Pruebas de cinetica enzimatica

SEP DGETI SEMS

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO Industrial y de servicios N° 107TUXTEPEC OAXACA.

NOMBRE DEL ALUMNO: ÁUREA AÍDA AGUILAR FELIPE

CATEDRÁTICO: I.B.Q. MARIA DE JESUS ROBLES ORTEGA

SUBMÓDULO PROFESIONAL: APLICAR TECNICAS DE VALORACION METABOLICAS

PRACTICA: DETERMINACION CUANTITATIVA-COLORIMETRICA ENZIMATICA

DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

SEMESTRE: 6° GRUPO: “AL”

FECHA DE ENTREGA: ____ DE __________________ DEL 201_

CALIFICACIÓN Y OBSERVACIONES: _____________________________________

INTRODUCCION

La determinación de los niveles de triglicéridos, cuando se lleva a cabo en conjunto con otros ensayos de lípidos, proporciona una ayuda en el diagnóstico de hiperlipoproteinemia primaria y secundaria. También es útil para dar seguimiento a la diabetes mellitus, nefrosis, obstrucción biliar y varias anormalidades metabólicas que resultan de disturbios endocrinos.

1. El glicerol y los ácidos grasos se forman en una primera etapa por la acción de la lipasa sobre los triglicéridos.

2. El glicerol se fosforila por l adenosin-5’-trifosfato (ATP) para producir glicerol-3 fosfato (G-3-P) y adenosión-5’-difosfato (ADP) n una reacción catalizada por el glicerol-cinasa (GK).

3. La G-3-P es oxidada por la glicerolfosfato oxidasa, (GPO) produciendo dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrogeno.

4. Los peróxidos reaccionan con 4-aminoantipirina y 4-clorofenol bajo la influencia catalítica de las peroxidasas (POD) para formar una quinoneimina de color rojo.

OBJETIVO

Determinar la concentración de los triglicéridos en el suero

PROCEDIMIENTO

1. extraer 5ml de sangre sin anticoagulante2. centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 min.3. Separar el suero en un nuevo tubo debidamente rotulado y llevar a

centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos.4. Observar si hay un botón eritrocitario, si lo hay, vaciar el suero a otro

tubo ya rotulado, sin desprender el botón, y obtenernos suero libre de células.

5. Continuamos agregando 2.0ml a un tubo rotulado con la letra “M” de muestra.

6. Al tubo “M” le agregamos 200µl de suero problema, mezclar y llevar a incubar a 37°C por 5 min.

7. Procedemos a leer en el espectrofotómetro a 500nm8. Realizar cálculos.

Blanco “B” Estándar “St” Muestra “M”

Glicerol + ATP GK G-3-P + ADP

G-3-P + O2 GPO DAP + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + POD quinoneimina + HCl + 4H2O 4-clorofenol

Reactivo 2,0ml 2.0ml 2.0mlestándar - 200µl -muestra - - 200 µl

INTERPRETACION

Reactivo 1: es incoloro Al adicionar el suero al reactivo 1 se

torna un color crema

CALCULOS

Resultados.Los valores se derivan de la siguiente ecuación:1. Triglicéridos en suero (mg/dL) = A M x 200

AE

Donde AM y AE son los valores de absorbancia de la muestra y del estándar respectivamente, 200 es la concentración del estándar (mg/dL).

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APLICAR TÉCNICAS DE VALORACIÓN METABOLICAS

PRÁCTICA

DETERMINACION CUANTITATIVA-COLORIMETRICA ENZIMATICA DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

NOMBRE DEL PACIENTE: JUNCO GARCÍA PERLA RUBÍSEXO: F EDAD: 18 AÑOS FECHA: 22/03/11 HORA: 9:40AM

REPORTE

RESULTADOS:

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:

AUREA AIDA AGUILAR FELIPE 6°“AL”FIRMA

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VALORES DE

En suero/plasma:30 – 150 mg/dL





PRACTICA: DETERMINACION DE LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD (HDL) EN SUERO




INTRODUCCIONEl colesterol HDL constituye la parte de las lipoproteínas de alta densidad (High Density Lipoproteins), formadas por el 50.0% de proteínas (de las cuales el 90.0% apoA); el 18.0%, colesterol; el 2.0%, triglicéridos; y el 30.0%, fosfolípidos.El colesterol HDL es producido en el hígado. El colesterol que se encuentra en las células está inmerso en las secreciones biliares y, a través de la bilis, es eliminado en el intestino.Las fracciones de lipoproteínas de baja densidad (LD) y las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son precipitadas del suero o plasma, por medio del reactivo de cloruro de magnesio/dextran sulfato, de acuerdo a Finely et al.

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son determinadas en el fluido sobrenadante, utilizando el factor de dilución derivado en el cálculo.

OBJETIVOLa determinación de este parámetro es un procedimiento analítico básico para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias.

PROCEDIMIENTO

1. Extraer 5ml de sangre sin anticoagulante2. centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 min.3. Separar el suero en un nuevo tubo debidamente rotulado y llevar a

centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos. 4. Observar si hay un botón eritrocitario, si lo hay, vaciar el suero a otro


5. Continuamos agregando 50µl de reactivo 1 a un tubo rotulado con la letra “M” de muestra.

6. Al tubo “M” le agregamos 500µl de suero problema, mezclar y llevar a …7. Centrifugar a 7000r.pm. durante 10 minutos.8. Medimos 2.0ml de reactivo de trabajo al tubo “MF”9. Tomar 50µl de precipitado al tubo “MF”10. Incubar a 37°C por 5 minutos.11. Procedemos a leer en el espectrofotómetro a 500nm12. Realizar cálculos.

INTERPRETACIONReactivos: IncoloroReactivo y suero: se torna color rosáceo/crema.

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PRÁCTICA

DETERMINACION DE LIPOPROTEÍNAS

CALCULOSResultados

HDL-colesterol (mg/dL) = Abs M x 55

Abs St

DE ALTA DENSIDAD (HDL) EN SUERO


REPORTE

RESULTADOS:

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:

AUREA AIDA AGUILAR FELIPE 6°“AL”

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VALORES DE

Edad Hombre Mujer0-14 30-65 30-65

15-19 30-65 30-7020-29 30-70 30-7530-39 30-70 30-80>40 30-70 30-85

Media 45 55

Raza Negra: Aproximadamente 10 mg/dL más altos.




PRACTICA: DETERMINACION CUANTITATIVA-ENZIMATICO-COLORIMETRICA

DE COLESTROL TOTAL EN SUERO




INTRODUCCION

El método enzimático para colesterol fue introducido en 1973 por Flegg1 y Richmond2, utilizando colesterol oxidasa de origen bacteriano seguida de saponificación química de los ésteres del colesterol. Roeschlau3 modificó ésta técnica y Allain y Col4 publicó los primeros ensayos enzimáticos completos combinando el colesterol oxidasa y el colesterol estearasa. Este método se basa en el de Allain y utiliza estas enzimas en combinación con el reactivo peroxidasa/fenol-4-antipirina, de Trinder5.La colesterol estearasa (CE) hidroliza a los ésteres del colesterol para dar colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol libre así producido más el colesterol preformado se oxida en presencia del colesterol oxidasa (COx) para dar colesten-4-3-cetona y peróxido de hidrógeno. Un cromógeno quinonaimina, con absorción máxima a 500 nm, se produce cuando el fenol se acopla oxidativamente con 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa (POD) con peróxido de hidrógeno. La intensidad final del color rojo es

proporcional a la concentración total del colesterol. El Factor Aclarador Lipemico (LCF) es una mezcla de aditivos especialmente diseñados por Stanbio integrados dentro del reactivo de colesterol para ayudar a minimizarlas interferencias debidas a la Lipemia.

Esteres del colesterol CE Colesterol + Ácidos Grasos

Colesterol + O2 COx Colesten-4-3-cetona + H2O2

H2O2 + 4-Aminofenazona + fenol POD H2O + O-Quinonaimina colorante

OBJETIVO

En el laboratorio clínico, la aplicación más importante de la electroforesis es la separación de proteínas presentes en el suero, orina y otros fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo y el líquido sinovial. El objetivo principal de la práctica estará dirigido a la comprensión e identificación de conceptos físicos teóricos relacionados con este tipo de técnicas, así como la descripción de las mismas y su uso.

PROCEDIMIENTO




5. Continuamos agregando 2.0ml de reactivo a un tubo rotulado con la letra “M” de muestra.

6. Al tubo “M” le agregamos 20µl de suero problema, mezclar y llevar a …7. Incubar a 37°C por 5 minutos.8. Procedemos a leer en el espectrofotómetro a 500nm9. Realizar cálculos.

Blanco (B) Estándar (S) Muestra(U)

Reactivo 2.0ml 2.0ml 2.0mlEstándar 20µlMuestra 20µl

INTERPRETACION

Reactivos: IncoloroReactivo y suero: se torna color rosáceo/crema.

CALCULOSRESULTADOS

Los valores se derivan de los siguientes cálculos:

Colesterol total en suero (mg/dL) = AM x 200 AE

Donde AM y AE son los valores de absorbancias de la muestra y del estándar respectivamente y 20 es la concentración del estándar (mg/dL).

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PRÁCTICA

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA-ENZIMATICO-COLORIMETRICA DE COLESTEROL TOTAL


REPORTE

RESULTADOS:

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:


SEP DGETI SEMS




VALORES DE

Colesterol Total mg/dLCordón 45-100Recién Nacido 53-135Infante 70-175Niños 120-200Adolescentes 120-210Adultos 140-310Ideal p/adultos 140-200

Raza Negra: Aproximadamente 10 mg/dL más altos.


PRACTICA: DETERMINACION CUANTITATIVA DE LIPIDOS TOTALES




INTRODUCCION

Los lípidos insaturados reaccionan con el ácido sulfúrico en caliente con formación de iones carbonio. En una segunda etapa, éstos, en presencia de fosfovainillina dan una coloración rosada. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de lípidos totales presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLINICO

Los lípidos son compuestos orgánicos cuya función más importante es la de actuar como combustible. Poseen un extraordinario rendimiento, favorecido por la posibilidad de almacenarse en notables cantidades como tejido adiposo. Otras funciones: son constituyentes de las membranas biológicas, forman estructuras adiposas protectoras de los órganos internos, y proveen compuestos importantes en la formación de diversas hormonas. Gran parte del interés en el estudio del aumento de estos compuestos se debe a la conexión entre hiperlipemia y arteriosclerosis, diabetes y enfermedad cardiaca. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

PROCEDIMIENTO




5. Pipetear en tubos.

(Preparación del Hidrolizado)


H2SO4 2.5ml 2.5ml 2.5mlPatrón 100µl

Muestra 100µl

6. Mezclar energéticamente en ayuda de un agitador mecánico7. Incubar 10 minutos en un baño hirviendo (100°C)8. Enfriar en baño de agua fría, dosificar en cubetas y pipetear en tubos.

(Preparación Prueba)


Reactivo 2.0ml 2.0ml 2.0mlHidrolizado de la

Muestra100µl

Hidrolizado del Calibrador

100µl

9. Mezclar energéticamente con ayuda de un agitador mecánico10. Incubar a 37°C durante 15 minutos.11. Llevar a leer a 520nm

INTERPRETACION

Reactivo con suero: se torna color crema El Hidrolizado: es de color café pardo Reactivo de Lípidos con Hidrolizado: Color

crema/rosáceo

CALCULOS

Ab Muestra__ x 750 (Conc. Cal.) =mg/dL de lípidos totales en la muestraAb Calibrador

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PRÁCTICA

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LIPIDOS TOTALES


REPORTE

RESULTADOS: VALORES DE

Suero o plasma: 450 – 800 mg/dL

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:


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PRACTICA: DETERMINACION COLORIMETRICA CUANTITATIVA

DE ALBÚMINA EN SUERO




INTRODUCCION

En 1964, el verde de bromocresol (BCG) fue reportado como útil en la determinación cuantitativa de albúmina sérica por Bartholomew y Delaney y por Rodkey. Esta técnica de unión fue publicada nuevamente un año más tarde por Rodkey quien describió un procedimiento colorimétrico inverso de BCG específico para la albúmina a un pH de 7.05 y 615 nm.Al mismo tiempo Watson reporto que el BCG era más sensible para la albúmina que el anaranjado de metilo o el HABA (ácido 2-(4'-hidroxiazo benceno) benzoico), dos compuestos también utilizados en la cuantificación de albúmina sérica por unión coloreada (teñida).Posteriormente Dow-Pinto y Miyada et al reportaron la linealidad del método de BCG en 5 g/dL, con interferencias mínimas por lípidos, hemoglobina y bilirrubina, además de evidencias de una gran especificidad y sensibilidad así como una excelente correlación para los valores de albúmina entre la técnica de BCG y la de electroforesis.El método presentado es esencialmente el de Dumas, Watson y Biggs modificado por el uso de citrato en lugar del amortiguador de succinato, un amortiguador de baja concentración y una lectura colorimétrica final a 550 nm en lugar de 630 nm.

PROCEDIMIENTO




5. Pipetear en tubos los siguientes volúmenes.



6. Mezclar el contenido e incubar a 37°C por 15 segundos o 30 segundos a temperatura ambiente.

7. Inmediatamente lea las muestras y el estándar contra el reactivo Blanco a 550nm

INTERPRETACION

Reactivo: color verde pantano Reactivo con suero: Color verde bandera

CALCULOS

Calcule los resultados usando la siguiente ecuación:

Albúmina en suero o plasma (g/dL) = AM x 6.0 AE

Donde AM y AE son los valores de absorbancia de la muestra y del estándar respectivamente y 6.0 es la concentración del estándar (g/dL).

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PRÁCTICA

DETERMINACIÓN COLORIMETRICA-CUANTITATIVA DE ALBÚMINA EN SUERO


REPORTE

RESULTADOS:

______________________

VALORES DE

Suero o plasma: 3.8 a 5.1 g/dL

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:


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PRACTICA: DETERMINACION CUANTITATIVA COLORIMETRICA

DE PROTEÍNAS TOTALES EN SUERO




INTRODUCCION

Las moléculas de Proteínas contienen un gran número de péptidos unidos. Cuando se tratan con iones de cobre (Cu2+) en solución alcalina, se forma un complejo coloreado entre el cobre y los grupos amino/carbonil de estos péptidos. Una reacción igual ocurre con el Biuret (compuestos más simples formados por el calentamiento de la urea). Así fue adoptado el término de “Reacción de Biuret”El método descrito está basado en los reportes de Weischselbaum y Gornal et al. El color violeta desarrollado es directamente proporcional al número de enlaces peptidicos de las proteínas e independiente de la concentración relativa de albúmina y globulina.

OBJETIVO

Determinar la concentración de nitrógeno presente en la muestra para luego ser transformado a través de un factor en proteína.

PROCEDIMIENTO




5. Pipetear en tubos.

Reactivo Blanco (RB)

Estándar (S) Muestra(U)


6. Dejar los tubos incubando por lo menos 5 minutos a 37°C o a temperatura ambiente por 10 minutos.

7. Leer el estándar y muestra contra RB a 500-505nm en el transcurso de una hora.

INTERPRETACION

Reactivo proteínas: Color Azul Claro Reactivo con suero e incubación: color azul un poco más

denso

CALCULOS

Los valores se derivan de la siguiente ecuación:

Proteínas Totales séricas (g/dL) = AM x (10) AE

Donde AM y AE son los valores de las absorbancias de la muestra y el estándar respectivamente y 10 g/dL es la concentración del estándar.

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PRÁCTICA

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA-COLORIMETRICA DE PROTEÍNAS TOTALES EN SUERO

NOMBRE DEL PACIENTE: GARDOZO VARGAS EMMANUELSEXO: M EDAD: 18 AÑOS FECHA: 01/04/11 HORA: 9:40AM

REPORTE

RESULTADOS:

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

VALORES DE

Suero o plasma: 6.6 a 8.3 g/dL.

ANALISTA:


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PRACTICA: DETERMINACION CUANTITATIVA-COLORIMETRICA DE LA GLICOHEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL



CALIFICACIÓN Y OBSERVACIONES: _____________________________________INTRODUCCION

La Glicohemoglobina es formada progresivamente e irreversiblemente en los eritrocitos durante sus 120 días de vida. La concentración de Glicohemoglobina en los glóbulos rojos depende del promedio de concentración de glucosa durante un cierto periodo de semanas y es estable durante la vida de la célula. Por lo tanto la medición de la Glicohemoglobina, como por ciento de la hemoglobina total, brinda un método de ayuda para el control del paciente diabético, ya que los niveles de glycohemoglobina se acercan a los valores normales dependiendo de cómo el diabético responda al tratamiento.Abraham et. al reportó una excelente correlación entre la concentración de Glicohemoglobina y el control diabético. En el método presentado, se mezcla un hemolizado de sangre total con una resina de intercambio catiónico. La hemoglobina no glicosilada (HbA0) se une a la resina, dejando la (HbA1) libre para que se pueda remover mediante un separador de resina en el sobrenadante. El porcentaje de HbA1, se determina midiendo los valores de absorbancia a 415 nm de la fracción HbA1 y de la fracción de Hb total, calculando la proporción de absorbancias (R) y comparando esta proporción con un estándar de glicohemoglobina al que se le practicó el mismo procedimiento. Los resultados son expresados como HbA1 también se puede convertir o reportar como HbA1c

OBJETIVO

Cuando se determina la Glicohemoglobina en el control del diabético, se está evaluando el comportamiento de su glicemia durante un período previo mínimo de cuatro semanas, lo cual da una imagen global del manejo del paciente que no se ve afectada por fluctuaciones de la glicemia de corto término.

PROCEDIMIENTO




5. Pipetear en tubos.(Preparación del Hemolizado)

Estándar (S)

Muestra(U)

Reactivo de lisis 500µl 500µlEstándar de 100µl

GlicohemoglobinaMuestra (sangre Total) 500µl

6. Medir 500µl del reactivo de lisis, pasarlo a la sangre 100µl - hemolizado7. Medir 100µl de lisado y vaciar resina, mezclar metiéndoles al tubo el manguillo y8. Se mezcla por 5 minutos. Se deja reposar por 60 minutos

aproximadamente.

9. Pasados los 5 minutos, se introduce un poco más el manguillo10. Esperar 60 minutos.

CALCULOS

Para cada Estándar y Muestra calcule el Rango (R) de absorbancia de la Glicohemoglobina y de la absorbancia de la hemoglobina total como sigue:

R = A gly___ A tot

Glicohemoglobina (%) = R (Muestra) x R (Estándar)

Resina + 100µl de sangre

Mezclar: destapar y mezclar

Manguillo

Mezclar 5 minutos.

Concentración del x Estándar de la Glicohemoglobina (%)

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PRÁCTICA

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA-COLORIMETRICA DE GLICOHEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL

NOMBRE DEL PACIENTE: GARDOZO VARGAS EMMANUELSEXO: M EDAD: 18 AÑOS FECHA: 01/04/11 HORA: 9:40AM

REPORTE

RESULTADOS

______________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________________________________________

ANALISTA:

VALORES DE

Glicohemoglobina A1

Valores Glicohemoglobina A1C

valores

Rango normal 6.0 – 8.0 %

Rango normal 4.2 – 6.2 %

Diabético DiabéticoBuen control 7.5 – 8.9

%Buen control 5.5 – 6.8 %

Control medio 9.0 – 10.0 %

Control medio 6.8 – 7.6 %

Control pobre Arriba de 10.0 %

Control pobre Arriba de 7.6 %


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