KOLESTEROL TOTAL
Kolesterol adalah komponen dari membran sel dan merupakan
prekursor untuk hormon steroid dan asam empedu yang disintesis oleh
sel-sel tubuh dan diserap dengan makanan [1].Kolesterol diangkut
dalam plasma melalui lipoprotein, yaitu kompleks antara lipid dan
apolipoproteins [1]. Ada empat kelas lipoprotein: lipoprotein
densitas tinggi (HDL), lipoprotein densitas rendah (LDL),
lipoprotein densitas sangat rendah (VDRL) dan kilomikron. Sementara
LDL terlibat dalam transportasi kolesterol ke sel perifer, HDL
bertanggung jawab atas penyerapan kolesterol dari sel. Empat kelas
lipoprotein yang berbeda menunjukkan hubungan yang berbeda untuk
aterosklerosis koroner [1]. LDL-kolesterol (LDL-C) memberikan
kontribusi untuk pembentukan plak aterosklerotik dalam arteri
intima dan sangat terkait dengan penyakit jantung koroner (PJK) dan
mortalitas. Bahkan dengan kolesterol total dalam kisaran normal
peningkatan konsentrasi LDL-C menunjukkan risiko tinggi. HDL-C
memiliki efek menghambat pembentukan plak pelindung dan menunjukkan
hubungan terbalik dengan prevalensi PJK. Bahkan, HDL-C nilai-nilai
rendah merupakan faktor risiko independen. Penentuan tingkat total
cholesteroI (TC) individu digunakan untuk tujuan skrining sedangkan
untuk penilaian risiko yang lebih baik itu perlu untuk mengukur
tambahan HDL-C dan LDL-C. Dalam beberapa tahun terakhir beberapa
uji klinis terkontrol menggunakan diet, perubahan gaya hidup dan /
atau obat yang berbeda (terutama inhibitor HMG CoA reductase
[statin]) telah menunjukkan bahwa menurunkan kolesterol total dan
LDL-C mengurangi tingkat risiko PJK drastis [2].
Metode 'Chod-PAP': tes fotometrik enzimatik
Prinsip Penentuan kolesterol setelah hidrolisis dan oksidasi
enzimatik [3,4]. Indikator kolorimetri adalah quinoneimine yang
dihasilkan dari 4-aminoantipyrine dan fenol oleh hidrogen peroksida
dibawah aksi katalitik dari peroksidase (reaksi Trinders) [3].
CHE Cholesterol ester + H2O Cholesterol + Fatty acid CHO
Cholesterol + O2 Cholesterol-3-one + H2O2 POD 2H2O2 +
4-Aminoantipyrine + Phenol Quinoneimine + 4H2O
Reagen Goods buffer pH 6,7 Fenol 4-Aminoantipyrine Kolesterol
esterase (CHE) Kolesterol oksidase (CHO) Peroksidase (POD) Standar
50 mmol / L 5 mmol / L 0,3 mmol / L 200 U / L 50 U / L 3 kU / L 200
mg / dL (5,2 mmol / L)
Instruksi Penyimpanan dan Stabilitas Reagen Reagen stabil sampai
dengan akhir bulan yang ditunjukkan kadaluwarsa, jika disimpan di
2-8OC, dilindungi dari cahaya dan menghindari kontaminasi. Jangan
membekukan reagen! Standar ini stabil sampai akhir bulan
ditunjukkan kadaluwarsa, jika disimpan pada 2-25OC. Catatan: Ini
harus disebutkan, bahwa pengukuran tidak dipengaruhi oleh perubahan
warna yang kadang-kadang terjadi, selama absorbansi reagen adalah
< 0,3 pada 546 nm.
Peringatan dan Tindakan Pencegahan 1. Pereaksi berisi natrium
azida (0,95 g/L) sebagai bahan pengawet. Jangan menelan! Hindari
kontak dengan kulit dan selaput lendir. 2. Mengambil tindakan yang
diperlukan untuk penggunaan reagen laboratorium.
Spesimen Serum, plasma heparin atau plasma EDTA. Stabilitas: 7
hari pada 20 - 25OC
7 hari pada 4 - 8OC 3 bulan pada - 20OC
Prosedur Assay Blank Sample or standard Distilled water Reagent
10 uL 1000 uL Sample or Standard 10 uL 1000 uL
Campurkan, inkubasi selama 20 menit pada 20-25OC atau selama 10
menit pada 37OC. Baca absorbansi dalam waktu 60 menit untuk reagen
blanko.
Perhitungan Dengan standar atau kalibrator A Sampel Kolesterol
[mg / dL] = ---------------- x konsentrasi Std/Cal [mg / dL] A
std/cal
Faktor Konversi Kolesterol [mg/dL] x 0,02586 = Kolesterol [mmol
/ L]
Karakteristik Kinerja Mengukur range Tes telah dilakukan untuk
menentukan konsentrasi kolesterol dalam rentang pengukuran 3-750
mg/dL (0,08-19,4 mmol / L). Ketika nilai-nilai range berlebih
sampel harus diencerkan 1 + 4 dengan larutan NaCl (9 g/L) dan
hasilnya dikalikan dengan 5.
Spesifisitas / gangguan
Tidak ada gangguan yang terlihat oleh asam askorbat hingga 5
mg/dL, bilirubin hingga 20 mg/dL, hemoglobin sampai 200 mg/dL dan
lipemia hingga 2.000 mg/dL trigliserida.
Sensitivitas / batas deteksi Batas bawah deteksi adalah 3 mg/dL
(0,08 mmol/L).
Referensi range [5] Diinginkan Batas berisiko tinggi Resiko
tinggi 200 mg / dL (5,2 mmol / L) 200-240 mg / dL (5,2-6,2 mmol /
L) > 240 mg / dL (> 6,2 mmol / L)
Interpretasi klinis Gugus Tugas Pencegahan Koroner Eropa
merekomendasikan untuk menurunkan konsentrasi TC untuk kurang dari
190 mg/dL (5,0 mmol/L) dan LDL-kolesterol untuk kurang dari 115
mg/dL (3,0 mmol/L) [2]
HDL-KOLESTEROL (CHOD-PAP METODE)
Nilai kolesterol total adalah pengukuran dari semua kolesterol
dan ester kolesterol di semua lipoprotein yang diambil secara
bersama-sama. Kolesterol HDL biasanya diukur dalam sampel dari mana
LDL dan VLDL telah dihilangkan. Kolesterol dan kolesterol ester
yang tersisa dalam HDL. Kolesterol HDL diuji menggunakan reaksi
enzimatik yang sama seperti yang digunakan untuk kuantisasi
kolesterol total. Sebuah jumlah yang diabaikan kolesterol dalam
kilomikron tidak mempengaruhi total atau nilai HDL kolesterol.
Untuk mengisolasi lipoprotein untuk kuantisasi berikutnya komponen
lipoprotein, seperti kolesterol, ultrasentrifugasi telah menjadi
standar emas
dibandingkan dengan metode yang lain.
Reagen Reagen pengendap (1,4 mmol/L asam phosphotungstic, 8,6
mmol/L magnesium klorida), 250 mL. Penyimpanan antara +15C dan +25C
sampai tanggal kadaluwarsa.
Persiapan 1. Reagen pengendap Reagen pengendapan siap untuk
digunakan 2. Reaksi solusi untuk penentuan kolesterol Siapkan
menurut daftar kerja untuk Kolesterol
Sampel bahan Serum HDL-Kolesterol dalam serum stabil selama 7
hari bila disimpan antara +15OC dan +25OC, dan 14 hari bila
disimpan antara +2OC dan +8C.
Prosedur A. Pengendapan: Pipet ke tabung sentrifuge:
Sample Reagent pengendap
200 uL 500 uL
Aduk rata dan inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian
centrifuge selama 5 menit pada 5000g. Dalam waktu 2 jam setelah
sentrifugasi pindahkan 0,1 mL supernatan untuk larutan reaksi untuk
penentuan kolesterol dengan metode CHOD-PAP.
B. Pengukuran Fotometrik Panjang gelombang: 500 nm, 546 nm
Sample Supernatant Water Reaction solution 0.1 mL 1.0 mL Reagent
blank 0.1 mL 1.0 mL
Aduk rata dan inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar atau 5
menit pada +37C. Kemudian mengukur absorbansi A terhadap nilai
blanko. Absorbansi tetap stabil selama 45 menit.
Perhitungan HDL-ChoIesterol concentration = A x F 500 nm
CHOD-PAP Prod. No. 1.14366.,1.14165.-67 F [mg/dL] 222 F [mmol/dL]
5.74 546 nm F [mg/dL] 318 F [mmol/dL] 8.22
Catatan: Supernatan setelah sentrifugasi harus solusi yang
jelas. Sera dengan kandungan trigliserida lebih dari 1000 mg/dl
cenderung supernatan keruh atau flotating presipitat.Dalam kasus
ini predilution sampel dengan volume yang sama larutan natrium
klorida fisiologis (9 g/L = 154 mmol/L) diikuti oleh presipitasi
prosedur yang dianjurkan. Kalikan hasilnya dengan 2.
KOLESTEROL LDL
Metode untuk pengukuran LDL didasarkan pada asumsi bahwa
kolesterol total adalah terutama terdiri dari kolesterol yang
ditemukan dalam VLDL, LDL, dan HDL. Kolesterol LDL dapat dihitung
dari diukur secara langsung. Untuk menghitung kolesterol LDL,
trigliserida serum atau plasma, kolesterol total, dan kolesterol
HDL harus ditentukan, dan kolesterol LDL dihitung dengan
menggunakan persamaan yang dirumuskan oleh Friedewald: (LDL
kolesterol) = (kolesterol total) - (kolesterol HDL) -
(trigliserida) / 5 Konsentrasi dinyatakan dalam mg/dL. Trigliserida
dibagi dengan 2,22 harus digunakan jika hasilnya dinyatakan dalam
mmol/L. Trigliserida dibagi 5 adalah perkiraan rata-rata rasio
trigliserida untuk kolesterol dalam VLDL. Persamaan Friedewald
dapat digunakan dalam banyak kasus untuk menentukan kolesterol LDL,
tetapi tidak boleh digunakan untuk sampel dengan konsentrasi
trigliserida lebih dari 400 mg/dL. Sampel ini biasanya juga
mengandung sisa-sisa kilomikron dan chylomicron di mana
trigIyceride-ke-choIesteroI rasio lebih tinggi daripada di VLDL.
Tipe lain dari kesalahan mungkin terjadi pada pasien dengan
hyperlipoproteinemia tipe III, karena adanya B-VLDL. B-VLDL, yang
biasanya tidak terjadi dalam darah, mengandung kolesterol secara
signifikan lebih dari VLDL normal dan memiliki rasio
trigliserida-ke-kolesterol hanya 3: 1. Jadi, dengan menggunakan
persamaan Friedewald, kolesterol VLDL akan menurun dan kolesterol
LDL yang berlebihan pada pasien. Metode direct juga tersedia untuk
pengukuran kolesterol LDL. Tes ini biasanya langsung menggunakan
antibodi spesifik untuk mempercepat apolipoproteins dalam VLDL,
IDL, dan HDL. Konsentrasi kolesterol LDL diukur secara langsung
dalam supernatan. Dalam salah satu versi dari metode ini, antibodi
yang digabungkan untuk lateks. Antibodi pada manik-manik lateks
mengikat VLDL dan HDL, dan kompleks dihilangkan dengan filtrasi
sentrifugal. Manik-bebas filtrat harus berisi hanya
LDL. Konsentrasi kolesterol LDL diukur dalam larutan dengan
metode enzimatik. Dalam metode lain, LDL diendapkan dengan
polivinil sulfat atau heparin sulfat. Dalam tes, kolesterol LDL
dalam chlolesterol total dalam endapan dihitung sebagai perbedaan
antara konsentrasi kolesterol total dan kolesterol dalam
supernatan.Kebanyakan penelitian menunjukkan bahwa metode langsung
berguna dan
klinis, tapi beberapa tes memerlukan validasi lebih lanjut.
Keterbatasan lain dari metode presipitasi adalah bahwa mereka tidak
dapat digunakan pada frozen plasma atau serum. Untuk kuantisasi
kolesterol LDL dihitung, pasien harus puasa, karena kolesterol LDL
ditentukan dengan menggunakan persamaan yang mencakup tingkat
trigliserida konsumsi lemak makanan terakhir. Tes yang mengukur LDL
secara langsung menghindari kebutuhan untuk puasa. Namun, LDL tetap
dihitung cara yang paling populer pengukuran LDL pada saat ini.
Tidak seperti kolesterol LDL pengukuran dapat dilakukan pada
spesimen nonfasting karena asupan lemak didominasi trigliserida,
bukan kolesterol.Trigliserida biasanya tertelan dalam jumlah gram,
dengan jumlah miligram tertelan dalam jumlah gram, dengan jumlah
miligram kolesterol tertelan. Trigliserida melebihi 400 mg / dL
mengganggu penentuan kolesterol LDL.
TRIGLISERIDA
Trigliserida adalah ester dari gliserol dengan tiga asam lemak
dan merupakan lipid alami yang paling berlimpah. Mereka diangkut
dalam plasma terikat untuk membentuk apolipoproteins lipoprotein
density sangat rendah (VLDL) dan kilomikron. Pengukuran
trigliserida digunakan dalam penyaringan status lipid untuk
mendeteksi risiko aterosklerosis dan dalam pemantauan tindakan
penurunan lipid. Studi terbaru menunjukkan bahwa konsentrasi
trigliserida dikombinasikan dengan peningkatan konsentrasi
lipoprotein density rendah (LDL) merupakan suatu risiko tinggi
untuk penyakit jantung koroner (PJK). Kadar trigliserida tinggi
juga terjadi pada berbagai penyakit hati; ginjal dan pankreas.
Trigliserida serum atau plasma diukur dengan kuantisasi
trigliserida di semua lipoprotein yang diambil secara bersama-sama.
Pengukuran ini secara substansial dipengaruhi oleh konsumsi lemak
makanan. Pengukuran yang akurat dari konsentrasi trigliserida serum
dasar hanya dapat diperoleh bila pasien telah berpuasa 12 sampai 14
jam. Langkah pertama dari metode referensi adalah ekstraksi
kloroform trigliserida dari serum untuk menghilangkan zat air
campur larut seperti glukosa dan gliserol. Pada langkah berikutnya,
asam silikat ditambahkan untuk mengekstrak untuk menghapus
fosfolipid, dan trigliserida yang dihidrolisis dengan KOH untuk
menghasilkan gliserol dan asam lemak.Gliserol kemudian teroksidasi
menjadi formaldehida, yang membentuk produk berwarna dengan asam
chromotropic. Produk ini dapat diukur dengan kolorimetri pada 570
nm. Dalam metode rutin, trigliserida dalam plasma atau serum diukur
enzimatis. Gabungan reagen yang tersedia yang mengandung semua
enzim, buffer, dan kofaktor yang dibutuhkan untuk pengujian
tersebut. Reagen ini dioptimalkan untuk sistem analisis dari
produsen. Dalam sebagian besar kit reagen, langkah pertama yang
umum adalah lipase-dimediasi reagen kit ini, langkah pertama yang
umum adalah hidrolisis lipasedimediasi trigliserida untuk gliserol
dan asam lemak: Lipase 1 triglyceride + 3H2O 1 glycerol + 3 fatty
acid. Gliserol selanjutnya terfosforilasi oleh glycerokinase untuk
glycerophosphate, menggunakan ATP. Dalam metode yang paling, untuk
dihidroksiaseton dan H202. H2O2
kemudian diukur dengan metode standar, seperti kondensasi
dimediasi peroksidase Netil-N (2-hidroksi-3-suIfopropyl)
-3,5-dimethoxy-4-fluoroanaline dan 4-aminoantipyrine, menghasilkan
reaksi dan warna NAD biru . Metode untuk lain menggunakan fosfat
dehidrogenase dan
glycerophosphate
menghasilkan
dihidroksiaseton
NADH.NADH ditentukan secara spektrofotometri pada 340 nm atau
dalam reaksi dikatalisis oleh diaphorase memproduksi formazan dari
pewarna tetrazolium menggunakan NADH. Formazan dapat diukur pada
500 nm. Metode enzimatik trigliserida tidak mengukur fosfolipid
atau gula dan linier sampai konsentrasi 700 mg / dL. Metode ini
sangat cocok untuk otomatisasi. Gliserol bebas, namun akan
memberikan kontribusi jumlah total trigliserida diukur. Gliserol
konsentrasi dalam serum atau plasma segar biasanya tidak melebihi
100 mg/dL. Gliserol tingkat meningkat 50 sampai 100 kali lipat
dalam hyperglycerolemia, gangguan langka dikaitkan dengan enzim
glycerokinase cacat atau dencient. Gliserol bebas dapat diukur
seperti yang dijelaskan dalam uji untuk trigliserida (lihat
sebelumnya), dengan penghilangan langkah lipase awal.
Metode Tes enzimatik kolorimetri menggunakan
gliserol-3-fosfat-oksidase (GPO).
Prinsip Tentukan trigliserida setelah pemisahan enzimatik dengan
lipoprotein lipase. Indikator quinoneimine yang dihasilkan dari
4-aminoantipyrine dan 4-chlorophenol oleh hidrogen peroksida bawah
aksi katalitik dari peroksidase. LPL Triglycerides Glycerol + Fatty
acid GK Glycerol + ATP Dihydroxyaceton phosphate + H2O2 GPO
Glycerol-3-phosphate + O2 Dihydroxyaceton phosphate + H2O2 POD 2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4-Chlorophe Ineimine + HCL + 4H2O
Reagen: Goods buffer 4-chlorophenol ATP Mg2+ Glycerokinase (GK)
Peroksidase (POD) Lipoprotein lipase (LPL) 4-Aminoantipyrine
Gliserol-3-fosfat-oksidase Standar: pH 7,2 50 mmol / L 4 mmol / L 2
mmol / L 15 mmol / L 0,4 kU / L 2 kU / L 2 kU / L 0,5 mmol / L
(GPO) 2 kU / L 200 mg / dL (2,3 mmol / L)
Instruksi Penyimpanan dan Stabilitas Reagen Reagen dan standar
yang stabil sampai dengan akhir bulan yang ditunjukkan kadaluwarsa,
jika disimpan pada 2-8C, terlindung dari cahaya dan kontaminasi
menghindari. Jangan membekukan reagen! Catatan: Ini harus
disebutkan, bahwa pengukuran tidak dipengaruhi oleh perubahan warna
yang kadang-kadang terjadi, selama absorbansi reagen adalah 180
mg/dL (>2,0 mmol/L) dan HDL-kolesterol 200 mg/dL) harus selalu
dianggap dalam hubungan dengan faktor risiko lain untuk penyakit
jantung koroner.
