Western-blot
Tcnica analtica utilizada para detectar hasta 0.1 ng protenas de manera especfica dentro de una muestra.
Preparacin de muestra
Separacin
Transferencia
Deteccin
Preparacin de muestraExtraccin de protenas mediante ruptura mecnica y/o
qumica del material biolgico
Tejido vegetal, animal, levaduras, cultivos bacterianos, etc.
Buffer de extraccinRegulador de pH
ReductorInhibidores de proteasas
Sales Detergente
EDTA
Separacin
Transferencia
Las protenas son transferidas usualmente electroforticamente a un soporte rgido o membrana donde quedan inmovilizadas.
Membrana: es una matriz inerte que une protenas de forma estable e inespecfica
Los geles son frgiles y difcil de manejar, ademas de no retener a los anticuerpos.
Nitrocelulosa(Cellulose nitrate)
PVDF(Polynivylidene difluoride)
Tipo de interaccin Interacciones hidrofbicas e inespecficas por protenas y cidos nucleicos
Tecnicas Western, Southern y Northern blots.
Tamao de poro 0.22 y 0.45 m 0.2 y 0.45 m
Capacidad de unir IgG 200 g/cm2 448 y 294 g/cm2
Activacin Metanol 50% Metanol
PVDF es mas resistente, une con mayor fuerza a las protenas y tiene el doble de capacidad de unin.
Material de las membranas
Electrotransferencia
gel
membrana
ctodo
nodo
papel filtro
migracin
Tipos de electrotransferencia
InmunodeteccinBloqueo
La membrana une protenas de manera inespecfica, por lo tanto es necesario bloquear o saturar los lugares de union que han quedado libres despus de la transferencia.
SFBASB Leche
Directo
Indirecto
Anticuerpos (AB)El AB marcado se une al antgeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una seal detectable. El AB esta marcado con una enzima
El AB primario reacciona con el antgeno unido a la membrana. Luego un AB secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.
El AB secundario esta marcado con una enzima
Tipos de deteccin
Quimioluminiscencia Fluorescencia Colorimtrico
AB secundario Conjugados con peroxidasa (HRP). Unidos a fluoroforos Conjugados a peroxidada o fosfatasa alcalina
Revelado
VentajasAlta sensibilidad
Multiples exposiciones Reusable
Buena sensibilidad Ensayos mltiplex No cuarto oscuro
Se puede evitar 2do AB
Sencillo No cuarto oscuro
Se documenta mediante foto
InconvenientesCuarto oscuro
Fotodocumentador caro La intensidad depende del tiempo
de exposicin
Reactivos costosos
No recomendado para proteinas poco abundantes
Menor sensibilidad El color se desvanece con el
tiempo
30 min
1 h TA / toda noche 4C
3 x 10 min
3 x 10 min
1 h TA / toda noche 4C
Caracterizacin Identificacin
Condiciones de trabajo
Aplicaciones
Diagnstico de mltiples enfermedades
Encefalopata espongiforme bovina
Enfermedad de Lyme
Confirmacin de VIH
Dermatitis
Investigacin
Caracterizacin
Seguimiento de:
Interacciones proteicas
Transgnesis
