Struktura a funkce buněčného jádraStruktura a funkce buněčného jádra

Mgr. Andrea BenedíkováMgr. Andrea Benedíková

MUDr. Josef SrovnalMUDr. Josef Srovnal

LaboratoLaboratořř experimentální medicíny experimentální medicíny DK DK LF UP a FN Olomouc LF UP a FN Olomouc

Cíle seminářeCíle semináře

• Seznámit posluchače se strukturou Seznámit posluchače se strukturou buněčného jádra a chromozómůbuněčného jádra a chromozómů

• Popsat hlavní funkci buněčného jádra – Popsat hlavní funkci buněčného jádra – replikace, transkripcereplikace, transkripce

• Poukázat na možnosti léčebného ovlivnění Poukázat na možnosti léčebného ovlivnění procesů na úrovni buněčného jádraprocesů na úrovni buněčného jádra

Prokaryota vs. EukaryotaProkaryota vs. Eukaryota

• Přítomnost x nepřítomnost jádra = základ pro třídění všech živých organismů

• eu = opravdu, karyon = jádro• pro = před

Buněčné jádroBuněčné jádro

Jádro lidské buňky:

• 5-8 μm v průměru

• 10% objemu buňky

• DNA 3x109 bp (haploid) (1 milion stran textu)

• celková délka DNA 2 m

• 2 x 23 chromosomů (od matky a otce)

• 23 tisíc genů

Struktura jádra

• jaderný obal • jaderné membrány• jaderné póry

• filamenta• jaderná matrix• chromatin• jadérko

Jaderný obal

Prokaryota vs. eukaryota

Proč obal?

• Ochrana DNA při aktivitě cytoskeletu

Jaderné póry

• složeny z složeny z proteinových proteinových podjednotekpodjednotek

• kanály naplněné kanály naplněné vodou – malé molekuly vodou – malé molekuly rozpustné ve voděrozpustné ve vodě

• větší molekuly – tzv. větší molekuly – tzv. jaderný lokalizační jaderný lokalizační signálsignál

Intermediární filamenta

• Nukleoskelet - komplexní struktura analogická cytoskeletu složená z jaderná laminy a několika typů filament nutných pro průběh replikace DNA, vazbu chromatinu a integritu jádra

• pevnost v tahu

• fce = vydržet mechanický stres

Jaderná matrix

• Eukaryontní chromosom – chromatin = komplex DNA + proteinůBakteriální chromosom – cirkulární molekula DNA

• Heterochromatin - trvale v kondenzovaném stavu• Euchromatin - v interfázi dekondenzován, v mitóze

kondenzován

Jadérko = nucleolus

• chromozomy s geny pro rRNA

• transkripce genů pro rRNA a tvorba ribozomálních podjednotek

Eukaryontní DNA je uspořádána do chromozomů.

Chromozom - dlouhá lineární DNA sbalená pomocí proteinů do složitějších struktur umožňujících snadné rozbalení a sbalení, čili úžasnou archivaci a zároveň rychlé čtení (milion stran textu v každé buňce).Struktura chromozomu se mění během buněčného cyklu (M-fáze – kondenzovaný, neaktivní, interfáze – dekondenzován, aktivní, transkripce).

Chromozomy

Chromozomy

• 2 kopie každého chromozomu = homologní chromozomy

• jediný nehomologní pár – pohlavní chromozomy samců (XY)

Struktura genu na chromozomu

• Regulační sekvence – vazba proteinů ovlivňujících transkripci

• Eukaryontní geny jsou přerušovány nekódujícími sekvencemi = introny

• Kódující sekvence = exony

• Intronové sekvence jsou z primárního RNA transkriptu vystřiženy (setřih RNA = RNA splicing). Vzniká molekula mRNA.

Struktura nukleozomu

• Nukleozom tvořen jádrem z osmi histonových molekul

obtočených DNA

• Nukleozomy spojeny spojníkovou DNA

• Každý nukleozom = 200 nukleotidových párů DNA

• Kolem jádra nukleozomu 2 neúplné otočky DNA =

146 nukleotidových párů

NukleozomNukleozom = základní jednotka kondenzace chromatinu = základní jednotka kondenzace chromatinu

Histony

• Malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin – vazba na negativně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA

• V jádře nukleozomu po dvou molekulách typy H2A, H2B, H3 a H4

• Histonů je v buňce značné množství (kolem 60 milionů molekul od každého typu v jedné buňce) a jejich celková hmotnost je přibližně stejná jako DNA samotné

Nukleozomy

• Nukleozom = nukleozomové jádro + sousední spojovací úsek DNA

• omotání DNA kolem nukleozomu – zkrácení molekuly DNA přibližně o 1/3 její původní délky

Chromatin – Chromatin –

30 nm silné vlákno 30 nm silné vlákno

Dekondezace –Dekondezace –

nukleozomy nukleozomy („korálky na niti“)(„korálky na niti“)

Kondenzace do 30-nm vlákna - histon H1

• Globulární jádro histonu H1 drží sousední nukleozomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání

Úrovně kondenzace chromatinu

• Předpokládané stupně kondenzace DNA vedoucí až ke struktuře vysoce kondenzovaných mitotických chromozomů

Funkce buněčného jádra

• replikace DNA

• transkripce

• processing, splicing RNA

• tvorba a transport ribosomálních podjednotek

• transport mRNA do cytosolu

Replikace

• Replikace – v S-fázi buněčného cyklu (synthesis)

• Zdvojení nejenom DNA, ale i histonů a jaderných proteinů

• Na konci S-fáze (8hodin) – dvě kopie chromozomu spojené centromerou

• laboratorní využití – metoda PCR

Replikace

• Vlákna DNA komplementární – obě slouží jako templát

• Replikace – vznik dvou nových dvojšroubovic DNA, které jsou věrnými kopiemi mateřské molekuly

Specializované sekvence DNA zajišťující účinnou replikaci chromozomů

• Každý chromozom má mnoho počátků replikace, jednu centromeru a dvě telomery

Replikační počátky

• DNA za normálních podmínek velmi stabilní – vodíkové můstky

• narušení – teplota okolo 100 °C• v buňce - iniciační proteiny

• speciální nukleotidové sekvence - rozpoznávány iniciačními proteiny a snadné oddělení řetězců (enzym DNA-helikáza)

• po navázání iniciačních proteinů na DNA a otevření dvojšroubovice se na replikační počátek váží proteiny spolupracující na syntéze nového vlákna

Replikační vidličky

• začátky replikace mají typický tvar Y – replikační vidličky

- navázány proteiny replikačního aparátu – pohyb ve směru replikace, rozvíjení dvojšroubovice za současné syntézy nového řetězce

DNA-polymeráza

• nejdůležitější enzym replikačního aparátu

• připojena k DNA pomocí speciálního proteinu, během replikace zůstává navázána na DNA a pohybuje se podél ní

• polymerační aktivita (5´-3´) - katalyzuje připojování nukleotidů na 3´-konec rostoucího řetězce DNA

• nukleázová aktivita (3´-5´) – štěpení nukleových kyselin při opravě špatně navázaného nukleotidu (korektura) (1 chyba na 107 navázaných nukleotidů)

Okazakiho fragmenty

• syntéza DNA pouze ve směru 5´-3´

• vedoucí a opožďující se řetězec

• Ve směru 3´-5´ prodlužována DNA diskontinuálně po krátkých úsecích = Okazakiho fragmenty

RNA jako primer pro syntézu DNA

• DNA-polymeráza schopna vázat nukleotid pouze na předchozí komplementární nukleotid (viz. korektura)

• Nutno enzym schopný spojit dva volné nukleotidy a začít syntetizovat nové vlákno podle jednořetězcové DNA

• Primáza – syntéza RNA = primer pro syntézu DNA – poskytne 3´-konec pro DNA-polymerázu

• RNA-primery nakonec odstraněny nukleázou a nahrazeny DNA pomocí DNA-polymerázy, úseky nakonec spojeny DNA-ligázou

Přehled enzymů účastnících se replikace

• DNA-helikáza – oddělování mateřských řetězců DNA

• Primáza – syntéza RNA jako primeru pro syntézu DNA

• DNA-polymeráza – syntéza DNA řetězce

• Nukleáza - štěpí primerovou RNA

• DNA-ligáza – spojení úseků DNA do jednoho řetězce

SSB-proteiny (Single-strand binding proteins)

• součást replikačního aparátu - proteiny vázající se na jednořetězcovou DNA a chránící ji (po rozpletení helikázou) před znovuspárováním

Svírací protein (Sliding clamp)

• Součást replikačního aparátu – pevně váže DNA-polymerázu na templát, na opožďujícím se řetězci ji navíc uvolňuje po dokončení syntézy každého Okazakiho fragmentu

Replikace

Transkripce

= přepis krátkého úseku DNA do RNA – vzniká RNA komplementární k jednomu řetězci DNA

• v některých krocích podobná replikaci

• další krok = translace (překlad) RNA – syntéza proteinů – probíhá na ribozomech

Transkripce

• Začíná jako replikace rozvolněním dvojšroubovice DNA - 1 z řetězců slouží jako templát

• Oproti nově vznikající DNA však nezůstává RNA spojena s templátovou DNA – po přidání nukleotidu dochází k obnovení dvojšroubovicové struktury DNA a vytěsnění vlákna RNA

RNA-polymeráza

• přepis DNA do RNA

• opět 5´-3´ polymerační aktivita

• nemá 3´-5´ nukleázovou aktivitu – neschopna oprav – transkripce méně přesná než replikace (1 chyba na 104 přepsaných nukleotidů) – RNA není určena jako DNA k trvalému uchování genetické informace

Posttranskripční úpravy (RNA processing)

• Bakterie – DNA volně v cytoplazmě, zde i ribozomy• Eukaryontní DNA – v jádře, transkripce probíhá v jádře –

RNA poté transportována z jádra do cytoplazmy jadernými póry

• před opuštěním jádra - posttranskripční úpravy primárního transkriptu– přidání čepičky– polyadenylace

- vystřiženy introny = sestřih RNA (RNA splicing)

Léčiva směřující do buněčného jádra

• Inhibice biosyntézy NK – analoga

• Poškození struktury a funkce NK – alkylace, interkalace, inhibice topoizomeráz

• Alterace mikrotubulárních proteinů

Léčiva ovlivňující dělení buněk:

Cytostatika, imunosupresiva, antivirotika

Inhibice biosyntézy NK - analoga

Analoga: aktivována a inkorporována do NK – zástava replikace, transkripce, nesprávný kód

Indikace: nejčastěji hematologické malignity

Dělíme na:

• Analoga kyseliny listové

• Purinová analoga

• Pyrimidinová analoga

Poškození struktury a funkce NK

Účinek: poškození struktury a funkce NK má za následek inhibici replikace a transkripce.

Indikace: nejčastější cytostatika, solidní tumory

Dělíme dle mechanismu poškození NK na: • alkylace – kovalentní vazba• interkalace – nekovalentní vazba• inhibice topoizomeráz (topoizomerázy jsou nukleární enzymy

důležité pro replikaci – riziko překroucení dvojšroubovice a vznik zlomů)

Alterace mikrotubulárního proteinu

Mitotické jedy – alterace mikrotubulů poškodí funkci dělícího vřeténka – omezená migrace chromosomů při mitóze. Většina omezuje syntézu tubulinu.

Polymerizace – v rovnováze s - depolymerizaci

• Inhibitory polymerizace – inhibice syntézy

• Inhibitory depolymerizace – inhibice rozpadu

Úvod do mÚvod do moleolekulární biologiekulární biologieStanislav Rosypal, 4. vydání, 2006Stanislav Rosypal, 4. vydání, 2006

Molecular Biology of the CellMolecular Biology of the Cell, , Fourth EditionFourth Edition Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter 28/02/2002 28/02/2002 1616 pages 1616 pages

Přednáška volně ke stažení na: Přednáška volně ke stažení na: www.lem.ocol.czwww.lem.ocol.cz

Děkuji za pozornost

Mgr. Andrea Benedíková

Laboratoř experimentální medicíny DK FN a LF UP Olomouc

Tel: +420 585 853 225

Email: benedikova.andrea@seznam.cz

www.lem.ocol.cz