szybciej -13 protofilamentów łączy się (bok do boku) i tworzy układ rureczki- mikrotubuli; (w rzeczywistości nigdy nie powstaje 1 protofilament, ale tworzą się pierścienie zbudowane z 13 cząsteczek tubuliny i wszystkie są jednocześnie wydłużane); -w kom. Stężenie tubuliny jest małe więc powstaje tzw. Centrum nukleacji- to tu zaczyna się polimeryzacja mikrotubul; najważniejszym jest centrosom Centrosom: zawiera zwykle pare centrioli, Na jego powierzchni cząsteczki tubuliny γ łączy się z tubuliną α (biegun plus jest wolny- może więc polimeryzować lub zanikać); -niestabilność mikrotubul jest związana ze zdolnością dimerów tubuliny do wiązania i hydrolizy GTP, dimer tubuliny z GTP przyłącza kolejne dimery i mikrotubula rośnie, w tym czasie dochodzi do hydrolizy GTP do GDP w dimerach WEWNĄTRZ mikrotubuli; -substancje przyczyniające się do depolimeryzacji mikrotubuliny: kolchicyna, kolcemid, winblastyna, winkrystyna; wykorzystywane w leczeniu nowotworów; -białka towarzyszące mikrotubulom: - Najważniejsze to tzw. Białka oczapkowujące- zabezpieczają przed depolimeryzacją,

znajdują się w błonie organelli kom., i niektórych częściach błony kom.; - Występują też białka MAP, które łączą boczne powierzchni mikrotubul i tworzą większe

kompleksy: centriole, aksonemy rzęsek, np. tau (ważne w ch. Alzheimera) - Białka łączące mikrotubule z innymi elementami cytoszkieletu; -białka motoryczne związane z mikrotubulinami:

• Są to kinezyna i dyneina- swoją budową przypominają miozynę; • Każde z nich zbudowane z 2 identycznych podjednostek, zawierającymi odcinki lekkie i

ciężkie; odcinki tworzą 2 główki i 1 wspólny ogonek; • Główki łączą się z podjednostkami tubuliny, mają aktywność ATPazy i mogą

hydrolizować ATP; Hydroliza zachodzi naprzemiennie w każdej główce, co umożliwia przesuwanie się białek motorycznych po tubulinie;

• a ogonki łączą się z innymi strukturami kom. • Kinezyna „kroczy” w kierunku bieguna (+) a dyneina w kierunku (-) • Wraz z białkami przemieszczane są organella dołączone do nich; • Jest to transport dość szybki - kilkadziesiąt cm na dobę;

-mikrotubule decydują o rozmieszczeniu organelli komórkowych we wszystkich komórkach; -mikrotubule budują także struktury komórkowe:

• Centriole: krótkie walce, zbudowane z 9 tripletów mikrotubul; − Zwykle w kom. Występuje para centrioli w okolicy jądra; ustawione

prostopadle; • Aksonema: jest rdzeniem rzęsek i witek, ale zbudowana z 9 dupletów mikrotubul

wyrastających z tripletów ciałek podstawowych; dodatkowo w centrum występują 2 połączone aksonemy (nie mają odpowiednika w ciałku podstawowym); obecna jest tu także specyficzna dyneina zwana rzęskową (odpowiada za ruch) jej ogon łączy się z jednym z dubletów, a główki mają kontakt z dubletem sąsiednim, dublety nie przesuwają się, lecz się uginają, co nadaje charakterystyczny ruch KLINIKA: nieprawidłowości w budowie aksonemy przejawiają się np. brakiem ramion dyneinowych i mikrotubul centralnych, uniemożliwiają poruszanie się rzęsek lub wici i są przyczyna choroby zwanej zespołem nieruchomych rzęsek lub zespołem Katagenera, Objawy: częste zapalenie oskrzeli, a u mężczyzn nieruchliwość plemników;

• Wrzeciono kariokinetyczne: wyróżniamy następujące typy: − mikrotubule kinetochorowe utrzymują początkowo chromosomy w

płytce metafazalnej; − mikrotub. Astralne- łączą centrosomy z białkami kory komórki -

właściwe ustalenie pozycji całego wrzeciona; − m. biegunowe- łączą się ze sobą i stabilizują cały układ;

Filamenty pośrednie: -średnica ok. 10nm; -b. stabilne, wytrzymałe na rozciąganie, b. odporne na działanie zw. chem.; -nadają tkankom wytrzymałość poprzez łączenie się ze sobą filamentów pośrednich sąsiadujących komórek, np. w naskórku, kom. mięśni; -jednostką strukturalną jest białko włókienkowe- najdłuższa, środkowa części ma charakter α-helisy, a na obu końcach znajdują się części globularne,

� białko włókienkowe tworzy dimery przez nawinięcie się odcinków środkowych wokół siebie (superhelisa)

� 2 dimery łączą się ze sobą i tworzą tetramer, częściowo tetramery występują jako niezwiązane w cytoplazmie, a część łączy się ze sobą bok do boku i powstaje filament pośredni; są zawsze tej samej grubości, bo na przekroju poprzecznym występuje zawsze 8 tetramerów;

� Końcówki globularne wystają z filamentu i służą głównie do połączeń z innymi składnikami cytoszkieletu lub błoną kom., końcówki różnią się miedzy sobą;

� Rodzaje filamentów: � Homodimery: f. cytokeratynowe, neurofilamenty, f. wimentynowe; � Heterodimery: są w nich białka: desmina, kwaśne białko glejowe <- łączą się z

wimentyną i zalicza się je do filamentów wimentynopodobnych; � KLINIKA: każdy typ filamentów jest charakterystyczny dla poszczególnych tkanek -

wykorzystuje się to w badaniach immunocytochemicznych; � rola fimalentów pośrednich:

� Wytrzymałość mechaniczna komórek; � Łączenie z białkami połączeń miedzykomórkowych, np. z desmoplakinami � KLINIKA: gdy są uszkodzone filamenty keratynowe, ma miejsce choroba - zwykłe

pęcherzykowe oddzielenie się naskórka - naskórek jest znacznie osłabiony, na powierzchni skóry występują liczne pęcherze na skutek delikatnych obrażeń;

� Neurofilamenty- utrzymują prawidłową konstrukcję niezwykle wydłużonych wypustek kom. nerwowych;

� Filamenty desminowe- uczestniczą w rozkurczu mięśni. � Utrzymanie właściwej lokalizacji organelli komórkowych; � Filamenty laminowe- utrzymują kształt jądra;

Mikrofilamenty: (aktynowe): -odpowiadają za ruch całych komórek lub ich fragmentów, a także organelli komórkowych; -nadają kształt komórce; -umocowują komórki do innych kom. i błon podstawnych; -średnica 7nm; -budowa:

• Mogą być stabilne (dzięki białkom wiążącym aktynę - ABP) lub niestabilne (pojawiają się okresowo, budują pierścienie kurczliwe, włókienka naprężeniowe=stresowe);

• filamenty aktynowe są polimerami składającymi się z globularnej aktyny G, wyróżniamy jej parę izoform:

− Aktyna α- charakerystyczna dla mięśni- obecne także podtypy charakterystyczne dla mm. szkieletowych, m. sercowego i mm. gładkich;

− Aktyna β- obecna w większości komórek; − Aktyna γ- w mm. gładkich trzewi;

• Niezależnie od izoformy aktyna G polimeryzuje i tworzy wydłużone cząsteczki aktyny F, dwie nici aktyny F skręcają się dookoła siebie tworząc filament aktynowy;

• Aktyna G jest spolaryzowana, a jej cząsteczki są ułożone zawsze w tym samym kierunku, to powoduje, że filament też jest spolaryzowany; wyróżniamy biegun + i -

• Polimeryzacja aktyny G może zachodzić jedynie w obecności ATP; • Polimeryzację blokuje alkaloid cytochalazyna, a aktynę F stabilizuje faloidyna; • Połowa aktyny G występuje w połączeniu z białkami wiążącymi monomer - zapobiega to

polimeryzacji lub ją indukuje w zależności od białka; • fimbryna i α- aktywina decydują o organizacji filamentów w sieci lub w pęczki; • w pęczkach filamenty ułożony są równolegle i mają układ przeciwbieżny (biegun (+)

koło (-); między pęczkami obecna miozyna II; • miozyna II przesuwa pęczki między sobą i powoduje ruch lub skurcz kom. • filamenty mogą być łączone w sieci np. przez filaminę; to powoduje, że cytoplazma ma

charakter żelu, w obecności jonów wapnia gelsolina zrywa wiązania krzyżowe filaminy i skraca filamenty aktynowe, co wpływa na zwiększenie płynności tej części cytoplazmy, czyli zmianę żelu w zol. Ma to miejsce np. w kolbce synaptycznej.

-filamenty tworzą struktury mniej stabilne: np. lamelipodia i filopodia; -duże skupiska filamentów aktynowych pod plazmolemmą - tutaj tworzą korę komórki (najlepiej poznana w erytrocytach); -w korze komórki z aktyną łączą się bezpośrednio lub pośrednio następujące białka: białko 4.1 prążka, glikoforyna, ankiryna, białko 3 prążka łączą filamenty aktyny i spektryny; -nieprawidłowa budowa kory komórki prowadzi do niedokrwistości, bo erytrocyty mają nieprawidłową budowę, następuje pękanie krwinek (hemoliza), co jest przyczyną upośledzonego transportu tlenu we krwi:

• wrodzona sferocytoza- erytrocyty są kuliste- wywołane nieprawidłową budową spektryny, nie może się ona wiązać z białkiem 4.1;

• wrodzona eliptocytoza- erytrocyty są elipsoidalne- nieprawidłowa budowa spektryny uniemożliwia tworzenie się dimerów i filamentów spektrynowych;

-w wielu kom. spektryna II oraz ezryna łączą dodatkowo pęczki filamentów aktynowych cytoplazmatycznych tworząc siateczkę graniczną- łączy się ona z połączeniami międzykom. typu zwierającego; -w kom. mięśniowych rolę spektryny przejmuje dystrofina, a w płytkach krwi filamina, -w neurocytach fodryna (izoforma spektryny) łączy się z dodatkowo z neurotubulinami, neurofilamentami, niektórymi organellami oraz pęcherzykami synaptycznymi- to ostatnie połączenie umożliwia egzocytozę neuroprzekaźników; -mikrokosmki-wypustki cytoplazmatyczne, ich obecność zwiększa powierzchnię chłonną kom., jelicie cienkim, kanalikach proksymalnych nefronu są tak liczne, że widać je jako rąbek szczoteczkowy; budowa mikrokosmka:

- stabilizację mikrokosmka zapewnia rdzeń zbudowany z pęczka 203-30 filamentów aktynowych z ABP;

- rdzeń mikrokosmka utworzony jest z równolegle ułożonych filamentów aktynowych, są one przymocowane bocznie do bł. kom. za pomocą miozyny i kalmoduliny, a między sobą za pomocą wiliny i fimbryny, u podstawy zaś za pomocą spektryny II;

- zewnętrzne końce filamentów aktynowych są umocowane do bł. kom. białkami nukleacyjnymi;

- cytoplazmatyczne zakończenia f. aktynowych łączą się z siateczką graniczną zbudowaną także z filamentów aktynowych;

- możliwa jest ograniczona ruchomość mikrokosmków;

białka motoryczne związane z aktyną: tj. miozyna II (mięśniowa) i miozyna I (niemięśniowa) MIOZYNA II:

− zbudowana z 2 głów połączonych wydłużonym ogonem; każda głowa ma 2 łańcuchy lekkie; ogon jest superhelisą i ma 2 łańcuchy ciężkie;

− głowa ma m-ce wiązania ATP i aktyny, hydroliza ATP umożliwia zmianę położenia głów i kroczenie po cząsteczkach aktyny;

− w mm. szkieletowych jest głównym składnikiem miofilamentów grubych; MIOZYNA I:

� składa się z 1 głowy i krótkiego ogona; � głowa ma takie same właściwości we wszystkich swoich izoformach - są takie same jak

w miozynie II; � ogon jest charakterystyczny dla izoformy- łączy się z różnymi obłonionymi strukturami

komórki; � odpowiada za transport organelli wzdłuż filamentów aktynowych;

Aparat kurczliwy mięśni: mm. poprzecznie prążkowane: ich aparat kurczliwy stanowią miofibryle, które tworzą pęczki biegnące równolegle do osi długiej włókna, wypełniając prawie całą komórkę. Jednostką strukturalną miofibryli jest sarkomer:

• jest to odcinek między 2 liniami Z(linia ta przebiega w połowie prążka I) w jego skład wchodzi: linia Z, połowa prążka I, prążek A, połowa prążka I, linia Z;

• w prążku A w mikroskopie elektronowym widać przejaśnienie zwane prążkiem H, a w nim linię M;

wyróżnia się 2 rodzaje miofilamentów (czyli włókienek budujących miofibryle): MIOFILAMENT CIENKI: =aktynowy

� zbudowany z 3 białek: aktyny, tropomiozyny, troponiny; � występują w prążku I i A � zakotwiczone w liniach Z, dzięki α aktyninie i winkulinie � 2 spiralne skręcone aktyny F tworzą rdzeń miofilamentu cienkiego, � Na rdzeń nawinięte są fibryle tropomiozyny;

� W pewnych odstępach jest przeczepiona globularna troponina, zbudowana z 3 podjednostek: I, T oraz C - ta łączy się z jonami wapnia i powoduje, że wcześniej wymienione podjednostki zmieniają położenie tropomiozyny na aktynie, to prowadzi do odsłonięcia na aktynie miejsc wiążących miozynę;

MIOFILAMENT GRUBY:= miozynowy • Zbudowany z białka fibrylarnego miozyny i białka C (spaja cząsteczki miozyny); • Jego rdzeń składa się ze skręconych łańcuchów ciężkich miozyny, a głowy wystają na

zewnątrz rdzenia; • Każda głowa ma miejsce wiązania aktyny i ATP, głowy znajdują się jedynie na końcach

miofilamentu grubego; • Występują tylko w prążku A • Połączone z liniami Z za pomocą titiny;

w mm. występują też filamenty pośrednie desminowe- pełnią ważną funkcję w utrzymaniu spoistości miofibryli i ułożeniu ich względem siebie, za co odpowiedzialne są synemina i skelemina;

� Filamenty desminy oplatają całą miofibrylę, a dodatkowo na wysokości linii Z tworzą gęstą sieć, która utrzymuje miofibryle na równej wysokości;

� F. p. deminowe przyczepiają się także do bł. kom. za pomocą ankyryny i paraneminy; dlatego uważa się, że linie Z i sieć desminowa odpowiadają za automatyczny rozkurcz miofibryli;

każda miofibryla przebiega przez całą długość komórki i zakończona jest na obu końcach liniami Z, które łączą się z integrynami sarkolemmy, a te z włóknami kolagenowymi ścięgien; KLINIKA: w korze włókna mięśniowego występuje także dystrofina (podobna do α aktywniny i spektryny), jej brak uniemożliwia przyczepienie się włókienek desminowych do sarkolemmy białka i wywołuje dystrofię mięśniową Duchenne’a. polega na degeneracji i martwicy włókien mm. szkieletowych i zastępowaniu ich przez tk. tłuszczową lub łączną włóknistą. Ok. 20 r.ż. następuje całkowita degeneracja mm. oddechowych i śmierć. -do synchronizacji skurczu mięśnia konieczna jest triada mięśniowa, tworzą ją:

� Kanalik T: rurkowate wpuklenie sarkolemmy, przebiega poprzecznie w stosunku do miofilamentów na granicy każdego prążka A i I; dociera do każdego sarkomeru,

� Cysterny brzeżne: są wyspecjalizowaną częścią siateczki sarkoplazmatycznej gładkiej otaczającej każdą miofibrylę; mają zdolność gromadzenia jonów wapnia, gdyż w ich błonie znajdują się kanały wapniowe otwierane depolaryzacją błon kanalików T;

mechanizm skurczu mięśnia szkieletowego:

� Bodziec nerwowy w postaci uwolnionej w płytce motorycznej acetylocholiny powoduje depolaryzację sarkolemmy;

� Depolaryzacja rozchodzi się po całej sarkolemmie i dociera też do kanalików T; � Następuje otwarcie kanałów wapniowych cystern brzeżnych, to doprowadza do 1000-

krotnego wzrostu stężenia wapnia w obrębie cytoplazmy; � Łączenie jonów wapnia z troponiną powoduje przemieszczenie tropomiozyny i dochodzi

do odsłonięcia miejsc wiążących miozynę na aktynie; � Obie głowy miozyny rozkładają ATP, dzięki czemu wykonują naprzemiennie ruchy i

głowy miozyny kroczą po aktynie; � Miofilamenty cienkie wsuwają się miedzy grube, co powoduje skracanie się sarkomerów

o ok. 30%, � Skraca się lub zanika prążek I oraz prążek H; � w/w zjawiska zachodzą synchronicznie dzięki triadzie; � po depolaryzacji następuje samoczynna repolaryzacja, w tym także repolaryzacja

kanalików T; � kanały wapniowe zostają zamknięte, a pompa wapniowa wypompowuje jony wapnia z

sarkoplazmy do wnętrza cystern; � stężenie jonów wapnia spada w sarkolemmie, troponina oddaje jony wapnia,

tropomiozyna wraca na swoje miejsce, miozyna traci swój kontakt z aktyną; � następuje rozkurcz sarkomerów i całego włókna;

skurcz komórek m. sercowego:

� przebiega podobnie j/w, bo organizacja sarkomeru jest podobna; � komórki w m. sercowym łączą się za pomocą wstawek w długie szeregi komórek,

tworząc włókna; � wstawkę budują: desmosomy łączące filamenty desminowe komórek, strefy zwierające

łączące filamenty aktynowe komórek oraz połączenia typu nexus (umożliwia szybkie przechodzenie potencjału czynnościowego, co zapewnia synchronizację skurczu komórek we włóknie);

-KLINIKA:

� w kom. m. sercowego niskie stężenie Ca++ jest głównie utrzymywane przez białko błonowe wymiennika Na+/Ca++ na zasadzie antyportu. Glikozydy nasercowe hamują pompę Na+/K+ co zwiększa stężenie Na+ w kom. i zmniejsza gradient Na+.

mięśniówka gładka: � niewielkie, wrzecionowate komórki, bez miofibryli, miofilamenty tworzą krzyżującą się

sieć pęczków. � Pęczki tworzą: � głównie miofilamenty cienkie zbudowane z aktyny, tropomiozyny, a rolę troponiny

pełni kalmodulina-rozproszona w cytoplazmie; � Miofilamenty grube (mniejsza liczba)- zbudowane z miozyny II, krótsze, nieregularne

rozmieszczone między filamentami aktyny � Ważną rolę w skurczu m. gładkich odgrywa kaldesmon - wiąże się z aktyną,

uniemożliwiając przyłączenie się miozyny; � Jej komórki nie posiadają triad, lecz wyspecjalizowany system błon siateczki

sarkoplazmatycznej- kontroluje wewnątrzkomórkowy poziom wapnia; � Ogólna zasada skurczu taka sama jak w m. szkieletowym: przesuwanie głów miozyny na

aktynie; � Aby zapoczątkować skurcz muszą być spełnione 2 warunki: � 1. fosforylacja głów miozyny przez kinazę miozynową (zmiana konformacji głów

miozyny - możliwa jej interakcja z aktyną) � 2. jednocześnie musi być usunięty kaldesmon; � Do obu tych zdarzeń dochodzi w wyniku wzrostu wewnątrzkomórkowego cAMP oraz

jonów wapnia, aktywujących kalmodulinę; � Uwolnienie jonów Ca++ oraz aktywacja cyklazy adenylowej następuje pod wpływem

neuroprzekaźników z zakończeń nerwowych układu sympatycznego i parasymapytcznego lub pod wpływem hormonów;

� Skurcz mm. gładkich wywołują: adrenalina, noradrenalina, angiotensyna, serotonina, oksytocyna;

� Rozkurcz mm. gładkich powodują: NO-> zwiększa stężenie cGMP, co prowadzi do spadku stężenia jonów wapnia;

� Cechą charakterystyczną kom. mm. gładkich są ciałka gęste, występują w cytoplazmie, oraz płytki mocujące, podobne do ciałek gęstych - obie struktury przyłączone do sarkolemmy, są jak linie Z w mm. szkieletowych, zbudowane z α-aktywiny i są miejscami przyczepiania się filamentów atynowych i pośrednich; Ponieważ filamenty aktynowe są przymocowane przeciwbieżnie do błony komórkowej oraz do ciałek gęstych, przesuwanie się miozyny po aktynie przybliża te struktury do siebie, wywołując skracanie się komórki;

Rozdział 8

Wybrane procesy cytoplazmatyczne

� Przedziały komórkowe

Komórka podzielona jest błonami na przedziały (kompartmenty). Należą do nich organella błoniaste, ale też pęcherzyki lub cysterny. Organella błoniaste można podzielić na te, które uczestniczą w szlaku wydzielniczym intensywnie (siateczka śródplazmatyczna gładka i szorstka, aparat golgiego wraz z sieciami cis i trans, endosomy, lizosomy) i te które uczestniczą w nim w mniejszym stopniu (mitochondria, peroksysomy). Tłumaczy się to ewolucyjnym pochodzeniem organelli.

Szlak wydzielniczy: jądro otoczone jest siateczką śródplazmatyczną szorstką (produkcja białek błon, białek luminalnych, białek na eksport) i gładką (synteza lipidów). Błony i ich zawartość przechodzą od siateczki śródplazmatycznej szorstkiej do aparatu golgiego przez obszar zwany siecią cis aparatu golgiego. Po odpowiedniej obróbce błony i białka wydostają się z niego przez sieć trans aparatu golgiego. Część z nich tworzy ziarna wydzielnicze (egzocytoza regulowana), pęcherzyki wydzielnicze (egzocytoza konstytutywna), pęcherzyki łączące się z endosomami lub lizosomami. Pamiętać należy tu o możliwości transportu wstecznego.

Cząsteczki rozpuszczalne w tłuszczach, drobnocząsteczkowe związki rozpuszczalne w wodzie są transportowane między przedziałami bez ograniczeń. Transport białek i kwasów nukleinowych podlega ograniczeniom. Pozwala to na zgromadzenie unikatowego zestawu makrocząsteczek w danym przedziale.

� adresowanie białek w komórce (hipoteza sygnałowa)

Ograniczenia w transporcie białek i kwasów nukleinowych narzuciły konieczność wykształcenia różnych sposobów transportu przez błony.

W jądrze w czasie mitozy jego zawartość miesza się z cytoplazmą, w czasie interfazy substancje drobnocząsteczkowe i niewielkie białka przechodzą swobodnie przez pory jądrowe, transport większych białek i kwasów rybonukleinowych jest regulowany przez kompleks poru jądrowego.

Transport makromolekuł z cytoplazmy do światła siateczki śródplazmatycznej, mitochondriów i peroksysomów odbywa się z pomocą transbłonowych białek transportowych. Pozostałe przedziały komórkowe szlaku wydzielniczego nabywają białka z siateczki śródplazmatycznej szorstkiej przez transport pęcherzykowy.

Powstałe białka muszą zostać przeniesione w odpowiednie miejsce. O adresowaniu i sortowaniu mówi hipoteza sygnałowa. Za adresowanie białek do poszczególnych przedziałów odpowiadają łańcuchy aminokwasów będące sekwencją sygnałową lub też motywami struktury drugo-, trzecio-, czwartorzędowej. Po osiągnięciu miejsca docelowego sekwencja sygnałowa odcinana jest w wyniku ograniczonej hydrolizy (zależnej od hydrolaz z grupy peptydaz sygnałowych).

Synteza wszystkich białek rozpoczyna się w cytoplazmie. Białka dla organelli szlaku wydzielniczego zawierają peptyd sygnałowy, który warunkuje kotranslacyjne przemieszczenie białka do światła lub w obręb siateczki śródplazmatycznej szorstkiej. Synteza innych białek zachodzi do końca w cytoplazmie, jeżeli mają sekwencje sygnałową są eksportowane do odpowiednich przedziałów (transport potranslacyjny).

� translokacja białek do siateczki śródplazmatycznej

Jeżeli wyłaniający się z cytoplazmatycznego rybosomu N-koniec łańcucha polipeptydowego ma sekwencje sygnałową dla siateczki śródplazmatycznej (zazwyczaj 7-20 aminokwasów hydrofobowych) to łączy się z cząstką rozpoznającą sygnał – SRP. SRP blokuje wydłużanie łańcucha polipeptydowego do czasu zakotwiczenia rybosomy na błonie siateczki śródplazmatycznej przez receptor SRP. Jedna z dwóch jego podjednostek ma aktywność GTP-azy. Rozpad GTP pozwala przekazać rybosom z polipeptydem do translokonu (kompleks białek kanałowych którym polipeptyd dostaje się do siateczki śródplazmatycznej, utworzony jest on przede wszystkim z białka Sec61α ale też Sec61β i Sec61γ). SRP uwalniana jest do cytoplazmy, a receptor może przyjmować kolejne kompleksy. Translokon łaczy się szczelnie z rybosomem, peptyd sygnałowy oddziałuje z hydrofobową częścią translokonu co powoduje jego otwarcie. Sekwencja sygnałowa jest umocowana w części hydrofobowej translokonu, w związku z tym wydłużający się polipeptyd wpukla się do światła siateczki śródplazmatycznej na kształt pętli. Pozwala na to energia z procesu wydłużania łańcucha polipeptydowego na rybosomie. Do pętli od strony światła siateczki przyłącza się białko opiekuńcze z rodziny hsp70, zwane BiP. Po zakończeniu syntezy polipeptyd jest przeciągany do światła siateczki przez BiP, energia pochodzi z hydrolizy ATP. Peptydaza sygnałowa odcina peptyd sygnałowy. Opisany mechanizm dotyczy białek luminalnych. Wbudowanie białka w błonę jest bardziej skomplikowane.

W czasie tego procesu zachodzi wielokrotne zamykanie i otwieranie translokonu, co umożliwia przenikanie kolejnych hydrofobowych części łańcucha polipeptydowego do błony siateczki. Podczas syntezy cytoplazmatycznej części polipeptydu rybosom odłącza się od translokonu powodując jego zamknięcie. Ponowne otwarcie zachodzi przy połączeniu rybosomy z translokonem i zachodzi synteza części luminalnej łańcucha polipeptydowego.

Szorstka siateczka śródplazmatyczna ma system kontroli białek umożliwiający jej ich zwrotny transport przez translokon do cytoplazmy.

Mutacja genu CFTR jest przyczyną mukiowiscydozy. Mutacja to delecja trzech nukleotydów kodujących fenyloalaninę w pozycji 508 łańcucha polipeptydowego. Białko CFTR jest związane z kanałem dla jonów Cl-. Normalne jest wbudowywane w błonę siateczki i transportowane na powierzchnię komórki. W mukowiscydozie białko jest w pełni sprawne, jednak nie dociera do powierzchni komórki. W siateczce śródplazmatycznej jest rozpoznawane jako nieprawidłowe i zwrotnie transportowane do cytoplazmy. Powoduje to zaburzenie wydzielania elektrolitów i wody w nabłonkach. Dochodzi do zalegania gęstej, śluzowatej wydzieliny i zmian z tym związanych, przede wszystkim w płucach i trzustce. Rozwój serca płucnego i częste zakażenia. Śmierć przed 30 rokiem życia.

� Kierowany transport białek w komórce

• Sortowanie białek organelli błoniastych

Istnienie wyspecjalizowanych przedziałów na drodze szlaku wydzielniczego jest możliwe dzięki białkom rezydującym (osadniczym). Posiadają one swoiste sekwencje sygnałowe, umieszczające je w określonym miejscu, a w przypadku ich przejścia następuje transport wsteczny.

Podobne sekwencje pozwalają na sortowanie białek w sieci trans aparatu golgiego. Gdzie część z nich tworzy pęcherzyki wydzielnicze (egzocytoza konstytutywna), ziarna wydzielnicze (egzocytoza regulowana – wydzielanie pod wpływem bodźców), pęcherzyki łączące się z endosomami lub lizosomami.

Endosomy są przedziałem błonowym. Endosomy wczesne (leżące bliżej błony komórkowej, będące pierwsze na szlaku endocytozy, mające niskie pH sprzyjające dysocjacji endocytowanych białek od ich receptorów) przekazują białka do endosomów późnych, a następnie do lizosomów. Pęcherzyki pośredniczące w tym transporcie nazywają się ciałami wielopęcherzykowymi. Do endosomów wczesnych i późnych trafiają pęcherzyki transportowe z sieci trans aparatu golgiego zawierające nieaktywne enzymy lizosomalne. Enzymy gromadzą się w endosomach poźnych.

Transport błon i ich zawartości między przedziałami szlaku wydzielniczego odbywa się za pomocą pęcherzyków transportowych. Istnieje wiele rodzajów pęcherzyków, co zapewnia swoistość i wybiórczość transportu.

Transport z szorstkiej siateczki śródplazmatycznej do aparatu golgiego odbywa się w obrębie elementów przejściowych. Transport rozpoczyna się przez wytworzenie pęcherzyków w przejściowej części siateczki szorstkiej (pozbawiona rybosomów, przypomina siateczkę gładką). Pęcherzyki z białkami (w tym z białkami osadniczymi siateczki, które posiadają sekwencję KDEL umożliwiającą transport wsteczny) dostają się do sieci cis, a stamtąd pęcherzykami transportowymi do aparatu golgiego.

Transport w poprzek aparatu golgiego odbywa się przez liczne pęcherzyki. Transportowi wydzielniczemu towarzyszy transport wsteczny. W obrębie aparatu golgiego zachodzą procesy biochemiczne, główny to modyfikacja białek np. glikozylacja.

W sieci cis niektóre białka uzyskują mannozo-6-fosforan (M6P). Są one rozpoznawane i silnie wiązane w sieci trans przez receptory dla M6P (białka transbłonowe) przy pH 7,0. Kompleksy grupują się w obrębie pęcherzyków transportowych, a te łączą się z endosomami późnymi. W kwaśnym środowisku białka z M6P oddysocjowują, a receptory są recyrkulowane. Tak przenosi się enzymy lizosomalne.

Choroba komórek z ciałkami inkluzyjnymi, przyczyną jest brak enzymu fosforylującego mannozę. Enzymy nie trafiają do lizosomów, a do cytoplazmy. Pojawiają się lizosomy z niestrawionymi substratami = ciałka inkluzyjne. Objawy to deformacja trzewioczaszki i opóźnienia rozwoju psychofizycznego.

Do lizosomów trafiają i inne substraty, gdzie ulegają hydrolizie. Substraty z otoczenia komórki trafiają do lizosomów przez endocytozę. Która może przebiegać drogą pinocytozy, lub przez związanie z receptorami błonowymi. W ostatnim procesie wyróżniamy endocytozę zależną od receptorów (oddziaływanie cytoplazmatycznej części receptorów z białkami np. klatryną) i fagocytozę (udział aktyny).

• Transport pęcherzykowy

Pęcherzyki transportowe w chwili powstania otoczone są płaszczem białkowym, który pozwala na inwaginację. Poznano płaszcz klatrynowy (endocytoza zależna od receptorów, wydzielanie regulowane), płaszcz koatomerowy COP I (transport wsteczny, transport w aparacie golgiego), płaszcz koatomerowy COP II (transport wsteczny).

Pęcherzyk transportowy przechodzi: pączkowanie (wywołane białkami płaszcza, który znajduje się w miejscu zgromadzenia receptorów wiążących kargo (ładunek)), transport (często oddziaływanie z mikrotubulami), cumowanie (białko Rab związane z pęcherzykiem wiąże się z błoną docelową przez białka rabfilinę, radaptynę na jej powierzchni) dokowanie (v-SNARE na pęcherzyku, t-SNARE na błonie docelowej) fuzję z przedziałem docelowym.

• Sortowanie białek w komórkach spolaryzowanych

Adresowanie białek rozpoczyna się przy ich rozdziale do odpowiednich subpopulacji pęcherzyków (na powierzchnię podstawno-boczną jeżeli motyw dwuleucynowy lub tyrozynowy, na powierzchnię szczytową jeżeli obecność grupy glikozylofosfatydyloinozytolu GPI) a kończy na adresowaniu pęcherzyków (v-SNARE na pęcherzykach, t-SNARE na błonach docelowych).

• Import białek do peroksysomów

Wszystkie białka muszą być przetransportowane z cytoplazmy do peroksysomów. Białka posiadają sekwencje sygnałowa PTS: PTS1, PTS2. Dla tych sekwencji istnieją receptory, odpowiednio peroksyna 5 i 7. W wyniku ścisłej asocjacji z białkiem posiadającym PTS możliwe jest przeniesienie białka bez PTS.

Mutacje peroksyn powodują: zespół Zellwegera, dziecięcy zespół Refsuma, noworodkową adrenoleukodystrofię, chondrodysplazję bliższej części kończyn. Wszystkie kończą się kalectwem i śmiercią. Hiperoksaluria typu I to błędne adresowanie aminotransferazy alaninowo-glioksalowej (AGT) do mitochondriów zamiast do peroksysomów. Początkowe objawy to kamienie nerkowe i zwapnienie miąższu nerek, końcowe to ich niewydolność.

• Import białek do mitochondriów

Błony (zew. i wew.) mitochondrium są nieprzepuszczalne dla białek. Białka mitochondrialne są syntezowane na polirybosomach i zawierają sekwencje sygnałową MTS (N-końcowy odcinek posiadający regularnie co 4 reszty Lis lub Arg, porozdzielane aminokwasami niepolarnymi; ten odcinek przybiera formę α-helisy, tak że po jednej stronie są aminokwasy polarne po drugiej niepolarne).

Po syntezie część białek mitochondrialnych wiąże się z hsp 70 (białko opiekuńcze, przeciwdziała zwijaniu białka), a część dodatkowo z białkiem wiążącym MTS tzw. czynnikiem stymulującym import do mitochondriów (MSF). Transport przez zewnętrzną błonę zapewnia kompleks białka kanałowego TOM. Po związaniu białka zbliża się on do podobnego kompleksu w błonie wewnętrznej, kompleksu TIM. Kanał pomiędzy cytoplazmą a macierzą mitochondrialną utworzony jest głównie (choć niecałkowicie) przez kompleks TIM. Od strony macierzy związane są z nim mitochondrialne białka opiekuńcze i peptydaza sygnałowa. Początkowy odcinek importowanego białka dostaje się do macierzy przez wewnętrzną błonę wskutek energii przejścia naładowanej dodatnio MTS zgodnie z gradientem elektrochemicznym. Następnie pozostała część łańcucha polipeptydowego jest przeciągana w poprzek kanału TOM/TIM dzięki energii z hydrolizy ATP dokonywanej przez mitochondrialne białka opiekuńcze. Peptydaza sygnałowa odcina MTS. Jeżeli po MTS znajduje się kolejna sekwencja, zwana sekwencją sortującą, to białko idzie do wewnętrznej błony mitochondrialnej lub do przestrzeni międzybłonowej. Jeżeli nie ma tej sekwencji, białko zostaje w macierzy.

Część białek (np. cytochrom b5 i jego reduktaza NADH) związana z metabolizmem lipidów może dostawać się do mitochondriów wraz z lipidami z siateczki śródplazmatycznej gładkiej. Odbywa się to z udziałem błon MAM (związane z mitochondriami błony podobne do siateczki śródplazmatycznej.

� Transport jądrowo-cytoplazmatyczny

Pomiędzy jądrem a cytoplazmą zachodzi dwukierunkowy transport przez pory jądrowe. Przepływ wody, metabolitów i białek o masie cząsteczkowej do 66 kDa jest swobodny. Białka powyżej 66 kDa nie są przepuszczane, jeśli nie posiadają sekwencji sygnałowej. Sekwencją warunkującą import do jądra jest NLS (grupa kilku aminokwasów zasadowych położonych w dowolnym miejscu białka). NLS nie są odcinane, w związku z mitozą i rozpadem otoczki jądrowej białka muszą wrócić do jądra. Istnieją też inne sekwencje transportu do jądra, są one specyficzne dla odpowiednich struktur w jądrze. Przykładem jest jąderkowa sekwencja sygnałowa (NOS). Sekwencja warunkująca eksport białka z jądra jest NES.

Transport białek polega na wiązaniu z odpowiednim receptorem i translokacji przez por jądrowy. Import polega na wiązaniu białka-NLS przez receptory z rodziny β-importyn, eksport na wiązaniu białka-NES przez receptor z rodziny eksportyny I.

W transporcie uczestniczą białka adaptorowe. Istotnym białkiem jest białko RAN o aktywności GTP-azy. W cytoplazmie RAN hydrolizuje GTP do GDP po przyłączeniu do siebie białka RAN-GAPI. W macierzy jądrowej w białku RAN, GDP zamienione jest na GTP po przyłączeniu białka RAN-GEPI. W jądrze eksportyna I wiąże białko-NES i białko RAN-GTP. Kompleks jest translokowany do cytoplazmy, gdzie następuje hydroliza GTP i uwolnienie białka-NES. Białka-NES służą jako adaptery dla mRNA. (białko-NES o którym cały czas myśleliśmy jak o głównej cząsteczce transportowanej staje się białkiem adaptorowym ;)

Importyna β wiąże białko-NLS, jedynie w obecności adaptora importyny α. Ten trójskładnikowy kompleks jest przenoszony do jądra. Tam z importyną β wiąże się białko RAN-GTP, powoduje to uwolnienie białka-NLS i importyny α. Importyna α łączy się ze swoistą eksportyną i powraca do cytoplazmy.

Wirus HIV dostaje się do cytoplazmy, tam jego RNA ulega odwrotnej transkrypcji i powstaje DNA (prowirus). Prowirus musi się dostać do jądra, dlatego ma adaptorowe białko Vpr. Z jednej strony Vpr łączy się z importyną α, z drugiej z prowirusem. Prowirus włącza się do DNA komórki, jest transkrybowany. Powstałe RNA wydostaje się z komórki przez por jądrowy z udziałem adaptorowego białka Rev. Rev łączy RNA wirusa z kompleksem eksportyny I i RAN z GTP.

� Formowanie struktury przestrzennej białka oraz ich degradacja

� Białka opiekuńcze

Białka opiekuńcze (chaperony) są ATP-azami. Obecne w jądrze, cytoplazmie jak i w świetle organelli błoniastych. Należą do dwóch głównych rodzin: hsp60 (polimer w kształcie pustego w środku cylindra) i hsp70 (monomer). Nazwa hsp oznacza białko szoku cieplnego.

Mają powinowactwo do hydrofobowych części łańcucha polipeptydowego, zapewniają tym prawidłowe przestrzenne ułożenie łańcucha polipeptydowego białek. Wiążą się z białkami narażonymi na działanie niekorzystnych czynników i przeciwdziałają denaturacji. Białka opiekuńcze wiążą się ze zdenaturowanym białkiem i starają się przywrócić jego prawidłową strukturę. Nie zawsze się to udaje. Zdenaturowane białka tworzą agregaty, tzw. ciałka inkluzyjne. Do innych funkcji należy utrzymywanie niesfałdowanego łańcucha polipeptydowego, aby mógł on zostać przeniesiony przez kanały błonowe.

Priony występują w OUN ssaków w dwóch konformacjach prawidłowej i scrapie. Forma scrapie wywołuje postępującą gąbczastą degenerację mózgu = choroba Creutzyfeldta-Jakoba.

� Ubikwitynacja białek Ubikwityna jak i białko SUMO-I są etykietami adresowymi. Ubikwityna dołączana w procesie ubikwitynacji przeznacza białko do degradacji, lub w mniejszym stopniu może służyć innym celom np. ubikwitynacja cytoplazmatycznej strony receptorów prowadzi do ich endocytozy. Białko SUMO-I chroni przed degradacją.

Ubikwitynacja zachodzi aktywnie (hydroliza ATP) i stopniowo z użyciem wielu enzymów: enzym aktywujący ubikwitynę (E1), enzym koniugujący ubikwitynę (E2), ligaza ubikwityny (E3). E3 łączy ubikwitynę do substratu, tym samym zapewnia wybiórczość i swoistość układowi proteolizy.

� Proteasomy Są to organella występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych, odpowiedzialne za degradację białek komórkowych. Białka degradowane przez proteasomy muszą być wcześniej ubikwitynowane.

W jądrze komórkowym skupiają się przy centrioli, tworząc centrum proteolityczne komórki. W prawidłowych komórkach nie są widoczne, w warunkach patogennych są w agregatach ze zdenaturowanymi białkami i ubikwityną jako agresom.

Proteasomy nie występują w obrębie światła organelli błoniastych. Zbudowane z czterech pierścieni ułożonych jeden na drugim w kształcie cylindra. Każdy pierścień zbudowany jest z siedmiu odmiennych białek tzw. podjednostek proteasomów.

Mają wiele różnych aktywności proteolitycznych, co poza budową i masą odróżnia je od klasycznych enzymów proteolitycznych. Białko rozkładają na peptydy, nie na aminokwasy.

W komórkach prezentujących antygen pod wpływem interferonu γ dochodzi do wymiany podjednostek proteasomu. Proteasom zmodyfikowany pod wpływem interferonu γ nazywa się immunoproteasomem. Prowadzi to do zmiany profilu peptydów wytwarzanych przez proteasom. Peptydy te są odpowiednio obrabiane i umieszczane na powierzchni komórki jako antygen.

Proteasomy 20 S występują w połączeniu z dodatkowymi białkami, tworzącymi tzw. aktywatory proteasomów. Da aktywatorów należy kompleks białek PA700, który wraz z proteasomem 20 S tworzy proteasom 26 S. Aktywatory umożliwiają rozpoznanie substratów związanych z ubikwityną, oddzielenie i uwolnienie ubikwityny, rozwinięcie łańcucha polipeptydowego substratu, otwarcie zamkniętego wejścia do kanału środkowego proteasomu 20 S i translokację polipeptydu do kanału.

Rozdział 9

Morfologia i funkcja mitochondriów � LICZBA I ROZMIESZCZENIE MITOCHONDRIÓW W KOMÓRCE

Mitochondria odgrywają dużą rolę w energetyce komórki i mogą zajmować od 12-25% jej objętości. Zazwyczaj mają kształt elipsoidalny, okrągły, niekiedy rozgałęziony. Są widoczne w mikroskopie świetlnym ze względu na swój stosunkowo duży rozmiar (średnica 0,5-1 um i długość 1-7um, w mięśniach szkieletowych 10um).

Liczba, wielkość, kształt, rozmieszczenie i ultrastruktura zależą od aktywności metabolicznej, rodzaju i funkcji komórki:

Plemnik - do kilkudziesięciu mitochondriów (niewielka ilość), oocyt - 200 000; komórka somatyczna – kilka tysięcy; komórka nabłonkowa kanalików krętych nerek, kom. endokrynowa kory nadnerczy – 1000; limfocyt, kom. naskórka, kom. nowotworowa, starzejąca się komórka - bardzo mała ilość mitochondriów

Lokalizacja: Organelle mogą zajmować cały obszar komórki, najczęściej występują w części okołojądrowej. Włókna mięśni szkieletowych, miocyty serca - między miofibrylami w regularnych szeregach. Komórki nabłonkowe zaangażowane w aktywny transport (kom. kanalików proksymalnych nerek, odcinków prążkowanych gruczołów ślinowych) – pionowe szeregi w pofałdowanej części przypodstawnej.

� OGÓLNA BUDOWA - Mitochondria otoczone są dwiema błonami różniącymi się pod względem morfologicznym, molekularnym i funkcjonalnym. Zewnętrzna - gładka o grubości 6-7nm, wewnętrzna – nieprzepuszczalna, silnie pofałdowana (tworzy fałdy mitochondrialne) o grubości 5-6nm. W błonie wewnętrznej znajdują się enzymy kompleksów łańcucha oddechowego oraz syntaza ATP. Wyróżnia się przestrzeń międzybłonową (przedział zewnętrzny) oraz matriks mitochondrialną (przedział wewnętrzny). Macierz mitochondrialna jest najbogatsza pod względem enzymatycznym.

● Błona zewnętrzna utrzymuje – półprzepuszczalność i asymetryczność, 6% białek mitochondrialnych

➔ fosfolipidy - utrzymują wysoką przepuszczalność,

➔ cholesterol nadaje sztywność błony,

➔ poryny - umożliwiają transport wody i cząsteczek do 5000 Da,

➔ enzymy syntetyzujące lipidy (eksport),

➔ enzymy hydrolizujące lipidy (import);

● Przestrzeń międzybłonowa – środowisko zbliżone składem do cytoplazmy, 6% białek mitochondrialnych

➔ fosforylacja nukleotydów z wykorzystaniem ATP

● Błona wewnętrzna dwuwarstwa – lipidowa szczelna, 21% białek mitochondrialnych

➔ kardiolipina (główny lipid) zwiększa szczelność błony,

➔ przepuszczalność tylko dla H2O, CO2, O2, NH3,

➔ białka integralne (30%) - spajają lipidy błon, porządkują układy

enzymatyczne, wiążą włókna kurczliwe, transportują substancje do macierzy,

➔ białka łańcucha oddechowego (70%) - odpowiadają za przenoszenie

elektronów i protonów ● Macierz – 61% białek mitochondrialnych, DNA, tRNA, rybosomy, enzymy cyklu Krebsa i mocznikowego, enzymy utleniające kwasy tłuszczowe, białka obsługi DNA i mRNA, NADH, ADP i inne

Dokładne nazwy enzymów wchodzących w skład błon i przestrzeni mitochondrialnych znajdują się w tabelce (str. 225), w książce z cytofizjologii, którą każdy ma.

� FUNKCJE KOMÓRKI A MORFOLOGIA MITOCHONDRIÓW

Komórki zaangażowane w syntezę hormonów steroidowych - Mitochondria duże, cewkowate/tubularne o grzebieniach w kształcie cewek. Zachodzą w nich niektóre etapy syntezy powyższych hormonów (komórki kory nadnerczy, Leydiga, pęcherzyk jajnikowy, ciałko żółte).

Tkanka tłuszczowa, brunatna - Duża liczba organelli o gęsto upakowanych grzebieniach. Wiele cytochromów, nieznaczna ilość syntazy ATP. Energia uwalniana podczas transportu elektronów zamieniana jest na ciepło, dzięki specyficznemu białku - TERMOGLOBINIE.

Plemnik - Dużo, specyficznych, wydłużonych i zakrzywionych mitochondriów. Tworzą pojedynczą, podwójną, potrójną lub bardziej złożoną spiralę, w zależności od gatunku. Łącząc się ze sobą swoimi powierzchniami bocznymi tworząc osłonkę. Funkcjonują jako jedno organellum we wstawce plemnika, dostarczają energii do ruchu.

� USZKODZENIA MITOCHONDRIÓW

Obrzmienie (pęcznienie, wakuolizacja) - Następuje na skutek gromadzenia wody wewnątrz co prowadzi do zaniku macierzy i przerwania błon. Przyczynami pęcznienia są: działanie czynników toksycznych, zakażenia wirusami, niedotlenienie.

Tworzenie różnorodnych struktur mielinopodobnych - Prowadzi do zaniku grzebieni oraz matriks w wyniku starzenia lub działania toksyn.

Hipertrofia - Zwiększenie liczby i rozmiarów mitochondriów (megamitochondria). W stanach patologicznych występują ziarnistości osmofilne (miopatie włókien mięśni szkieletowych, martwica wątroby u alkoholików, deficyty pokarmowe, choroba degeneracyjna c.u.n., kardiomiopatie). W warunkach fizjologicznych występuje podczas przerostu endometrium macicy w czasie ciąży.

Mitochondria piknotyczne – Małe, o dużej gęstości elektronowej macierzy, występują w uszkodzonych komórkach/okres nekrozy.

� MITOCHONDRIA JAKO ORGANELLE WYTWARZAJĄCE ATP

Mitochondria korzystają z energii wiązań chemicznych uzyskiwanych z pożywienia. Czerpią energię swobodną Gibbsa (G), uwalnianą podczas reakcji egzoenergetycznych i wykorzystują ją do napędzania reakcji niemogących zachodzić spontanicznie. Przenośnikiem jest ATP, który zawiera dwa wiązania fosfobezwodnikowe, a ich zerwanie wyzwala dużą ilość energii użytecznej.

Budowa łańcucha oddechowego (krótko, przypomnienie z biochemii)

Kompleks I (reduktaza NADH-koenzym Q; dehydrogenaza NADH) - Duże transbłonowe białko enzymatyczne, zawierające ponad 30 łańcuchów polipeptydowych. Katalizuje przeniesienie dwóch elektronów z matriksowej puli NADH na ubichinon. Posiada grupę prostetyczną FMN (mononukleotyd flawinowy), oraz dwa centra żelazosiarkowe typu [2Fe-2S] i [4Fe-4S]. Żelazo połączone z siarką koordynacyjnie.

Kompleks II (reduktaza bursztynian - koenzym Q; dehydrogenaza bursztynianowa) - Składa się z kilku polipeptydów. Dwa największe tworzą właściwą dehydrogenazę, która funkcjonuje też jako jeden z enzymów cyklu kwasu cytrynowego. Elektrony z FADH2 są odbierane i przenoszone do ubichinonu.

Kompleks III (reduktaza cytochromowa; reduktaza ubichinol-cytochrom c; kompleks cytochromów bc1) - Przenosi elektrony z ubichinolu (QH2) do cytochromu c. Zawiera cytochromy b (bL i bH) i c1 oraz białka typu 2Fe-2S. Cytochromy mają grupy hemowe o centralnie położonym atomie żelaza.

Kompleks IV (oksydaza cytochromowa) - Elektrony z cytochromu c do tlenu. Składa się z dwóch cytochromów a i dwóch atomów miedzi. Hem a położony jest blisko atomu miedzi typu CuA, cytochrom a3 tworzy parę z atomem miedzi CuB.

Poza transbłonowymi kompleksami w łańcuchu występują dwa ruchome przekaźniki: ubichinon (koenzym Q) oraz cytochrom c. Koenzym Q odbiera też elektrony z FADH2 niezwiązanym bezpośrednio z łańcuchem oddechowym. Pierwszy system współpracuje z czółenkiem glicerofosforanowym, a drugi wykorzystuje beta-oksydację kwasów tłuszczowych. Cytochrom c jest pojedynczym polipeptydem występującym peryferycznie po stronie zewnętrznej błony mitochondrialnej, wewnętrznej. Przenosi elektrony z kompleksu III na IV.

� POTENCJAŁY OKSYDOREDUKCYJNE

Elektrony są przenoszone poprzez poszczególne składniki łańcucha oddechowego według ich potencjałów oksydoredukcyjnych. Potencjał wyrażany jest w voltach i określa różnicę między parami oksydoredukcyjnymi. Punktem odniesienia do badanych związków jest wodór H+/H2 wynosi 0 mV. Dany potencjał oznacza powinowactwo do elektronów. Silne reduktory np. NADH mają ujemny potencjał oksydoredukcyjny i mniejsze powinowactwo, a silne utleniacze dodatni np. tlen. Łańcuch oddechowy zaczyna się od pary NAD+/NADH (-320mV) i kończy na 0,5 O2/H2O (+820mV).

� HIPOTEZA CHEMIOSMOTYCZNA MITCHELLA

Pan Mitchell przedstawił teorię chemiosmotyczną i dostał za nią nagrodę nobla w 1978 roku. Teoria opiera się na założeniu, że czynnikiem sprzęgającym transport elektronów z syntezą ATP jest gradient protonowy, utworzony w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej kosztem energii uwalnianej podczas wędrówki elektronów do O2. Kompleksy I,III,IV są jednocześnie pompami protonowymi. Wskutek pompowania H+ tworzy się gradient ich stężenia i różnica pH o niecałą jednostkę. Matriks (około 8), przestrzeń międzybłonowa (około 7). Wytwarza się siła protonomotoryczna Δp, napędzająca syntezę ATP.

Syntaza ATP - Enzym katalizujący fosforylację ADP do ATP. Składa się z dwóch części: F1 (frakcja 1) „wystaje” z białka, F0 (frakcja oligomycyowa) zakotwiczona w błonie. F1 składa się z pięciu rodzajów podjednostek α3β3γδε. Podjednostki α i β zawierają miejsca katalityczne. Pozostałe łączą frakcję pierwszą z drugą. Część syntazy F0 jest hydrofobowa, zbudowana z podjednostki a, dwóch b i dziesięciu c. Pełni funkcję kanału dla protonów. Miejsca katalityczne podjednostki β mają odmienną konformację w każdym etapie cyklu syntezy ATP.

Konformacja otwarta (O) - znikome powinowactwo do substratów konformacja luźna (L) - słabe powinowactwo, bez aktywności katalitycznej konformacja związania (T) - aktywność katalityczna i silne powinowactwo

Każde z miejsc ma w danej chwili odrębną konformację, ale wszystkie przechodzą kolejno przez dane stany, czemu ostatecznie towarzyszy uwolnienie ATP. Przepompowywanie protonów jest wykorzystywane nie do samej syntezy ATP, tylko do oderwania już zsyntezowanej cząsteczki od miejsca katalitycznego. Syntezę 1 ATP napędzają 3H+ przechodzące przez syntazę. W czasie utleniania NADH są syntezowane 2,5 cząsteczki ATP na 2 elektrony przechodzące od NADH do tlenu, a z przeniesienie 2 elektronów z FADH2 do O2 powstaje 1,5 ATP.

� KONTROLA ODDECHOWA I WSPÓŁCZYNIK KOTROLI ODDECHOWEJ

Odpoczywający człowiek zużywa w ciągu doby około 40 kg ATP, podczas wytężonego wysiłku 0,5 kg w ciągu minuty. Duże stężenie ADP jest czynnikiem przyspieszającym transport elektronów, a tym samym fosforylację oksydacyjną, duże stężenie ATP działa na te procesy hamująco. Mechanizm zabezpieczający jego stałe dostarczanie komórce przez mitochondria nazwano kontrolą oddechową. Współczynnik kontroli oddechowej jest to stosunek szybkości oddychania w obecności ADP (maksymalna synteza ATP) do szybkości oddychania w nieobecności ADP (brak syntezy ATP). Wyższa wartość współczynnika świadczy o lepszym sprzężeniu.

� INHIBITORY ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO I FOSFORYLACJI OKSYDACYJNEJ

Kompleks I - rotenon (izoflawonoid, środek owadobójczy), amytal, piericydyna A Kompleks II - malonian (różni się od bursztynianiu tylko jedną grupą CH2) Kompleks III - antymycyna (na poziomie cytochromu bH), myksotriazol (przejście elektronu z kompleksu III do cytochromu c) Kompleks IV - cyjanek i azydek (reagują z formą żelazową hemu a3), tlenek węgla Zahamowanie samej fosforylacji oksydacyjnej - oligomycyna (hamuje syntezę ATP przez związanie z białkiem OSCP, co uniemożliwia przejście protonów przez syntazę ATP), atraktylozyd, karboksyatraktylozyd i kwas bongkrekowy (hamują aktywność translokazy nukleotydów adeninowych, blokują wymianę ADP/ATP) Rozprzęgacze (protonofory) - związki lipofilne , 2,4-dinitrofenol (DNP), FCCP (karbonylocyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon); zwiększają przewodnictwo protonowe błony przez co energia uwalniania podczas transportu elektronów zostaje przekształcona w ciepło

MUTACJE GENOMU MITOCHONDRIALNEGO PRZYCZYNĄ ZABURZEŃ ENERGETYCZNYCH

Mitochondrialny DNA (mtDNA) jest zbudowany z podwójnej, kolistej nici, pozbawionej intronów i białek histonowych. Zawiera 16 569 par nukleotydów i koduje 2 rRNA, 22 tRNA oraz 13 z 67 polipeptydów budujących kompleksy łańcucha oddechowego i syntazę ATP. Zaburzenia pracy mitochondriów są najczęściej spowodowane mutacjami punktowymi lub/i delecjami w mtDNA. W komórce koegzystują setki i tysiące niezmutowanych kopii mtDNA i takie, które zawierają patogenne mutacje. Choroba mitochondrialna zależy od stosunku zmutowanego mtDNA do prawidłowego. Diagnostyka powinna zawierać oprócz ujawnienia danej mutacji, także ustalenie według stosunku. Genetyczne choroby mitochondrialne dziedziczone są po matce.

Przykłady chorób mitochondrialnych:

Mutacje punktowe genów strukturalnych - dziedziczna, wzrokowa neuropatia Lebera; neuropatia obwodowa z ataksją i barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki; zespół Leigha (śmiertelna choroba wieku dziecięcego)

Mutacje punktowe w genach mitochondrialnego tRNA - padaczka monoklonalna, encefalopatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i napadami przypominającymi udar mózgu

Delecje mtDNA - zespół szpikowo-trzustkowy Pearsona (śmiertelny w niemowlęctwie)

Mutacje mieszane- degeneracja mięśni objawiająca się słabością i nietolerowaniem wysiłku; cukrzyca nieinsulinozależna wraz z głuchotą; zespół Kearnsa-Sayre’a (wieloukładowe uszkodzenie neurologiczne z degeneracją siatkówki, blokiem serca, ataksją i demencją, stwierdza się także postępującą zewnętrzną oftalmoplegię i postępujące porażenie mięśni oka)

Rozdział 10

Komunikacja międzykomórkowa

� Informatory pierwotne.

Przekazują informacje ze srodowiska lub wymienianej między poszczegolnymi narządami i komorkami organizmu przekazywanymi na rozne sposoby (poprzez krew, substancję międzykomorkową). Są nimi czynniki fizyczne (energia np. swietlna lub cieplna, fala dzwiękowa) i chemiczne (cząstki o okreslonej konformacji przestrzennej).

� Sposoby komunikacji międzykomorkowej

• Podział ze względu na zasięg i sposob rozprzestrzeniania się sygnału:

Sposob komunikacji

Działanie miejscowe – ograniczony zasięg

Endokrynowe (rozprowadzane przez układ krwionosny)

Przekaznictwo synaptyczne -wybiorcze, dociera do pojedynczych komorek

Połączenie metaboliczne – najbardziej wybiorcze

Informatory Eikozanoidy, cytokiny – tzw. mediatory lokalne

Hormony, witaminy transportowane we krwi i chronione przez białka transportowe (albuminy, globuliny)

Neurotransmitery Rozne substancje przekazywane między połączonymi komorkami

• Podział ze względu na pochodzenie informatora pierwotnego:

Sposob komunikacji Parakrynowy Autokrynowy Justakrynowy

Charakterystyka Wydzielana substancja wiąze się z receptorem innej pobliskiej komorki

Wydzielony informator wiąze się z receptorem w tej samej komorce

Informator pierwotny związany jest z błoną komorki przekazującej sygnał (cząsteczki adhezji międzykomorkowej, cytokiny)

� Receptory

Najczęsciej glikoproteiny i inne polipeptydy, czasem glikolipidy i oligosacharydy. Mogą się składac z jednej lub wielu podjednostek. Czynniki fizyczne odbierane są dzięki domenom zdolnym do przetwarzania specyficznej energii, czynniki chemiczne (ligandy) wiązą się z receptorem.

• INTERAKCJE RECEPTOR-LIGAND � poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania jonowe i elektrostatyczne � dopasowanie na zasadzie „klucz do zamka” lub zmian konformacyjnych w trakcie

wiązania (zamek błyskawiczny) � lokalizacja receptora zalezy od masy cząsteczkowej ligandu (duza – receptory

błonowe, mała - receptory wewnątrzkomorkowe, inne – receptory jądrowe) i charakteru ligandu

� receptory dla roznych ligandow o zblizonej budowie tworzą rodziny receptorów. Ale rowniez „niespokrewnione” receptory mogą wiązac ten sam ligand (powstałe w wyniku konwergencji genetycznej w trakcje ewolucji) – np. receptory muskarynowy i nikotynowy dla acetylocholiny.

� Tworzenie kompleksu charakteryzują następujące wielkosci – kinetyka wiązania,

stała dysocjacji (powinowactwa) � celem odbioru informacji jest jej rozpoznanie i indukcja właściwej odpowiedzi

komórki � bodźce fizyczne powodują zmianę konformacji receptora lub jego oligomeryzację

prowadzącą do aktywacji receptora i reakcji komorki

• ANTAGONISbCIIAGONISbCIAgonista–aktywujereceptorAntagonista–nieaktywujereceptorawyrozniamyantagonistówkompetencyjnych –wspołzawodniczą owiązanie z receptorem zagonistami,zmieniająpowinowactwodoagonisty.

� Klasyfikacjareceptorówpodwzględembudowyitransdukcjisygnału:RECEPTORYJONOTROPOWE:

• pełniąfunkcjękanałowjonowych• głowniewukładzienerwowym–przekaźnictwosynaptyczne• związanie z receptorem powoduje zmianę swobodnego przepływu jonów,

depolaryzacjęlubhiperpolaryzację• najszybszyinajprostszysposobprzekazywaniainformacji• tworząheterooligomerycznekompleksy–kanałyotwierającesiępozwiązaniuzagonistą• przykłady–receptornikotynowydlaAch,receptorkwasuγ-aminomasłowego,receptory

purynergiczne–nieselektywnekanały,wiąząsięzATP KANAŁYWAPNIOWE

• występują w błonie zewnętrznej (bramkowane zmianą potencjału), i w błonachwewnątrznych(wsiateczcegładkiej–rianodynoweizalezneodIP3)

• Ca2+pełniwkomorcefunkcjeregulatorowe–kofaktoriaktywatorenzymow(ATP-azy,kinazyifosfotazy),powodujeinterakcjecytoszkieletu,skurczkomorki,

• zbudowanez1łancuchapolipeptydowego• receptory rianodynowe – w siateczce gładkiej mięsni szkieletowych. Aktywowane

przez interakcję z innym receptorem - dihydropirydynowym występującym wkanalikach T- zaleznym od napięcia . W mięsniu sercowym – aktywowane przezprzepływjonowCa2+zesrodowiskazewnętrznegodocytoplazmy

• receptory zależne od IP3 – aktywowane przez IP3 powstającym w wyniku rozpadufosfatydyloinozytoludziękifosfolipazieC

RECEPTORYZWIĄZANEZAKTYWACJĄUKŁ.ENZYMATYCZNYCH

• wpływająnaaktywacjębiałekefektorowych(wwynikufosforylacjilubdefosforylacji)lubichsyntezę

• najwazniejszeenzymybiorąceudziałwodpowiedzikinazy i fosforylazy.Dzieląsięnaserynowo-treoninowe (aktywacja szlakow biochemicznych) oraz tyrozynowe(przenoszeniesygnałuprzezbłonę).

• Kinazyifosforylazydziałająnaczynnikitranskrypcyjne,enzymy,białkastrukturalneisamereceptory

• Kinazyifosforylazyaktywowanesąprzezinformatorywtórne–cyklicznenukleotydy,prod. przemian fosfolipidow lub sfingolipidow, Ca2+, ktorych pojawienie się jestwynikiemtransdukcjisygnałuprzezbłonęiaktywnościenzymów

• czynniki transkrypcyjne mogą poprzez wiązanie się z DNA w regionachregulatorowychaktywowacsyntezęmRNA.

Typyreceptorówzw.zaktywacjąszlakówenzymatycznych:

AKTYWUJĄCEBIAŁKAG–RECEPTORYMETABOTROPOWE

RECEPTORYZWIAZANE ZKINAZAMITYROZYNOWYMI

RECEPTORYZWIĄZANE ZKINAZAMISERYNOWO-TREONINOWYMI

RECEPTORYZWIĄZANEZAKTYWACJĄ PROTEAZWEWNATRZKOMOb RKOWYCH

typowe dla hormonow,neurohormonow ineurotransmiterow orazmorfogenow z rodzinyhedgehog

Typowe dla czynnikowwzrostu orazhemopoetycznych,interleukin, neutrofin,niektorychTNF

Receptory dla TGF-β,białekmorfogenetycznychkosci(BMP)

Charakterystyczne dlaindukcji procesowprowadzących do apoptozy.RodzinareceptorowdlaTNF(np. TNF-α), fas/APO-1, rec.Dla czynnikow TRAIL,TWEAK,DR4iDR5

Mają 7 domentransbłonowych(innanazwa–receptoryserpentynowe)

2podjednostki;wczęscicytoplazmatycznej mająaktywnosckinazSer-Thr

Posiadają w częscicytoplazmatycznej domenyśmierci

Miejsce wiązania białek G –między pętlą V i VI oraz C-koncem

Homodimeryzują pozwiązaniuligandu

Tworzą heterodimer pozwiązaniu ligandu copowodujeaktywację

Po aktywacjihomotrimeryzują

Transdukcja sygnału zapomocąbiałekG

Transdukcja sygnału zapomocą kinaztyrozynowych

Transdukcja sygnału zapomocąkinazSer-Thr

Domena smierci rekrutujebiałka adaptorowe (FADD,TRADD)

Białka G (podj. alfa)hydrolizująGTPdoGDP+Pi.Obejmuje rodzinę białek GRas,orazrodzinęzwiązanązcytoszkieletem iendo/egzocytozą.Podjednostką aktywującąjest alfa powiązana z GTP.Inne podjednostki – beta,gamma rekrutują substratydla enzymowsyntetyzujących informatorywtorne i pełnią rolęregulatorow podjednostekalfa

Kinazy Tyr powodująautofosforylacjęreceptorapopołączeniuzligandem.

Powodują fosforylacjeczynnikowtranskrypcyjnych Snad,ktore następnie sątransportowane dojądra.

Białka adaptorowepowodują powstaniekompleksu aktywującegokaskadę kaspaz – proteazcysteinowych

Białka G aktywują enzymysyntetyzujące informatorywtorne (np. cyklazaadenylanowa, fosfolipazy),czasem kanały i wymiennikijonowe(Na+/K+,Ca2+).

Kinazy Tyr powodująsyntezę informatorowwtornych, aktywacjękinaz/fosfotaz Ser-ThrorazkinazTyrzrodzinySrc, aktywację białekadaptorowych(aktywacja szlaku Ras ikaskady kinaz Map -proliferacja/apoptoza,aktywacja kinaz Src),lub aktywację kinaztyrozynowychJak/Tyk-aktywacja czynnikowtranskrypcyjnychSTAT.

Ufosforylowaneczynnikitranskrypcyjne inicjująekspresję genow. BycmozekinazyteaktywująkaskadękinaMAP.

Procesy aktywowane przezte czynniki nie wymagająaktywacji kina/fosfotaz aniczynnikowtranskrypcyjnych.

RECEPTORYJĄDROWE:− występująwcytoplazmieijądrzekomorkowym− aktywowane przez czynniki o charakterze hydrofobowym, przechodzące przez błonę

komorkową – hormony steroidowe, witamina D3, kwas retinowy, hormony tarczycy,pochodnenienasyconychkwasowtłuszczowych

− mają budowę czynników transkrypcyjnych – mają domenę wiążącą DNA ostrukturze „palców cynkowych”. Po aktywacji wiązą się z DNA w miejscachregulatorowychinicjująctranskrypcję–receptorjestczynnikiemtranskrypcyjnym

− po związaniu ligandu homo/heterodimeryzują (między sobą bądz innymi czynnikamitranskrypcyjnyminp.JuniFos)isątranslokowanedojądra

− brak udziału informatorow wtornych, kaskad enzymatycznych etc. prowadzących wprzekazywaniusygnału

RegulacjafunkcjireceptorówUczestnicząwniejnastępującezjawiska:

• fosforylacja,defosforylacjareceptorowprzeprowadzonaprzezkinazy(np.kinazySer-Thr β-ARK) i fosfotazy białkowe – powoduje dysocjację ligandu lub związanie białkablokującegoprzekazywaniesygnału(np.arestyna).np.receptoryzw.ZGsorazaktywacjącyklazyadenylanowej

• blokowaniefunkcjireceptorow• białkaregulatorowe• internalizacja receptorow (endocytoza po związaniu z ligandem w postaci wgłębien

okrytych). Po endocytozie w powstałych receptosomach działa pompa protonowa –obnizeniepHpowodujedysocjacjękompleksureceptor-ligand.Ewentualneprzyłączenielizosomow–proteolizareceptorowiligandow.Receptosomymogąrównież,winnychprzypadkach przekazywać sygnał do organelli, na drugą stronę komorki lub dookreslonychobszarowcytoplazmy.

• degradacja• „złuszczanie” z powierzchni komorek – moze prowadzic do desyntetyzacji komórki

(nie moze odpowiadac na dany bodziec, gdyz nie posiada odpowiednich receptorow).Zachodzidziękiproteazompowierzchniowym.Receptory, ktore związały ligand i niemająkontaktuzbłonąkomorkowąuniemozliwiająpozostałymreceptoromzwiązaniezinformatorem.

• Blokowanie poprzez naturalne ligandy o właściwościach antagonistycznych –blokowaniekompetencyjne.

Rolakomunikacjimiędzykomórkowej.Komunikacjamiędzykomorkowauczestniczywutrzymaniuhomeostazy.Nieprawidłowe funkcjonowanie receptorow (niedostateczne przekazywanie sygnału lubnadwrazliwoscnaligand)–czynnikietiopatologicznewieluchorobiwadrozwojowych.Niedostateczneprzekazywaniesygnałumozebycpowodowaneprzez:

� brakfunkcjonalnegoreceptoralubczynnikowprzekazującychsygnał� nadmiernaaktywnoscczynnikowhamującychreceptorylubprzekazywaniesygnału

Nadmierneprzekazywaniesygnału:

� mozebyczwiązaneznadekspresjąreceptorowlubczynnikowtransdukującychsygnał� niewłasciwąaktywacjąreceptorow� nieprawidłowądesyntetyzacjąreceptorowiukładuprzenoszeniasygnału

Powodemtychzaburzensą:� wady genetyczne i mutacje, ktore mogą byc przyczyną nowotworow (mutacje

receptorow dla czynnikow wzrostu, mutacje białka Ras uniemozliwiające jegodezaktywację)

� czynnikiinfekcyjne–np.toksynybakteryjne–cholery,krztusca� egzogenneczynnikichemiczne� zaburzenia regulacji poziomu ligandu, np. choroby o podłozu endokrynologicznym

(nadczynnosc/niedoczynnoscgruczołu,nadreaktywnosclubniewrazliwoscnahormony)związanezutratąreceptorowimutacjągenowkodującychbiałkaG

Spozywanie kawy i herbaty w duzych ilosciach (czyli zawartych w nich alkaloidow) powoduje inhibicję enzymu – fosfodiestrazy cAMP, ktory hyrolizuje cAMP aktywujące kinazę A zw. z metabolizmem glikogenu, co ma wpływ na gospodarkę węglowodanową organizmu. Mutacje związane z czynnikami stymulującymi mają charakter dominujący. Mutacje inaktywujące czynniki hamujące są mutacjami recesywnymi. Synapsy Wyrozniamy synapsy elektryczne (przekazują sygnały bezposrednio na błonę postsynaptyczną) i chemiczne (w ktorych uwalniany jest neurotransmiter, powodujący zmianę potencjału elektrycznego błony postsynaptycznej). Budowa synapsy chemicznej Informacja przekazywana za pomocą substancji chemicznej – zmiana przekaznika informacji. Jest to powodem występowania opoznienia synaptycznego.

� Część presynaptyczna – tworzy ją zakonczenie aksonu w kształcie kolbki. Znajdują się tu pęcherzyki synaptyczne (zawierają neurotransmiter, mitochondria, neurofilamenty), gromadzące się w poblizu błony presynaptycznej – strefie

aktywnej synapsy. � Szczelina synaptyczna – ma szerokosc 30nm, zawiera składniki macierzy

komórkowej (laminina, cząsteczki adhezyjne, włokienka kolagenowe) oraz enzymy rozkładające neurotransmitery

� Część postsynaptyczna – wyspecjalizowany odcinek błony komorkowej, często pofałdowana. Zawiera białka receptorowe dla neurotransmiterów. W cytoplazmie przy błonie postsynaptycznej znajduje się duzo mitochondriow, rybosomow i siateczka srodplazmatyczna gładka.

Budowa synapsy zalezy od jej funkcji. Występują rowniez synapsy mieszane – chemiczno-elektryczne, a takze synapsy „na odległość” - z szeroką szczeliną synaptyczną, w ktorej neurotransmiter dociera do kilku komorek efektorowych. Innym typem synapsy jest synapsa dwukierunkowa np. między komorkami kłębka tętnicy szyjnej, w ktorej pęcherzyki istnieją w częsci pre- i postsynaptycznej. Funkcjonowanie synapsy chemicznej potencjał czynnosciowy w rejonie presynaptycznym → depolaryzacja błony presynaptycznej → fuzja pęcherzykow synaptycznych z błoną presynaptyczną → wydzielenie neurotransmitera → wiązanie neurotransmitera z receptorem → otwarcie/zamknięcie kanałow jonowych w błonie postsynaptycznej - zmiana przepuszczalnosci błony → zmiana potencjału w błonie postsynaptycznej i jej rozprzestrzenianie Potencjały postsynaptyczne mogą się sumowac, poniewaz występują zarowno pobudzające (EPSP) jak i hamujące (IPSP) potencjały postsynaptyczne. Ich charakter zalezy od neurotransmitera oraz receptorow błony postsynaptycznej. W synapsie elektrycznej występuje:

• opoznienie synaptyczne (zalezne od czasu otwarcia kanałow Ca2+, uwolnienia neurotransmitera i reakcji z receptorem) – od 0,5 do kilku ms.

• sumowanie w czasie – nakładanie się potencjałow podprogowych do uzyskania potencjału czynnosciowego

• sumowanie w przestrzeni – nakładani się potencjałow pochodzących z roznych neuronow

Neurotransmitery Są one syntetyzowane w neuronie, zlokalizowane w pęcherzykach synaptycznych, uwalniane po wpływem jonow Ca2+ po depolaryzacji błony presynaptycznej, a wiąząc się z receptorem powoduje zmianę potencjału błony postsynaptycznej. Unieczynnienie powoduje powrot błony postsynaptycznej do stanu spoczynkowego.

Wyrozniamyneurotransmiteryklasyczneineuropeptydy(większeizazwyczajpełniąfunkcjęneuromodulatorow).Ichfunkcjępełniąponadtozasadypurynowe,NO,CO,ATP.Neurotransmitery klasyczne – Ach, NA, serotonina, histamina, glicyna, dopamina, kwasasparaginowy.Zlokalizowanewpęcherzykachmałych,wczęsciczynnejsynapsy.Neuropeptydy – substancja P, neurotensyna, VIP, tyreoliberyna, wazopresyna, oksytocyna,galanina,somatostatyna,luliberyna,peptydyopioidowe.Zlokalizowanewpęcherzykachduzych,ktorychlokalizacjajestprzypadkowa.Neurotransmitery pobudzające otwierają kanały Na+, Na+/K+. Zalicza się do nich zazwyczaj:Ach,glutaminian,asparaginian,noradrenalinę,serotoninę,dopaminę,substancjęP.Neurotransmiteryhamująceotwierają kanałyCl- lubwolnekanałyK+. Są to glicyna i kwasγ-aminomasłowy.Związanie tego samego neurotransmitera z roznymi receptorami wywołuje rozny efekt (np.acetylocholina–receptornikotynowypobudza,amuskarynowyhamuje).Biosynteza zachodzi zarowno w perikarionie (głownie neuropeptydy) jak i w zakonczeniachnerwowych. Neurotransmitery powstałe w ciele komorki nerwowej są transportowane drogątransportuaksonalnego.Uwolnienie neurotransmiterow zachodzi w scisle okreslonych porcjach, tzw. pakietach. Iloscuwolnionychpakietowzalezyodrodzajuimpulsu.Niewielkieiloscipęcherzykowsynaptycznychwydzielane spontanicznie bez pobudzenia powodują powstanieminiaturowych potencjałówpostsynaptycznych,ktore niewystarczają do powstania potencjału czynnosciowego. Cały tenprocesregulowany jestprzezbiałkabłonowe,występującewpęcherzykachsynaptycznych iwbłoniepostsynaptycznej.W transporcie pęcherzykow uczestniczy synapsyna I, wiąząca się z F-aktyną i pęcherzykami.Aktywnosc regulowana jest przez fosforylację (następuje po potencjale czynnosciowym).Kotwiczeniewstrefieczynnejsynapsyzalezyodbiałekbłonypresynaptycznej–syntapsyny,jaki białek błony pęcherzykow synaptycznych - synaptobrewiny (VAMP) i synaptotagminy(wykazujepowinowactwodoCa2+).KompleksSNAREumozliwiafuzjępęcherzykowzbłonąitworzonyjestprzezsuntapsynęisynaptobrewinę.Fuzja błona zalezy od synaptofizyny, ktora tworzy kanały, przez ktore wydostaje sięneurotransmiter,atakzegwałtownegowzrostustęzeniajonowCa2+.Żylakowatościwystępujące w aksonach uwalniających aminy biogenne powodują uwalnianieneurotransmiterowpozasynapsą. Jest topostsynaptyczna transmisjaobjętosciowa–działanaznaczneodległosciimodulujeprzekazywaniesygnałowwsynapsach.Recyrkulacja–nadrodzeendocytozyotoczoneklatrynąpęcherzykisynaptycznenapełniająsięneurotransmiterem.TenproceszaleznyjestodCa2+.Dotyczytylkopęcherzykówmałych.Unieczynnianieneurotransmiterow–zapobiegablokowaniureceptorow,umozliwiaprawidłowesumowanie sygnałow w przestrzeni i czasie. Zachodzi na drodzedegradacji enzymatycznej(np. esteraza cholinowa dla Ach, enzymy proteolityczne), dyfuzji, wychwytywania przezkomórkiglejowe(GABA,glicyna).KanałyjonoweUmozliwiająwymianęjonowmiędzykomorkąasrodowiskiemzewnętrznym.Stymulowanesą:

- poprzez związanie ligandu z receptorem (zewnątrzkomorkowego lubwewnątrzkomorkowego)

- poprzezzmianępotencjałubłony- mechanicznie

Kanały występują w stanie aktywacji, inaktywacji lub spoczynku. Zalezy to od iloscineurotransmiteraiczasuoddziaływaniazreceptorem.PotencjałczynnosciowyzwiązanyjestgłowniezjonamiNa+.PotencjałspoczynkowyjestwywoływanyprzedewszystkimprzezkanałyK+.Receptorydlaneurotransmiterów.Mogąznajdowacsięzarownowbłoniepresynaptycznej(autoreceptoryiheteroreceptory)jakipostsynaptycznej.Informację przekazywanę przez neurotransmiter odbierają receptory jonotropowe (szybkieprzekazywanieinformacji)imetabotropowe(zapomocąbiałekG–reagujązketecholoaminamiineuropeptydami).

Neurotransmiterymogądziałacnaroznetypyreceptorow.Receptory jonotropowe – przekazywanie informacji szybko i bezposrednio. Np. receptornikotynowy dla Ach. Zmiana nawet kilku aminokwasow zmienia własciwosci receptora.Występujewieleodmiandlajednegoneurotransmitera,oroznychwłasciwosciach.Receptorymetabotropowe–oddziałujązneurotransmiteramiklasycznymiineuropoptydami.Uczynniają kanały jonowe posrednio poprzez aktywację białek G lub powodują powstanieinformatorowwtornych.Takiprzekazinformacjijestwolniejszy.Cechą charakterystyczną receptorow jest mozliwosc samoregulacji czynności kanałówjonowych.Uzaleznionejestodstęzenianeurotransmitera,Ca2+...BudowasynapsyelektrycznejInformacjaprzekazywanazapomocąprądujonowego.Szczelinasynaptycznamatylko2nm,abłonypreipostsynaptycznepołączonesąkoneksonami,zbudowanymizkoneksyny.Dziękinimpotencjałczynnosciowymozebycszybkoprzekazywanymiędzykomorkami,iwdodatkudwukierunkowo,bezopóźnieniasynaptycznego.Modulowaniesygnałynastępujeprzez:-zmianykoncentracjiCa2+- poprzez wspołdziałanie z synapsą chemiczną – przez efekt działania chemicznej substancjiprzekaznikowejnabłonępostsynaptycznąSynapsyelektrycznezanikająnarzeczchemicznychwmiarędojrzewaniaorganizmu.

- Regulacjaprzekazywaniasygnałowprzezzakonczeniapresynaptyczne• poprzezreceptory(autoreceptory)–uwolnienie innychsubstancjiprzekaznikowych,w

tym neuropeptydow. Instnieją rozne rodzaje autoreceptorow dla tego samegoprzekaznika

• zmianastęzeniajonowCa2+

Rozdział 11

Cząsteczki adhezyjne i składniki substancji miedzykomórkowej CZĄSTECZKI ADHEZYJNE (CAM): 1.Selektyny - wiążą grupy cukrowe swoistych glikoprotein i mucyn błonowych innych komórek np. leukocyty - śródbłonek - ekspresja – szybka kontrola, połączenia przejściowe - słabe, czasowe połączenia międzykomórkowe - rozpoznawanie i pierwszy kontakt z innymi komórkami - domena wewnątrzkomórkowa, wewnątrzbłonowa, na zewnątrz różna liczba domen białkowych + EGF + domena rozpoznająca cukry (CRD) 2. Integryny - trwałe połączenia z ECM (kolagen, laminina, fibronektyna) lub czasem z komórkami (IgCAM) - hemidesmosomy, przyczepy ogniskowe - 2 podjednostki: α (wiąże kationy) i β (łączy ligand) 3. Kadheryny - homofilowe (kadheryna+kadheryna) połączenia międzykomórkowe - desmosomy (rodzaj kadheryn-desmogleiny), obwódki zwierające - połączenia zwierające z udziałem cytoszkieletu (poprzez kateniny), wymagające jonów Ca2+

- domena wewnątrzkomórkowa, wewnątrzbłonowa, 5x domena zewnątrzkomórkowa 4. Nadrodzina immunoglobulin IgCAM - połączenia międzykomórkowe w ukł. nerwowym i immunologicznym - połączenia homo - lub heterofilowe o charakterze trwałym lub czasowym - niezależne od jonów Ca2+

- domeny wewnątrzkomórkowa, wewnątrzbłonowa i zewnątrzkomórkowa zbudowana z różnej liczby pętli aminokwasów Ważniejsze białka wewnątrzkomórkowe związane z ECM: a) z kadherynami – kateniny, desmoplakiny w desmosomach b) z integrynami – α-aktynina, winkulina, dystrofina, paksylina SUBSTANCJA MIĘDZYKOMÓRKOWA (ECM): Glikozaminoglikany – polimery dwucukrów (kwas uronowy+aminoheksoza) - charakter polianionowy - wiążą duże ilości wody i elektrolitów Np. siarczan dermatanu (skóra, ścięgna), siarczan heparanu (płuca, wątroba), siarczan keratanu (rogówka, jądra miażdżyste), siarczan chondroityny (chrząstki, skóra), kwas hialuronowy. Proteoglikany – GAGi połączone krótkimi rdzeniami białkowymi lub glikoproteinami np. agrekan, syndekan, dekoryna. Kwas hialuronowy może łączyć proteoglikany w większe agregaty. Białka niekolagenowe: Fibronektyna Pośredniczy w łączeniu komórek z cząsteczkami ECM. Laminina Pośredniczy w łączeniu komórek do błon podstawnych. Entaktyna Występuje głównie w błonach podstawnych.

Białka tworzące włókna: a) Kolagen Białko występujące u człowieka w największych ilościach. Przebieg syntezy (fibroblasty lub ich odpowiedniki): - synteza łańcuchów α - hydroksylacja lizyny i proliny (kofaktor hydroksylaz to wit. C) - łańcuchy łączą się po 3 tworząc prokolagen - zostaje on wydzielony poza komórkę, gdzie telopeptydazy odcinają telopeptydy, powstaje tropokolagen - tropokolagen łączy się w większe struktury Typ kolagenu Występowanie Cechy charakterystyczne

I Skóra, kości zęby, ścięgna, więzadła, powięzie, rogówka

Grube włókna

II Chrząstki, dyski międzykręgowe, ciało szkliste

Drobne włókienka

III Skóra, naczynie krwionośne, wątroba, śledziona, macica

Drobne włókienka (srebrochłonne)

IV Błony podstawne Sieć

VII Włókienka zakotwiczające w błonie podstawnej

Jak IV

VI, IX, XII Łączą składniki ECM b) Elastyna, fibrylina Rozciągliwe białka włókien i błon sprężystych (najwięcej w płucach, tętnicach, skórze).Cząsteczki elastyny tworzą rdzeń włókna sprężystego. Obwodowo, równolegle leżą włókienka zbudowane głównie z fibryliny. Prekursorem elastyny jest białko zwane tropoelastyną, wytwarzane przez fibroblasty. W łączeniu włókien bierze udział oksydaza lizynowa. Połączenia międzykomórkowe:

• Połączenia zamykające Liniowe układy białek błonowych tworzą rozgałęzione systemy, które łączą się z układami komórki sąsiedniej. Uszczelniają przestrzenie komórkowe uniemożliwiając przechodzenie cząsteczek. Typ połączenia nazywany również obwódką zamykającą. Występują najczęściej w szczytowych częściach komórek nabłonkowych. Białka np. klaudyna i okludyna.

• Połączenia zwierające Wspólną cechą tych połączeń jest połączenie z cytoszkieletem. Występują np. w naskórku i mięśniu sercowym (te tkanki charakteryzują się odpornością na rozciąganie).

a) Obwódki zwierające – Pozakomórkowe domeny kadheryn sąsiednich komórek łączą się ze sobą, ich domeny cytoplazmatyczne łączą się z filamentami aktynowymi, w połączeniu pośredniczą kateniny i α-aktynina. b) Desmosomy – białka transbłonowe będące odmianą kadheryn nazywane są desmogleinami. Domeny cytoplazmatyczne łączą filamenty pośrednie, cytokeratynowe lub desminowe, białka pośredniczące to desmoplakina, plaktoglobina, które tworzą pod błoną płytkę mocującą. c) Hemidesmosomy – punktowe połączenia między komórkami i cząsteczkami ECM błon podstawnych. Białkami transbłonowymi są integryny, łączące się z lamininą błony podstawnej. Podobnie jak w desmosomach do połączenia przyczepione są filamenty pośrednie, a białkami pośredniczącymi są desmoglobiny. d) Przyczepy ogniskowe – podobnie jak hemidesmosomy łączą komórki nabłonkowe z błoną podstawną. Białkiem transbłonowym jest integryna, łącząca się z fibronektyną.

Typ połączenia Łączone elementy

Białka transbłonowe Filamenty cytoszkieletu

Wewnątrzkom. białka łączące

Obwódka zwierająca Komórka- -komórka

Kadheryny Aktynowe Kateniny, α-aktynina

Przyczep ogniskowy Komórka- -ECM

Integryny łączące fibronektynę Aktynowe Winkulina, talina, α-aktynina

Desmosom Komórka- -komórka

Desmogleiny i desmokoliny (odmiana kadheryn)

Pośrednie Desmoplakiny, plaktoglobiny

Hemidesmosom Komórka- -ECM

Integryny łączące lamininę Pośrednie Desmoglobiny

Połączenia jonowo-metaboliczne Nazywane są połączeniami typu neksus. Sześć białek (koneksyny) tworzy tkwiący w błonie cylinder – konekson, który łączy się z koneksonem drugiej komórki tworząc kanał. Występują w nabłonkach, mięśniach gładkich, wstawkach mięśnia sercowego. CAM w rozwoju układu nerwowego: IgCAM – łączą komórki nerwowe między sobą i biorą udział we wzroście aksonów wzdłuż innych aksonów Kadheryny – odpowiadają za wzrost aksonów między astrocytami Integryny – ukierunkowują wzrost aksonów w ECM KLINIKA 1. Przechodzenie leukocytów przez ścianę naczynia krwionośnego (diapedeza).

a) Aktywacja Makrofagi i limfocyty wydzielając cytokiny aktywują komórki śródbłonka, które wbudowują selektyny i IgCAM w błonę komórkową.

b) Toczenie Selektyny wiążą glikoproteiny leukocytów, dochodzi do tzw. „toczenia”.

c) Adhezja Aktywowane integryny leukocytów wiążą się z IgCAM kom. śródbłonka.

d) Transmigracja Leukocyty przechodzą poza naczynie

2. Podczas tworzenia skrzepu integryny płytek krwi wiążą fibrynogen. 3. Brak ekspresji kadheryn lub katenin jest przyczyną zaniku połączeń międzykomórkowych, co stwarza możliwość tworzenia przerzutów nowotworowych.

Rozdział 12

Podstawy obrony immunologicznej Odporność naturalna – nieswoista

� Bariery tkankowe i narządowe – skora, sluz, niskie pH w zołądku

� Stan zapalny

Warunkuje efektywną odpowiedz immunologiczną oraz miejscowe nagromadzenie komorek i

mediatorow odpornosci naturalnej i nabytej. Efektem działania mediatorow jest wzrost

przepuszczalnosci naczyn krwionosnych oraz indukcja w komorkach srodbłonka naczyn zmian

prowadzących do migracji leukocytow do ogniska zapalnego.

� Reakcja ostrej fazy

Nieswoista odpowiedz organizmu w następstwie zakazen, urazow, krwotokow i innych zmian

prowadzących do zaburzenia homeostazy ustroju. We wczesnym okresie reakcji ostrej fazy

dochodzi do miejscowego stanu zapalnego. W pozniejszym okresie rozwijają się zmiany

układowe, ktore klinicznie objawiają się jako: gorączka, leukocytoza, anoreksja, sennosc, bole

stawowo-mięsniowe, osłabienie i dreszcze.

� Czynniki humoralne (łac. humor – płyn, tj. osocze i międzykomorkowy)

� cytokiny – są cząsteczkami białkowymi wpływającymi na wzrost, proliferację i

pobudzenie komorek biorących udział w odpowiedzi odpornosciowej.

� interferony

glikoproteiny wydzielane przez niektore komorki w odpowiedzi na zakazenie

wirusem lub pod wpływem toksyn bakteryjnych. Mają działanie

przeciwwirusowe i wzmagają odpowiedz komorkową. Hamują proliferację m.

in. nowotworow.

� chemokiny

niewielkie białka chemotaktycznie przyciągające leukocyty do ogniska

zapalnego

� interleukiny

� układ białek dopełniacza � białka ostrej fazy

� CRP (białko C reaktywne)

inhibitory proteinaz

� C2, C3, C4, czynnik B – składniki układu dopełniacza

� haptoglobina

� ceruloplazmina

� fibrynogen

� plazminogen

� Komórki � makrofagi

Mają zdolnosc do fagocytozy i wywierania efektu cytotoksycznego na komorki zakazone i

nowotworowe. Uczestniczą tez w przebudowie tkanek i regeneracji.

� NK Wywierają szybki efekt cytotoksyczny na komorki zakazone i nowotworowe, jesli te utraciły

antygeny MHC I klasy.

� granulocyty

Odporność nabyta – swoista

� Antygen Jest to substancja, ktorą cechuje:

� immunogennosc – zdolnosc do wywołania swoistej odpowiedzi

immunologicznej,

� antygenowosc – zdolnosc do swoistego łączenia się z immunoglobulinami oraz z

receptorami limfocytow T. Częsc antygenu, ktora decyduje o tej zdolnosci to

determinanta antygenowa (epitop). Pojedynczy epitop bez nosnika to hapten.

� LimfocytyTPowstają w szpiku kostnym, dojrzewają w grasicy. Charakterystycznym markerem jestpodjednostka CD3 receptora wiązącego antygen (TCR), ktory przenosi sygnał do wnętrzakomorki.Wzaleznosciodskładupodjednostektegoreceptora,limfocytyTdzielimyna:

• LimfocytyTCR2(Tαβ)� LimfocytyTCD4+(pomocnicze,Th)� LimfocytyTCD8+(cytotoksyczne,Tc)

• LimfocytyTCR1(Tγδ)Większoscznich jestpozbawionacząsteczekCD4iCD8,nielicznewykazująekspresję jednejznich.Naleządonich rownieznieliczniewystępującecytotoksyczne limfocytyNKTpodobnedokomorekNK.

� ZnaczenieMHCSątobiałkapowierzchniowe,zawierającewswejstrukturzerowek,wktorymumieszczanesą(atym samym prezentowane) fragmenty białek, ktore uległy ubikwitynacji i fragmentacji wproteasomachwewnątrzkomorki.Prezentowanesąantygenyzarownowłasne, jak iobce,przyczym MHC klasy I prezentuje białka pochodzące z wnętrza komorki, natomiast MHC klasy IIprezentuje antygeny, ktore uległy wczesniej endocytozie spoza komorki. MHC II występujeprzedewszystkimnapowierzchniprofesjonalnychkomorekprezentującychantygen(APC),doktorychnaleząkomorkidendrytyczne,limfocytyBimakrofagi.

• RestrykcjaMHC� MHC I wiąze się z molekułą CD8 limfocytow Tc. Jezeli antygen zostanie

rozpoznanyjakoobcy(mozepochodzicnp.zbiałekwirusowych),limfocytTcinicjujeapoptozędanejkomorki.

� MHC II wiąze się z molekułą CD4 limfocytow Th, brak apoptozy – zaposrednictwem cytokin inicjowana jest produkcja swoistych przeciwciałprzezlimfocytyB.

� LimfocytyBPowstająw szpiku i tamdojrzewają. Zasadniczą cechą limfocytowB jestmozliwosc produkcjiprzeciwciał. Podczasodpowiedzi odpornosciowej limfocytyBwiązą antygeny zapomocąBCR,czyli receptora, w ktorego skład wchodzi swoiste, charakterystyczne dla danej komorkiprzeciwciało. Po związaniu antygenu najbardziej typową sytuacją jest jego przetworzenie iwystawienienapowierzchnikomorkiwpostacikompleksuzbiałkamiMHC.Kompleksten jestrozpoznawany przez swoisty względem danego antygenu limfocyt Th. Dopiero po takimrozpoznaniu dochodzi do transformacji blastycznej i powstaniu komorki plazmatycznejprodukującej przeciwciała. Niektore antygeny, nazywane grasiczoniezaleznymi nie wymagająobecnoscilimfocytowThimogąbezposrednioaktywowaclimfocytyB.RowniezprzyponownymkontakcieantygenuzlimfocytamiBpamięciniejestwymaganaasystalimfocytuTh.

� Odpowiedźhumoralna-przeciwciała(immunoglobuliny,Ig)Wytwarzane są przez limfocyty B, mogą byc związane z ich błoną jako receptoryimmunoglobulinowe, lub tez wydzielnicze – wolne. Składają się z dwoch łancuchow lekkich idwoch łancuchow cięzkich połączonych trzema mostkami siarczkowymi. Wyrozniamy dwarodzajełancuchowlekkich(κ,λ)ipięcrodzajowłancuchowcięzkich(α,δ,ε,γ,μ).Wzaleznosciodtypułancuchowcięzkich,ktorezawieraprzeciwciało,dzielisięjenaklasy:

• IgG–pozanaczyniowa,przechodziprzezłozyskoiwystępujewmlekumatki.Wiązesię do makrofagow i neutrofili, wzmagając fagocytozę. Aktywuje drogę klasycznądopełniacza;

• IgE – prozapalna, powoduje degranulację komorek tucznych, bierze udział wodpornosci przeciwrobaczej i reakcjach alergicznych. Jest takze jednym znieswoistychaktywatorowalternatywnejdrogiaktywacjidopełniacza;

• IgD–występujegłownienapowierzchnilimfocytowB,jejfunkcjaniejestznana;• IgA – występuje głownie na powierzchni błon sluzowych jako dimer, rowniez w

osoczu jako monomer. IgA z mleka matki adsorbuje na błonach sluzowych, udorosłych wytwarzane jest głownie w jelicie. Neutralizuje wirusy i aglutynujebakterie. Jest takze jednym z nieswoistych aktywatorow alternatywnej drogiaktywacjidopełniacza;

• IgM – pentameryczna, wewnątrznaczyniowa, nie przechodzi przez łozysko.Aglutynujebakterie,aktywujefagocytozęidrogęklasycznądopełniacza.

� PamięćimmunologicznaCzłowiek posiada miliardy limfocytow, ktore wykazują olbrzymie zroznicowanie receptorowspowodowane losową rearanzacją regionow zmiennych receptora TCR i receptorow Iglimfocytow B. Rozpoznanie antygenu wymaga szczegołowego dopasowania receptora, dlategonielicznekomorkisąwstanierozpoznacdanyantygen.Jednakkiedytonastąpi,inicjowanajestklonalna proliferacja, ktorej skutkiem jest zwiększenie populacji komorek zdolnych dorozpoznania danego antygenu. Wykształcają się dwie linie potomnych komorek – efektorowaorazpamięci.Komorkipamięciprzechodząwstanuspieniaimogąkrązycwekrwiprzezwielelat. Dotyczy to zarowno limfocytow T, jak i B. Kiedy ponownie spotkają się z antygenem,odpowiedzimmunologicznajestznacznieszybszam.in.zewzględunawiększąpoczątkowąilosckomorekzdolnychdorozpoznaniadanegoantygenu.

Rozdział 13

Kancerogeneza Kancerogeneza to zmiany zachodzące w komórce organizmu, prowadzące do powstania nowotworu. Jest to wieloetapowy proces zachodzący na poziomie DNA komórki (niekontrolowana proliferacja). Wyróżnia się w nim trzy (czasem cztery) złożone etapy: inicjację, promocję i progresję. Kancerogeneza jest najczęściej wywoływana czynnikami rakotwórczymi, takimi jak: światło ultrafioletowe, azbest, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne czy niektóre wirusy. Protoonkogen - gen kodujący białko będące droga przekazywania sygnału do proliferacji ; zmutowane protoonkogeny nazywa się onkogenami Gen supresorowy – geny kodujące białka , które hamują proliferacje komórki ; zmutowane białko jest nieaktywne Etapy : Inicjacja Powstanie nowotworu najczęściej rozpoczyna się od pojedynczej mutacji, która może powstawać pod wpływem kancerogenu lub spontanicznie. Zazwyczaj zdrowa komórka rozpoznaje i naprawia je przez systemy naprawcze. Gdy uszkodzenie DNA jest zbyt poważne, żeby mogło być naprawione, komórka przechodzi do procesu apoptozy. Promocja Etap ten polega na aktywacji onkogenów i zwiększeniu produkcji czynników odpowiedzialnych za wzrost i namnażanie komórek. Jednocześnie zachodzą dalsze mutacje, które nie są naprawiane. Szczególnie niebezpieczne są zmiany w genach odpowiadających za apoptozę i za hamowanie podziałów komórki (np. gen p53). Uszkodzenie właśnie tych rejonów DNA prowadzi do rozwoju nowotworu, prowadzą bowiem do charakterystycznych zmian, obserwowanych w komórkach nowotworowych. Wszystko to prowadzi do niekontrolowanego namnażania (proliferacji) zmutowanych komórek i rozwoju guza. Inwersja W jej przebiegu powstają kolejne mutacje w komórkach nowotworowych, ujawniają się zmiany fenotypowe (np. inny kształt komórek nowotworowych). Progresja(proces powolny, trwa latami) Nieodwracalny etap, prowadzący do powstania nowotworu. Polega on głównie na pojawianiu się kolejnych zaburzeń molekularnych, przede wszystkim zmian w kariotypie. W miarę jak uszkodzenia się nakładają, powstają klony zdolne do naciekania i tworzenia przerzutów. Progresję często nazywa się uzłośliwieniem nowotworu. Typy nowotworu – stwierdza się metodami histopatologicznymi

nowotwór łagodny Dobrze

ograniczony, skupiony w jednym miejscu

Rośnie wolno Brak przerzutów

złośliwy Liczne nacieki w zdrową tkankę

Rośnie szybko Przerzuty

Nowotwór złośliwy :

• Rak –pochodzenie nabłonkowe • Mięsak – pochodzenie nienabłonkowe • Gruczolak- gruczoły • Chłoniak- pochodzenie ukł. chłonny

Onkogeny wirusowe • Onkogeny wirusowe (v-onc) sa aktywniejsze od protoonkogenów komórkowych (c-onc) • Po zakażeniu komórki genom wirusa integruje się z genomem jądrowym i może spowodować transformacje nowotworową komórki (np. poddając onkogen komórkowy kontroli silniejszego promotora) Przykłady: HPV (wirus papilloma- rak szyjki macicy), HBV(wirus hepatitis B), EBV (wirus Epstain-Barr – Chłoniaki ), HTLV (wirus ludzkiej białaczki) Powstawanie onkogenów w komórkach niezakażonymi retrowirusami

− Mutacja punktowa − Delecja – utrata części chromosomu − Translokacja chromosomowa- chromosom Philadelphia przeniesienie gen z chrom. 9 na

chrom.22 powstanie genu fuzyjnego BCR/ABL − Metylacja cytozyny – szczególnie w rejonie promotora bogatego w C i G (wyspy CpG)

metylacja w miejscach nieodpowiednich − Amplifikacja – powielenie protoonkogenu

Geny supresorowe / Antyonkogen - gen działający hamująco na procesy proliferacji komórkowej (geny bramkowe), bądź stabilizująco na procesy utrzymujące stabilność genetyczną komórki (geny opiekuńcze) Białko p53 – w komórkach nowotworowych obserwuje się duże stężenie tego białka, natomiast w komórkach prawidłowych żyje zbyt krótko, by można było je wykryć. Białko p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który może indukować bądź hamować ekspresje wielu genów, ponadto tworzy w komórce formy di- i tetramery, postać aktywna występuje w jądrze. Białko to jest utrzymywane w małym stężeniu w wyniku oddziaływania z białkiem MDM2, które je degraduje. Nieprawidłowy tetramer nie wiąże się z białkiem MDM2, stąd dłuższy okres życia w komórce. Stres oksydacyjny – wzrost białka p53 – inaktywacja MDM2 (fosforylacja)

� Uszkodzenie DNA – ↑ p53 – aktywacja genów biorących udział w zatrzymaniu cyklu i reperacji DNA

� Brak naprawy –↑↑ p53 – pojawiają się tetramery p53 i dimery związane z koaktywatorem - aktywacja apoptozy

� Zmutowany p53 – brak przejścia do procesu apoptozy

p21 – inhibitor cyklin i kinaz zależnych od cyklin : CDK4/D, CDK6/D, CDK2/D • Kompleks kinazy-cykliny regulują wchodzenie komórki w cykl i proces replikacji • Ekspresja regulowana przez białko p53

Telomery U zdrowego człowieka telomery wystarczają na około 70 podziałów. Występują one na końcach chromosomów i zabezpieczają je przed rozpadem lub łączeniem się z innym chromosomem. W warunkach prawidłowych telomeraza (enzym, który powoduje odbudowywanie telomerów) jest obecna tylko w okresie życia płodowego i komórkach linii rozrodczej. W komórkach nowotworowych telomerazy mogą wykazywać nadekspresję, zapewniając im „nieśmiertelność”. Brak obronny immunologicznej Komórka nowotworowa wymyka się spod kontroli ukł. immunologicznego, gdyż mogą mieć niesprawny układ przygotowywania antygenów proteasomach <patrz dział immuno.> lub mogą utracić zdolność prezentacji poprzez niską ekspresje MHC I. Ponadto nowotwór może uzyskać zdolność do wytwarzania czynników immunosupresyjnych <np.TGF beta –hamuje lim T > - tolerancja (układ nie odpowiada na pojawiające się kom. nowotworowe). Inną przyczyną może być szybszy wzrost kom. nowotworowych niż swoistych lim. T zdolnych usunąć guz.

Leczenie nowotworów − Chirurgicznie – zabieg najczęściej nie usuwa wszystkich kom. nowotworowych. − Napromieniowanie – promieniowanie X i gamma. W wyniku promieniowania woda

ulega radiolizie, co powoduje powstanie wolnych rodników, które niszczą komórkę. Naświetla się tylko miejsce, w którym znajduje się guz.

− Chemioterapia - stosowanie cytostatyków – hamujących podział komórek w całym organiźmie. Skutkiem ubocznym jest zmniejszenie odporności chorego.

− Immunoterapia - ma na celu indukcję odpowiedzi immunologicznej u chorego z rozwijającym się nowotworem, aby powstały komórki zdolne do rozpoznania komórek nowotworowych jako obcych, a następnie ich zniszczenia.

Diagnostyka

• Biopsja – badanie histopatologiczne • Mutacja w genie BRCA1 - Kobiety, które odziedziczyły uszkodzoną kopię tego genu, mają

zwiększone prawdopodobieństwo (50-80%) zachorowania na raka sutka oraz raka jajnika. Ponadto zwiększone jest ryzyko wystąpienia raka jajowodu, otrzewnej, okrężnicy i prostaty

• Obecność w surowicy CEA – rak jelita grubego • PSA - wzrost w surowicy – rak prostaty • Wzrost fosfatazy kwaśnej sterczowej – łagodny gruczolak prostaty

Rozdział14

MetodybadańbudowyifunkcjikomórekPrzygotowaniekomórekdobadań

badaniein-situ

pobraniefragmentutkanki–technikimikroskopowe� materiał poddaje się procesowi utrwalenia, czynnikami chemicznymi lub fizycznymi.

Podobnyefektdajezamrazaniemateriału.� Utrwalony materiał utrwala się (utwardza) w parafinie, zywicy akrylowej. Proces

zatapiania.� Krojenienaskrawki.

Izolacjakomórek

uzyskanie zawiesiny homogennej populacji kom. przez delikatne, mechaniczne rozdrobnieniefragmentu tkanki,materiał poddaje siędziałaniuenzymow trawiących, ktorewiązą komorki zsubstancją międzykomorkową. Łagodne wirowanie, aby oddzielic kom. od nieuszkodzonychfragmentowkom.

Hodowlakomórek

metodabadawcza, sposobprzygotowaniapopulacji kom.dobadan.Komorki umieszcza sięnapozywkach, w tych warunkach pełnią swoje funkcje, namnazają się, zakładają nowe kolonie.Obserwacja procesow zywych komorek. Wszechstronne badanie aparatu genetycznego,wewnątrzkomorkowych procesow metabolicznych, działanie lekow i toksyn, materiał doprzeszczepow.Wwarunkachhodowlimoznałączyczesobąodmiennerodzajekom.,połączeniebłon kom i zespolenie cytoplazmy innej kom. (fuzja). Połączenie genomow czyli hybrydyzacjakom, ktore uległy fuzji. Hybrydy kom. są zrodłem przeciwciał monoklonalnych, obiekt badangenetycznych.Badaniabiochemiczne,molekularneimikroskopowe.

Homogenizacjaifrakcjonowaniekomórek

do badan biochemicznych i molekularnych nalezy zniszczyc integralnosc kom. przerwanieciągłosci błony kom. aby uzyskac cytoplazmę i organella kom. Homogenizacja to bardzodokładnemechanicznerozdrobnieniewpłynie.Uzyskujesięhomogenat–zawiesinęskładnikowkom. rozniącesięmasąskładnikiwewnątrzkom.Selektywnie izoluje sięprzez frakcjonowanie.Otrzymuje się frakcje zawierające struktury kom. rozniące się masą. Podobny efekt dajewirowaniewsrodowisku(sacharoza,chlorekcezu)owzrastającejgęstosci.

Badaniamikroskopowe:

• Mikroskopyświetlne:

obrazpozorny,powiększony,odwrocony.Zdolnoscrozdzielcząwarunkujedługoscfali.• Mikroskop kontrastowo – fazowy – przekształca przesunięcia fazowe fali swietlnej w

zmianyjejamplitudy.Obserwacjazywychkom.,widoczneprzezroczystestrukturykom.• Mikroskopinterferencyjny–korzystazinterferencjipromieniswietlnychprzechodzących

przez preparat, quasi – 3D obrazy daje tzw. ukł. optyczny Nomarskiego. Obserwacjeniezabarwionychkomorek.

• Mikroskop fluorescencyjny – zrodłem swiatła jest ultrafiolet.Wykorzystaniebarwnikowfluorescencyjnychwprowadzanychdokomorki.

• Mikroskop konfokalny (współogniskowy)- zrodłem swiatła jest laser, emitującypromieniowanie w zakresie bliskim ultrafioletu. Promien lasera skanuje preparat,eliminacja tła. Obraz jest bardzo wyrazny, rejestrowany przez kamerę, przekształcanyprzezkomputer.

• Mikroskopyelektronowe

Obraztworzonypoprzezstrumienelektronow,ocharakterzefalioniewielkiejdługosci.Zdolnosc rozdzielcza 0,2-5nm. Widoczne są w obrazie pojedyncze cząstki białkowe.Strumien elektronow wytwarzany w procesie termoemisji lub emisji polowej poprzeztzw. działo elektronowe, przyspieszony w silnym polu elektrycznym, uginany przezkolejne„soczewki”elektromagnetyczne.Wwarunkachprozni.

• Transmisyjnymikroskopelektronowy

obraz rzutowany na ekran pokryty substancją fluoryzującą pod wpływembombardowania elektronami, powstaje monochromatyczny obraz utworzony przezciemniejsze lub jasniejsze kontury. Najlepsza zdolnosc rozdzielcza. Jego odmianą jestwysokonapięciowymikroskopelektronowy–wyjątkowosilnepoleelektrycznerozpędzaelektrony do bardzo wysokich energii. Mogą przenikac przez grubsze preparaty iwyrazniejobrazowacprzestrzennierelacjestrukturwewnątrzkomorkowych.

• Skaningowymikroskopelektronowy

badaniepowierzchnikomorki,obraz3D,nizszarozdzielczosc,obiektywskanujepreparatpokrytywarstewkąmetalucięzkiego.

Specjalnemetodystosowanewmikroskopiielektronowejwrozmazachwykonywanychzzawiesinuzytecznejestbarwienienegatywowelubcieniowanie(pokryciepowierzchnipreparatuplatynąnapylonąpodkątem;powstająroznicejejgrubosciwzaleznosciodkształtustruktury).Metodamrozeniaiłamania–badaniebłonkom.,umozliwiaobserwację„zgory”.Pozwalabadacrozmieszczeniebiałekbłonowychistrukturęichkompleksow.Odmianątechnikijest:mrozenieigłębokierytowanie–materiałcieniujesiępokilkumin.odprzełamania.Podwpływemproznidochodzi do sublimacji wody z preparatu i odsłonięcia głębiej połozonych struktur. Badanieprzestrzennegoułozeniastrukturcytoszkieletu.

• Cytochemiaklasycznaicytochemiaenzymów

metody zastępujące barwienie –wykrywają konkretny związek, substancję chemiczną.Metodyswoiste.

• Cytochemiaklasyczna–komorkęumieszczasięwroztworzezawierającymodpowiedniodobranezwiązkichemicznedoreakcjicytochemicznej(międzyzwiązkiemchemicznymazwiązkiem z komorki). Ma ograniczoną swoistosc. Wykrywa spokrewnione grupyzwiązkow,np.lipidy,aniescisleokreslone.Metodamisą:PAS(obojętnewielocukrowce),reakcjaFeulgena(wykrywaDNA),reakcjaFIF(aminybiogenne).

• Cytochemia enzymów -wykrywa aktywnosc enzymow. Produkty reakcji z enzymem sąbarwne i nierozpuszczalne. Swoistosc zalezy od swoistosci substancji i enzymu.Wykrywanie enzymatycznych znacznikow przeciwciał i lektyn. Częsciowa metodaimmunocytochemiiicytochemiilektyn;uzytecznawhistopatologii.

• Immunocytochemia

bardzo wysoka swoistosc wiązania antygenu z przeciwciałem (antygen jestrozpoznawanyprzezkonkretnącząsteczkęprzeciwciała).Komorkę lub tkankę inkubujesięwroztworachzawierającychprzeciwciałaskierowaneprzeciwwykrywanymbiałkom.Miejsce związania przeciwciała wyznacza lokalizację danego białka. Przeciwciała sąznakowane:fluorochromami-immunofluorescencja,enzymy-reakcjacytoenzymatyczna,metalecięzkie-np.Aukoloidalne.

Diagnostykahistopatologiczna,wykrywaniebiałekiprzeciwciał

• Cytochemialektyn

lektyny (grupa glikoprotein) mają zdolnosc swoistego wiązania się z okreslonymiresztamicukrowymi(Glc,Gal,Man,Nac).Znakowanelektynywykrywajągrupycukrowe.

• Hybrydocytochemia

wykrywanie DNA, RNA o okreslonej sekwencji nukleotydow. Wykorzystuje sięhybrydyzację kwasownukleinowych (łączeniekomplementarnych fragm.pojedynczychłancuchow kw. Nukleinowych pochodzących z roznych zrodeł = hybrydyzacja in situ).Wykrywany fragment kwasumusimiec znaną sekwencję nukleotydow. Syntetyzuje siętzw. sondę (odc DNA, RNA o sekwencji komplementarnej). Sondy znakuje się:fluorochromami, znacznikami antygenowymi, ktore są wykrywaneimmunocytochemicznie i izotopami promieniotworczymi; metody autoradiograficzne.Materiałpoddajesiędziałaniupodwyzszonejtemp.,abyzdenaturowackw.nukleinowewkomorce.Własciwahybrydyzacjatoinkubowaniekom.wroztworzesondy,wiązącejsięzwykrywanym odc. kwasu. Uwidacznianie znacznika sondy= reakcjaimmunocytochemiczna lub autoradiografia (metoda FISH). Wykrywanie konkretnychgenow lub ich fragmentow, okreslenie lokalizacji w chromosomach, badanie ekspresji

genow. Identyfikacja obcych kwasow nukleinowych w kom. tworzenie map genowych,diagnostykachorobdziedzicznychiwirusowych,nowotwory.StosujesiętakzePCR,abyzwielokrotnicbadanyodcinekkw.

• Znacznikiiwskaźnikiwprowadzanedokomórekfluorochromy,peroksydaza–wykrywaniekomunikacji międzykomorkowej, obserwacja, endocytoza (tzw. technika tropienia).Niektore substancje zmieniające intensywnosc zabarwienia w zaleznosci od stęzeniaCa2+,H+(tzw.wskaznikijonowe).

• Genetyczneznakowaniebiałek

Sb ledzenie znakowanych białek, mikroskopowa obserwacja procesowwewnątrzkomorkowychwczasierzeczywistym.Niskocząsteczkowe,zielonofluoryzującebiałko(GFP).Badaniacytoszkieletu,procesowprzepływubiałekwkomorce,sekwencje,przemieszczaniesięreceptorowicząsteczeksygnałowych.

• Autoradiografia

wykrywanieizotopowpromieniotworczych,wykorzystującichzdolnoscdozaczernianiaemulsji swiatłoczułych. Daje mozliwosc sledzenia procesow metabolicznych, dynamikipodziałowkom.,procesyroznicowaniakom.,wykrywanieznakowanychizotopamisondw hybrydocytochemii. Preparat pokrywa się cienką warstwą emulsji swiatłoczułej –izotopyztkankami/komorkipromieniują.Identyfikacjabiałekikwasownukleinowych.

• Cytometriaprzepływowa

ilosciowa ocena własciwosci fizycznych i chemicznych komorek, ktore pojedynczoprzepływająprzezmiejscepomiaru,przecinającwąskistrumienswiatła,ktorywywołujeswiecenie fluorochromow, jesli kom. były nim znakowane. Do badan uzywa sięodpowiednich zawiesin komorkowych, odczyty z kazdego pomiaru są rejestrowane,zliczane i analizowane statystycznie przez komputer. Nie nalezy do technikmikroskopowych,przygotowaniekom.dopomiarowcytometrycznychobejmujemetodycytochemiczneiimmunocytochemiczne.Cytometrprzepływowy-utworzeniezzawiesinykomorekwpłyniecienkiegostrumieniaabykom.mogłyprzepłynącwnimszeregowo.Promienswietlnyemitowanyprzezlaser,przecinającystrumienwywołujeefektywprzepływającychkom.,ktoresąrejestrowaneimierzoneprzezkilkaodrębnychdetektorow,wysyłającychodrębneimpulsyelektryczne;przekształcaneiprzetwarzaneprzezkomputer.Cytometrmozemiecsortownikkomorek,rozdzielającyniejednorodnepopulacjekom.na3groroznychwłasciwosciach.Badania:kształtu i rozmiaru kom., zawartosc DNA, ploidię, geny, białka i cukrowce,przepuszczalnoscbłon,aktywnoscreceptorow,wewnątrzkomorkowepH,stęzeniajonow.Diagnostyka rozrostowych chorob krwi, zaburzenia ukł. immunologicznego, ocenawłasciwoscikom.nowotworowych.

Elektronicznemetodyrejestracjiiprzekształcaniaobrazumikroskopowego.

Wideomikroskopia do badan dynamicznych procesow zachodzących w zywych komorkach, sąonerejestrowaneprzezkameręzespolonązmikroskopemswietlnym,następniezapisywane.Cyfrowaanalizaobrazudotyczystatycznychobrazowzmikroskopuswietlnegoielektronowegozapisanychnanosnikachpamięci.Badaniabiochemiczneimolekularnecelem badan za pomocą metod biochemicznych i molekularnych jest wyizolowanie z kom.substancji międzykomorkowej i okreslenie składu chemicznego komorki. Głownie dotyczy to:białek,kw.nukleinowych.

• Elektroforezabiałekikwasównukleinowych

elektroforezatozjawiskoporuszaniasięcząstekobdarzonychładunkiemwpoluelektrycznym.Rozdziałbiałekikwasownukleinowychdziękiroznejszybkosciwędrowkiwkierunkujednegozbiegunowpola.Kwasynukleinowe-elektroforezanazelachagarozowychbiałka – elektroforeza na zelu poliakrylamidowymwobecnosci dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE).Wywołujeon2 efekty: rozdzielenie kompleksowbiałkowychnapojedyncze cząsteczki,ktore są denaturowane, 2. poprzez przyłączenie się do aminokwasow takiego łancuchacząsteczki SDS nadają mu ładunek ujemny. Dzięki temu maskowany jest naturalny ładunek

białka,atempomigracjizalezyodmasycząsteczkowejbiałka.Największą efektywnosc rozdziału mieszaniny białek daje tzw. elektroforeza dwukierunkowa.Jest to ogniskowanie izoelektryczne (elektroforeza w gradiencie pH: zatrzymanie białka wmiejscugdziepH=pI).TakrozdzielonebiałkapoddajesięprocesowiSDS-Page.

• Identyfikacjarozdzielonychbiałekikwasównukleinowych

rozdzielone w elektroforezie białka i kwasy nukleinowe poddaje się tzw. blotting'owi(odciskanie). Zasadą wszystkich odmian metody jest: rozdzielone podczas elektroforezysubstancjeprzeniesczzelunabłonęnitrocelulozową,będącejpodłozemdokolejnejidentyfikacjiwykrywanego odcinka kwasu nukleinowego. Identyfikacje poprzez zanurzenie tej błony wroztworzezeznakowanymisubstancjami,swoiscierozpoznającewykrywanecząsteczki:

� Southernblotting–wykrywapojedyncze,krotkiełancuchyDNA� Northernblotting–wykrywaRNAzapomocąznakowanychsondnukleotydowych� Westernblotting–wykrywabiałka;stosujesięswoisteznakowaneprzeciwciała.

Bardzowysokaczułosc,identyfikacjaskrajniemałychilosciwykrywanychsubstancji.

• Łańcuchowareakcjapolimerazy

metoda PCR umozliwia namnozenie sladowych ilosci kwasow nukleinowych w celupozniejszejidentyfikacji.PrzeprowadzasięwielenastępującychposobiecyklisyntezyDNA:

� denaturacja–mieszaninępodgrzewasiędook.90C,podwojnahelisarozplatasię� przyłączanieprimerow–spontaniczne,zachodziwnieconizszejtemp.� elongacja – dobudowywana jest druga nic do matrycy. Stosuje się termostabilną

polimerazę DNA, pozyskaną np. z bakterii zyjących w gorących zrodłach, byprzetrwałacyklicznyetapdenaturacji.

Gdy badany jest RNA, wykorzystuje się zmodyfikowany wariant reakcji – RT-PCR. Dosrodowiskareakcjiwprowadzasięodwrotnątranskryptazę–syntetyzującąDNAnamatrycyRNA.PowstajełancuchDNAkomplementarnydoRNA,jestonpowielanyzuzyciemPCR.DoautomatycznegoprzeprowadzaniaPCRsłuzątzw.termocyklery.

• Metodypomiarustężeńiprzepływujonówprzypomocymikroelektrod

mikromanipulator przebija błonę komorkową mozna umiescic w cytoplazmie kom.mikroelektrodę zaopatrzoną w filtr selektywnie przepuszczający okreslone jony. Elektrodareagujenazmianęstęzeniajonow,umozliwiającpomiar.W technice „łatkowej” umozliwiającej badanie czynnosci pojedynczych kanałow jonowych.Elektrody są „tępo” zakonczone, nie przebijają błony, tylko przywierają do niej. Elektrodarejestrujeprzepływjonowprzezkanał,badaniezachowaniakanałujonowego.Bibliografia:KawiakJ.,ZabelM.:Seminariazcytofizjologii–podręcznikdlastudentówmedycyny,weterynarii ibiologii.

WydawnictwomedyczneUrban&Partner,Wrocław2002