tổng hợp tạp meloxicam

1

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc thành phẩm, ngoài vấn đề nghiên cứu tác dụng

dược lý của các hoạt chất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo sát các tác dụng

dược lý của các tạp chất có thể phát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm do

nguyên liệu đầu vào còn lẫn tạp hoặc tạp chất phân hủy phát sinh trong quá trình

sản xuất và lưu hành. Đối với các thuốc ung thư, tim mạch, kháng sinh, đái tháo

đường, kháng viêm non-steroid, … hoặc các thuốc có ngưỡng trị tiệu thấp thì với

một sự thay đổi nhỏ hàm lượng hoạt chất chính hoặc có tạp chất phát sinh có thể sẽ

thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc hoặc gây các tác dụng

khác nhau với hậu quả không lường trước được. Hơn nữa, việc sử dụng thuốc

generic (thuốc hết hạn bảo hộ quyền sở hữu) cho bệnh nhân để giảm chi phí điều trị

đòi hỏi các cơ quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng và hiệu quả

của thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt là hàm lượng hoạt chất và tạp chất phân hủy.

Ví dụ: tạp chất trong thuốc trung hòa acid dạ dạy Rolaid gây nôn mửa, tổn thương

răng, lợi…được bệnh nhân phản ánh.

Hiện nay, vấn đề khảo sát và tổng hợp các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và

thành phẩm tương ứng chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam. Mặt khác, một số

tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và phải mua từ nước

ngoài. Trong khi đó, một số chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV có qui định

kiểm tra tạp chất liên quan trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng như

meloxicam, metformin, …. Do đó, việc nghiên cứu tổng hợp và tiêu chuẩn hóa các

tạp chất sẽ góp phần tăng cường công tác kiểm tra chất lượng thuốc, giúp giảm bớt

chi phí mua tạp chuẩn từ nước ngoài. Vì vậy, đề tài “Điều chế và tiêu chuẩn hóa

hai tạp chất liên quan 5-methylthiazol-2-ylamin và N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-

thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-

dioxyd của meloxicam” được thực hiện với mong muốn điều chế và tiêu chuẩn hóa

hai tạp chất liên quan của meloxicam để ứng dụng vào việc kiểm tra nguyên liệu và

thành phẩm chứa hoạt chất này.

2

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tạp chất liên quan của meloxicam

1.1.1. Qui định tạp chất liên quan theo một số đi

1.1.1.1. Dược điển Việt Nam IV [3]

Quy định 3 tạp chính có thể có trong meloxicam:

- Tạp A: Ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1-

dioxyd.

- Tạp B: 5-methylthiazol-2-ylamin.

- Tạp C: 4-hydroxy-2-methyl-N-ethyl-N’-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-2H-1,2-

benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

1.1.1.2. Dược điển Anh 2010 [8]

Quy định 5 tạp chính có thể có trong meloxicam, đó là các tạp A, B, C, D, E, trong

đó hai tạp A và B giống với quy định của Dược điển Việt Nam IV.

3

- Tạp C: N-[(2Z)-3,5-dimethyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-

2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

- Tạp D: N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-

methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

- Tạp E: Methyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1-

dioxyd.

1.1.1.3. Dược điển Mỹ 2009 [23]

Quy định 4 tạp chính có thể có trong meloxicam, đó là các tạp A, B, C, D, trong đó

hai tạp A và B giống với quy định của Dược điển Việt Nam IV.

4

- Tạp C: Isopropyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-

1,1-dioxyd.

- Tạp D: 4-methoxy-2-methyl-(5-methyl-1,3-thiazol-2yl)-2H-1,2-benzothiazin

-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

1.1.2. u i ạ

1.1.2.1. Các nguyên nhân có thể phát sinh tạp

Tạp chất có thể xuất hiện trong quá trình sản xuất, tinh chế, đóng gói sản phẩm hoặc

khi sản phẩm đã được lưu hành trên thị trường. Tạp chất xuất hiện ở giai đoạn tổng

hợp là các nguyên liệu ban đầu còn tồn dư khi cho vào phản ứng. Đây là các tạp

chất điển hình được lưu ý nhiều nhất khi kiểm tra độ tinh khiết của một hoạt chất,

cần phải dựa vào đặc tính lý hóa của các chất và các thiết bị dụng cụ để tách sản

phẩm tổng hợp. Ngoài ra, các tạp chất có thể có nguồn gốc từ nguyên liệu ban đầu

do nguyên liệu ban đầu chưa được tinh khiết.

Trong quá trình tinh chế sản phẩm sau khi tổng hợp cũng không tránh khỏi hiện

tượng các hóa chất dùng để tinh chế bị lẫn vào trong sản phẩm, do đó việc chọn lựa

phương pháp tinh chế thích hợp để làm sạch sản phẩm cũng là một quá trình phức

tạp đòi hỏi nhiều kiến thức và kỹ năng.

Sau khi sản phẩm được lưu hành trên thị trường, do tác động của môi trường bên

ngoài như sự va đập, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… thì các hoạt chất chính của sản

5

Kiềm

phẩm cũng có thể bị phân hủy dẫn đến phát sinh một số tạp chất, các tạp chất này

được gọi là tạp chất phân hủy. Hiện nay, với phương pháp lão hóa cấp tốc có thể dự

đoán được một số tạp chất phân hủy để từ đó có phương pháp bảo quản thích hợp.

1.1.2.2. Quy trình tổng hợp meloxicam

Theo Tibor Mezei và cộng sự [21], sơ đồ tổng hợp meloxicam như sau:

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp meloxicam của Tibor Mezei và cộng sự

(1) R = CH3 : Methyl-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1-

dioxyd (tạp E – Dược điển Anh).

R = C2H5 : Ethyl-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1-

dioxyd (tạp A).

(2) 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B).

(3) 4-hydroxy-N-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-

1,1-dioxyd.

(4) R = CH3: N-[(2Z)-3,5-dimethyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-

2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp C – Dược điển Anh)

R = C2H5: N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-

methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp D – Dược điển

Anh).

6

Ngoài ra còn có qui trình tổng hợp của meloxicam theo Gunter Trummlitz và cộng

sự với bằng sáng chế US Patent 4,233,299 [22] và theo Joseph G. Lombardino và

cộng sự với bằng sáng chế US Patent 3591584 7/17 [19].

1.1.2.3. Nguyên nhân phát sinh tạp chất của meloxicam

Từ hình 1.1 cho thấy tạp chất A và tạp chất B (theo quy định của Dược điển các

nước) là thành phần chính trong quá trình tổng hợp meloxicam, vì vậy trong quá

trình kết tinh và tinh chế có thể còn lẫn một lượng nhỏ hai thành phần này. Đặc biệt,

tạp chất B còn có thể xuất hiện do sự thủy phân meloxicam ở nối amid khi điều kiện

môi trường thích hợp.

Ttạp chất C, D (theo quy định của Dược điển Anh 2010) có thể xuất hiện trong quá

trình tổng hợp meloxicam theo cả hai đường (hình 1.1). Các tạp chất này có thể

được giải thích là do tác nhân alcol mới sinh phản ứng tạo thành tạp chất khi điều

kiện xúc tác thích hợp. [24]

1.1.2.4. Độc tính [11][12]

Các tạp chất meloxicam gây độc tính nếu nuốt phải, gây dị ứng khi tiếp xúc, có thể

gây chóng mặt, ngủ gà ngủ gật, hôn mê, suy thận cấp, bất thường chức năng gan,

suy giảm chức năng hô hấp. Các tạp này có hại với các loài sống dưới nước, có thể

là nguyên nhân gây tác hại lâu dài cho môi trường nước và có thể nguy hiểm cho trẻ

trong bụng mẹ.

1.1.3. Tạ ấ B (5-Methylthiazol-2-ylamin )

1.1.3.1. Công thức, tên khoa học

Công thức phân tử: C4H6N2S

hối lượng phân tử: 114,17 g/mol.

Danh pháp I AC: 5-methyl-2-thiazolamin.

Danh pháp thông thường: 5-methylthiazol-2-ylamin hay 2-amino-5-methylthiazol

1.1.3.2. nh chất l – hóa

Dạng bột màu kem đến màu nâu, bền ở điều kiện thường, có mùi hôi đặc trưng của

nhóm amin. Tan trong methanol, cloroform. Nhiệt độ nóng chảy: 92-96 °C.

1.1.3.3. Giới hạn cho phép

7

a. Trong nguyên liệu meloxicam

Theo chuyên luận meloxicam của Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn cho phép

của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá 0,3%,

trong đó tạp chất B không được quá 0,1%.

Dược điển Anh 2010 [8] và Dược điển Mỹ 2009 [23] cũng quy định tổng phần trăm

tất cả các tạp không được quá 0,3%, trong đó tạp chất B không được quá 0,1%, qui

định giới hạn cho phép của tạp chất B tương tự như Dược điển Việt Nam IV.

b. Trong chế phẩm chứa meloxicam

Theo chuyên luận viên n n meloxicam của Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn

cho phép của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá

, trong đó tạp B không được quá 0,15%.

1.1.3.4. Phương pháp tổng hợp tạp chất B

Theo Arthur I.Vogel [6] -amino- -methylthia ol được tổng hợp từ phản ứng đóng

vòng của thioure và monocloroaceton ]. Trong đó, cloroaceton được tổng hợp

bằng phản ứng clor hóa aceton ở nhiệt độ thấp. Cloroaceton công nghiệp được cất

lại trước khi sử dụng cho phản ứng tổng hợp, nhiệt độ sôi 118-120 °C.

Quy trình tổng hợp như sau: phân tán g thioure trong ml nước cất bằng máy

khuấy từ, đun hồi lưu và thêm từ từ , g ( ml) monocloroaceton trong khoảng

hơn phút. Trong quá trình phản ứng thioure tan và sinh nhiệt. Đun hồi lưu dung

dịch màu vàng trong giờ, sau đó làm lạnh trong nước đá, khuấy đều, thêm g

bột natri hydroxyd. Chuyển vào bình lắng gạn, thêm một ít nước đá, thu lớp dầu

phía trên và chiết lớp nước với ml ether x lần. Làm khan lớp dầu và dịch chiết

ether bằng magnesi sulphat khan. Làm bay hơi ether bằng bếp cách thủy và cất dầu

tồn dư dưới áp suất giảm. 2-amino-5-methylthia ol thu được ở 130- °C dưới áp

suất mmHg, sau đó được làm lạnh trong nước đá để kết tinh thành dạng rắn.

8

Theo bằng sáng chế số PCT/JP99/05895 [25], -amino- -methylthia ol được tổng

hợp từ phản ứng đóng vòng của thioure và -cloropropionaldehyd. Trong đó

-cloropropionaldehyd được điều chế từ phản ứng clor hóa propionaldehyd bằng

khí clor trong điều kiện thích hợp.

Trong một nghiên cứu cải tiến phương pháp tổng hợp -amino- -methylthia ol từ

n-propanol bằng phản ứng oxy hóa và clor hóa với acid hypoclorơ (mới sinh khi

cho khí clor phản ứng với nước), sau đó phản ứng đóng vòng với thioure cho hiệu

suất toàn phần 55%. [27]

1.1.3.5. Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo DĐVN IV [3]

Phương pháp: Sắc ký lỏng.

Pha động A: Dung dịch kali dihydro phosphat , , đã được điều chỉnh đến pH

6,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 8,5%.

Pha động B: Methanol.

Dung dịch thử: Pha dung dịch chế phẩm có nồng độ 0,4% trong một hỗn hợp

methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3). Pha loãng 2 lần dung dịch

này bằng methanol 40%.

Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1 thể tích dung dịch thử thành 100 thể tích bằng

methanol 40%. Pha loãng 1 thể tích dung dịch này thành 10 thể tích bằng methanol

40%.

Dung dịch đối chiếu (2): Pha dung dịch tạp chất chuẩn của meloxicam có nồng độ

0,4% trong một hỗn hợp methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3).

Pha loãng 2 lần dung dịch này bằng methanol 40%.

9

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), cột Inertsil ODS-2 là phù

hợp. Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm. Thể tích tiêm:

10 µl.

Tiến hành sắc ký theo chương trình ở bảng 1.1

Bảng 1.1. Chương trình dung môi kiểm tạp chất B của meloxicam theo Dược điển

Việt Nam IV.

Thời gian

(phút)

ha động A

% (tt/tt)

Pha động B

% (tt/tt)

0 60 40

2,5 60 40

12 30 70

Tiêm lần lượt các dung dịch đối chiếu (2), (1) và dung dịch thử. Tiến hành sắc ký

với khoảng thời gian phút, đối với dung dịch thử khoảng 20 phút hoặc đến khi

tạp C được rửa giải. Phép thử chỉ có hiệu lực khi dung dịch đối chiếu (2) cho sắc ký

đồ giống với sắc ký đồ đối chiếu được cung cấp cùng với tạp chất B của meloxicam

chuẩn.

Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử ở bước sóng 260 nm, diện tích pic

của pic tương ứng với pic của tạp chất B không được lớn hơn diện tích của pic thu

được trên sắc đồ của dung dịch đối chiếu (1) ở bước sóng 350 nm (0,1%).

1.1.3.6. Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Anh 2010


Pha động A: Dung dịch kali dihydrophosphat g/l đã được điều chỉnh đến pH 6,0

bằng dung dịch natri hydroxyd 1 M.

Pha động B: Methanol.

Dung dịch thử: hòa tan 40 mg chất cần kiểm tra vào hỗn hợp 5 ml methanol và 0,3

ml natri hydroxyd 1 M, pha loãng thành 20 ml với methanol.

Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 2 ml dung dịch thử thành 100 ml với methanol.

Pha loãng 5 ml dung dịch này thành 100 ml với methanol.

Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan 2 mg chất cần kiểm tra và 2 mg tạp B vào hỗn hợp

5 ml methanol và 0,3 ml natri hydroxyd 1 M, pha loãng thành 25 ml với methanol.

10

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). Nhiệt độ cột 45 °C. Tốc

độ dòng 1,0 ml/phút. Đầu dò quang phổ đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm. Thể

tích tiêm mẫu: 10 µl.

Tiến hành sắc ký các dung dịch theo chương trình ở bảng 1.2.


Anh 2010.

Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b), thời gian lưu tương đối của pic tạp B so

với pic meloxicam (thời gian lưu khoảng 7 phút) là khoảng 0,5. Ở bước sóng

260 nm, hệ số phân giải giữa pic meloxicam và pic tạp B không được nhỏ hơn , .

Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử ở bước sóng 260 nm, diện tích pic

của tạp chất B không được lớn hơn diện tích của pic thu được trên sắc đồ của dung

dịch đối chiếu (a) ở bước sóng 350 nm (0,1%).

1.1.3.7. Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Mỹ [23]


Pha động : Dung dịch kali dihydrophosphat , , đã được điều chỉnh đến

pH 6,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N.

Pha động : Methanol.

Dung dịch phù hợp hệ thống: Cân 4 mg meloxicam chuẩn và 4 mg tạp B chuẩn, cho

vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri

hydroxyd 1 N, thêm methanol đến vạch, lắc đều.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml,

hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N, thêm methanol

đến vạch, lắc đều. Pha loãng 2 ml dung dịch này thành 100 ml với methanol.

Dung dịch thử: Cân chính xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml,

hòa tan bằng 5 ml methanol và 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N, thêm methanol

đến vạch, lắc đều.

Thời gian

(phút)

ha động A

(%)

ha động B

(%)

0-2 60 40

2-10 60 30 40 70

10-15 30 70

11

Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; m). Nhiệt độ cột °C, tốc độ

dòng ml/phút. Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm và 350 nm.

Thể tích tiêm: 5 µl.

Tiến hành sắc ký theo chương trình ở bảng 1.3.


Mỹ 2009.

Thời gian

(phút)

ha động A

(%)

ha động B

(%)

ửa giải

0-2 60 40 Đẳng dòng

2-10 60 30 40 70 Gradient tuyến tính

10-15

15-15,1

15,1-18

30

30 60

60

70

70 40

40

Đẳng dòng

Gradient tuyến tính

Cân bằng hệ thống

Tiến hành sắc ký dung dịch phù hợp hệ thống, thời gian lưu tương đối của pic tạp

chất B so với pic meloxicam (thời gian lưu khoảng 7 phút) là khoảng 0,4 . Ở bước

sóng 260 nm, hệ số phân giải giữa pic meloxicam và pic tạp chất B không được nhỏ

hơn , .

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Phần trăm tạp chất B được tính theo công thức:

C% = 100(CS/CT)(1/F)(rU/rS)

Trong đó: CS: nồng độ meloxicam (mg/ml) trong dung dịch chuẩn; CT: nồng độ

meloxicam (mg/ml) trong dung dịch thử; F: hệ số đáp ứng tương đối (Đối với tạp B,

F=1); rU: diện tích pic tạp chất B trong dung dịch thử ở bước sóng thích hợp (Đối

với tạp B: 260 nm); rS: diện tích pic của meloxicam trong dung dịch thử ở bước

sóng 350 nm.

Giới hạn cho phép (%, kl/kl) của tạp B là 0,1%.

1.1.3.8. Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B bằng phương pháp quang phổ

Tạp chất B còn được định lượng bằng cách tạo phức màu với 7-cloro-4-nitrobenz-2-

oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) và đo ở bước sóng nm. hương pháp tiến hành như

sau: [10]

12

- Pha dung dịch đệm borat pH 8: hòa tan 0,620 g acid boric và 0,750 g kali

clorid vào ml nước, pH được điều chỉnh đến pH 8 bằng natri hydroxid 0,1 M và

thêm nước vừa đủ 200 ml.

- Cân chính xác 10 mg meloxicam, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml

natri hydroxid M và thêm nước vừa đủ ml, đun sôi trong phút. Để nguội,

điều chỉnh đến pH 9 bằng acid hydrocloric 2 M. Lấy một lượng dung dịch tương

đương g meloxicam, thêm ml đệm borat pH , sau đó thêm , ml dung dịch

NBD-Cl (0,4% kl/tt), lắc đều, đun nóng đến 100 0C trong 30 phút. Để nguội, cho

vào bình định mức 10 ml, acid hóa bằng 0,1 ml acid hydroclorid 0,1 M và thêm

methanol vừa đủ, lắc đều. Tiến hành đo phổ hấp thụ của mẫu trắng và mẫu thử

trong khoảng 350 – 700 nm.

1.1.4. Tạp chất D

1.1.4.1. Công thức, tên khoa học

Công thức phân tử: C16H17N3O4S2.

hối lượng phân tử: 379,45 g/mol.

Danh pháp I AC: N-[(2Z)-3-ethyl-5-

methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-

hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

Danh pháp khác: 2H-1,2-Benzothiazin-3-carboxamid, N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-

2(3H)-thiazolyliden]-4-hydroxy-2-methyl-, 1,1-dioxyd.

1.1.4.2. Tính chất lý – hóa

Dạng bột màu vàng nhạt hơi xanh, bền ở điều kiện thường, thực tế không tan trong

nước, rất khó tan trong methanol và ethanol 99%, khó tan trong aceton,

dimethylformamid, DMSO và hơi tan trong hỗn hợp dicloromethan : methanol

(20 : 1), tan tốt trong dung dịch kiềm pH 10 ở 25 0C. Nhiệt độ nóng chảy 280 ± 2

0C

1.1.4.3. Giới hạn cho phép

a. Trong nguyên liệu chứa meloxicam

13

Theo chuyên luận meloxicam của Dược điển Anh 2010 [8], giới hạn cho phép của

tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng H LC) không được quá , trong đó

tạp chất D không được quá 0,1%.

b. Trong chế phẩm chứa meloxicam

Theo chuyên luận viên n n meloxicam của Dược điển Anh [8], giới hạn cho phép

của tổng phần trăm tất cả các tạp (phân tích bằng HPLC) không được quá 0,5%

trong đó tạp chất D không được quá 0,2%.

1.1.4.4. Phương pháp tổng hợp tạp chất D

Cho đến nay chưa tìm thấy bài báo hay công trình nghiên cứu cụ thể nào được công

bố về tổng hợp tạp chất D theo Dược điển Anh 2010.

1.1.4.5. Phương pháp định lượng/xác định giới hạn tạp chất D

Dược điển Anh [8] ghi rõ phương pháp định lượng tạp chất D trong chuyên luận

meloxicam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Điều kiện sắc ký tương tự

như phương pháp định lượng tạp chất B ở mục 1.1.3.6.

1.2. Các phương pháp xác định độ tinh khiết

1.2.1. Nhiệ độ nóng chảy

Muốn đánh giá độ tinh khiết của một chất, tiến hành xác định các hằng số vật lý của

chất đó rồi so sánh với tài liệu. Đối với chất rắn thường tiến hành xác định nhiệt độ

nóng chảy.

Để xác định khoảng chảy và điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất , có

thể áp dụng một trong các phương pháp 1, 2 hay 3 theo phụ lục . , Dược điển Việt

Nam IV. [3]

Các chất tinh khiết bao giờ cũng có một nhiệt độ nóng chảy xác định. hoảng nhiệt

độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn thường chênh

lệch khoảng °C. Nếu có lẫn tạp chất nhiệt độ nóng chảy sẽ thấp hơn và khoảng

cách nhiệt độ nóng chảy sẽ rộng hơn so với một chất tinh khiết. [18]

1.2.2.

Đây là một phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền.

14

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là

silicagel, nhôm oxyd) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là

một pha t nh.

Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển

các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều

vết có f khác nhau.

Có loại bản mỏng: bản mỏng phân tích và bản mỏng chế hóa. Bản mỏng phân tích

có thể ứng dụng để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng cách: Chấm tương

đối đậm mẫu thử trên ít nhất bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất hệ dung

môi khác nhau. Nếu cả sắc đồ đều cho một vết gọn trong vùng f , - , thì

có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết. Việc khẳng định sự tinh

khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra tiếp bằng phương pháp H LC. [7]

1.2.3. iệu

hi tiến hành phân tích mẫu bằng phương pháp H LC, trong các điều kiện sắc ký

khác nhau, nếu một chất chỉ cho một pic đối xứng riêng biệt, không bị chồng phủ

bởi các pic kế cận thì khả năng đó là một chất tinh khiết. Nhờ độ phân giải và độ tin

cậy cao cùng với các bộ phận phát hiện cung cấp các thông tin cấu trúc, H LC là

một công cụ rất hữu ích trong việc xác định độ tinh khiết của các hợp chất khác

nhau. [4]

1.2.4. iệ i uả

hương pháp điện di mao quản dùng để tách các tiểu phân đã ion hóa, hòa tan hay

phân tán trong dung dịch điện giải dưới tác dụng của điện trường. Độ nhạy không

bằng so với HPLC nhưng độ phân giải cao do số đ a lý thuyết lớn nên diện tích pic

hẹp, vì vậy các chất tách được hoàn toàn và tinh khiết. Tuy nhiên, kết quả không ổn

định, độ lặp lại không cao do phụ thuộc vào sự thay đổi pH và dòng điện thẩm.

1.2.5. ộ ạ

Cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp khá phổ biến và sự biện giải toàn bộ phổ

được nhiều chuyên gia mong đợi. Đây là phương pháp không làm phá vỡ cấu trúc,

nếu kết hợp với các thiết bị hiện đại có thể thu được dữ liệu tốt từ mẫu có khối

15

lượng nhỏ hơn một miligam. hương pháp này có thể cho biết được các nhóm chức,

sự liên kết nguyên tử, sự tương tác nội và ngoại phân tử cũng như cấu hình và cấu

dạng tương đối. Khi có sự hiện diện tạp chất sẽ thay đổi số lượng proton và độ dịch

chuyển hóa học khi so sánh với phổ chuẩn.

1.3. Chất đối chiếu

1.3.1. ị ĩ

Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép

thử đã được quy định về hoá học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó các tính

chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối

chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. [3]

1.3.2. Phân loại chất đối chiếu [9]

Chuẩn sơ cấp hay chuẩn gốc là chuẩn được thừa nhận không cần phải so sánh với

chất khác.

Chuẩn thứ cấp được thiết lập dựa trên chuẩn sơ cấp, gồm có chuẩn chính thức vùng

hay quốc gia.

Chuẩn làm việc, được thiết lập dựa trên chuẩn chính thức

1.3.3. Thiết lập chấ đối chiếu

- Chọn hóa chất làm đối tượng, có thể áp dụng kỹ thuật tinh chế để đạt độ tinh

khiết cần thiết theo bảng 1.4

Bảng 1.4 Yêu cầu về độ tinh khiết chất đối chiếu theo quy trình phân tích [26]

Quy trình Loại Độ tinh khiết

Định lượng

Thử tinh khiết

Định lượng hoạt chất chính > 99,5%

Thử giới hạn tạp chất > 98%

hi định lượng Định tính và thử tính phù hợp hệ thống Tùy trường hợp

- Định danh bằng các phương pháp phổ học ( V-Vis, I , MS, MN ) hay sắc

ký (sắc ký lớp mỏng, HPLC, GC).

- ác định độ tinh khiết của chất cần làm chất đối chiếu:

16

Các phương pháp trực tiếp: sắc ký, quang phổ, phân tích nhiệt, xác định tạp chất vô

cơ, các chất d bay hơi (nước, dung môi tồn dư).

Các phương pháp gián tiếp: năng suất quay cực, phân tích nguyên tố, chuẩn độ các

nhóm chức.

- Đánh giá tạp chất liên quan bằng nhiều phương pháp khác nhau

- Định lượng bằng một phương pháp đã được thẩm định, thực hiện ở các

phòng thí nghiệm khác nhau.

- Đánh giá kết quả, ấn định hàm lượng dựa trên kết quả liên phòng.

1.3.4. ó ói, bảo quản và sử dụng

Để đáp ứng mục đích sử dụng, chất đối chiếu phải được bảo quản, theo d i và sử

dụng đúng. Theo quy định thông thường, chất đối chiếu phải được đựng trong bao

bì gốc, kín, có nhãn r ràng. Điều kiện bảo quản tốt nhất là chất đối chiếu được

đóng trong lọ thủy tinh nâu để tránh tác động ánh sáng, quá trình đóng được thực

hiện trong buồng nitơ hoặc chân không và bảo quản ở 5 0C, nếu cần có điều kiện

bảo quản đặc biệt khác thì có hướng dẫn trên nhãn.

1.3.5. ộ ổ định và chu kỳ đ i ại

Điều quan trọng của chất đối chiếu là độ ổn định, do đó phải theo dõi bằng cách

kiểm tra đánh giá lại thường kỳ các chất đối chiếu và thay thế chúng khi có những

thay đổi quan trọng. Chọn lựa phương pháp phân tích thích hợp để theo d i độ ổn

định của chất đối chiếu tùy thuộc vào bản chất của chúng. Quy trình chung để kiểm

tra sản phẩm phân hủy, độ ẩm …

- Sắc ký lớp mỏng để tìm tạp chất liên quan.

- ác định nước bằng chuẩn độ Karl-Fisher hay giảm khối lượng do sấy khô.

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng và xác định giới hạn tạp chất.

Tần suất đánh giá lại tùy thuộc vào các thông số như hàm lượng nước, mẫu thử

dùng thử nghiệm, điều kiện bảo quản. Nói chung sự chuẩn hóa lại các chất đối chiếu

được đề nghị là hai năm, riêng đối với chất đối chiếu có độ nhạy cảm cao có thể là 6

tháng hoặc 12 tháng.

17

1.3.6. Hạn dùng của chấ đối chiếu

Chất đối chiếu không chỉ định hạn dùng, phần lớn được thay thế bằng lô sản xuất

mới khi có những biến đổi thuộc tính riêng quan trọng được ghi nhận sau khi được

đánh giá lại theo chu kỳ quy định.

18

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. ối i u

Tạp chất B: 5-methylthiazol-2-ylamin.

Tạp chất D (theo Dược điển Anh 2010) N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-

2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd.

2.1.2. Chất chuẩn - ó ấ - Dung môi

Meloxicam chuẩn do Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp:

- Số kiểm soát: QT 089060911.

- Hàm lượng: 99,35% tính trên chế phẩm nguyên trạng.

- Điều kiện bảo quản: 5 °C trong tủ lạnh.

Hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin:

- Độ tinh khiết: 98%

- Hãng sản xuất: Acros organics (Bỉ)

- Số lô: A0275029

- Quy cách đóng gói: lọ 5 g

- Hạn dùng: 07/2015

Nguyên liệu meloxicam dùng để tổng hợp tạp đạt chuẩn EP 6.3

- Hãng sản xuất: Công ty dược phẩm Zhejiang Excel (Domesco phân phối)

- Số lô: CML20110204

- Khối lượng: 100 g

- Hạn dùng: 01/03/2014

Hóa chất dùng cho phân tích: triethylamin, natri hydroxyd, acid acetic, natri hydrid,

silica gel cỡ hạt 230 – 400 µm (Merck),…

Dung môi dùng cho sắc ký lỏng (Merck): methanol, isopropanol.

Dung môi dùng cho phân tích: methanol, dicloromethan, n-hexan, aceton,

cloroform, dimethylformamid.

2.1.3. iế bị

Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck (Đức).

19

Bể siêu âm Elma T DH (Đức).

Cân phân tích điện tử KERN ABS 220- (Đức)

Tủ sấy ULM-500 Memmert (Đức)

Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm ; 5 µm), Phenomenex (Mỹ).

Cột sắc ký Gemini - NX C18 (150 x 4,6 mm ; 5 µm), Phenomenex (Mỹ).

Máy cô quay RE300DB, Stuart (Thụy S )

Máy chuẩn độ điện thế inoLab pH (Đức).

Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 (Anh).

Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật).

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters , đầu dò PDA 2996 (Mỹ), được nối với

máy tính xử lý kết quả bằng phần mềm Empower-2.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. iều chế tạp chất liên quan của meloxicam

2.2.1.1. Tinh chế tạp chất B của meloxicam

hương pháp tinh chế dự định tiến hành: phương pháp kết tinh lại trong dung môi

thích hợp.

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng.

- ác định nhiệt độ nóng chảy [3]

Cho tạp chất B đã nghiền vào ống mao quản, lèn bột bằng cách gõ nhẹ ống mao

quản xuống mặt phẳng cứng để có một lớp chế phẩm cao 4 – 6 mm.

Tiến hành đo lần, lấy giá trị trung bình.

- Sắc ký lớp mỏng

Pha dung dịch tạp chất B trong methanol, chấm trên bản mỏng và khai triển với các

hệ dung môi khác nhau.

Tạp chất B được coi là tinh khiết về sắc ký khi trên các bản mỏng khai triển với các

hệ dung môi khác nhau thu được sắc ký đồ không có vết lạ nào.

20

2.2.1.2. Tổng hợp tạp chất D của meloxicam

a. Tổng hợp

Phản ứng tổng hợp

Cơ chế phản ứng

Dựa trên cơ chế ái nhân của phản ứng N-alkyl hóa. Dựa theo tài liệu EP 1 717 229

B1 [13], tạp chất D được tổng hợp theo cơ chế phản ứng N-alkyl hóa nguyên tử nitơ

của vòng thiazol với tác nhân là alkyl-halid (hoặc tương tự) trong dung môi hữu cơ

như tetrahydrofuran hoặc DMF với sự hiện diện của base mạnh là natri hydrid ở

nhiệt độ từ 0 0C đến nhiệt độ phòng, thời gian từ phút đến 3 giờ.

Tiến hành

Hòa tan meloxicam vào lượng vừa đủ DMF khan trong bình cầu, thêm từng giọt

hỗn dịch natri hydrid (60% trong dầu khoáng) trong DMF khan vào dung dịch

meloxicam đã được làm lạnh đến 5 0C, khuấy khoảng 5 phút. Thêm ethyl bromid

vào hỗn hợp trên và khuấy ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp

mỏng cho đến khi xuất hiện vết mới. Để yên cho đến khi xuất hiện tủa. Lọc lấy tủa,

rửa tủa vài lần bằng DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô.

b. Tinh chế

Dựa vào độ tan của meloxicam và sản phẩm tổng hợp trong DMF, cho một lượng

lớn DMF vào sản phẩm tổng hợp, siêu âm 5 phút, lọc lấy tủa, rửa tủa vài lần bằng

21

DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô. Loại meloxicam thừa bằng

phương pháp sắc ký cột. Lượng silicagel nạp vào cột gấp 25 – 50 lần so với lượng

mẫu cần tinh chế; mẫu được thêm một lượng tối thiểu dung môi pha động và trộn

đều với silica gel theo tỉ lệ 1/10. Cô bay hơi dung môi, sấy khô, sau đó nạp lên cột

đã được ổn định với pha động. Rửa giải hứng lấy phân đoạn sản phẩm, cô thu hồi

dung môi, rửa lại với DMF, nước và methanol lần nữa, sấy khô.

c. Thử tinh khiết

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng.


Thực hiện tương tự như mục 2.2.1.1.


Hòa tan một ít sản phẩm tổng hợp sau khi tinh chế vào dicloromethan, sau đó thực

hiện tương tự như mục 2.2.1.1.

d. ác định cấu trúc

Sản phẩm sau khi tinh chế được đo phổ I để xác định sự có mặt của các đỉnh đặc

trưng cho các nhóm chức trong phân tử, phổ MS để xác định số khối của phân tử và

các mảnh vỡ của phân tử tương ứng với công thức dự kiến và phổ NMR để xác định

cấu trúc.

e. Hiệu suất phản ứng

Hiệu suất thô được tính dựa trên lượng sản phẩm thu được sau khi tinh chế sơ bộ

(chưa qua sắc ký cột) so với lượng nguyên liệu meloxicam ban đầu.

Hiệu suất tinh chế được tính dựa trên lượng sản phẩm sau khi qua cột sắc ký so với

trước khi qua cột sắc ký.

2.2.2. u đị độ i iế các ạ ấ bằng HPLC

2.2.2.1. hảo át phương pháp

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 10 mg tạp chất B (hoặc D), thêm 4 ml dung dịch

natri hydroxyd M và ml methanol, siêu âm phút, để nguội, thêm methanol

vừa đủ 100 ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Mẫu trắng: Chuẩn bị giống như mẫu thử nhưng không có tạp chất B (hoặc D).

22

Chọn điều kiện sắc ký thích hợp dựa vào:

- Pic tạp chất B (hoặc D): hệ số đối xứng AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, tách

hoàn toàn các pic khác trên sắc ký đồ (kể cả meloxiccam), đạt độ tinh khiết pic ≥

99%, thời gian lưu không quá dài để giảm thời gian phân tích, tiết kiệm dung môi.

Bảng 2.1. Các điều kiện sắc ký khảo sát tạp chất B và D

iều kiện s c ký Tạp B Tạp D

Bước sóng phát hiện Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp B hoặc D

ha động

- Dung môi pha động MeOH – nước MeOH – nước

MeOH – isopropanol MeOH – nước thêm triethylamin

- Tỉ lệ dung môi pha

động

50:50 60:40

45:55 65:35

40:60 70:30

Tốc độ dòng

0,6 ml/phút 0,6 ml/phút

0,8 ml/phút 0,8 ml/phút

1,0 ml/phút

Thể tích tiêm mẫu 10 μl và 20 μl với nồng độ mẫu 100 µg/ml

Thêm base hữu cơ

vào pha động Triethylamin 1 mM; 0,8 mM

Cột pha đảo

Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)

2.2.2.2. hẩm định phương pháp

Việc thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất liên quan của meloxicam

được dựa theo ICH. [15]

Tính phù hợp hệ thống

Chuẩn bị 1 mẫu thử của chất cần xác định độ tinh khiết với nồng độ khoảng 100

µg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần.

Tính phù hợp của hệ thống được xác định dựa trên các thông số đặc trưng của sắc

ký: diện tích pic (S) và thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS).

23

Theo quy định của DĐVN IV 3], yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống cho các

chuyên luận không có trong Dược điển Việt Nam là: độ lệch chuẩn tối đa được phép

cho các lần tiêm lặp lại là 2%. Ngoài ra, hệ thống phải đạt các yêu cầu sau:

- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8- , ( , ≤ AS ≤ , ).

- Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn , ( S > 1,5).

Tính đặc hiệu

Phải phân biệt được chất phân tích với các chất khác.

Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu pha động và mẫu thử.

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng: nếu xuất hiện pic thì các pic đó phải

không được xuất hiện tại vị trí tương ứng của pic tạp chất B (hoặc D) trong sắc ký

đồ mẫu thử, và các pic này phải có phổ hấp thụ UV giống với các pic có thời gian

lưu tương ứng trong sắc ký đồ mẫu thử.

- Sắc ký đồ mẫu thử phải không xuất hiện pic tạp trùng với pic tạp chất B

(hoặc D), pic tạp chất B (hoặc D) phải tinh khiết.

Miền giá trị

- Chuẩn bị các mẫu thử có nồng độ tương ứng sao cho trong sắc ký đồ thu

được các pic chính có chiều cao trong khoảng 0,1 – đơn vị hấp thụ. Tiến hành sắc

ký các mẫu thử ở 6 nồng độ khác nhau, mỗi mẫu tiêm 3 lần, xác định diện tích pic,

tính giá trị trung bình.

- Đánh giá:

Vẽ đường biểu di n của diện tích pic trung bình theo nồng độ phân tích.

ác định các hệ số B0 (độ dốc), B (tung độ gốc), R2 (bình phương của hệ số tương

quan) của phương trình hồi quy (ŷ B0x + B). Thường chấp nhận sự tuyến tính khi

, ≤ 2 ≤ .

Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và

ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy.

Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

24

- Độ lặp lại

Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử của chất cần xác định độ tinh khiết ở nồng

độ thích hợp trong miền giá trị đã khảo sát. Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 2 lần.

- Độ chính xác liên ngày

Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc

và người thực hiện.

2.2.2.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các tạp chất

a. Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm Nghiệm (Khoa Dược - Đại học

Y Dược T .HCM)

Tiến hành sắc ký 3 mẫu thử tại nồng độ đã khảo sát, mỗi mẫu tiêm 2 lần, tính độ

tinh khiết trung bình của mẫu thử.

b. Tại Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM

Tiến hành theo quy trình kiểm tra độ tinh khiết các tạp chất đã xây dựng.

2.2.3. i u uẩ ó ạ ấ

2.2.3.1. Tính chất

Dựa vào cảm quan xác định hình dạng, màu, mùi của chất.

ác định độ tan: bằng cách cho lượng dung môi vào 1 g chất thử để ở nhiệt độ 25 ±

2 ºC trong 30 phút, cứ cách 5 phút lại lắc giây, đánh giá theo Dược điển Việt

Nam IV. [3]

2.2.3.2. Định tính

Nhiệt độ nóng chảy [3]

Tiến hành giống mục 2.2.1.1

Phổ hồng ngoại:

Tiến hành đo phổ hồng ngoại bằng kỹ thuật dập viên KBr.

- Chuẩn bị mẫu: nghiền 1-2 mg chất thử với 300-400 mg bột mịn kali bromid

đã sấy khô. Luợng này đủ để tạo một viên n n có đường kính 13 mm và cho phổ có

cường độ phù hợp. Nghiền hỗn hợp cẩn thận và rải đều lên một khuôn thích hợp.

Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 M a trong điều kiện chân

không.

25

- Tiến hành đo, xác định số sóng của các nhóm chức đặc trưng trong công thức

cấu tạo của chất thử.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành sắc ký 3 mẫu thử theo điều kiện đã chọn. Trên sắc ký đồ, dựa vào thời

gian lưu để xác định pic tạp chất B (hoặc D).

2.2.3.2. Độ tinh khiết

ác định độ tinh khiết của mẫu thử bằng quy trình đã xây dựng ở mục 2.2.2.

2.2.4. i đồng nhất lọ u đó ói

Tiến hành đánh giá dựa trên hướng dẫn của ISO Guide 35 [17].

Phòng thí nghiệm đánh giá: chọn phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO

để tiến hành đánh giá đồng nhất lô.

Thực hiện tại khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu và khoa Vật lý đo lường,

Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh.

Lấy mẫu: sử dụng cách lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel, số lọ (g) được lấy để

kiểm tra: 1N g lọ, trong đó N là số lọ đóng được.

Xác định hàm lượng: áp dụng quy trình xác định độ tinh khiết để tiến hành xác định

hàm lượng, mỗi lọ được kiểm tra 2 lần, thống kê kết quả thu được.

Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon [20]: xếp các giá trị định lượng

trong đánh giá đồng nhất lọ theo thứ tự từ nhỏ đến lớn. Tính Gmin và Gmax của hai

giá trị nhỏ nhất và lớn nhất. Các giá trị được coi là bình thường khi Gmin và Gmax đều

nhỏ hơn G0,05.

Đánh giá đồng nhất giữa các lọ: đánh giá theo ISO Guide [17]. Các lọ được coi

là đồng nhất khi bbr un

S

Sr: độ lệch chuẩn lăp lại

n: số lần lặp lại của kết quả đo

ubb: độ không đảm bảo đo từ độ đồng nhất giữa các lọ

Thực tế khó đạt được yêu cầu trên nên có thể áp dụng công thức chuyển đổi sau để

tính ubb

26

42

MSwithin

withinbb

vn

MSu

MSwithin: trung bình bình phương trong từng nhóm

vMSwithin: bậc tự do của trung bình bình phương trong từng nhóm

Các lọ được xem là đồng nhất khi thỏa mãn bất đẳng thức:

n

SSu

n

MSMSr

bbbb

withinamong2

22

Sbb: độ lệch chuẩn của độ đồng nhất giữa các lọ

MSamong: trung bình bình phương giữa các nhóm

2.2.5. Ấ định giá trị công bố chất chuẩn

Tiến hành dựa theo hướng dẫn của ISO 13528 [16]

Thành phẩm sau khi đóng gói và đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy mẫu

ngẫu nhiên và tiến hành định lượng tại hai phòng thí nghiệm độc lập.

Lựa chọn phòng thí nghiệm: thực hiện tại ít nhất 2 phòng thí nghiệm, các phòng thí

nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO , trong đó có ít nhất một phòng thí

nghiệm có đủ thẩm quyền và có ý ngh a pháp lý đối với Việt Nam. Mỗi phòng thí

nghiệm sẽ nhận được 6 lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo quy trình phân tích và các tài

liệu liên quan khác.

Trước khi phân tích, mỗi phòng thí nghiệm sẽ đánh giá lại tính phù hợp của hệ

thống. Nếu đạt yêu cầu, tiến hành định lượng trên 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu nên

được kiểm tra 2 lần để tránh sai số.

Hai phòng thí nghiệm tham gia đánh giá các tạp chất liên quan của meloxicam

thuộc khoa:

- Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố

Hồ Chí Minh.

- Vật lý đo lường, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh.

Xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm (CoA) [16]

Tiến hành xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm

27

Các giá trị:

x* : trung vị của xi (xi : là giá trị định lượng x tại lần đo i)

s* = 1,483 x trung vị của |xi - x*|

ác định các giá trị:

= 1,5s*

hi đó

Tính toán các giá trị mới:

)1/(*)(134,1*

/*

2*

*

pxxs

pxx

i

i

với p : tổng các giá trị có kết quả z-score < 2,0

Giá trị ấn định x* (n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n lần tính (lấy 3 số

lẻ phía sau dấu phẩy), sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết quả phân

tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân tích có |z| > 2,0. Chọn các giá trị | | ≤ , ;

tính giá trị trung bình.

Xác định độ không đảm bảo đo: psU x /*25,1

Lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu kiểm nghiệm (theo ISO

Guide 31). Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 0C, tránh ánh sáng.

2.2.6. Xây d ui đị ạ ấ i u u iệu

ế ẩ i

2.2.6.1. Chuẩn bị mẫu

Tạp chất B và D đã được tiêu chuẩn hóa theo mục . . được dùng làm chất đối

chiếu để kiểm tra tạp chất B, D trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam.

Chuẩn bị mẫu chuẩn: giới hạn cho phép của tạp B và D trong nguyên liệu

meloxicam theo Dược điển Anh 2010 đều là 0,1%. Do tạp chất C và tạp chất D theo

Dược điển Anh 2010 [8] có công thức tương tự nhau, được quy định giới hạn cho

phép trong nguyên liệu lần lượt là , và , . Do đó, mẫu chuẩn được chuẩn bị

với tỉ lệ nồng độ meloxicam : tạp chất B : tạp chất D là 1000 : 1 : 0,5.

28

Chuẩn bị mẫu thử: thủy phân nguyên liệu meloxicam trong dung dịch natri

hydroxyd 1 M và sau đó điều chỉnh bằng cách thêm chuẩn meloxicam và tạp chất D

để được dung dịch thử có tỉ lệ nồng độ của meloxicam : tạp chất B : tạp chất D

tương ứng như trong dung dịch chuẩn.

2.2.6.2. Xây dựng qui tr nh định lượng các tạp chất liên quan trong ngu ên liệu

và chế phẩm meloxicam ằng P C

Từ điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết của tạp chất B và D (mục 2.2.2), tiếp tục

khảo sát điều kiện sắc ký để tách đồng thời meloxicam, tạp chất B, tạp chất D và

các tạp khác (nếu có). Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử với điều kiện sắc ký

gradient dự kiến ở bảng 2.2 sau:

Bảng 2.2. Chương trình dung môi định lượng tạp chất B và D

Pha động A: Dung dịch triethylamin 0,8 mM

Pha động B: Methanol

Khảo sát nồng độ phân tích (nồng độ đo): meloxicam 1000 µg/ml : tạp chất B 1

µg/ml : tạp chất D 0,5 µg/ml.

Chọn nồng độ phân tích thích hợp khi diện tích pic tạp chất B và D đủ lớn để đảm

bảo tính chính xác và độ đúng của phương pháp, pic meloxicam không quá lớn để

đảm bảo cột không bị quá tải.

a. Thẩm định phương pháp

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH. [15]

Tính phù hợp của hệ thống

Tiến hành giống như mục 2.2.2.2.

Tính đặc hiệu

Phải phân biệt được tạp chất B và D với meloxicam và các tạp chất khác.

Thời gian

(phút)

ha động A

(%)

ha động B

(%)

0-2 55 45

2-6 55 35 45 65

6-12 35 65

12-18 35 55 65 45

29

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng (chuẩn bị giống như mẫu chuẩn

nhưng không có các tạp chất B, D), mẫu pha động, mẫu thử thêm chuẩn.

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng: phải không có pic nào xuất hiện tại

thời gian lưu tương ứng của pic tạp chất B và D trong mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn: không xuất hiện pic lạ trùng với pic

tạp chất B và D; pic tạp chất B, D phải tinh khiết và tách hoàn toàn với pic

meloxicam và các pic tạp khác (nếu có), diện tích pic của tạp chất B và D phải tăng

lên trong mẫu thử thêm chuẩn.

- Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất B, D trong sắc ký đồ mẫu chuẩn,

mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn phải giống nhau.

Tính tuyến tính

Khảo sát khoảng tuyến tính từ 80-120% của nồng độ đo. Tiến hành pha 5 dung dịch

(ứng với 5 nồng độ 80%, 90%, 100%, 110%, 120%), thực hiện tiêm 3 lần cho mỗi

mẫu. ác định diện tích pic trung bình của mỗi mẫu. Vẽ đồ thị biểu di n và thiết lập

phương trình hồi quy của diện tích pic theo nồng độ.

Đánh giá t nh tu ến tính: sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp

của phương trình hồi quy và ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện:

hương pháp tiến hành: pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ nhất

còn phát hiện được.

Đo tín hiệu thu được từ mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ đã biết (được xác định

trong phần khảo sát điều kiện sắc ký). Tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, từ mẫu

chuẩn là S. Thiết lập tỉ số S/N. Pha loãng dần mẫu chuẩn tới một nồng độ tối thiểu

nào đó còn phát hiện được bằng quy trình phân tích đề xuất. Với S/N = 3/1 là chấp

nhận được. Nồng độ mẫu chuẩn tại điểm đó chính là LOD.

- Giới hạn định lượng:

30

hương pháp tiến hành: pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu vẫn đáp

ứng độ đúng và độ chính xác.

Phân tích mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ đã biết. Tín hiệu thu được từ mẫu

trắng là N, từ mẫu chuẩn là S. Thiết lập tỉ số S/N. Với S/N = 10/1 là chấp nhận

được. Nồng độ mẫu chuẩn tại điểm đó chính là LOQ.

Độ chính xác

- Độ lặp lại: tiến hành sắc ký 6 mẫu thử, mỗi mẫu tiêm 1 lần.

- Độ chính xác liên ngày: tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác

nhau với cùng điều kiện làm việc và người thực hiện.

Độ chính xác thể hiện bởi giá trị độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng tạp chất B

và D trong mẫu thử, RSD tối đa cho ph p đối với nồng độ phân tích ≤ g/ml là

7,3%. [14]

Độ đúng

Cách tiến hành: thêm vào dung dịch thử một lượng tạp chất chuẩn B và D tương

ứng , , hàm lượng từng tạp chất có trong dung dịch thử. Mỗi nồng

độ pha 3 mẫu.

Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu thử thêm chuẩn theo điều kiện sắc ký đã chọn.

Mỗi mẫu tiêm 1 lần.

Tính tỷ lệ phục hồi lượng chất chuẩn thêm vào.

Yêu cầu: hương pháp định lượng đạt độ đúng khi tỷ lệ phục hồi nằm trong giới

hạn cho phép. Với nồng độ chất phân tích ≤ g/ml, tỷ lệ phục hồi được chấp nhận

trong khoảng 80 – 110%. [14]

31

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. iều chế tạp chất liên quan của meloxicam

3.1.1. Tinh chế tạp chất B

hương pháp: kết tinh lại trong methanol.

Tiến hành: Hòa tan 4,0 gam 5-methylthiazol-2-ylamin trong một lượng tối thiểu

methanol nóng. Lọc nóng qua giấy lọc. Để nguội cho kết tinh. Lọc dưới áp suất

giảm thu tủa. Sấy trong tủ sấy 50 °C trong 6 giờ, thu được 3 gam sản phẩm tinh chế.

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế bằng nhiệt độ nóng chảy

và sắc ký lớp mỏng:

- Nhiệt độ nóng chảy:

Bảng 3.1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của tạp chất B

Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy

(°C)

Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn

(°C)

1 95 95

2 95 95

3 95 95

Theo kết quả ở bảng 3. , khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến

khi tan chảy hoàn toàn của mẫu tạp chất B chênh lệch không quá °C, sơ bộ cho

thấy mẫu tạp chất B tinh khiết.

- Sắc ký lớp mỏng:

Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml methanol.

Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck, kích thước 10 x 1,5 cm.

Thể tích chấm mẫu: 10 µl.

Dung môi khai triển:

(1) Dicloromethan – methanol (20:1)

(2) n-hexan – aceton (2:1)

Phát hiện: soi dưới đèn V nm.

Theo kết quả trong hình 3.1, khi tiến hành sắc ký với 2 hệ dung môi khai triển khác

nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy mẫu tạp chất B

tinh khiết.

32

(1)

(2)

Hình 3.1. Kết quả sắc ký lớp mỏng của tạp chất B

Hệ dung môi khai triển: (1) dicloromethan – methanol (20:1)


3.1.2. Tổng h p tạp chất ( đi n Anh 2010)

3.1.2.1. Tổng hợp

Quy trình tổng hợp tạp chất D được tiến hành như sau:

Hòa tan 10 g meloxicam vào 50 ml DMF khan trong bình cầu 250 ml, thêm từ từ

từng giọt hỗn dịch natri hydrid (1,5 g) trong DMF khan (10ml) vào dung dịch

meloxicam đã được làm lạnh đến 5 0C, khuấy 30 phút. Thêm 40 ml ethyl bromid

vào hỗn hợp trên và khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 4 giờ. Để yên cho tủa màu

vàng lắng xuống, lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó tiếp tục rửa tủa với

nước 3 lần, methanol 3 lần (mỗi lần khoảng 50 ml), sấy khô thu được 7 g sản phẩm.

3.1.2.2. Tinh chế

Tiến hành: cho sản phẩm tổng hợp vào 100 ml DFM, siêu âm 5 phút, đun nóng ở

nhiệt độ 60 0C, lọc nóng lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó rửa lại với nước và

methanol, sấy khô thu được 5 g sản phẩm. Tiếp tục tinh chế sản phẩm sau khi sấy

khô bằng sắc ký cột [5].

33

Chuẩn bị cột sắc ký: cột thủy tinh, đường kính 3 cm, dài 1 m

ha động: dicloromethan : H2O (20 : 1)

ha t nh: silica gel kích thước 230 - 400 µm

Chuẩn bị mẫu: 2 g mẫu được hòa tan vào ml pha động, thêm 20 g silica gel và

trộn đều với mẫu, sau đó cô bay hơi dung môi, sấy khô.

Mẫu được nạp lên cột đã được ổn định với pha động, thấm ướt mẫu bằng một lượng

dung môi tối thiểu. Rửa giải và hứng lấy từng phân đoạn sản phẩm, mỗi phân đoạn

15 ml và được kiểm tra bằng phương pháp H LC với hệ dung môi methanol : H2O

(60 : 40). Cô thu hồi dung môi, rửa lại với DMF, nước và methanol, sấy khô, thu

được 800 mg sản phẩm.

3.1.2.3. Thử tinh khiết

- ác định nhiệt độ nóng chảy

Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp

Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy

(0C)

Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn

(0C)

1 281 282

2 281 282

3 280 282

Theo kết quả ở bảng 3.2, khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến

khi tan chảy hoàn toàn sản phẩm tổng hợp chênh lệch khoảng 1 0C - 2

0C, sơ bộ cho

thấy sản phẩm tổng hợp tinh khiết.


Dung dịch thử: dung dịch sản phẩm tổng hợp 0,001 g/ml hỗn hợp dicloromethan :

H2O (6:4).

Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck, kích thước 10 x 1,5 cm.

Thể tích chấm mẫu: 10 µl.

Dung môi khai triển:

(1) Tricloromethan – methanol (40:1)

(2) Dicloromethan – methanol (30:1)

(3) n-hexan – aceton (4:5) (thêm 2 giọt acid acetic vào 10 ml hỗn hợp dung môi)

34

Phát hiện: soi dưới đèn V nm.

Theo kết quả trong hình 3.2, khi tiến hành sắc ký với 3 hệ dung môi khai triển khác

nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy sản phẩm tổng

hợp tinh khiết.

(1)

(2)

(3)

Hình 3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm tổng hợp

Hệ dung môi khai triển: (1) tricloromethan – methanol (40:1)

(2) dicloromethan – methanol (30:1)


3.1.2.4. Xác định cấu trúc

Phổ hồng ngoại

Hình 3.3. Phổ IR của sản phẩm tổng hợp

0.0

20.0

40.0

60.0

%T

500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 1750.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 1/cm

4000.0

35

Bảng 3.3. Kết quả biện giải phổ IR của sản phẩm tổng hợp

Số sóng (cm-1

) Nhóm chức

3128,3 -OH

2922 -C-H (benzen)

1596,9 -C=O

1502,4 -C=C-

1284,5/1336,6 -SO2-

Nhận xét: phổ IR cho thấy một số đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức phân tử của

tạp chất C (Dược điển VN IV) hoặc tạp chất D (Dược điển Anh 2010), đặc biệt là

có sự xuất hiện hai số sóng của nhóm chức -SO2-.

Phổ MS

Phổ MS [M+Na]+ và [M+H]

+ của sản phẩm tổng hợp cho các mảnh có số khối

(m/z) 402,13 và 380,12 phù hợp với số khối của tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp

chất D (BP 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2 (M= 379,45).

Hình 3.4. Phổ MS của sản phẩm tổng hợp

36

Phổ NMR

Bảng 3.4a. So sánh độ dịch chuyển hóa học của meloxicam và sản phẩm tổng hợp

trên phổ 1H NMR

δ Meloxicam (ppm) δ đo (ppm) Nhóm proton trong phân tử

1,4 3H (Nthiazol-CH3)

2,33 2,3 H- ’

2,9 2,9 3H-(CH3-Nbenzothiazin)

4,2 2H (Nthiazol-CH2)

7,36 7,5 H- ’

7,8 - 8,2 7,8 - 8,1 H-5, H-6, H-7, H-8

14,9 HO-

37

Hình 3.5a. Phổ 1H NMR của sản phẩm tổng hợp

Bảng 3.4b. So sánh độ dịch chuyển hóa học của meloxicam và sản phẩm tổng hợp

trên phổ 13

C NMR

δ meloxicam (ppm) δ đo (ppm) Nhóm proton trong phân tử

165,528 169,845 C=O

163,503 163,608 C-4

155,943 155,297 C- ’

44,232 -CH2- (ethyl-Nthiazol)

38,320 37,722 CH3-Nbenzothiazin

13,549 -CH3 (ethyl-Nthiazol)

11,664 11,953 CH3 (C- ’)

38

Hình 3.5b. Phổ 13

C NMR của sản phẩm tổng hợp

Nhận xét: hình 3.5a, 3.5b và bảng 3.4a, 3.4b của phổ NMR cho thấy số lượng và vị

trí của proton, carbon phù hợp với công thức tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp chất

D (Dược điển Anh 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2.

44

39

Phổ NOESY

Hình 3.5c. Phổ NOESY của sản phẩm tổng hợp

Phổ NOE (7,48 ppm): 4,2; 2,32 ppm (hình 3.5c) cho thấy proton H- ’ có tương tác

với proton H (CH3-C- ’) và H (-CH2-N-thiazol) chứng tỏ nhóm -CH2- của ethyl gắn

trên N-thiazol.

Như vậy, dựa trên phổ IR, MS và NMR có thể khẳng định sản phẩm tổng hợp chính

là tạp chất D (Dược điển Anh 2010).

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

40

3.1.2.5. Hiệu suất phản ứng

Hiệu suất thô (chưa qua cột sắc ký): 50%, thu được 5 g sản phẩm tổng hợp

Hiệu suất tinh chế tinh khiết: 40%, thu được 800 mg sản phẩm tinh khiết.

Hiệu suất quy trình: 20%, thu được 2 g sản phảm tinh khiết.

3.2. y ng quy t nh xác định độ tinh khiết các tạp chất ằng HPLC

3.2.1. Tạp chất B

3.2.1.1. hảo át phương pháp

Điều kiện (1): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (40:60), tốc độ

dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.

Điều kiện (2): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - isopropanol (40:60),

tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.

Điều kiện (3): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 1

mM (pH 10,5) (50:50), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.

Điều kiện (4): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA

0,8 mM (pH 9,7) (50:50), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.





Bước sóng phát hiện: chọn bước sóng hấp thụ cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian

lưu của pic tạp chất B.

41

(a) (b)

(c) (d)

(e)

(f)

Hình 3.6. Sắc ký đồ của tạp chất B với các điều kiện sắc ký khảo sát

(a) Điều kiện (1); (b) Điều kiện (2); (c) Điều kiện (3)

(d) Điều kiện (4); (e) Điều kiện (5); (f) Điều kiện (6)

Nhận xét:

- Kết quả khảo sát cho thấy:

+ Điều kiện (1), (2), (3), (4): pic tạp chất B có hệ số đối xứng lớn hơn , .

+ Điều kiện (5): thời gian lưu của pic tạp chất B là 3,3 phút, pic rửa giải quá nhanh,

d lẫn với meloxicam và các tạp khác nếu có.

42

+ Điều kiện (6): tạp chất B có thời gian lưu là , phút, hệ số đối xứng AS = 1,2,

độ tinh khiết của pic ≥ . Ở điều kiện này pic tạp chất B cũng tách hoàn toàn pic

meloxicam (hình 3.7).

- Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp chất B, chọn bước sóng phát hiện

là 260 nm (hình 3.8).

ậ điều kiện s c ký thích h đ đị độ tinh khiết tạp chất B là điều

kiện (6):

- ha động: methanol – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (45:55,tt/tt).

- Cột sắc ký Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm).

- Đầu dò DA: bước sóng phát hiện 260 nm.

- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Nhiệt độ cột: 26 0C.

Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chứa meloxicam 1000 µg/ml và tạp chất B 1 µg/ml

với điều kiện (6)

43

(a)

(b)

Hình 3.8. Phổ UV tại thời gian lưu tạp chất B khi khảo sát với điều kiện (6)

(a) Dung dịch tạp chất B 100 µg/ml

(b) Dung dịch meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml

Hình 3.9. Biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic của tạp chất B

3.2.1.2. Thẩm định phương pháp


Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR),

diện tích pic (S), số đ a lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm

44

trong khoảng 0,8 – , , độ phân giải (RS) lớn hơn , , khẳng định rằng quy trình

xác định độ tinh khiết tạp chất B đạt tính phù hợp của hệ thống.

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình xác định độ tinh

khiết tạp chất B

Số lần

tiêm mẫu tR (phút)

S

(µAU*giây) AS RS

1 N

1 5,072 5547591 1,2 8,6 32539

2 5,065 5556760 1,2 8,7 32741

3 5,071 5585236 1,2 8,6 33347

4 5,074 5600523 1,2 8,2 31993

5 5,081 5594475 1,2 8,7 33262

6 5,070 5587803 1,2 8,4 32637

Trung

bình 5,072 5578731 1,2 8,5 32753

RSD 0,10% 0,38% 0,42% 2,13% 1,53% 1: độ phân giải của pic tạp chất B với pic tạp của mẫu trắng có tR = 2,63 (phút)

Tính đặc hiệu

Kết quả khảo sát cho thấy:

- Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động (hình 3.10 và 3.11): không xuất hiện

pic nào có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của tạp chất B trong sắc ký

đồ mẫu thử.

- Sắc ký đồ mẫu thử (hình 3.12 và 3.13.a): ngoài pic tạp chất B chỉ có 2 pic lạ

có thời gian lưu và phổ UV giống như pic xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng,

chứng tỏ 2 pic lạ này là của mẫu trắng. Pic tạp chất B tinh khiết (hình 3.13.b) và

tách hoàn toàn các pic khác.

Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu.

45

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng và phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong

mẫu trắng (đối với tạp chất B)

46

Hình 3.11. Sắc ký đồ pha động (đối với tạp chất B)

(a)

(b)

Hình 3.12. Sắc ký đồ (a) 2 chiều và (b) 3 chiều của mẫu thử tạp chất B

47

(a)

(b)

Hình 3.13. (a) Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử tạp chất B

(b) Biểu đồ minh họa độ tinh khiết của pic tạp chất B

48

Miền giá trị

Chuẩn bị 6 dung dịch tạp chất B trong khoảng nồng độ 20 - 200 µg/ml. Tiến hành

sắc ký mỗi mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được trong bảng 3.4.

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát miền giá

trị của quy trình xác định độ tinh

khiết tạp chất B

Nồng độ

(µg/ml)

Diện tích pic

(μA *giây)

20 1046305

40 2179813

60 3313633

100 5552624

150 8169392

200 10912757

Hình 3.14. Đường biểu di n diện tích pic theo

nồng độ phân tích của tạp chất B

Khả đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồ độ phân tích của tạp chất B

Độ dốc: B0 = 54638.

Tung độ gốc: B = 5146.

Bình phương của hệ số tương quan: 2 = 0,9998.

, ≤ 2 ≤ , do đó chấp nhận sự tuyến tính.

Xét hàm ANOVA bằng phần mềm excel 2010:

- Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy: FS = 1,07.10-6

< α ,

phương trình hồi quy tương thích.

- Kiểm tra ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy:

Giá trị đối với hệ số B0 là 1,07.10-8 < α , hệ số B0 có ý ngh a về mặt

thống kê.

Giá trị đối với hệ số B là , > α , hệ số B không có ý ngh a về mặt

thống kê.

49

Như vậy, miền giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B là 20 – 200

g/ml. hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n sự tương quan diện tích pic theo

nồng độ phân tích của tạp chất B là ŷ x.

Độ chính xác

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình kiểm tra độ tinh khiết tạp

chất B

Số lần đo Diện tích pic (μA *giây)

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

1 5543404 5380931 5398859

2 5605736 5390179 5385716

3 5389605 5507166 5375694

4 5419143 5505405 5379349

5 5555903 5508387 5450586

6 5549345 5549288 5466099

7 5362985 5404410 5348279

8 5472700 5427628 5351958

9 5349761 5565980 5473226

10 5355545 5559060 5474534

11 5396532 5618684 5297472

12 5326312 5626649 5311054

Trung bình 5443914 5503647 5392736 5446766

RSD 1,78% 1,56% 1,14% 1,70%

Kết quả thu được theo bảng 3.7 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao

(RSD của diện tích pic ≤ ).

Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B bằng phương pháp H LC có

tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó có thể áp dụng quy trình

để tiến hành xác định độ tinh khiết của tạp chất B.

3.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết tạp chất B

a. Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm nghiệm ( hoa Dược – Đại học

Y Dược T . Hồ Chí Minh)

50

Tiến hành sắc ký mẫu tạp chất B theo quy trình đã chọn, chuẩn bị 3 mẫu thử, mỗi

mẫu sắc ký 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu tạp chất B nghiên cứu có độ tinh khiết

> 99,9%. Số liệu được trình bày trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả xác định độ tinh khiết tạp chất B bằng HPLC với đầu dò PDA

Mẫu Số lần đo Diện tích pic

(µAU*giây) % diện tích pic Xử lý thống kê

1 1 5380931 100%

n = 6; xTB = 100%;

SD = 0 ; RSD = 0%

e = 0 (với t = 2,57;

p = 0,05)

2 5390179 100%

2 1 5507166 100%

2 5505405 100%

3 1 5508387 100%

2 5549288 100%

b. Tại Viện iểm nghiệm thuốc T .HCM

Kết quả phân tích tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh cho kết quả độ

tinh khiết tạp B là 99,94% (phụ lục 1, 2) tính trên chế phẩm nguyên trạng bằng

phương pháp H LC.


3.2.2.1. Khảo át phương pháp

Điều kiện (1): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (60:40),

tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.

Điều kiện (2): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - nước (65:35),

tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.









51

Bước sóng phát hiện: chọn bước sóng hấp thu cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian

lưu của pic tạp chất D.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Hình 3.15. Sắc ký đồ của tạp chất D với các điều kiện sắc ký khảo sát

(a) Điều kiện (1); (b) Điều kiện (2); (c) Điều kiện (3)

(d) Điều kiện (4); (e) Điều kiện (5); (f) Điều kiện (6)

Nhận xét :

- Kết quả khảo sát cho thấy :

+ Điều kiện (1), (2): pic tạp chất D có hệ số đối xứng lớn hơn , .

52

+ Điều kiện (3) : pic tạp chất D có thời gian lưu là , phút, hệ số đối xứng As =

1,2, pic rửa giải chậm, đạt độ tinh khiết pic ≥ .

+ Điều kiện (4), (5) : thời gian rửa giải được rút ngắn, hệ số đối xứng As , và độ

tinh khiết pic không đạt.

+ Điều kiện (6) : thời gian lưu của tạp D là 8,517 phút, hệ số đối xứng As = 1,4 ; pic

đạt độ tinh khiết.

- Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp chất D (hình 3.17), chọn bước sóng

phát hiện là 360 nm.

Hình 3.16. Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất D khi khảo sát với điều kiện

(3)

ậ điều kiện s c ký thích h đ đị độ tinh khiết tạp chất D điều

kiện (3) :





- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl


53

Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch tạp chất D 100 µg/ml với điều kiện (3)

3.2.2.2. Thẩm định phương pháp


Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR),

diện tích pic (S), số đ a lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm

trong khoảng 0,8 – , , độ phân giải (RS) lớn hơn , , khẳng định rằng quy trình

xác định độ tinh khiết tạp chất D đạt tính phù hợp của hệ thống.

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình xác định độ tinh

khiết tạp chất D

Số lần

tiêm mẫu tR (phút)

S

(µAU*giây) AS RS

1 N

1 10,387 5706680 1,1 4,53 27927

2 10,367 5716676 1,1 4,53 27927

3 10,373 5691849 1,1 4,54 28073

4 10,367 5709113 1,1 4,56 28147

5 10,365 5706116 1,1 4,55 28113

6 10,363 5707089 1,1 4,55 28173

Trung

bình 10,370 5706254 1,1 4,55 28060

RSD 0,09% 0,14% 0,11% 0,24% 0,39% 1: độ phân giải của pic tạp chất D với pic tạp có tR = 7,39 (phút)

54

Tính đặc hiệu

Kết quả khảo sát cho thấy:

- Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động (hình 3.18 và 3.19): không xuất hiện

pic nào có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của tạp chất D trong sắc ký

đồ mẫu thử.

- Sắc ký đồ mẫu thử (hình 3.20) và phổ UV (hình 3.21 a): ngoài pic tạp chất D

chỉ có 1 pic lạ, pic này có độ cao và diện tích đỉnh nằm trong giới hạn cho phép. Pic

tạp chất D tinh khiết (hình 3.21 b) và tách hoàn toàn các pic khác.


Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu trắng và phổ UV tại thời gian lưu của pic trong mẫu

trắng (đối với tạp chất D)

55

Hình 3.19. Sắc ký đồ pha động (đối với tạp chất D)

(a)

(b)

Hình 3.20. Sắc ký đồ (a) 2 chiều và (b) 3 chiều của mẫu thử tạp chất D

56

(a)

(b)

Hình 3.21. (a) Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử tạp chất D

(b) Biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic của tạp chất D

Miền giá trị

Chuẩn bị 6 dung dịch tạp chất D trong khoảng nồng độ 20 - 200 µg/ml. Tiến hành

sắc ký mỗi mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được trong bảng 3.10.

57

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát miền

giá trị của quy trình xác định độ

tinh khiết tạp chất D

Nồng độ

(µg/ml)

Diện tích pic

(μA *giây)

20 1165928

40 2175257

60 3462724

100 5825388

150 8243590

200 11003487

y = 54681x + 118028

R2 = 0.9988

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0 50 100 150 200 250

Nồng độ (µg/ml)

diện tích pic

µAu*giây

Hình 3.22. Đường biểu di n diện tích pic theo

nồng độ phân tích của tạp chất D

Khả đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồ độ phân tích của tạp chất D

Bình phương của hệ số tương quan: 2 = 0,9988.


Xét hàm ANOVA bằng phần mềm MS excel:

- Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy: FS = 5,75.10-7

< α ,

phương trình hồi quy tương thích.

- Kiểm tra ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy:

Giá trị đối với hệ số B là 0,34 > α , hệ số B không có ý ngh a về mặt

thống kê.

Giá trị đối với hệ số B0 là 5,75.10-7

< α , hệ số B0 có ý ngh a về mặt

thống kê.

Như vậy, miền giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp D là 20 – 200 µg/ml.

hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n sự tương quan diện tích pic theo nồng độ

phân tích của tạp D là ŷ = 54681x.

58

Độ chính xác

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình kiểm tra độ tinh khiết tạp

chất D

Số lần đo Diện tích pic (μA *giây)

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

1 5934558 5939959 5921555

2 5992808 6082203 6054944

3 6145965 6045708 6157156

4 6167216 6216752 6303063

5 5979166 6086989 6102670

6 5968814 6293946 6123179

7 5969784 5956671 5949224

8 5986130 5999125 6049282

9 6174438 6047198 6142357

10 6162590 6198923 6324810

11 6001199 6086847 6128461

12 5983797 6302862 6105671

Trung bình 6038872 6104765 6113531 6085723

RSD 1,53% 2,00% 1,94% 1,87%

Kết quả thu được theo bảng 3.11 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao

(RSD của diện tích pic ≤ ).

Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất D bằng phương pháp H LC có

tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó có thể áp dụng quy trình

để tiến hành xác định độ tinh khiết của tạp chất D.

3.2.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết tạp chất D

a. Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm nghiệm ( hoa Dược – Đại học

Y Dược T . Hồ Chí Minh)

Tiến hành sắc ký mẫu tạp chất D theo quy trình đã chọn, chuẩn bị 3 mẫu thử, mỗi

mẫu sắc ký 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu tạp chất D nghiên cứu có độ tinh khiết >

98%. Số liệu được trình bày trong bảng 3.12.

59

Bảng 3.12. Kết quả xác định độ tinh khiết tạp chất D bằng HPLC với đầu dò PDA

Mẫu Số lần đo Diện tích pic

(µAU*giây)

% diện tích

pic Xử lý thống kê

1 1 5610543 98,21

n = 6; xTB = 98,22%;

SD = 0,11 ; RSD = 0,01%

e = 0,01 (với t = 2,57;

p = 0,05)

2 5625523 98,23

2 1 5504829 98,21

2 5498298 98,20

3 1 5632650 98,22

2 5632821 98,23

b. Tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh

Kết quả phân tích tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh cho kết quả độ

tinh khiết tạp chất D là 98,22% tính trên chế phẩm nguyên trạng bằng phương pháp

HPLC (phụ lục 3, 4).

3.3. Tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan của meloxicam

3.3.1. Tiêu chuẩn hóa tạp chất B

3.3.1.1. nh chất

Chất rắn, dạng bột vô định hình màu nâu, mùi hắc.

Tan trong methanol, cloroform.

3.3.1.2. Định t nh

- Nhiệt độ nóng chảy:

Dựa vào kết quả ở bảng 3.1 mức chất lượng của chỉ tiêu độ nóng chảy được đề nghị

là 95 ± 0,5 0C.

- hổ hồng ngoại:

Hình 3.23 minh họa phổ IR của tạp chất B với các số sóng và nhóm chức đặc trưng

của 5-methylthiazol-2-ylamin như sau:

Số sóng đặc trưng (cm-1

) Nhóm chức

3423 -NH

1510 C=C

60

Hình 3.23. Phổ IR của tạp chất B

Như vậy, yêu cầu định tính bằng quang phổ hồng ngoại là: phổ IR của mẫu thử phải

có số sóng hấp thụ đặc trưng của nhóm –NH và C=C.

- Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Các sắc ký đồ mẫu tạp chất B cho kết quả pic tạp chất B có thời gian lưu như sau:

Bảng 3.13. Thời gian lưu của pic tạp chất B

Số lần xác định tR (phút) Xử lý thống kê

1 5,069 n = 3; xTB = 5,095;

SD = 0,013; RSD = 0,44%

e = 0,056 (với t = 4,3;

p = 0,05)

2 5,110

3 5,105

Dựa vào kết quả xử lý thống kê ở bảng 3.13, mức chất lượng của chỉ tiêu định tính

dựa vào thời gian lưu được đề nghị là 5,095 ± 0,509 phút.


Dựa vào kết quả kiểm tra độ tinh khiết tạp chất B tại 2 phòng thí nghiệm có thể kết

luận mẫu tạp chất B sau khi tinh chế có độ tinh khiết > 99,9%.

Như vậy, mức chất lượng của độ tinh khiết được đề nghị là ≥ , tính trên chế

phẩm nguyên trạng khi xác định bằng HPLC.

3.3.1.4. Dự thảo tiêu chuẩn tạp chất B

3423

525 1045 1309

1618

1510

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

%T

500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 1750.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 1/cm TB ( HD-13-7-2012)

61

Sau khi tiến hành tiêu chuẩn hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin, sơ bộ xây dựng

một số tiêu chuẩn như sau:

Bảng 3.14. Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm tạp chất B

STT Chỉ tiêu M c chấ đề nghị

1 Tính chất

Chất rắn, dạng bột vô định hình màu nâu,

mùi hắc.

Tan trong methanol, cloroform.

2

Định tính

Nhiệt độ nóng chảy 95 ± 0,5 °C

Phổ hồng ngoại Phải có số sóng của nhóm –NH, C=C

HPLC tR = 5,095 ± 0,509 phút

3 Độ tinh khiết hông ít hơn , tính trên chế phẩm

nguyên trạng khi xác định bằng HPLC

Ph ơ ử

Tính chất:

- Bằng cảm quan, chất thử phải đạt yêu cầu đã nêu.

ác định độ tan: theo Dược điển Việt Nam IV.

Định tính


Cho tạp chất B đã nghiền vào ống mao quản, lèn bột bằng cách gõ nhẹ ống mao

quản xuống mặt phẳng cứng để có một lớp chế phẩm cao 4 – 6 mm.

Tiến hành đo lần, lấy giá trị trung bình.

- Phổ hồng ngoại [3]

Tiến hành đo phổ hồng ngoại bằng kỹ thuật dập viên KBr.

Chuẩn bị mẫu: nghiền 1-2 mg tạp chất B với 300-400 mg bột mịn kali bromid đã

sấy khô. Luợng này đủ để tạo một viên n n có đường kính 13 mm và cho phổ có

cường độ phù hợp. Nghiền hỗn hợp cẩn thận và rải đều lên một khuôn thích hợp.

Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng M a trong điều kiện chân

không.

62

Tiến hành đo, xác định số sóng của các nhóm chức đặc trưng trong công thức cấu

tạo của tạp chất B.

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao: xác định thời gian lưu của pic chính trong sắc ký

đồ của dung dịch thử theo quy trình xác định độ tinh khiết của tạp chất B bằng

phương pháp H LC.

Độ tinh khiết: phương pháp H LC và quy về 100% diện tích pic.

Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 10 mg 2-amino-5-methyl-1,3-thiazol, thêm 10 ml

dung dịch natri hydroxyd M và ml methanol, siêu âm phút, để nguội, thêm

methanol vừa đủ 100 ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có -amino-5-methyl-1,3-

thiazol.

Tiến hành sắc ký mẫu thử 6 lần theo điều kiện sau:





- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.


- Thời gian sắc ký: 15 phút.

Phép thử chỉ có giá trị khi RSD của thời gian lưu và diện tích của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, hệ số đối xứng của pic chính phải nằm trong khoảng

0,8 – , và độ phân giải của pic chính và pic phụ (nếu có) phải lớn hơn , .

Tính kết quả: Bỏ qua tất cả các pic phụ trong mẫu thử có thời gian lưu tương ứng

với các pic trong mẫu trắng khi xem sắc ký đồ ở bước sóng 260 nm.

Độ tinh khiết tính theo chế phẩm nguyên trạng của 2-amino-5-methyl-1,3-thiazol

được tính theo công thức sau:

Trong đó:

63

( ): độ tinh khiết tạp chất B

Sa: Diện tích của pic chính trong mẫu thử.

: Tổng diện tích của các pic phụ trong mẫu thử (ngoại trừ các pic phụ trong mẫu

thử có thời gian lưu tương ứng với các pic trong mẫu trắng).

3.3.2. Tiêu chuẩn hóa tạp chất D

3.3.2.1. nh chất

Chất rắn, dạng bột vô định hình màu vàng nhạt hơi xanh, thực tế không tan trong

nước, rất khó tan trong methanol và ethanol 99%, khó tan trong acetone,

dimethylformamid, DMSO và hơi tan trong hỗn hợp dicloromethan : methanol

(20 : 1), tan trong hỗn hợp natri hydroxyd 1M và methanol (1: 10)

3.3.2.2. Định t nh

- Nhiệt độ nóng chảy

Dựa vào kết quả ở bảng 3.2, sau khi xử lý thống kê: n = 3; xTB = 281,3; SD = 0,3;

RSD = 0,10%; e = 0,7 (với t = 4,3; p = 0,05), mức chất lượng của chỉ tiêu độ nóng

chảy được đề nghị là 281 ± 1 °C.

- hổ hồng ngoại

Dựa vào kết quả ở bảng 3.3, yêu cầu định tính bằng quang phổ hồng ngoại là: phổ

IR của mẫu thử phải có số sóng hấp thụ đặc trưng của nhóm -OH, C=O, C=C và -

SO2.

- Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các sắc ký đồ mẫu tạp chất D cho kết quả pic tạp chất D có thời gian lưu như sau :

Bảng 3.15. Thời gian lưu của pic tạp chất D

Số lần xác định tR (phút) Xử lý thống kê

1 10,387 n = 3; xTB = 10,375;

SD = 0,01; RSD = 0,10%

e = 0,025 (với t = 4,3;

p = 0,05)

2 10,367

3 10,373

Theo kết quả thu được sau khi xử lý thống kê ở bảng 3.15, mức chất lượng của chỉ

tiêu định tính dựa vào thời gian lưu được đề nghị là 10,375 ± 1,037 phút.

64


Dựa vào kết quả kiểm tra độ tinh khiết tạp chất D tại 2 phòng thí nghiệm có thể kết

luận mẫu tạp chất D sau khi tinh chế có độ tinh khiết 98,22%.

Như vậy, mức chất lượng của độ tinh khiết được đề nghị là ≥ , tính trên chế

phẩm nguyên trạng khi xác định bằng phương pháp H LC.

3.3.2.4. Dự thảo tiêu chuẩn tạp chất D

Sau khi tiến hành tiêu chuẩn hóa tạp chất D (Dược điển Anh 2010), sơ bộ xây dựng

một số tiêu chuẩn như sau :

Bảng 3.16. Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm tạp chất D (Dược điển Anh 2010)

STT Chỉ tiêu M c chấ đề nghị

1 Tính chất

Chất rắn, dạng bột vô định hình màu vàng hơi

xanh.

Tan trong hỗn hợp natri hydroxyd 1M và methanol

(tỉ lệ 1 : 10), khó tan trong aceton, DMF, DMSO,

rất khó tan trong methanol, ethanol 99%, không

tan trong nước.

2

Định tính

Nhiệt độ nóng chảy 281 ± 1 °C

Phổ hồng ngoại Phải có số sóng của nhóm –SO2, C=O, C=C, -OH

HPLC tR = 10,375 ± 1,037 phút

3 Độ tinh khiết hông ít hơn ,0% tính trên chế phẩm nguyên

trạng khi xác định bằng HPLC

P ơ ử

Tính chất:

- Bằng cảm quan, chất thử phải đạt yêu cầu đã nêu.

- ác định độ tan: theo Dược điển Việt Nam IV.

Định tính

- ác định nhiệt độ nóng chảy, phổ IR và HPLC: tiến hành giống như trong

mục 3.3.1.4 phần định tính trang 60 và 61.

Độ tinh khiết: phương pháp H LC và quy về 100% diện tích pic.

65

Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 10 mg tạp chất D, thêm 4 ml dung dịch natri

hydroxyd M và ml methanol, siêu âm phút, để nguội, thêm methanol vừa đủ

100 ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có tạp chất D.

Tiến hành sắc ký mẫu thử 6 lần theo điều kiện sau:

- ha động: Methanol – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (60:40,tt/tt).




- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

- Nhiệt độ cột: 30 0

C.

- Thời gian sắc ký: 20 phút.

Phép thử chỉ có giá trị khi RSD của thời gian lưu và diện tích của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, hệ số đối xứng của pic chính phải nằm trong khoảng

0,8 – , và độ phân giải của pic chính và pic phụ (nếu có) phải lớn hơn , .

Tính kết quả: Bỏ qua tất cả các pic phụ trong mẫu thử có thời gian lưu tương ứng

với các pic trong mẫu trắng khi xem sắc ký đồ ở bước sóng 360 nm.

Độ tinh khiết tính theo chế phẩm nguyên trạng của tạp chất D được tính theo công

thức sau:

Trong đó:

( ): độ tinh khiết của tạp chất D.

Sa: Diện tích của pic chính trong mẫu thử.

: Tổng diện tích của các pic phụ trong mẫu thử (ngoại trừ các pic phụ trong mẫu

thử có thời gian lưu tương ứng với các pic trong mẫu trắng).

66

3.4. Đánh giá đồng nhất lọ t ong quá t nh đóng gói và xác định giá trị ấn

định công bố chất chuẩn

3.4.1. Tạp chất B

3.4.1.1. Đánh giá đồng nhất lọ trong quá tr nh đóng gói

Đóng gói

Khối lượng đóng gói: mg/ lọ

Số lọ: 8 lọ

Đánh giá đồng nhất lọ

Số lọ đánh giá: 1N g ≈ +

Do số lượng lọ đóng ít nên tiến hành đánh giá đồng nhất tất cả các lọ đóng được.

Kết quả định lượng được trình bày trong bảng 3.17

Bảng 3.17. Kết quả định lượng tạp chất B trong đánh giá đồng nhất lọ

STT Lần 1 (%) Lần 2 (%)

1 99,97 99,96

2 99,97 99,96

3 99,96 99,96

4 99,96 99,96

5 99,97 99,97

6 99,97 99,97

7 99,97 99,97

8 99,97 99,95

- Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: xếp các kết quả trên theo thứ

tự tăng dần, xét hai giá trị nhỏ nhất và lớn nhất theo trắc nghiệm Dixon.

Gmin = 0,5 < G0,05 = 0,507

Gmax = 0 < G0,05 = 0,507

Vậy không có giá trị bất thường trong kết quả định lượng đồng nhất lọ.

- hân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA

67

Bảng 3.18. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố tạp chất B theo ANOVA

Nguồn sai số Tổng bình

phương Bậc tự do Bình phương F P F0,05

Giữa các nhóm 0,0003 7 0,00043 1,143 0,423 3,500

Trong cùng nhóm 0,0003 8 0,00038

Tổng cộng 0,0006 15

Nhận xét: F = 1,143 < F0,05 , , khi đó ta có:

n

Sr = 0,0043 > Ubb = 0,003

Do đó, áp dụng công thức chuyển đổi để tính Ubb. Kết quả thu được như sau:

n

MSMS withinamong = 2,68.10

-6

Ubb = 0,003 U2

bb = 9,4.10-6

n

SS r

bb

22 = 2,8.10

-5

Xét thấy 2,68.10-6

< U2bb = 9,4.10

-6 < 2,8.10

-5, do đó kết luận các lọ tạp chất B đồng

nhất trong quá trình đóng gói.

3.4.1.2. Ấn định giá trị công bố chất chuẩn

Bảng 3.19. Các thông số của hệ thống sắc ký định lượng tạp chất B tại các phòng

thí nghiệm

Yêu cầu PTN1 PTN2

N > 12000 27016 26722

T: 0,8 - 1,5 0,865 0,877

SD ≤ 0,004 0,005

PTN1: Phòng vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh

PTN2: Phòng thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ

Chí Minh.

Nhận x t: phương pháp định lượng đạt tính phù hợp hệ thống tại hai phòng thí

nghiệm trên, có thể tiếp tục tiến hành định lượng tạp chất B.

68

Bảng 3.20. Kết quả định lượng tạp chất B tại hai phòng thí nghiệm

Mẫu PTN1 PTN2

1 99,965 99,796

2 99,964 99,792

3 99,963 99,801

4 99,961 99,798

5 99,969 99,807

6 99,970 99,805

7 99,970 99,801

8 99,960 99,805

Trung bình 99,965 99,801

Bảng 3.21. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp chất B (n = 16) (phụ lục 5)

Số lần thay đổi x* 0 x* 1 x* 2 x* 3

= 1,5s* 0,182 0,145 0,145

x* - δ 99,701 99,738 99,738

x* + δ 100,065 100,027 100,027

Trung bình 99,883 99,883 99,883 99,883

Độ lệch s 0,085 0,085 0,085 0,085

x* mới 99,883 99,883 99,883 99,883

s* mới 0,121 0,096 0,096 0,096

Nhận xét, sau ba lần thay đổi, s* = 0,096 không thay đổi, khi đó giá trị x* được

chọn là 99,883%.

Từ kết quả trên tính z-score, kết quả tất cả 16 giá trị đều có |z| < 2,0.

Tính trung bình 16 giá trị này, kết quả thu được như sau:

- Hàm lượng trung bình: 99,883%

- Độ lệch chuẩn s: 0,085

- Độ không đảm bảo đo ,

69

Kết luận chung, tạp chất B đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng

được xác định 99,883% tính theo hiện trạng, độ không đảm bảo đo , 0, độ lệch

chuẩn 0,085 (n = 16).

Bảo quản các lọ chuẩn ở nhiệt độ 2 - 8 0C, tránh ánh sáng.


3.4.2.1. Đánh giá đồng nhất lọ trong quá tr nh đóng gói

Đóng gói

Khối lượng đóng gói: mg/ lọ

Số lọ: 12 lọ

Đánh giá đồng nhất lọ

Số lọ đánh giá: 1N g ≈ , + ≈

Do số lượng lọ đóng ít nên tiến hành đánh giá đồng nhất tất cả các lọ đóng được.

Kết quả định lượng được trình bày trong bảng 3.22

Bảng 3.22. Kết quả định lượng tạp chất D trong đánh giá đồng nhất lọ

STT Lần 1 (%) Lần 2 (%)

1 98,202 98,212

2 98,197 98,226

3 98,228 98,205

4 98,231 98,204

5 98,258 98,219

6 98,250 98,229

7 98,213 98,211

8 98,236 98,211

9 98,213 98,222

10 98,226 98,225

11 98,233 98,226

12 98,218 98,230

- Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: xếp các kết quả trên theo thứ

tự tăng dần, xét hai giá trị nhỏ nhất và lớn nhất theo trắc nghiệm Dixon.

70

Gmin = 0,132 < G0,05 = 0,413

Gmax = 0,393 < G0,05 = 0,413

Vậy không có giá trị bất thường trong kết quả định lượng đồng nhất lọ.

- hân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA

Bảng 3.23. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố tạp chất D theo ANOVA

Nguồn sai số Tổng bình

phương Bậc tự do Bình phương F P F0,05

Giữa các nhóm 0,00275 11 0,00025 1,111 0,427 2,717

Trong cùng nhóm 0,0027 12 0,000225

Tổng cộng 0,00545 23

Nhận xét: F = 1,111 < F0,05 = 2,717, khi đó ta có:

n

Sr = 0,0106 > Ubb = 0,0068

Do đó, áp dụng công thức chuyển đổi để tính Ubb. Kết quả thu được như sau:

n

MSMS withinamong = 1,25.10

-5

Ubb = 0,0068 U2

bb = 4,59.10--5

n

SS r

bb

22 = 0,00016

Xét thấy 1,25.10-5

< U2

bb = 4,59.10-5

< 16.10-5

, do đó kết luận các lọ tạp chất D

đồng nhất trong quá trình đóng gói.

3.4.2.2. Ấn định giá trị công bố chất chuẩn

Bảng 3.24. Các thông số của hệ thống sắc ký định lượng tạp chất D tại các phòng

thí nghiệm

Yêu cầu PTN1 PTN2

N > 12000 27823 54041

T: 0,8 - 1,5 1,134 1,007

SD ≤ 0,009 0,0002

PTN1: Phòng vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh

71

PTN2: Phòng thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ

Chí Minh.

Nhận xét: phương pháp định lượng đạt tính phù hợp hệ thống tại hai phòng thí

nghiệm trên, có thể tiếp tục tiến hành định lượng tạp chất D.

Bảng 3.25. Kết quả định lượng tạp chất D tại hai phòng thí nghiệm

Mẫu PTN1 PTN2

1 98,20 98,21

2 98,20 98,23

3 98,23 98,21

4 98,23 98,20

5 98,26 98,22

6 98,25 98,23

7 98,21 98,21

8 98,24 98,21

9 98,21 98,22

10 98,23 98,23

11 98,23 98,23

12 98,22 98,23

Trung bình 98,23 98,22

Bảng 3.26. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp chất D (n = 22) (phụ lục 6)

Số lần thay đổi x* 0 x* 1 x* 2 x* 3

= 1,5s* 0,022 0,022 0,021

x* - δ 98,201 98,200 98,200

x* + δ 98,246 98,243 98,242

Trung bình 98,222 98,221 98,221 98,221

Độ lệch s 0,015 0,013 0,012 0,012

x* mới 98,224 98,221 98,221 98,221

s* mới 0,015 0,014 0,014 0,014

Nhận xét, sau bốn lần thay đổi, s* = 0,014 không thay đổi, khi đó giá trị x* được

chọn là 98,221%.

Từ kết quả trên tính z-score, loại 2 giá trị có |z| > 2,0, tính giá trị ấn định trên 22 kết

quả.

- Hàm lượng trung bình: 98,221%

72

- Độ lệch chuẩn s: 0,012

- Độ không đảm bảo đo ,004

Kết luận chung, tạp chất D đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng

được xác định 98,221% tính theo hiện trạng, độ không đảm bảo đo , , độ lệch

chuẩn 0,012 (n = 22).

Bảo quản các lọ chuẩn ở nhiệt độ 2 - 8 0C, tránh ánh sáng.

3.5. Xây d ng qui t nh định lượng các tạp chất liên quan t ong nguyên liệu

và chế phẩm meloxicam

3.5.1. ả ơ

- Dung dịch Meloxicam 1000 µg/ml : tạp chất B 1 µg/ml : tạp chất D 0,5

µg/ml

Dung dịch meloxicam chuẩn 2000 µg/ml (1): cân 200 mg meloxicam chuẩn, thêm

20 ml dung dịch natri hydroxyd 1M và 20 ml methanol, lắc siêu âm trong 5 phút.

Để nguội, thêm methanol vừa đủ 100 ml.

Dung dịch tạp B chuẩn 100 µg/ml (2): hòa tan 10 mg tạp B chuẩn trong 5 ml dung

dịch natri hydroxyd M và ml methanol, để nguội và thêm methanol vừa đủ 100

ml.

Dung dịch tạp D chuẩn 50 µg/ml (3): hòa tan 5 mg tạp chất D chuẩn trong 2 ml

dung dịch natri hydroxyd M và ml methanol, siêu âm, để nguội và thêm

methanol vừa đủ 100 ml.

Dung dịch chuẩn: hỗn hợp 50 ml dung dich (1), 1 ml dung dịch (2), 1 ml dung dịch

(3) thêm methanol vừa đủ 100 ml.

Tiến hành: sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn theo điều kiện sắc ký xây dựng quy trình

định lượng ở mục 2.2.6.2.

Kết quả các sắc ký đồ thu được ở hình 3.24.

Nhận xét: pic của tạp chất B và D có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 - , ; độ

phân giải lớn hơn , ; số đ a lý thuyết không bị giảm sau các lần tiêm mẫu liên tiếp,

điều này chứng tỏ cột không bị quá tải. Chọn nồng độ meloxicam : tạp chất B : tạp

chất D ( 1000 : 1 : 0, ) để tiến hành khảo sát phương pháp.

73

(a)

(b)

Hình 3.24. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn của tạp chất B và D

(a) Sắc ký đồ ở bước sóng 260 nm, (b) Sắc ký đồ ở bước sóng 360 nm

Điều kiện sắc ký: ha động: methanol – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) gradient;

Cột sắc ký Gemini-NX C18 ( x , mm; m); Bước sóng phát hiện 260 nm;

Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µl; Nhiệt độ cột: 30 0C.

74

3.5.2. ẩ đị ơ

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị giống như dung dịch chuẩn ở mục 3.5.1.

Dung dịch thử: Cân chính xác 100 mg meloxicam, thêm 10 ml dung dịch natri

hydroxyd M. Đun sôi ở 100 0C trong 1 giờ. Để nguội, thêm methanol vừa đủ 100

ml thu được dung dịch thủy phân. Lấy 2 ml dung dịch thủy phân, thêm 1 ml dung

dịch chuẩn (3), thêm dung dịch meloxicam chuẩn 1000 µg/ml vừa đủ 100 ml thu

được dung dịch thử có nồng độ meloxicam : tạp chất B : tạp chất D tương ứng như

trong dung dịch chuẩn.

Mẫu trắng: chuẩn bị giống như mẫu chuẩn nhưng không có tạp chất B và D.


Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử. Mỗi mẫu tiêm 6 lần.

Bảng 3.27. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn của quy trình

định lượng tạp chất B và D

Lần

tiêm

mẫu

Tạp chất B Tạp chất D

tR

(phút)

S

(µAU*giây) AS RS

1 N tR (phút)

S

(µAU*giây) AS RS

2 N

1 4,925 53715 1,3 2,9 27513 13,298 25027 1,2 24,4 134353

2 4,919 54338 1,2 3,0 27753 13,275 24695 1,1 26,6 127307

3 4,916 53502 1,2 3,0 25713 13,273 25028 1,2 26,4 148820

4 4,908 53875 1,2 3,0 26553 13,285 24527 0,9 24,6 102567

5 4,923 53941 1,2 3,0 27553 13,299 25149 0,9 24,8 115887

6 4,915 52957 1,2 3,0 26333 13,283 25609 1,0 24,4 115633

Trung

bình 4,918 53721 1,2 3,0 26903 13,286 25006 1,1 25,2 124094

RSD

(%) 0,12 0,87 1,42 1,37 3,06 0,08 1,51 13,1 4,05 13,1

1: độ phân giải của pic tạp chất B với pic meloxicam có tR = 3,875 (phút)

2: độ phân giải của pic tạp chất D với pic meloxicam có tR = 3,875 (phút)

75

Bảng 3.28. Khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử của quy trình định lượng

tạp chất B và D

Lần

tiêm

mẫu


tR

(phút) S AS RS

1 N

tR

(phút) S AS RS

2 N

1 4,911 77314 1,3 3,2 24880 13,273 22400 1,1 26,6 135240

2 4,902 77474 1,3 3,1 25327 13,250 23193 1,1 24,1 151787

3 4,901 78329 1,3 3,1 25453 13,250 22887 0,9 26,4 107627

4 4,895 78828 1,3 3,1 25087 13,249 22712 1,1 26,7 107553

5 4,896 78035 1,3 3,1 25047 13,250 22105 1,0 24,6 169547

6 4,905 77958 1,3 3,1 25360 13,248 23152 0,8 24,4 116267

Trung

bình 4,902 77990 1,3 3,1 26903 13,253 22754 1,0 25,5 124581

RSD

(%) 0,12 0,71 0,67 1,31 0,88 0,07 1,88 12,6 4,79 19,4

1: độ phân giải của pic tạp chất B với pic meloxicam có tR = 3,875 (phút)

2: độ phân giải của pic tạp chất D với pic meloxicam có tR = 3,875 (phút)

Kết quả ở bảng 3.27 và 3.28 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian

lưu (tR), diện tích pic (S) đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng

0,8 – , , độ phân giải (RS) lớn hơn , , khẳng định rằng quy trình định lượng đồng

thời tạp chất B và D đạt tính phù hợp của hệ thống.

Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu pha động, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm

chuẩn. Kết quả cho thấy:

- Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng (hình 3.25 và 3.26) không có pic nào

xuất hiện tại thời gian lưu tương ứng của pic tạp chất B (260 nm) và tạp chất D (360

nm) trong mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn (hình 3.28, 3.29) không xuất hiện

pic lạ trùng với pic tạp chất B (260 nm) và tạp chất D (360 nm), pic tạp chất B và D

tinh khiết, tách hoàn toàn với pic meloxicam. Diện tích pic của tạp chất B và D tăng

lên trong mẫu thử thêm chuẩn.

76

- Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất B, D trong sắc ký đồ mẫu chuẩn,

mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn (hình 3.27, 3.28, 3.29) giống nhau.


(a)

(b)

Hình 3.25. Sắc ký đồ pha động của quy trình định lượng tạp chất B, D

(a) Sắc ký đồ pha động ở bước sóng 260 nm

(b) Sắc ký đồ pha động ở bước sóng 360 nm

(a)

(b)

Hình 3.26. Sắc ký đồ mẫu trắng của quy trình định lượng tạp chất B, D

(a) Sắc ký đồ mẫu trắng ở bước sóng 260 nm

(b) Sắc ký đồ mẫu trắng ở bước sóng 360 nm

77

(a)

(b)

78

Hình 3.27. Sắc ký đồ, biểu đồ biểu di n độ tinh khiết pic và phổ UV tại thời gian

lưu của tạp chất B và D trong mẫu chuẩn

(a) Sắc ký đồ tại bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ tại bước sóng 360 nm

79

(a)

(b)

80


lưu của tạp chất B và D trong mẫu thử

(a) Sắc ký đồ tại bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ tại bước sóng 360 nm

81

(a)

(b)

82


lưu của tạp chất B và D trong mẫu thử thêm chuẩn

(a) Sắc ký độ tại bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ tại bước sóng 360 nm

83

Tính tuyến tính

Pha 5 dung dịch có nồng độ meloxicam 1000 µg/ml, nồng độ tạp chất B lần lượt là

0,8 µg/ml; 0,9 µg/ml; 1 µg/ml; 1,1 µg/ml; 1,2 µg/ml, nồng độ tạp chất D lần lượt là

0,4 µg/ml; 0,45 µg/ml; 0,5 µg/ml; 0,55 µg/ml; 0,6 µg/ml. Thực hiện tiêm 3 lần cho

mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được trong bảng 3.29. Đồ thị biểu di n

diện tích pic theo nồng độ tạp chất B và D được trình bày ở hình 3.30.

Bảng 3.29. Kết quả xác định diện tích pic của tạp chất B và D trong theo nồng độ


Nồng độ

(µg/ml)

Diện tích pic trung bình

(μA *giây)

Nồng độ

(µg/ml)

Diện tích pic

trung bình

(μA *giây)

0,8 41778 0,40 20577

0,9 47129 0,45 22477

1,0 51926 0,50 25260

1,1 58227 0,55 27918

1,2 63028 0,60 30423

Hình 3.30. Đồ thị biểu di n diện tích pic theo nồng độ tạp chất B và D

(a) Đường tuyến tính tạp chất B (b) Đường tuyến tính tạp chất D

Khả đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồng độ phân tích của tạp chất B, D

y = 53598x - 1180.4R² = 0.9984

y = 50266x + 198R² = 0.9968

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3

Diện tích pic(µAu*giây)

Nồng độ (µg/ml)

(b)

(a)

84

Bình phương của hệ số tương quan đối với tạp chất B và D lần lượt là R2 = 0,9984

và R2 = 0,9968


Xét hàm ANOVA bằng phần mềm MS excel:

- Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy: FS (B) = 2,78.10-5

và FS

(D) = 7,82.10-5

< α , phương trình hồi quy tương thích.

- Kiểm tra ý ngh a của hệ số B và B0 bằng trắc nghiệm t (phân phối Student).

Giá trị đối với hệ số B có tB = 0,42 và tC = 0,83 > α , hệ số B không có ý

ngh a về mặt thống kê.

Giá trị đối với hệ số B0 có tB = 2,78.10-5

và tC = 7,82.10-5

< α , hệ số B0

có ý ngh a về mặt thống kê.

Như vậy, miền giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B là 0,8 – 1,2

µg/ml và tạp chất D là 0,4 – 0,6 µg/ml.

hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n sự tương quan diện tích pic theo nồng độ

phân tích của tạp chất B là ŷ = 53598x và tạp chất D là ŷ = 50266x.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc ký mẫu thử ở các nồng độ giảm dần như sau:

- Giới hạn phát hiện (LOD) của tạp chất B và D là 0,075 µg/ml.

- Giới hạn định lượng (LOQ) của tạp B và D là 0,200 µg/ml.

Tiêm lặp lại mỗi mẫu ở nồng độ LOD và LOQ 6 lần để kiểm tra kết quả khảo sát.

Số liệu cụ thể được trình bày trong bảng 3.30 và 3.31.

Bảng 3.30. Giá trị S/N tại giới hạn phát hiện của 6 lần đo lặp lại

Lần đo NB SB S/N tạp chất B ND SD S/N tạp chất D

1 95 327 3,44 190 645 3,39

2 95 365 3,84 190 604 3,18

3 95 269 2,83 190 681 3,58

4 95 353 3,72 190 688 3,62

5 95 293 3,08 190 761 4,01

6 95 327 3,44 190 574 3,02

Trung bình 95 322 3,39 190 659 3,47

85

Bảng 3.31. Giá trị S/N tại giới hạn định lượng của 6 lần đo lặp lại

Nhận xét: LOD và LOQ đều thấp hơn giới hạn cho phép của tạp chất B và D trong

nguyên liệu meloxicam (đều không quá 1 µg/ml) và chế phẩm (không quá 1,5

µg/ml đối với tạp chất B và 2 µg/ml đối với tạp chất D).

Độ chính xác

Kết quả ở bảng 3.32 cho thấy RSD của hàm lượng tạp chất B và D trong mẫu thử là

1,61% và 5,43%, nhỏ hơn mức cho phép là 7,3% khi nồng độ chất phân tích ≤ 1

µg/ml. Vậy quy trình đạt yêu cầu về độ chính xác [14].

Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng tạp chất B và D

(phụ lục 7)

Số lần

đo

Hàm lượng tạp chất B trong mẫu

thử (µg/ml)

Hàm lượng tạp chất D trong mẫu

thử (µg/ml)

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

1 1,05 1,04 1,07 0,45 0,50 0,45

2 1,02 1,01 1,05 0,46 0,42 0,45

3 1,02 1,04 1,04 0,50 0,44 0,48

4 1,04 1,06 1,03 0,50 0,46 0,45

5 1,02 1,04 1,07 0,49 0,49 0,48

6 1,04 1,05 1,03 0,46 0,44 0,51

Trung

bình 1,03 1,04 1,05 0,48 0,46 0,47

RSD 1,11% 1,48% 1,61% 4,51% 5,92% 4,81%

Trung

bình 1,04 0,47

RSD 1,61% 5,43%

Lần đo NB SB S/N tạp chất B ND SD S/N tạp chất D

1 95 922 9,71 105 958 9,12

2 95 924 9,73 105 882 8,40

3 95 952 10,02 105 1049 9,99

4 95 905 9,53 105 910 8,67

5 95 941 9,91 105 1106 10,53

6 95 968 10,19 105 867 8,26

Trung bình 95 935 9,85 105 962 9,16

86

Độ đúng

Kết quả ở bảng 3.33 cho thấy tỉ lệ phục hồi của hai tạp chất B và D nằm trong

khoảng cho phép 80-110% ứng với nồng độ chất phân tích tạp chất B là 1 µg/ml và

tạp chất C là 0,5 µg/ml. Như vậy quy trình đạt yêu cầu về độ đúng ].

Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời tạp chất B

và D

Mẫu

Tỷ lệ

thêm

chuẩn

(%)

Lượng

sẵn có

(µg/ml)

Lượng

thêm

vào

(µg/ml)

Tổng

lượng

sau khi

thêm

chuẩn

(µg/ml)

Diện

tích pic

sau khi

thêm

chuẩn

Nồng

độ tìm

được

sau khi

thêm

chuẩn

(µg/ml)

Tỷ lệ

phục hồi

(%)

Tạp

chất

B

1

80

1,04

0,80 0,92 49528 0,92 100,39

2 0,79 0,92 50537 0,94 102,99

3 0,81 0,93 52232 0,97 105,30

4

100

1,00 1,02 56206 1,02 100,33

5 0,99 1,02 54586 1,02 100,29

6 1,01 1,03 54878 1,05 102,26

7

120

1,20 1,12 61434 1,11 99,26

8 1,19 1,12 60590 1,15 101,34

9 1,21 1,13 59614 1,15 101,84

TB 101,56

SD 0,02

RSD 1,79%

Tạp

chất

D

1

80

0,47

0,40 0,44 20717 0,41 94,75

2 0,39 0,43 22492 0,43 99,61

3 0,41 0,44 21530 0,45 101,70

4

100

0,50 0,49 26611 0,45 91,88

5 0,49 0,48 22400 0,46 96,13

6 0,51 0,49 23193 0,53 108,04

7

120

0,60 0,54 25450 0,51 94,64

8 0,59 0,53 27955 0,53 100,41

9 0,61 0,54 26750 0,56 102,99

TB 98,90

SD 0,05

RSD 5,10%

Nhận xét: Quy trình định lượng tạp chất B và D trong meloxicam bằng phương

pháp H LC có tính đặc hiệu, tuyến tính tại khoảng nồng độ đo, có giới hạn phát

87

hiện và giới hạn định lượng thấp, độ chính xác và độ đúng đáp ứng yêu cầu đề ra,

do đó có thể áp dụng quy trình để tiến hành định lượng đồng thời tạp chất B và D

trong nguyên liệu và thành phẩm meloxicam.

88

CHƯƠNG 4 - ÀN LU N

4.1. Điều chế các tạp chất liên quan B và D của meloxicam

4.1.1. Tinh chế 5-methylthiazol-2ylamin (tạp chất B của meloxicam)

5-methylthiazol-2ylamin là hóa chất công nghiệp, d tổng hợp và tinh chế. hương

pháp tinh chế đơn giản nhưng phổ biến và hiệu quả được lựa chọn là kết tinh lại. 5-

methylthiazol-2-ylamin d tan trong methanol, nên chọn methanol làm dung môi

kết tinh lại. Ether cũng có thể dược dùng để kết tinh lại hóa chất này nhưng cần chú

ý đến tính chất d cháy của nó.

4.1.2. Tổng h p và tinh chế N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-

4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp chất D

đi n Anh 2010)

Mặc dù tạp chất D chưa có quy trình tổng hợp nhưng việc tổng hợp được thực hiện

dựa trên cơ chế N-alkyl hóa nitơ. Tuy nhiên không tránh khỏi phát sinh một lượng

nhỏ sản phẩm phụ chính là tạp chất C (Dược điển Việt Nam IV [3]) do alkyl hóa

nitơ nhóm carboxamid.

Dựa vào phổ MS, 1H NMR và

13C NMR cũng chưa thể xác định được sản phẩm

tổng hợp là tạp chất D (Dược điển Anh 2010) hoặc tạp chất C (Dược điển Việt Nam

IV). Phổ NOESY (7,48 ppm - H- ’): 4,2; 2,32 ppm cho thấy proton H- ’ có tương

tác với proton H (CH3-C- ’) và H (-CH2-N-thiazol) chứng tỏ nhóm -CH2- của ethyl

gắn trên N-thiazol, khẳng định sản phẩm tổng hợp là tạp chất D .

Meloxicam tan tốt trong DMF nhưng tạp chất D khó tan trong dung môi này, có thể

sử dụng để loại meloxicam khỏi sản phẩm tổng hợp, tuy nhiên chỉ có thể loại được

90% meloxicam trong sản phẩm. Sắc ký cột cổ điển được sử dụng để loại hoàn toàn

meloxicam ra khỏi sản phẩm. Dung môi được chọn là dicloromethan : MeOH (20 :

1) vì rẻ tiền hơn so với tricloromethan: MeOH và n-hexan: aceton.

Một tạp chất khác của tạp chất D với lượng nhỏ không thấy trên sắc ký lớp mỏng và

hầu như không loại được qua sắc ký cột. Tiến hành sắc ký cột lần thứ hai với cột dài

1 m đã loại được nhưng hàm lượng thu được nhỏ hơn mg.

89

Trong giai đoạn tổng hợp tạp D, NaH được thêm vào sẽ phân ly thành H- là một tác

nhân ba ơ mạnh trong môi trường khan với vai trò phân ly proton H+ trên nitơ giúp

cho sự alkyl hóa trên nitơ d dàng hơn.

4.2. Quy t nh xác định độ tinh khiết các tạp chất B và D

- Khi tiến hành sắc ký bằng pha động là MeOH – nước, pic tạp chất B và D bị

k o đuôi. Hiện tượng này là do chất phân tích bị lưu giữ lâu trên pha t nh, các phần

tử chất phân tích không được rửa giải cùng lúc dẫn đến pic bị k o đuôi. Để khắc

phục hiện tượng này, độ phân cực của hệ dung môi sắc ký đã được giảm bằng cách

thay nước bằng isopropanol, tuy nhiên pic vẫn k o đuôi. Sau đó một tác nhân điều

chỉnh pH pha động về pH kiềm được thêm vào là triethylamin đã khắc phục được

hiện tượng k o đuôi của pic. Điều này có thể được giải thích như sau: do bản chất

tạp B và D là một amin có tính kiềm nên tạo liên kết hydro với pha t nh,

triethylamin thêm vào có tác dụng cạnh tranh tương tác với tạp chất B, D trên pha

t nh, hạn chế liên kết hydro của chất phân tích với pha t nh, giúp các phân tử của

chất phân tích được rửa giải cùng lúc.

- Nồng độ triethylamin sử dụng cũng phải phù hợp với bản chất của tạp chất

B, D và bản chất của cột. Qua khảo sát cho thấy đối với chất phân tích là 5-

methylthiazol-2-ylamin, nồng độ triethylamin 0,8 mM làm giảm hệ số k o đuôi tốt

hơn nồng độ triethylamin 1 mM. Triethylamin là một chất d bay hơi và tạo môi

trường kiềm cho vi khuẩn, do đó pha động khi thêm khi triethylamin chỉ sử dụng

trong vòng ngày để đảm bảo hệ thống HPLC không bị nhi m khuẩn.

- Tạp chất B tan tốt trong methanol, tuy nhiên tạp chất D chỉ tan được trong

hỗn hợp methanol + natrihydroxyd M. Lượng natri hydroxyd 1M thêm vào không

cố định mà phụ thuộc vào nồng độ của tạp chất D (khoảng 2 ml NaOH 1M cho 5

mg tạp chất D), cần khảo sát nồng độ natri hydroxyd thích hợp để lượng mẫu tan

hoàn toàn, tránh sai số khi đo.

- Khi sử dụng pha động có pH cao, cột sắc ký cần phải có khả năng chịu được

pH rộng để không làm giảm hiệu năng của cột. Cột Gemini-N được lựa chọn có

thể chịu được pH từ 1 - 14.

90

Tốc độ dòng khi khảo sát với cột dài 250 mm là 1 ml/phút nên khi khảo sát với cột

ngắn hơn ( cm), tốc độ dòng phải giảm để thu được pic chính có thời gian lưu

phù hợp. Khi tiến hành khảo sát tốc độ dòng 0,8 ml/phút, tạp chất B và D được rửa

giải nhanh hơn (tB = 3,287 phút và tD = 8,373 phút), có thể ảnh hưởng đến độ phân

giải và độ tinh khiết pic. Do đó tốc độ dòng được giảm xuống 0,6 ml/phút. Với điều

kiện này pic tạp chất B, D tách hoàn toàn các pic tạp của mẫu trắng và mặt khác, pic

tạp chất B, D cũng tách hoàn toàn với pic meloxicam.

4.3. Quy t nh định lượng các tạp chất B và D t ong nguyên liệu và chế

phẩm meloxicam

- Qua khảo sát nồng độ phân tích, dung dịch chuẩn có nồng độ meloxicam :

tạp chất B : tạp chất D lần lượt là 1000 µg/ml : 1 µg/ml : 0,5 µg/ml cho chiều cao

pic và diện tích pic tạp chất B, D chấp nhận được (chiều cao pic và diện tích pic tạp

chất B, D lần lượt là 0,005 AU và 53316 µAU*giây; 0,0025 AU và 25014

µAU*giây). Qua đánh giá quy trình phân tích đã chứng minh được ở nồng độ phân

tích này, phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác và độ đúng.

Meloxicam là chất k m bền với ánh sáng, có thể thủy phân nối amid, tạo sản phẩm

phân hủy trong đó có tạp chất B. Do đó trong quá trình chuẩn bị mẫu nếu không tiến

hành sắc ký ngay thì cần bảo quản mẫu ở nhiệt độ 0C, tránh ánh sáng.

91

CHƯƠNG 5 - KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LU N

Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề ra của luận văn,

với các kết quả như sau:

- Đã tinh chế hóa chất công nghiệp 2-amino-5-methyl-1,3-thia ol đạt độ tinh

khiết trên 99%, có thể dùng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất B của

meloxicam.

- Đã tổng hợp được N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-

hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd đạt độ tinh khiết

trên 98%, có thể dùng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất D của

meloxicam (Dược điển Anh 2010 [9]).

- Đã xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B và D bằng phương

pháp HPLC.

- Đã dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật của tạp chất B và D để ứng dụng trong kiểm

nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam.

- Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời tạp chất B và D trong nguyên

liệu meloxicam và thành phẩm bằng phương pháp H LC.

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau:

- Tiếp tục ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan B và D trên nhiều

mẫu nguyên liệu và thành phẩm meloxicam.

- Tiếp tục nghiên cứu theo d i độ ổn định của các chất đã điều chế để có thể

tính toán chu kỳ đánh giá lại chất chuẩn.

- Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp, tiêu chuẩn hóa các tạp chất liên quan khác và

xây dựng quy trình định lượng đồng thời các tạp chất liên quan của meloxicam.

Documents

tổng hợp tạp meloxicam