“Frequenza di occorrenza del tetrapeptide HGGG e sue possibili implicazioni

biologiche”

Relatore

Prof.ssa Silvia Morante

Candidato

Stefania Alleva

Anno Accademico 2005/2006

Tesi di Laurea Triennale in Fisica

Università degli studi di Roma

“Tor Vergata”Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e

Naturali

SOMMARIO Introduzione: le malattie neurodegenerative;

La Proteina Prionica: i motivi ripetuti e il legame con il Cu+2;

Tecniche utilizzate per studiare il sito di legame PrP- Cu+2: Diffrazione a raggi X; Spettroscopia XAS; Spettroscopia EPR; Simulazioni numeriche;

Analisi statistica sulla frequenza di occorrenza del tetrapeptide HGGG: verifica della rarità;

Ricerca di omologie, affinità, relazioni tra le proteine umane dotate del peptide studiando: struttura primaria, struttura secondaria, struttura terziaria, idropaticità, sito di legame per i metalli;

Conclusioni e sviluppi futuri.

MALATTIE NEURODEGENERATIVE

Agente infettivo:

PROTEINA

MALATTIE NEURODEGENERATIVE

Morbo di Parkinson

Morbo di Alzheimer

Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE)

CJD

nvCJD

MISFOLDING

AGGREGAZIONE

LA PROTEINA PRIONICA (PrPc) Glicoproteina di membrana (cellule presinaptiche)

Numero di a.a. variabile da specie a specie

Dominio globulare (strutturato e intramembrana) e dominio non strutturato extramembrana nella

regione N-terminale

Presenza nel dominio N-terminale di vari octarepeats (PHGGGWGQ), potenziali siti di legame per il Cu+2

Funzione esatta ignotaIPOTESI PIU’ ACCREDITATE

1. Traduzione di segnali cellulari

2. Adesione molecolare

3. Trasporto e chelazione del rame

4. Antiossidante

LA PROTEINA PRIONICA SCRAPIE (PrPsc) L’agente patogeno della TSE è la PrPsc, forma anomala della PrPc, in cui tratti di α elica

sono sostituiti da β-sheet all’estremità C-terminale

Misfolding probabilmente legato all’interazione con Cu+2

La PrPsc si accumula nel CNS portando, dopo anni, alla rottura della barriera ematoencefalica

Modello diffusione intracellulare cerebrale “domino-stone”

Contagio avviene in genere per progressivo misfolding e aggregazione di PrP adiacenti ma la malattia può essere trasmessa per iniezione di PrPsc intraoculare, intravenosa e intracerebrale. La PrPsc raggiunge, trasportata dalle cellule B, le terminazioni nervose senza danneggiare organi e

tessuti attraversati

DETERMINARE LA COORDINAZIONE OCTAREPEAT-Cu+2

Diffrazione a raggi X

Spettroscopia XAS

Spettroscopia EPR

Simulazioni numeriche

DIFFRAZIONE A RAGGI XPermette di determinare la disposizione degli atomi in strutture ordinate (cristalli)

Un fascio di fotoni (raggi X) è inviato sul campione

Le nubi elettroniche degli atomi diffrangono tali onde che

interferiscono

Dai pattern di diffrazione si elaborano modelli strutturali del

sistema analizzato

Confronto pattern di diffrazione simulati e

sperimentali

STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA AI RAGGI X DEL COMPLESSO HGGGW-Cu+2

Legame peculiare HGGGW/Cu+2

Nε dell’H1

N deprotonati di G2 e G3

O di G3

O di una molecola H2O

La catena laterale del W è parallela al piano equatoriale

Probabilmente tiene in sito l’H2O

Il metallo è legato alla catena

principale

Burns C.S., Aronoff-Spencer E., Dunham C.M., Lario P., Avdievich N.I., Antholine W.E., Olmsteam M.M., Vrielink A., Gerfen G.J., Peisach J., Scott W.G., Millhauser G.L..

Biochemistry

dE0eI)E(I

SPETTROSCOPIA XAS (X-ray Absorption Spectroscopy)

Legge di Lambert-Beer

Campione in qualsiasi stato di aggregazione;

Non esistono regole di selezione;

Acquisizione rapida dello spettro.

Vantaggi

SPETTRO XAS

Energia di soglia

• Energia di ionizzazione elettrone interno

• Molteplici per ogni specie atomica

• Distinguibili per atomi con Z diversi ed elevati

ATOMO ISOLATO SISTEMA MULTIATOMICO

K-edge =>1s

Spettro XAS analizzato in termini della quantità χ(k)

k

kkk

0

0

2

0Em2k

)k(kR2sinee),k(AkR

NS)k( ii

)k(R2

i

k2i2

i

i20

i2i

2

k è il vettore d’onda del fotoelettrone emesso

Per energie sufficientemente elevate è adottabile l’approssimazione di singolo scattering (regione EXAFS)

Fase e ampiezza onde di back scattering sono caratteristiche

per ogni specie atomica.

Ma per atomi leggeri (C, O, N)

NON sono DISTINGUIBLI

È necessario introdurre i termini di scattering multiplo per distinguere i vari a.a. (regione XANES)

132

,,12,11

,,2,1; S

C

S

CCSiiSiiSiS

SA

χ(k) è approssimato da una sommatorie di un numero finito di termini irriducibili

A

ii;Aii;A

0

n1nI

n1)1n(

DATI XAS IN COMPOSTI OCTAREPEATS-Cu+2

Morante S., González-Iglesias R., Potrich C., Meneghini C., Meyer-Klaucke W., Minestrina G., Gasset M. (2004). J. Biol. Chem..

Dati XAS alla soglia K del Cu+2 in composti con numero vario di octarepeats e diversi

rapporti di concentrazione peptide /Cu+2 (R)

Sequenza peptidi utilizzati Numero siti R

  legame Cu+2  

KKRPKPWGQPHGGGWGQ 1 0,5

KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ)2 2 1,5

KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ)4 4 2

BoPrP-(24-242) 6 3

REGIONE XANES

Stesso stato di ossidazione

REGIONE EXAFSSi osservano delle differenze

GEOMETRIA INTRA-REPEAT

(1 o 2 octarepeats)

GEOMETRIA INTER-REPEAT

(4 o 6 octarepeats)

GEOMETRIA DI COORDINAZIONE INTRA-REPEAT

Il fit è compatibile con una struttura identica a quella cristallografica in cui il legame è completamente nel singolo octarepeat

Ciascun atomo di rame è legato a tre atomi di azoto e uno di ossigeno posti su un piano

Il fit è compatibile con la presenza di un atomo di ossigeno a distanza maggiore e su un piano ortogonale

GEOMETRIA DI COORDINAZIONE INTER-REPEAT

Il Cu+2 è legato agli anelli imidazolici di due His di octarepeats diversi

NB: Se la concentrazione di Cu+2 non satura tutti gli octarepeats

Il legame avviene tra diversi octarepeats

Se appartengono a diverse PrP potrebbe

favorire l’aggregazione

SPETTROSCOPIA EPR (Electron Paramagnetic Resonance)

Basata sull’assorbimento di energia da parte di un sistema dotato di un elettrone spaiato immerso in un campo magnetico statico (H)

L’Hamiltoniana del sistema

H=He+Hiperfine= βS·g·H + S·A·I

Interazione col campo magnetico

Interazione iperfine

Campo magnetico efficace

Rapporto giromagnetico considera lo splitting Zeeman

Energia di contatto di Fermi

Termine dipolare

ATOMO DI IDROGENO

Sono permesse (per l’idrogeno S=1/2 e I=1/2) solo le transizioni

h2

AgHE

Risultati

Cu+2 lega preferibilmente l’octarepeat

La geometria di coordinazione dipende dalla concentrazione relativa peptide/Cu+2

Diverso ruolo delle His e delle Gly nel legare il metallo

Sono stati simulati spettri EPR implementando la precedente Hamiltoniana in sistemi contenenti uno o due ioni Cu+2 , in approssimazione di geometria rigida e usando sequenze peptidiche diverse per numero di octarepeats e composizione in a.a.

SIMULAZIONI EPR IN COMPOSTO OCTAREPEAT-Cu+2

Chattopadhyay, M.; Walter, E. D.; Newell, D. J.; Jackson, P. J.; Aronoff-Spencer, E.; Peisach, J.; Gerfen, G. J.; Bennett, B.; Antholine, W. E.; Millhauser, G. L. (2005).

J. Am. Chem. Soc.

Componenti dello spettro EPRCOMPONENTE 1

Cu+2 satura tutti gli octarepeats

Stessa struttura della cristallografia

COMPONENTE 2

Concentrazione intermedia Cu+2

Riduzione distanza tra atomi

Cu+2 si lega a Nε e N dell’His e agli O di due H2O

Stabilizzato da più octarepeats

COMPONENTE 3

Bassa concentrazione Cu+2

Un singolo Cu+2 è legato a tre Nε delle His

Peptidi con 3 o 4 octarepeats

Lo spettro mostra tutte le componenti ma la forma varia con la concentrazione

SEQUENZE UTILIZZATE E COMPONENTI DELLO SPETTRO EPR

SEQUENZA PEPTIDICACOMP

N. 1COMP

N. 2COMP

N. 3

KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ)4 X X X

(PHGGGWGQ)3 X X X

HGGGWGQPHGGGW X X  

PHGGGWGQ X    

HGGGW X    

KKRPKPWGQ(PHGXGWGQ)4   X X

HGXGWGQPHGXGW   X  

HGXGW   X  

HXGGW   X  

HGGGWGQPYGGGW X    

YGGGWGQPHGGGW X    

HGGGWGQPYGGGWGQPHGGGW X    

La sostituzione di una G con X comporta una modifica del sito di legame

HGGGWGQPYGGGW X    

YGGGWGQPHGGGW X    

HGGGWGQPYGGGWGQPHGGGW X    

Sostituendo l’His con Tyr cambia il sito di legame

KKRPKPWGQ(PHGXGWGQ)4   X X

HGXGWGQPHGXGW   X  

HGXGW   X  

HXGGW   X  

SIMULAZIONI NUMERICHE

Simulazioni di dinamica molecolare del tipo Car-Parrinello per studiare la coordinazione del Cu+2

RISULTATI

Il legame tra il Cu+2 e gli azoti deprotonati delle G2 e G3 è

estremamente stabile

La presenza del triptofano W5 sembra non avere

influenza sulla stabilità del legame

Usando dipeptidi [Cu(HGGG)]2 è stata

messa in evidenza una struttura “entangled”

I due ioni nei diversi peptidi si

scambiano dinamicamente i

leganti

Furlan S., Guerrieri F., La Penna G., Morante S., Rossi G.C.

Journal of Biological Inorganic Chemistry; European Biophysics Journal

FREQUENZA DEL TETRAPEPTIDE TRA LE SEQUENZE UMANE

IPOTESIIPOTESI: HGGG nocivo in tutte le proteine

TESITESI: La selezione naturale ha eliminato il motivo dalle sequenze proteiche

HGGG frequenza significativamente minore dell’aspettato

Analisi statistica usando “l’algoritmo delle parole rare”

Una sequenza oligopeptidica (r) in una sequenza proteica è detta parola (b1b2…br)

BIAS: parole rare in parole più lunghe: si ipotizza un processo Markoviano di ordine (r-2)

Sfruttando iterativamente il teorema della probabilità condizionata

)b...bb(P

)b...bb(P)b|bbb(P

1r211r

r21rr1-r21

Identificando la probabilità con la frequenza di occorrenza

Colosimo A., Morante S, Parisi V. and Rossi G. C.

J. theor. Biol.

Frequenza sperimentale Frequenza teorica attesa

)b...bb(E

)bb...b(E)b...bb(E)b...bb(T

1r322r

r1r21r1r211rr21r

r

r21rr21r N

)b...bb(K)b...bb(E

Questi valori vanno confrontati

)b...bb(T

)b...bb(E)b...bb(D

r21r

r21rr21r

D>>1; D<<1 parola significativamente abbondante o rara a opera della selezione naturale

D ≈ 1 parola compare con frequenza non significativamente diversa dal valore teorico aspettato

si introduce la variabile

MISURA DI T4(HGXY) e E4(HGXY)

Algoritmo delle parole rare utilizzato per determinare la frequenza delle quadruplette

HGXY

Programma “cicle.pl” legge tutte le sequenze proteiche umane depositate e misura, restituendoli in output, il numero di volte e in quante proteine compaiono i peptidi HGX,

GXY, GX e HGXY

Programma “ratio.pl”, dopo aver calcolato i valori delle variabili E r(b1b2…br) per ogni parola scelta e quello di T4(HGXY) , calcola D4(HGXY) e lo restituisce in output

RisultatiD4(HGGG)≈0,75

HGGG risulta raro

63 peptidi hanno D4(HGXY)<D4(HGGG)

157 proteine su oltre 29760 analizzate

hanno HGGG

)GX(E

)GXY(E)HGX(E)HGXY(T

2

334

)HGXY(T

)HGXY(E)HGXY(D

4

44

CORREZIONI SUL CAMPIONE

eliminare dal campione le sequenze ipotetiche

controllare gli aggiornamenti delle informazioni depositate

in banca dati

eliminare le ripetizioni

controllare i siti di taglio

Campione iniziale costituito da 157 proteine umane contenenti il peptide HGGG e identificate con codici diversi

ALLINEAMENTO MULTIPLO(ClustalW)

Raggruppato proteine con definizione simile

Allineate con “gap open penality” massima, “gap extension penality”

minima e matrice di identità

Se le sequenze erano allineate e le funzioni molecolari identiche una sola proteina è stata considerata

Campione finale costituito da 99 proteine umane diverse e contenenti il peptide HGGG

CORREZIONI

RICERCA DI OMOLOGIESe HGGG ha un ruolo

simile in tutte le proteine in cui si trova

Potrebbe trovarsi in una regione scarsamente

interagente con l’ambiente circostante

Esiste il PDB SOLO di un’altra proteina

oltre la PrP

PrP oltre a legare Cu+2 è una proteina di membrana Classificato le proteine

Proteine che legano metalli

Proteine di membrana

Funzione esatta PrP ignota

Ricercato funzione molecolare svolta e processo biologico in cui

interviene per ogni proteina

Analisi struttura primaria

Informazioni sugli altri livelli strutturali

Lunghezza proteine

Localizzazione peptide

Profili idropaticità

Struttura secondaria Il peptide è in una regione di random-coil nella PrP

PROTEINE CHE LEGANO METALLI

20 proteine legano metalli

15 Zn

3 Cu

1 Fe

1 Zn-Fe-Co-Mn

Ricerca del sito di legame

Solo di 10 proteine che legano Zn

In due “zinc-finger protein” l’HGGG è parte dello “zinc-finger domain”

(C2H2)

“Zinc-finger domain”

Dominio costituito da 25-30 a.a. che lega Zn

Presente in molte proteine

Esistono vari classi

Più comune (C2H2)

“Zinc-finger protein”

Sono dotate dello zinc-finger domain

Proprietà specifiche (legano DNA con il dominio)

Allineamento multiplo

PrP con altre leganti Cu+2

PrP con le tre zinc-finger protein dell’elenco (lett.)

PrP con le due zinc-finger protein precedenti

PrP con ognuna delle due zinc-finger protein precedenti

ClustalW con opportuni punteggi di penalità e varie

matrici di simiglianza

Nessun risultato soddisfacente

BUON ALLINEAMENTO

ALLINEAMENTO PrP-Zinc Finger Protein

HGGG compare due volte nella zinc

finger protein

PROTEINE DI MEMBRANA

27 proteine di membrana

4 legano metalli

3 Cu

1 Fe

Stimato le regioni transmembrana

PrP ha il dominio N-terminale (comprende HGGG)nella regione

non citosolica, il dominio C-terminale all’interno della cellula

e due regioni transmembrana

TMHMM2

RISULTATI

HGGG non è mai in una regione transmembrana

In 3 casi l’HGGG è nella regione citosolica

In 24 casi l’HGGG è nella regione non citosolica

In 13 casi le proteine non hanno regioni transmembrana

Verifica validità del programma con dati noti della PrP

PROCESSO BIOLOGICO A B C

Metabolismo 23 6 4

Regolazione Metabolismo Acidi Nucleici 23 0 9

Comunicazione Cellulare E Trasduzione Dei Segnali 14 9 1

Crescita & Mantenimento Cellulare 11 5 2

Risposta Immunitaria 1 1 0

Trasporto 4 4 1

Apoptosi 1 0 0

Sconosciuto 20 2 3

PROCESSO BIOLOGICO

La maggior parte delle proteine prende parte a

processi metabolici (13 C)

FUNZIONE MOLECOLAREFUNZIONE MOLECOLARE A B C

Enzima 21 6 6

Regolatore 9 1 2

Recettore 5 5 0

Strutturali 9 3 1

Ligandi 7 4 3

Trasporto 5 5 1

Chaperone 1 0 0

Fattori Di Trascrizione 11 0 2

Sconosciuta 29 3 5

Recenti studi sostengono che la PrP potrebbe essere un fattore di

trascrizione

L’allineamento non ha mostrato risultati interessanti

LUNGHEZZA PROTEINELunghezza di una

proteinaStruttura e

funzioni svolte

Confrontare il nostro campione con tutte le sequenze proteiche

depositate in banca dati

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

1\50

51\10

010

1\150

151\2

0020

1\250

251\3

0030

1\350

351\4

0040

1\450

451\5

0050

1\550

551\6

0060

1\650

651\7

0070

1\750

751\8

0080

1\850

851\9

0090

1\950

951\1

000

1001

\1100

1101

\1200

1201

\1300

1301

\1400

1401

\1500

1501

\1600

1601

\1700

1701

\1800

1801

\1900

1901

\2000

2001

\2100

2101

\2200

2201

\2300

2301

\2400

2401

\2500 >250

0

Intervallo lunghezza

Num

ero

prot

eine

Sequenze banca dati

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1\50

51\10

010

1\150

151\2

0020

1\250

251\3

0030

1\350

351\4

0040

1\450

451\5

0050

1\550

551\6

0060

1\650

651\7

0070

1\750

751\8

0080

1\850

851\9

0090

1\950

951\1

000

1001

\1100

1101

\1200

1201

\1300

1301

\1400

1401

\1500

1501

\1600

1601

\1700

1701

\1800

1801

\1900

1901

\2000

2001

\2100

2101

\2200

2201

\2300

2301

\2400

2401

\2500 >2

500

Intervallo lunghezza

Nume

ro pr

oteine

Sequenze nostro campione

Numero diverso di proteine con cui è stata realizzata la distribuzione;

Banca dati non solo sequenze proteiche umane

Picco della distribuzione è a lunghezza maggiore nel nostro campione

SEQUENZE SEGNALE & LOCALIZZAZIONE DEL PEPTIDE

SIGNAL PEPTIDE = breve sequenza (3-60 a.a.) utilizzata per il

trasporto della proteina

Regione Iniziale (N-terminale) primi 60 a.a.

Regione Finale (C-terminale) ultimi 60 a.a.

HGGG nella regione N-terminale 21

HGGG nella regione C-terminale 9

HGGG tende preferibilmente a trovarsi in una regione centrale della sequenza

(69/99)

Nella PrP i primi due octarepeats sono nella

regione iniziale

PROFILI DI IDROPATICITA’

IDROPATICITA’

Misura del ΔG di trasferimento di un soluto da un solvente apolare a uno polare

ΔG =ΔH-T ΔS

Misura la propensità di un a.a. a collocarsi in una regione polare (ΔG < 0 a.a.idrofilico) o

apolare(ΔG >0 a.a. idrofobico)

Si realizzano delle scale di idropaticità in base ai valori di ΔG

Sequenza => stringa di numeri

Profili di idropaticità

Profilo della PrPProfilo della PrP

Realizzato con ProtScale

L’HP del singolo a.a. è mediata sui primi vicini

Valore di riferimento -0,4 (HP Gly)

RISULTATI Tutte le proteine sono caratterizzate da zone anfifiliche

La maggior parte delle proteine che legano metalli sono anfifiliche

Proteine sono di membrana sono prevalentemente anfifiliche

ANALISI DELLA REGIONE ATTORNO IL TETRAPEPTIDE

Nella metà dei casi il peptide è in una regione anfifilica

Nel 40% dei casi è in una regione idrofilica

In 7 peptidi è localizzato in una regione idrofobica

Nella PrP e nelle due “zinc-finger protein” in cui l’H partecipa al sito di legame il peptide è in una regione idrofilica compresa tra due regione

idrofobiche

STRUTTURA SECONDARIAα ELICA β sheet Random-coil

Ciascun a.a. ha una propensità a trovarsi in

una struttura

Predire la struttura

secondaria

HNN (corrispondenza con la realtà superiore al 60%)

Abbiamo rilevato che:

Il peptide HGGG si colloca preferibilmente in una regione di random coil

Solo in 6 proteine l’His è in una regione strutturata ;

La maggior parte delle proteine ha una struttura prevalentemente random-coilSTRUTTURA SECONDARIA

58

20

4

8 9

0

10

20

30

40

50

60

70

>50%random coil

>random coil

elica=random coil

> elica >50% elica

CONCLUSIONI & FUTURI SVILUPPI Il motivo HGGG è risultato significativamente raro nelle sequenze proteiche umane depositate

Non è stata individuata una caratteristica comune alle proteine che lo contengono che possa chiaramente indicare le ragioni della rarità

Ripetizione dell’intera procedura di analisi sul peptide GGGH

Utilizzare simulazioni numeriche ed esperimenti in vitro per misurare l’affinità per il Cu+2 delle proteine del campione simili alla PrP

Raffinamento delle tecniche di allineamento con l’uso di altre matrici di proprietà

Raffinamento dell’analisi dei profili di idropaticità

Verifica del dato relativo alla quasi totale assenza nel campione (2/100 contro un valore medio di 40/100) di proteine di cui è nota la struttura