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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPASFacultad de ciencias químicasCampus IV (Extensión Ocozocoautla)

BIOQUIMICA 4° Semestre

BIOQUIMICAProfesor: Dra. Ana Olvia Cañas Urbina

Licenciatura: Químico Farmacobiólogo

Alumna:

Espinoza López YuridiaGómez Pérez Maritza Elizabeth

Hernández Nigenda Diana Laura. Morales Gonzáles Ana Laura.

Zamayoa Espinosa Aida Patricia

Cuarto semestre

Ocozocoautla de Espinosa Chiapas Noviembre del 2015

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Ocozocoautla)

Práctica 5“actividad de la

enzima succinato

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INTRODUCCIÓN

Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones

desde una molécula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente

oxidante) (Jenner Us Martin, 2014). Según González nos dice que las enzimas

oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia

de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo oxidasa.

Según Sierra en el 2013 nos dice que las células de la gran mayorías de los

organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de óxido reducción

mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a través de la degradación

de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético

(ATP). La succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del grupo

de las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy importante en el metabolismo

oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato. Esta enzima se

localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el

succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el

azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o

viceversa. Según Gonzalez en el 2010 nos dice la coloración de la oxidación y

reducción del azul de metileno al cambiar su estado redox.

Indicador Color (reducido) Color (oxidado)

Azul de metileno Incoloro Azul

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La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para

formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima está sujeta a una

poderosa inhibición competitiva por parte de reactivos como el fenol lo cual

constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio

(Sierra, 2013). Para estudiar el transporte de cargas en la reacción se empleó un

aceptor artificial de electrones (azul de metileno), cuya decoloración permite

diferenciar la actividad enzimática en los ensayos a realizar en la presente

práctica.

OBJETIVO

Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reacción colorimétrica.

MATERIALES Y MÉTODO

MATERIALES

2 tubos de ensaye Baño maría a 50°C

pipetas de 5ml Pinzas para tubo de ensaye

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Figura 1.- Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de laboratorio. Bioquímica. Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla. UNACH, citado por Cañas en el 2015.

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Reactivos

NaOH Azul de metileno al

0.1%

Acido succínico Aceite mineral

Fenol al 90% Hígado de pollo

METODOLOGÍA

RESULTADO

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Pesar 1g de hígado de pollo.

En el mortero molerlo con 3 o 4 ml de ácido

succínico, hasta obtener una masa.

Transferir en partes iguales a 2 tubos.

Incube ambos tubos por 10 minutos en el baño maría (50%)

Observe los cambios

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Concentraciones:

g soluto :( porcentaje enmasa )(gdedisolución)

100

gsoluto :(90% )(20 g)100% =18 gde fenol

Se necesitan 18 g de fenol en 20 ml de disolución.

gsoluto :(3% )(50g)100% =1.5 gdeácido succinico

Se necesitan 1.5 g de ácido succínico en 50 ml de disolución.

Tubo 1: Con fenol Tubo 2: Sin fenol.

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Ilustración 2: El tubo 1 contiene fenol y el tubo 2 no contiene. En el tubo 2 hubo cambio de coloración a transparente y en el tubo 1 no hubo separación y además formo un halo a incoloro. Después de calentar a baño maría.

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DISCUSION DE RESULTADOS

En la práctica, se utilizó 1 gramo de hígado de pollo y se mezcló con ácido succínico; esto se hizo debido a que en el hígado se encuentra la enzima de interés, es decir, la enzima succinato deshidrogena y el ácido succínico es el que nos ayudó a reducir el azul de metileno en lugar del succinato. (Alberto, 2012)

Después de mezclar el hígado con ácido succínico, obtuvimos una masa que fue repartida por partes iguales en dos tubos de ensayo; a uno de los tubos se le añadió fenol (tubo 1), el cual ayudo a inhibir la actividad de la enzima ya que ocurre una desnaturalización.En este paso se observó que el tubo 1 (con fenol), separó la masa de hígado con ácido succínico del fenol agregado.

Posteriormente, se agregó azul de metileno a los dos tubos, haciendo que el tubo 1 se coloreara de azul y el tubo 2 (sin fenol) se coloreara de café, este paso se realizó, ya que el azul de metileno fue el aceptor de electrones del complejo succinato-FADH2. Después, se agregó aceite de bebé, ya que contiene aceite mineral, este se encargó de aislar los dos tubos de ensayo del aire del ambiente y así prevenir la oxidación temprana del FADH2. (Alberto, 2012)

Finalmente, se calentó a baño María por 10 minutos a 50°C con el fin de que la enzima fuera liberada de la mitocondria.

En general, cada uno de los reactivos desempeño una función importante en la realización de la práctica, como resultado final se obtuvieron dos tubos uno de color transparente (tubo 2) y en el otro se formó un halo incoloro (tubo 1), en ambos la enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico actuó como una oxidorreductasa, ya que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD.El succinato cedió un H2 que es transferido del FADH2 al azul de metileno, por lo que este cambio su estado redox de coloreado a incoloro o viceversa. (Alvarado & et. Al. 2008)

CONCLUSIÓN.

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Se logró llegar al objetivo debido a que se obtuvo como se esperaba una decoloración en el tubo 2, ya que hubo una reducción del azul de metileno que fueron cedidos desde el FADH2 obteniendo FAD oxidado y azul de metileno reducido, y en el tubo 1 no hubo una decoloración debido a la inhibición del fenol, con la realización de esta práctica se comprobó la acción de la enzima succinato deshidrogenasa.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido?En estado reducido el color es azul y en su estado oxidado es incoloro.

2. ¿Cuál es la función del fenol en la reacción?El fenol inhibe la actividad de las enzimas ya que desnaturaliza las proteínas, en este caso a la enzima deshidrogenasa, provocando la pérdida de su actividad.

3. ¿En qué vía metabólica está involucrada la enzima succinato deshidrogenasa? Lista los activadores, inhibidores, Km y mecanismo de rx de ésta enzimaLa oxidación del succinato a fumarato está involucrada en la reacción 6 del ciclo de Krebs.Activadores: α glicerofosfato, acido beta oxibutirico, isocitrato y proteína SDHA F2.Inhibidores: 2-Oxoglutarato, oxalato y ácido oxaloacéticoKm: 0.3 mMEn la succinato deshidrogenasa el anillo isoaloxazina del FAD está unido covalentemente a la cadena lateral de una histidina del enzima. El FAD es el aceptor de hidrógeno en esta reacción por que el cambio de energía libre es insuficiente para reducir al NAD+¿ ¿ .

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REFERENCIAS

Alberto.(04 de marzo de 2012).Determinación de la actividad de succinato deshidrogenasa. Recuperado de HYPERLINK "http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci%C3%B3n-De-La-Actividad-De-Succinato/3600966.html"http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci%C3%B3n-De-La-Actividad-De-Succinato/3600966.html.

Alvarado & et.al. (2008). BIOQUIMICA II. Obtenido de http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/media/users/10/523320/files/51871/Ma.

BRENDA. (2015). Información sobre EC 1.3.99.1 - succinato deshidrogenasa. Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de: http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.3.99.1&Suchword=succinato+deshidrogenasa&organism%5B%5D=#INHIBITORS

Berg, J., Tymoczko, J. & Stryer, L. (2008). Bioquímica. El oxalacetato se regenera por oxidación del succinato. (pp. 487-488). Barcelona: Reverté. Recuperado de: https://books.google.com.mx/books?id=HRr4MNH2YssC&pg=PA487&lpg=PA487&dq=MECANISMO+DE+RX+DEL+SUCCINATO+DESHIDROGENASA&source=bl&ots=LUtJN3Ci9x&sig=jdxTYlxJ-6wXAD96uB9SGdTl-lc&hl=es&sa=X&ved=0CCwQ6AEwA2oVChMI04-4uN3_yAIVwUImCh11BQsz#v=onepage&q=MECANISMO%20DE%20RX%20DEL%20SUCCINATO%20DESHIDROGENASA&f=false

Cañas, A. (2015). Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de laboratorio. Bioquímica. Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla. UNACH. Obtenido de: https://anacanas.files.wordpress.com/2015/09/prc3a1ctica-5.pdf

González, J (s.f.). CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS. Obtenido de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1

González, M. (2010). Química. Indicador redox. Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox

Gonzalez, M. (26 de Octubre de 2010). Indicador redox. Obtenido de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox

Jenner Us Martin. (12 de marzo de 2014). Oxidorreductasa. Obtenido de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1

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Sierra, I. (28 de junio de 2013). Practica transporte de cargas 7. Obtenido de: http://es.slideshare.net/ingridjohanasierramejia/practica-transporte-de-cargas-7

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